Kompostmikrokosmos tar med sig den mikrobiella mångfalden som finns i naturen till laboratoriet för att underlätta mikrobiomforskning i Caenorhabditis elegans. Här finns protokoll för att sätta upp mikrokosmosexperiment, där experimenten visar förmågan att modulera miljömikrobiell mångfald för att utforska relationerna mellan miljömikrobiell mångfald och masktarmmikrobiomsammansättning.
Nematoden Caenorhabditis elegans växer fram som en användbar modell för att studera de molekylära mekanismer som ligger till grund för interaktioner mellan värdar och deras tarmmikrobiomer. Medan experiment med välkarakteriserade bakterier eller definierade bakteriesamhällen kan underlätta analysen av molekylära mekanismer, är det viktigt att studera nematoder i deras naturliga mikrobiella sammanhang för att utforska mångfalden av sådana mekanismer. Samtidigt är isolering av maskar från naturen inte alltid möjlig, och även när det är möjligt begränsar provtagning från naturen användningen av den genetiska verktygslåda som annars finns tillgänglig för C. elegans-forskning. Följande protokoll beskriver en metod för mikrobiomstudier som använder kompostmikrokosmos för tillväxt i labbet i mikrobiellt olika och naturliknande miljöer.
Lokalt anskaffad jord kan berikas med produkter för att diversifiera de mikrobiella samhällen där maskar odlas och från vilka de skördas, tvättas och ytsteriliseras för efterföljande analyser. Representativa experiment visar förmågan att modulera det mikrobiella samhället i en gemensam jord genom att berika den med olika produkter och visar vidare att maskar uppvuxna i dessa distinkta miljöer monterar liknande tarmmikrobiomer som skiljer sig från sina respektive miljöer, vilket stöder uppfattningen om ett artspecifikt kärntarmmikrobiom. Sammantaget ger kompostmikrokosmos naturliknande miljöer i labb för mikrobiomforskning som ett alternativ till syntetiska mikrobiella samhällen eller till isolering av vilda nematoder.
Nematoden Caenorhabditis elegans växer fram som en användbar modell för att studera interaktioner mellan värdar och deras tarmmikrobiomer 1,2. Som modell erbjuder den flera fördelar. För det första är bakteriefria eller gnotobiotiska djur lätta att få tag på och underhålla; Blekmedel kan användas för att döda gravidmaskar och tillhörande mikrober, vilket lämnar deras blekmedelsresistenta ägg oskadda för att växa som ålderssynkroniserade populationer som kan koloniseras av bakterier av intresse 3,4. Dessutom, när de odlas i närvaro av bakterier, intar C. elegans, en bakterivore, de påträffade bakterierna, med mottagliga arter smälta eller utsöndrade, medan resistenta och ihållande arter stabilt koloniserar masktarmen. Dessutom är C. elegans mestadels hermafroditiska och producerar populationer av genetiskt identisk avkomma, vilket minskar förvirrande genetisk variation. Tillsammans med tillgången på mutanta och transgena maskstammar erbjuder arbetet med C. elegans forskare en gnotobiotisk och genetiskt lätthanterlig modell för att undersöka den molekylära grunden för värd-mikrobinteraktioner 5,6,7,8.
Medan experiment med välkarakteriserade bakterier kan underlätta analysen av molekylära mekanismer, är det viktigt att identifiera och studera bakterierna som maskar interagerar med i naturen för att utforska mångfalden av sådana mekanismer, avslöja det naturliga sammanhanget för deras funktion och förstå de selektiva krafter som har format deras utveckling. Utanför laboratoriet finns C. elegans globalt i fuktiga tempererade klimat, där populationer tros genomgå en “boom-and-bust” livscykel, kännetecknad av snabb befolkningstillväxt när resurserna är rikliga, följt av en utvecklingsförskjutning till banbrytande, stresstoleranta dauers när resurserna är uttömda9. Även om de anses vara en jordnematod, är vildförökande C. elegans-populationer vanligast som matar på sönderdelande organiskt material som ruttnande blommor eller frukter, där bakteriepopulationer är rikliga och olika.
Studier av tarmmikrobiomet i nematoder isolerade från naturen har identifierat olika, men ändå karakteristiska, bakteriesamhällen 10,11, vars sammansättning ytterligare stöddes av studier utförda med maskar uppfödda i naturliknande mikrokosmosmiljöer 12,13. Tillsammans möjliggjorde sådana studier avgränsningen av ett kärnmaskmikrobiom2. Medan provtagningen av C. elegans-populationer i naturen representerar den mest direkta undersökningen av naturliga mask-mikrobinteraktioner, är det inte möjligt överallt och när som helst, eftersom det är begränsat till regioner och årstider med riklig nederbörd10,11. Alternativt, istället för att isolera maskar från deras naturliga livsmiljö, tar experiment med mikrokosmos den naturliga livsmiljön in i laboratoriet 6,8,12,13,14,15. Mikrokosmosmiljöer framställs av jord komposterad med olika frukter eller grönsaker, vilket möjliggör ytterligare diversifiering av det ursprungliga marksamhället. De erbjuder lätthanterliga experimentella metoder som kombinerar den mikrobiella mångfalden och den tredimensionella vilda jordmiljön med de experimentella fördelarna med en kontrollerad laboratorieanläggning och genetiskt definierade maskstammar. Protokollet nedan beskriver stegen i arbetet med kompostmikrokosmos, vilket visar deras användning för att förstå sammansättningen av ett karakteristiskt masktarmmikrobiom från olika miljöer.
Protokollet som presenteras här beskriver en metod för att studera tarmmikrobiomet hos nematoder uppvuxna i naturliknande miljöer, vilket erbjuder ett alternativt tillvägagångssätt för isolering av maskar från naturen eller för att höja dem på syntetiska samhällen.
De tusentals potentiella bakteriearter som fångats i det representativa mikrokosmosexperimentet återspeglar den mikrobiella mångfalden som maskarna har utvecklats med och visar mikrokosmos rörledningens förmåga att kombinera fördelarna med att arbeta med en modellvärdorganisme och fördelarna med att arbeta med naturliga, olika mikrobiella samhällen.
De representativa resultaten visar att anrikning av en gemensam jord med olika produkttyper modulerar miljömikrobiell mångfald och belyser utbudet av mikrobiell mångfald som är tillgänglig för prospektering med hjälp av denna pipeline. Producera val är inte särskilt viktigt. Tidigare arbete har använt bananer, äpplen, apelsiner, jordgubbar, gröna teblad och potatis för att berika jorden, vilket resulterar i liknande maskhöjningseffektivitet. Blandade produkter har också använts effektivt. Nyckelfunktionen är att olika produkter kommer att diversifiera en viss jord på olika sätt.
Trots den stora variationen i miljömikrobiell mångfald varierar masktarmens mikrobiomer betydligt mindre, vilket rekapitulerar vikten av masktarmnischen och värdfiltreringen för montering av ett kärntarmmikrobiom som skiljer sig från dess markmiljö13. Detta mönster observeras bäst med viktad UniFrac PCoA-analys, vilket visar att skillnaderna mellan miljöjord och masktarmmikrobiomer främst härrör från skillnader i det relativa överflödet av nyckeltaxa.
Även om protokollet som beskrivs här fokuserar på att skörda maskar för 16S-sekvensering, kan mikrokosmos användas för att utforska ytterligare frågor av intresse. Till exempel kan maskar som skördats från mikrokosmos därefter undersökas för effekten av ett varierat tarmmikrobiom på värdresistens mot olika negativa tillstånd, inklusive patogener eller toxiner. Alternativt kan nya bakteriearter och stammar isoleras och odlas från markskördade maskar, vilket utökar den taxonomiska och funktionella mångfalden av bakterier som är tillgängliga att utföra experiment med.
Medan forskningsmetoder i laboratoriemiljöer söker konsistens och reproducerbarhet, utnyttjar arbetet med mikrokosmos den naturliga variationen för att utforska värd-mikrobinteraktioner i ett naturligt liknande sammanhang. Denna variation innebär dock också vissa utmaningar. Vissa jordar som innehåller höga nivåer av endogena ryggradslösa djur kan kräva ytterligare centrifugerings-, filtrerings- och undersökningssteg för att effektivt eliminera oönskade organismer från mikrokosmosberedningen. Dessutom kan låg mikrobiell förekomst i jord inducera oönskad dauerbildning i maskpopulationer, vilket kräver en ökning av mikrobiellt extrakt eller berikar jord med en större mängd produkter. Med varje mikrokosmosexperiment som utförs fortsätter forskarna att utforska den fullständiga taxonomiska och funktionella mångfalden som tillhandahålls av naturen, vilket möjliggör upptäckten av nya mikrobiella taxa och funktionella förmågor som sträcker sig från infektionsresistens till skydd mot miljöxenobiotika.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet som beskrivs i detta manuskript stöddes av NIH-bidrag R01OD024780 och R01AG061302. K.T. stöddes vidare av ett Summer Undergraduate Research Fellowship från University of California, Berkeley, finansierat av Rose Hills Foundation. Tecknade mönster i figur 1 erhölls från BioRender.com.
AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |