Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.
Abstract
השבתת גנים חיונית לחקר תפקוד הגנים ומייצגת אסטרטגיה מבטיחה לטיפול במגוון רחב של מחלות. בין הטכנולוגיות המסורתיות, הפרעות RNA סובלות מביטול מטרה חלקי ומהצורך בטיפולים לכל החיים. לעומת זאת, נוקלאזות מלאכותיות יכולות לכפות השתקה גנטית יציבה באמצעות השראת שבר גדיל כפול של DNA (DSB), אך מחקרים אחרונים מטילים ספק בבטיחות של גישה זו. עריכה אפיגנטית ממוקדת באמצעות מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עשויה להוות פתרון, שכן מתן יחיד של שילובי ETR ספציפיים יכול להוביל להשתקה מתמשכת מבלי לגרום לשברי DNA.
ETRs הם חלבונים המכילים תחום קושר DNA ניתן לתכנות (DBD) ומשפיעים ממדכאי שעתוק טבעיים. באופן ספציפי, שילוב של שלושה ETR המצוידים בתחום KRAB של ZNF10 אנושי, התחום הקטליטי של DNMT3A אנושי ו- DNMT3L אנושי, הוכח כגורם למצבים אפיגנטיים דכאניים תורשתיים על גן היעד ETR. אופי הפגע וברח של פלטפורמה זו, היעדר ההשפעה על רצף הדנ"א של המטרה, והאפשרות לחזור למצב הדיכוי על ידי דה-מתילציה של דנ"א לפי דרישה, הופכים את ההשתקה האפיגנטית לכלי משנה משחק. שלב קריטי הוא זיהוי המיקום הנכון של תעודות סל על גן המטרה כדי למקסם את המטרה ולמזער השתקה מחוץ למטרה. ביצוע שלב זה במסגרת הפרה-קלינית האחרונה ex vivo או in vivo יכול להיות מסורבל.
מאמר זה לוקח את מערכת הקריספר/Cas9 המתה קטליטית כ-DBD פרדיגמטי עבור ETRs, ומתאר פרוטוקול המורכב ממסך במבחנה של רנ"א מנחה (gRNAs) המשולב בשילוב ETR משולש להשתקה יעילה על המטרה, ולאחר מכן הערכה של פרופיל הספציפיות הרחב של הגנום של פגיעות מובילות. זה מאפשר לצמצם את הרפרטואר הראשוני של gRNA מועמדים לרשימה קצרה של מבטיחים, שמורכבותם מתאימה להערכתם הסופית במסגרת העניין הרלוונטית מבחינה טיפולית.
Introduction
השבתת גנים שיחקה באופן מסורתי תפקיד מפתח בחקר תפקוד גנים הן במודלים תאיים והן במודלים של בעלי חיים. יתר על כן, בשני העשורים האחרונים, עם עליית הריפוי הגנטי, הוצע כגישה בעלת פוטנציאל לשנות את כללי המשחק לטיפול במחלות הנגרמות על ידי מוטציות רווח של תפקוד1, מחלות זיהומיות2, או פתולוגיות שבהן השתקה של גן אחד עשויה לפצות על פגם תורשתי בגן אחר3. לבסוף, הוצע השבתה גנטית של רגולטורים מרכזיים של כושר תאי ובקרה תפקודית כדי לשפר את היעילות של מוצרי תאים עבור אימונותרפיה לסרטן4 ורפואה רגנרטיבית5.
בין הטכנולוגיות השונות להשגת השבתת גנים, אחת המבטיחות ביותר היא השתקה אפיגנטית ממוקדת 6,7. בליבה של טכנולוגיה זו נמצאים מה שמכונה מדכאי שעתוק מהונדסים (ETRs), חלבונים כימריים המורכבים מתחום קושר DNA ניתן לתכנות (DBD) ותחום אפקט (ED) עם פונקציית דיכוי אפיגנטית. חלבוני אצבע אבץ (ZFPs)8, אפקטיבים דמויי מפעילי שעתוק (TALEs)9, או DBDs מבוססי CRISPR/dCas910 יכולים להיות מתוכננים כך שיקשרו באופן סלקטיבי את ה-ED לרצף המקדם/משפר של גן המטרה שיושתק. ברגע שהוא שם, ה-ED של ה-ETR מבצע את פעילות ההשתקה שלו על ידי הטלת סימנים אפיגנטיים דכאניים הגורמים להטרוכרומטין, כגון שינויים בהיסטון (H3K9 11,12 או H3K27 13 מתילציה, H3 או H4 deacetylation 14) ומתילציה של CpG DNA 15, בהתאם לתחום הדיכוי שבו נעשה שימוש.
בפרט, בהשראת התהליכים המולקולריים של דיכוי שעתוק קבוע של רטרו-וירוסים אנדוגניים המתרחשים בעובר16 לפני ההשרשה, נוצר שילוב של שלושה ETR כדי לנצל את ה- EDs הבאים: i) תחום התיבה המשויכת לקרופל (KRAB) של ZNF10 אנושי; ii) התחום הקטליטי של DNA de novo אנושי methyltransferase 3A (DNMT3A); ו-iii) DNA אנושי באורך מלא דמוי מתילטרנספראז 3 (DNMT3L). KRAB הוא תחום דיכוי שמור המשותף למספר ZFPs בבעלי חוליות גבוהים17,18, שפעילות ההשתקה שלו מבוססת בעיקר על יכולתו לגייס KAP1 19 - חלבון פיגום המקיים אינטראקציה עם מספר השראות הטרוכרומטין אחרות20 - הכוללות את קומפלקס השיפוץ והדה-אצטילציה של הנוקלאוזומים (NuRD) 21, ההיסטון מתילטרנספראז H3K9 SETDB122, וקורא המתילציה H3K9 HP1 23, 24, בין היתר.
DNMT3A מעביר באופן פעיל קבוצות מתיל על הדנ"א ברצפי CpG25. הפעילות הקטליטית של DNMT3A משופרת על ידי הקשר הפיזיקלי שלו עם DNMT3L, פרלוג מוגבל עובריים ותאי נבט של DNMT3A חסר את התחום הקטליטי האחראי על העברת קבוצת מתיל26,27. מתילציה של דנ"א באזורים עשירים ב-CpG – המכונים איי CpG (CGIs) – המשובצת באלמנטים המקדמים/משפרים של גנים של יונקים קשורה בדרך כלל להשתקת שעתוק28. חשוב לציין, לאחר ההפקדה, מתילציה של CpG יכולה לעבור בתורשה יציבה לאורך מיטוזה על ידי קומפלקס מולקולרי מבוסס UHRF1-DNMT129.
ביטוי יתר יציב של ETR בתא המטרה יכול להיות בעייתי, ככל הנראה בגלל הסיכונים הגוברים של פעילות מחוץ למטרה ודיכוי של אינטראקטורים אנדוגניים מאתרי המטרה הפיזיולוגיים שלהם לאורך זמן. עם זאת, ביטוי חולף של moieties ETR יחיד יכול להיכשל לגרום להשתקה לטווח ארוך עם יעילות גבוהה30, מה שפוגע ביישום הטיפולי שלהם. לכן, פריצת דרך משמעותית בתחום הייתה הראיות לכך שהשילוב של שלושת ה-ETR מבוססי KRAB, DNMT3A ו-DNMT3L יכול ליצור סינרגיה, ואפילו כאשר הם מועברים רק באופן זמני, לכפות על רצף המקדם של גן המטרה מתילציה H3K9 ו-CpG. אלה נקראים ומופצים על ידי התא לאורך מיטוזה, מה שמוביל להשתקה תורשתית במספר שורות תאים אנושיים ומורין, כמו גם תאים ראשוניים בתרבית ex vivo 30.
יש לציין כי ניתן להחזיר את ההשתקה האפיגנטית שנכפתה על ידי תעודות הסל לפי דרישה על ידי גיוס ממוקד (למשל, גיוס של דמתילאז DNA TET1 מבוסס CRISPR/dCas9 על הלוקוס המושתק) או פרמקולוגית (מתן מעכב DNA methyltransferase 5-Aza) דהמתילציה30 של DNA, תרופה פוטנציאלית במקרה של תופעות לוואי הקשורות ל-ETR. תוארו גם תעודות סל All-in-One הנושאות את שלושת ה-EDs מבוססי KRAB, DNMT3A ו-DNMT3L, והראו יעילות השתקה משמעותית בקווי תאים31,32 כנגד הרוב הגדול של גנים מקודדי חלבונים. יתר על כן, מספר מחקרים שהשתמשו ב-ETR דיווחו על פרופיל בטיחות גבוה, ללא פעילות משמעותית מחוץ למטרה במונחים של מתילציה דה נובו CpG או שינוי בנגישות הכרומטין30,31,32. עם זאת, ניתוח ייעודי של פרופיל הספציפיות של ETR המצויד ב- DBD שעוצב לאחרונה מומלץ לפני יישומים קליניים.
מנקודת מבט קלינית, השתקה אפיגנטית ממוקדת עשויה לספק יתרונות קריטיים הן להפרעות RNA (RNAi) מבוססות Knockdown33 והן לשיבוש גנים מלאכותי מבוסס Nuclease8. בניגוד ל-RNAi, השתקה אפיגנטית ממוקדת עשויה לגרום לביטול מלא של המטרה בכל תא ואינה דורשת טיפול תקופתי כדי להבטיח השתקה ארוכת טווח; בניגוד לשיבוש גנטי, הוא משאיר את רצף הדנ"א ללא שינוי, ונמנע מיצירת שברים דו-גדיליים של דנ"א (DSB). DSBs יכולים לגרום לאפופטוזיס ולמעצר מחזור התא, מה שעלול להוביל לברירה נגד תאים עם מסלול p53 פונקציונלי 34,35, ובמיוחד בהגדרות עריכת גנים מרובי רקעים, סידור מחדש של כרומוזומלים35. יתר על כן, על ידי העברת תוצאת הפסיפס הבלתי הפיכה של תיקון DSB36 של DNA שאינו הומולוגי-מצטרף-קצה, שיבוש גנים אינו יכול למנוע תיקון בתוך מסגרת של המטרה לרצפי קידוד פונקציונליים כאחת התוצאות הסופיות, ובניגוד להשתקה אפיגנטית, לא ניתן למחוק אותה לפי דרישה.
לבסוף, השתקה אפיגנטית טומנת בחובה פוטנציאל להרחיב את טווח האלמנטים הגנטיים הניתנים למטרה למחלקות העמידות באופן מלא או לפחות חלקי ל-RNAi ולשיבוש גנים, כגון אלמנטים רגולטוריים שאינם משועתקים ו-RNA30,32 שאינם מקודדים. הצעד הקריטי הראשון עבור כל יישום השתקה אפיגנטית ממוקדת הוא לתכנן פאנל של ETR המכסה את הרצפים הרגולטוריים השונים של גן המטרה ולזהות את אלה בעלי הביצועים הטובים ביותר. מספר ה-ETR שייבדקו יכול להיות קריטי, בהתחשב בחלק ההולך וגדל של הגנום שיכול להיות ממוקד על ידי טכנולוגיות קישור DNA ניתנות לתכנות שנמצאות כל הזמן בפיתוח37. ביצוע המסך של ETR ישירות על סוג התא שבו להשתיק טיפולית את גן המטרה יהיה האפשרות הרלוונטית ביותר. עם זאת, מסכים בעלי תפוקה גבוהה יכולים להיות מסורבלים מבחינה טכנית בתאים ראשוניים בשל הישרדותם המוגבלת בתרבית ויכולתם ההנדסית הלא אופטימלית לעתים קרובות. מסכים בקנה מידה גדול יכולים להיות אפילו יותר בלתי אפשריים in vivo.
חלופה מעשית יותר כוללת ביצוע סינון ראשוני של פאנל גדול של ETR בקווי תאים הניתנים להנדסה בקלות בהתחלה, ולאחר מכן רק אימות המבטיחים ביותר בסוג התא הרלוונטי מבחינה טיפולית. סוגיה מקבילה היא בחירת קריאה מתאימה למדידת יעילות ההשתקה של תעודות הסל. הערכה ישירה של רמות השעתוק או החלבון של גן המטרה על ידי RT-qPCR, Western Blot או ELISA יכולה להיות יקרה וגוזלת זמן ועשויה להיות חסרת רגישות מספקת, ובכך להגביל את היישום שלהם בסקאלות תפוקה גבוהות. יצירת קווי תאי כתב מהונדסים אד-הוק , שבהם פלואורופור ממוקם תחת בקרת שעתוק של רצפי הבקרה של גן המטרה, מאפשרת ניצול של הגישה מבוססת ציטומטריית זרימה לקריאת השתקה אפיגנטית ברמת התא הבודד ובקצב תפוקה גבוה.
בעקבות שיקולים כלליים אלה, מאמר זה מתאר פרוטוקול המורכב ממסך במבחנה של ETR ליעילות השתקה על המטרה, ואחריו הערכה של הפעילות מחוץ למטרה ברחבי הגנום של הפגיעות המובילות. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם את הרפרטואר הראשוני של ETR מועמדים לרשימה קצרה של מבטיחים, שמורכבותם מתאימה להערכתם הסופית בסוג התא הרלוונטי מבחינה טיפולית.
בין ה-DBD השונים הניתנים לתכנות שניתן לנצל ליצירת ETRs, פרוטוקול זה יתמקד בטכנולוגיה מבוססת CRISPR/dCas9, בגלל הקלות של תכנון gRNA המשתרע על פני מקדם גן המטרה בקנה מידה של תפוקה גבוהה. עם זאת, ניתן לאמץ את אותה זרימת עבודה קונספטואלית המתוארת להלן כדי להעריך את היעילות והספציפיות של ETR המצוידים ב- DBD אחרים.
Protocol
1. הנדסה של קו תאי כתב מבוסס פלואורסצנטיות לניטור פעילות השעתוק של גן המטרה על ידי ציטומטריית זרימה
- זהה קווי תאים המבטאים את גן המטרה שיש להשתיק. עיין בגן המטרה שיושתק באטלס החלבון האנושי38 ונווט דרך החלק "קו התא" שלו כדי לזהות את הקווים המייצגים את הרקמה הסומטית המעניינת (למשל, קו תאי כבד אם המטרות הסופיות הן הפטוציטים בכבד). לחלופין, חקור מסד נתונים של ריצוף RNA (RNA-Seq) הזמין לציבור (לדוגמה, NCBI GEO).
- בין המועמדים, יש לתעדף קווי תאים שעבורם קיימים פרוטוקולי העברת גנים ארעיים יעילים - החיוניים להעברת ETR.
הערה: בין השיטות השונות, נוקלאופקציה מייצגת את אחת האפשרויות הטובות ביותר, מכיוון שהיא מבטיחה יעילות טרנספקציה גבוהה. כאן, תאי אריתרולוקמיה K-562 אנושיים נבחרו כדי ליצור קו תאים המדווח על פעילות השעתוק של הגן בטא-2-מיקרוגלובולין (B2M) (להלן תאי B2M TdTomato K-562). - כמו כן, יש לתעדף את המועמדים להימנע מקווי תאים שבהם גן המטרה חיוני לקיום התא, שכן הדבר פוגע בתחזוקת התאים עם השתקה יציבה של גן המטרה בתרבית. אם לא דווח בעבר, כדי לקבל תחושה של חיוניות גן המטרה בסוג התא הנבחר, ליצור בקרת שיבוש גנטי על ידי הדבקת התאים עם נוקלאז Cas9 ו gRNA מכוון לאחד אקסונים קידוד הראשונים של הגן.
הערה: שיבוש גנטי הוא אירוע יציב בהגדרה; בחירה נגדית של תאים משובשים לאורך זמן מצביעה על כך שגן המטרה חיוני לפיזיולוגיה של התא הנבחר.- זהה את איזופורם שחבור המטרה המועדף בשימוש בקו התא שנבחר (האיזופורם NM_004048.4 של הגן B2M ממוקד בפרוטוקול זה).
- זהה gRNA שיכול לחתוך ביעילות ובאופן ספציפי באקסון הקידוד הראשון של איזופורם המטרה (למשל, Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, שהוא כלי בחירת gRNA מקוון תקף וידידותי למשתמש).
- עבור תאי K-562, טרנספקט 1 מיקרוגרם של פלסמיד קידוד spCas9 (hCas9; ראה טבלת חומרים) ו- 250 ננוגרם של פלסמיד מקודד gRNA (phU6-gRNA; ראה טבלת חומרים) לכל 5 × 105 תאים באמצעות נוקלאופקציה (בהתאם להוראות היצרן).
- תרבית את התאים (תאי K-562 ב-37°C תחת 5%CO2 ב-RPMI-1640 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי [FBS], L-גלוטמין ופניצילין/סטרפטומיצין [100 U/mL]) ומנטרת את רמות שיבוש הגנים לאורך זמן על ידי ניצול ערכה לזיהוי מוטציות (עקוב אחר הוראות היצרן).
- שיבוט תבנית תורם לשילוב הומולוגי בתיווך רקומבינציה של כתב פלואורסצנטי תחת בקרת שעתוק של גן המטרה המעניין (איור 1).
- זהה את האזור של גן המטרה כדי לשלב את קלטת ביטוי פלואורופור.
הערה: הימנע מהתמקדות ברכיבים רלוונטיים לתמלול, כגון איי CpG ואזורים מועשרים לאצטילציה H3K27 (סמן של מקדמים ומשפרים פעילים). שינוי אלמנטים רגולטוריים אלה (שעשויים להיות חשובים למיקוד על ידי ETR כדי להורות על השתקה אפיגנטית) הופך את קו תאי המדווח לפחות מנבא את הוויסות הפיזיולוגי של גן המטרה.- אם גן המטרה אינו מקודד לחלבון מופרש, התיך את המדווח לקודון האחרון של גן המטרה באמצעות פפטיד 2A המבקע את עצמו כדי לשמור על הפונקציונליות של גן המטרה.
- אם גן המטרה אכן מקודד לחלבון מופרש, כדי למנוע הפרשה פוטנציאלית של המדווח, מקם את המדווח באזור אינטרוני של גן המטרה. שילוב כפוי של המדווח בתמלול שחבור דרך אתר מקבל פרוסות (SA) ותרגום לאחר מכן באמצעות רצף כניסת ריבוזום פנימי (IRES) פוגע בפונקציונליות של גן המטרה.
- השתמש ב- Chopchop כדי לבחור חיתוך gRNA באזור היעד (כאן, gRNA נבחר להתמקד ברצף 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ של האינטרון הראשון של הגן B2M ).
- תכנן תבנית תורם לאתר חיתוך gRNA המורכבת מ: i) זרוע הומולוגיה שמאלית (n זוגות בסיסים [bp] התואמים את האזור במעלה הזרם של אתר חיתוך ה- gRNA); ii) קלטת ביטוי טרנסגנים ללא מקדם (במקרה המוצג כאן, SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly(A) המעדיפה שחבור עם האינטרון הראשון של הגן B2M ); ו-iii) זרוע הומולוגיה ימנית (n bp התואמת את האזור במורד הזרם של אתר חיתוך ה-gRNA).
הערה: אורך זרועות ההומולוגיה הדרושות כדי לגרום ביעילות לרקומבינציה הומולוגית יכול להשתנות בין סוגי תאים שונים (100-500 bp הוא טווח מתאים לתאי K-562).
- זהה את האזור של גן המטרה כדי לשלב את קלטת ביטוי פלואורופור.
- ספק את מערכת הנוקלאז CRISPR/Cas9 ואת תבנית התורם בתוך קו תאי היעד. עבור תאי K-562, העבר 1 מיקרוגרם של פלסמיד קידוד spCas9 (hCas9; ראה טבלת חומרים), 250 ננוגרם של פלסמיד מקודד gRNA (phU6-gRNA; ראה טבלת חומרים), ו -1 מיקרוגרם של פלסמיד מקודד תבנית תורם לכל 5 × 105 תאים באמצעות נוקלאופקציה (בהתאם להוראות היצרן).
- תרבית את התאים במשך 14 יום לפחות (עבור תאי K-562) ונטר את רמות הביטוי של המדווח הפלואורסצנטי לאורך זמן באמצעות ציטומטר זרימה (הפעל את תעלת הפיקוריתרין (PE) כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כתב tdTomato ופעל לפי הוראות היצרן לביצוע ציטומטריית זרימה).
הערה: תבנית התורם - במיוחד אם היא מבוססת פלסמיד - יכולה להכיל רצפי מקדם מוצפנים, מה שמוביל לביטוי של כתב הפלואורסצנט מעותקים לא משולבים של תורמים. תרבית התאים מאפשרת דילול של עותקים לא משולבים אלה על ידי חלוקת התא ולבסוף שמירה על ביטוי המדווח רק מהעותקים התורמים המשולבים בגנום המטרה. - שיבוט תאים חיוביים לכתב באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) ברמת תא יחיד. עבור פרוטוקול זה, הפעל את ערוץ PE כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כתב tdTomato ופעל לפי הוראות היצרן כדי למיין תאי K-562 חיוביים ל- tdTomato בודדים לכל באר של צלחת 96 באר.
- עם התרחבות התאים בתרבית (בדרך כלל 20-30 יום עבור תאי K-562), סינון שיבוטים חיוביים לכתב על ידי PCR כדי לבחור אחד הנושא שילוב דו-אללי של קלטת הכתב בתוך מוקד המטרה.
הערה: זה ממקסם את ביטוי הכתב ומאפשר פתרון נוסף בין תאים המבטאים כתב לבין תאים מושתקים על ידי ציטומטריית זרימה בטיפול ETR.- חלץ DNA גנומי מ- 1 ×10 5 תאים לכל שיבוט חיובי לכתב באמצעות ערכת מיצוי DNA (בהתאם להוראות היצרן).
- הגבר את אזור היעד B2M עם פריימרים קדימה (5'-GTATTTGCTGGTTATGTGTTAG-3') והפוך (5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') בהתאם להוראות ערכת הגברה PCR. טמפרטורת החישול של זוג פריימרים זה היא 47.7 מעלות צלזיוס עם פולימראז DNA מבוסס Taq וריכוזי פריימר של 0.5 מיקרומטר.
- יש לנתח את מוצר ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה ג'ל אגרוז 1% (בהתאם להוראות היצרן). מסך לשיבוטים המציג את הרצועה הקשורה לאינטגרציה של tdTomato במיקום היעד B2M (3,413 bp), ללא הרצועה הקשורה למוקד המטרה מסוג Wild (1,027 bp).
2. תכנון gRNA להשתקה אפיגנטית מבוססת CRISPR/dCas 9 של גן המטרה
- עיין בגן המטרה בדפדפן הגנוםUCSC 40 וחלץ את רצף הנוקלאוטידים של אזורים שעשויים לווסת את פעילות השעתוק שלו, כגון איי CpG ואתרים מועשרים לאצטילציה H3K27 (סמן של מקדמים ומשפרים פעילים).
הערה: על פי מחקר שנערך לאחרונה, אזור המיקוד הטוב ביותר הוא חלון 1 קילו-בסיס (kb) שבמרכזו אתר התחלת השעתוק של גן היעד32. - הדבק את הרצפים שנבחרו בכלי המקוון Chopchop ובחר דיכוי כמטרת ה- gRNA שיש לאחזר. חכו ש-Chopchop יספק רשימה של gRNA שמופו על פי הרצף הגנטי של העניין ונרשמו לפי ציון בהתחשב הן במספר ההתאמות מחוץ למטרה והן ביעילות החזויה על המטרה (איור 2).
- בחר לפחות 10 gRNA לכל רצף מטרה. במידת האפשר, נסו לבחור gRNA המשתרע על פני כל האזור לחקירה, ללא התאמה מלאה עם רצפים תוך-גניים אחרים ברחבי הגנום.
3. אספקה ארעית מאורגנת של ETR מבוסס CRISPR/dCas 9 בקו התא של הכתב
- מבין מערכות העברת הטרנסגנים שדווחו בעבר עבור קו תאי היעד, בחר את אלה המאפשרות ביטוי טרנסגנים חולף בלבד, ממקסמות את יעילות המסירה וממזערות רעילות הקשורה למניפולציה של התא. במקרה של תאי K-562, הן נוקלאופקציה פלסמיד והן mRNA מומלצים מאוד, כאשר ייצור פלסמיד מייצג חלופה קלה וזולה יותר מבחינה טכנית.
- שכפל הן את ה-gRNA שנבחרו בסעיף 2 והן את ה-ETR מבוסס CRISPR/dCas9 במערכת העברת הטרנסגנים הנבחרת. עיין בשלבים הבאים עבור פרוטוקול לשיבוט ETR בדנ"א פלסמיד.
הערה: פלסמידים בקידוד נפרד עבור dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A ו- dCas9:DNMT3L30 אינם זמינים ב- Addgene. הם שוכפלו על ידי החלפת הטרנס-אקטיבטור VP160 מהפלסמיד pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (ראו טבלת חומרים) ברצף קידוד תחום30 של KRAB, DNMT3A או DNMT3L. קיים קידוד פלסמיד עבור ETR All-in-One, המכונה CRISPRoff-v2.132 (ראה טבלת חומרים).- התמירו פלסמידים המקודדים עבור ETR בתאי E. coli בעלי כשירות כימית (בהתאם להוראות היצרן). סנן את המושבות לנוכחות פלסמיד נושא ETR על ידי עיכול אנזים הגבלה וריצוף סנגר, ולבסוף בחר אחת מהמושבות החיוביות לייצור פלסמיד DNA Midiprep (בהתאם להוראות היצרן).
- שכפלו את ה-gRNA בתוך עמוד השדרה של phU6-gRNA (איור 3).
- באמצעות תוכנת תכנון ביולוגיה מולקולרית, צרף רצף 5'-CACCG-3' במעלה הזרם של הפרוטוספייסר (המשתנה הראשון 20 נוקלאוטידים [nt] של gRNA שנבחר) כדי ליצור אוליגו באורך 25 nt בסיליקו, המכונה SGfw.
- באופן דומה, יש לצרף רצף של 5'-AAAC-3' במעלה הזרם של המשלים ההפוך של הפרוטוספייסר של ה-gRNA שנבחר ו-5'-C-3' במורד הזרם שלו כדי ליצור אוליגו באורך 25 nt המכונה SGrv.
- סדרו את שני רצפי SGfw ו-SGrv כאוליגוס DNA חד-גדילי נטול מלח, המרחפים מחדש במים ב-100 מיקרומטר.
- הוסף 1 μL מכל אוליגו ל-2 μL של חיץ חישול (10 mM Tris [pH 7.5-8.0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) ו-16 μL מים.
- בצע חישול אוליגו על ידי הנחת התמיסה בתרמוסייקלר המתוכנת להתחיל ב 95 ° C למשך 10 דקות. לאחר מכן, מצננים בהדרגה ל-25°C במשך 45 דקות.
- לדלל 1 μL של אוליגוס מחושל עם 99 μL של מים ללא nuclease, ולאחר מכן ligate 1 μL של דילול זה עם 50 ng של פלסמיד phU6-gRNA מעוכל בעבר עם אנזים הגבלת BsaI (בצע את ההוראות של ספקי ערכות BsaI וליגאז עבור הליך העיכול והקשירה).
- להפוך 20 μL של תאי E. coli מוכשרים כימית עם 2 μL של מוצר קשירה (בצע את הוראות היצרן עבור הליך טרנספורמציה).
- בחר מושבות מרובות לייצור פלסמיד DNA Miniprep (עקוב אחר הוראות הספק) ובקר בשיבוט המוצלח של הפרוטוספייסר על ידי ריצוף סנגר עם התאמת הפריימר הבא למקדם U6 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'.
- בחר אחת מהמושבות החיוביות לייצור פלסמיד DNA Midiprep (בהתאם להוראות היצרן).
- ספק את ה-gRNA שנבחר ואת ה-ETR מבוסס CRISPR/dCas9 בקו תאי הדיווח במערך (gRNA ספציפי אחד לכל תנאי) (איור 3).
הערה: כמקרה מייצג, זרימת העבודה עבור נוקלאופקציה של פלסמידים בקידוד עבור dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ו- gRNA המכוונים לאי B2M CpG בתאי B2M TdTomato K-562 מוצגת בשלבים הבאים.- הכינו צינורות נפרדים המכילים 500 ננוגרם של כל אחד מהפלסמידים המקודדים dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A ו-dCas9:DNMT3L, אך שונים זה מזה כדי שה-gRNA ייבדק (125 ננוגרם של פלסמיד מקודד gRNA לכל צינור). כלול תנאי נוקלאופקציה נטולי gRNA ו- ETR כדגימה שטופלה בדמה. בצע את המסך עם לפחות שלושה עותקים טכניים משוכפלים לכל דגימה.
- גלולה 5 × 105 B2MTdTomato K-562 תאים לכל צינור ונוקלאופקט אותם עם תערובת פלסמיד (בהתאם להוראות היצרן).
- השהה מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של תרבית תאי יונקים RPMI-1640 שחוממו בעבר והחזירו אותם לאינקובטור.
4. ניתוח פעילות השעתוק של גן המטרה לאורך זמן
- השתמשו בציטומטריית זרימה כדי למדוד את אחוז התאים המושתקים בנקודות זמן שונות לאחר מסירת תעודות הסל (איור 4). השתמש בתאים מסוג Wild (WT) - שאינם נושאים את רצף קידוד הפלואורופור - כדי לקבוע את הסף של תאים שליליים למדווח. השתמש בדגימה שטופלה בדמה כדי להגדיר את השער לתאים חיוביים למדווח.
הערה: כפי שהוצע בשלב 1.3, כלול בקרת שיבוש גנטי בניסוי. זה יכול להיות שימושי הן כדי לפקח על יעילות העברת CRISPR ואת הכושר של תאים משוללי גן המטרה; את אובדן השתקת השעתוק וההפרעה הגנטית לאורך זמן ניתן לייחס לחיוניותו של גן המטרה בסוג התא הנבחר. כלול נקודות זמן קצרות (יום 3, יום 7, יום 10) וארוכות טווח (יום 21, יום 35) כדי לקבל אינדיקציה ליעילות אקוטית וארוכת טווח של השתקה. - זהה את שלושת ה- gRNA המובילים במונחים של יעילות השתקה לטווח ארוך. השתמש ב- FACS כדי לבחור את תת-האוכלוסייה השלילית למדווח הנשמרת ביציבות בדגימות אלה. כמו כן, בצע FACS של דגימות דמה בתפזורת כדי לשמור אותם תחת אותו טיפול כמו דגימות הבדיקה כדי לאפשר השוואה נכונה בניתוחים הבאים.
5. הערכת הספציפיות של טיפול ETR על ידי RNA-seq ומשקעים חיסוניים של DNA מתילציה (MeDIP)-seq
- השתמש ב- RNA-seq כדי להעריך כל דה-רגולציה של שעתוק כלל הגנום בסופו של דבר בעת מסירת ETR.
- עבור תת-האוכלוסייה המושתקת על ידי הכתבים של הדגימות שטופלו בשלושת ה-gRNA בעלי הביצועים הטובים ביותר ובתאים שטופלו בדמה, יש לחלץ רנ"א באמצעות ערכות מסחריות. להעריך את האיכות והריכוז של RNA באמצעות ערכות זמינות מסחרית.
- ביצוע פיצול RNA, שעתוק לאחור והכנת ספריות באמצעות ערכות זמינות מסחריות להכנת ספריות RNA-seq (בהתאם להוראות היצרן).
- בצע כימות ספריות ובקרת איכות באמצעות מכשירי בקרת איכות התואמים לריצוף הדור הבא ולאלקטרופורזה דיגיטלית.
- ספריות רצפים על רצף הדור הבא בהתאם להוראות היצרן, עם פרוטוקול 100 bp paired-end ומכוון לממוצע של 45 M קריאה/דגימה.
- יישר תגי קריאה לגנום הייחוס המתאים וכמת ביטוי תעתוק. בצע יישור על רצף tdTomato וכמת אותו בנפרד.
הערה: כאן, יישור כוכבים (v 2.3.0)43, עם פרמטרי ברירת מחדל, יחד עם חבילת Rsubread44 משמש. - בצע ניתוח של נתוני RNA-seq על פי שיטות עבודה מומלצות שפורסמו45.
הערה: חבילת R/Bioconductor edgeR46 משמשת כאן, תוך יישום מסנן של לפחות ספירה אחת למיליון (cpm) בשלוש דגימות לפחות כדי להיפטר מגנים בעלי ביטוי נמוך. לחלופין, ניתן להשתמש בפונקציה filterByExpr ב- edgeR. - הערכת ביטוי גנים דיפרנציאלי באמצעות מודל לוג-ליניארי כללי בינומי שלילי המיושם edgeR (פונקציה glmFit)47. קבע סף של 0.01 על ערכי p מותאמים (תיקון בנימיני-הוכברג [BH]) כדי לשמור על גנים מווסתים דיפרנציאלית.
- הערך כל פעילות מתילציה CpG מחוץ למטרה של ETR על ידי MeDIP-seq.
- עבור תת-האוכלוסייה המושתקת של הדגימות שטופלו בשלושת ה-gRNA המובילים ובתאים שטופלו בדמה, יש לחלץ DNA גנומי באמצעות ערכות זמינות מסחרית (בהתאם להוראות היצרן).
- Sonicate 500 ng של DNA גנומי באמצעות ultrasonicator ואת הפרמטרים הבאים: חובה: 20 %; פיפ: 175; מחזורים לפרץ: 200; זמן: 40 שניות.
- הכינו ספריות ריצוף עם ערכות זמינות מסחריות עבור MeDIP-seq (בהתאם להוראות היצרן).
- לאחר שלב קשירת המתאם, כמת ספריות על ידי בדיקה פלואורומטרית ובדוק את יעילות הקשירה באמצעות qPCR באמצעות ערכות כימות ספריות זמינות מסחרית (בהתאם להוראות היצרן).
- השג מאגרי ספריות על-ידי ערבוב ספריות שנבחרו באופן אקראי כדי להפחית הטיות טכניות. השתמש בכמות ספרייה שווה (ng) עבור כל ספרייה כדי לאזן את המאגרים. לכל בריכה, הוסיפו את הדנ"א של בקרת ספייק-אין שעבר מתילציה ו-unmethylated המסופק בערכה. למטרות בקרה, שמור נפח של 10% מהספריה, המסומן כ"קלט" ולא מדוכא חיסון. בצע משקעים חיסוניים על 90% הנותרים של הספרייה באמצעות נוגדן חד שבטי המכוון נגד 5-methylcytosine שסופק בערכת MeDIP-seq.
- לטהר ספריות מועשרות וקלט באמצעות ערכות לטיהור המוצר 5-methylcytosine immunoprecipitation, בהתאם להוראות היצרן.
- להעריך את יעילות ההעשרה על ידי ביצוע PCR כמותי בזמן אמת על הזינוק הפנימי בבקרות באמצעות פריימרים שסופקו עם הערכה. עבור כל משקעים חיסוניים (IP), חשב את ספציפיות ההעשרה משחזור DNA שעבר מתילציה ובלתי מתילציה, תוך שימוש בערכי סף המחזור (Ct) של MeDIP ושברי קלט המתקבלים מתגובת qPCR (ראה משוואות 1 ו- 2):
(1)
(2)
הערה: שקול ספריות IP כמוצלחות אם ערכי הספציפיות הם ≥0.95. - להגביר את הספריות באמצעות ערכות הכנת ספריות MeDIP-seq, בהתאם להוראות היצרן, ולבצע כימות וניתוח התפלגות גודל הספרייה של המוצר.
- בצע ריצוף ספרייה על רצפים של הדור הבא. השתמש ברצף זוגי, עם אורך קריאה של 100 bp, מכוון לממוצע של 30 M קריאה/דגימה.
- יישר את תגי קריאת הריצוף לגנום הייחוס המתאים (לדוגמה, HG38) באמצעות BWA (גרסה 0.7.5 ומעלה)48 ולאחר מכן זהה פסגות באמצעות MACS (גרסה 2.0.10 ומעלה)49, דבר המאפשר זיהוי של פסגות רחבות (-slocal = 0,-llocal = 500000).
- צור קבוצה משותפת של אזורים מדוגמאות שונות באמצעות כלי ההצטלבות50 של BEDTools, המאפשר את אפשרות קיבוץ האשכולות.
- חשב את הכיסוי לכל מדגם ברשימת האזורים הסופית באמצעות multicov של BEDTools, תוך השלכת קריאות כפולות.
- בצע ניתוח של ספירת המטריצה באמצעות edgeR. החל מסנן של ספירה אחת לפחות למיליון (cpm) בשלוש דגימות לפחות כדי להיפטר מאזורים מועשרים ברמה נמוכה.
הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בפונקציה filterByExpr ב- edgeR. - זהה מתילציה דיפרנציאלית על ידי אימוץ מודל לוג-ליניארי כללי המיושם ב- edgeR (פונקציה glmFit) ונורמליזציה באמצעות נורמליזציה כמותית מותנית51 כדי לתקן עבור תוכן GC מבחינת אזור. בחר אזורים בעלי מתילציה דיפרנציאלית על-ידי החלת סף של 0.01 על ערכי p מותאמים של BH. בצע ניתוח של רצפים חוזרים כדלקמן.
הערה: עיין במדריך למשתמש של edgeR לקבלת הרשימה המלאה של האפשרויות והפרמטרים (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).- סנן תוצאות MeDIP-seq עבור ערך p נומינלי <0.01 וצור שתי קבוצות של אזורים: בחר אזורים עם logFC >1 בקבוצה הראשונה ואזורים עם logFC <-1 בקבוצה השנייה.
- אחזר את הביאור RepeatMasker עבור הגנום שנבחר כקובץ מיטה וספור את מספר האלמנטים בכל קבוצה. המר את הספירה כיחס על פני מספר האזורים עבור כל ערכת נתונים.
- חלצו את יחס המתילום החופף לכל סוג של חזרות ובצעו בדיקת Chi-squared כדי לזהות העשרה משמעותית.
- הערך אם אזורים שעברו שעתוק דיפרנציאלי או מתילציה דיפרנציאלית בין דגימות ETR ודגימות שטופלו בדמה ממופים לקשירת gRNA מחוץ למטרה שנחזה על ידי סיליקו.
- השתמש בחבילת העיצובCRISPR 52 ככלי חיזוי קשירת gRNA מחוץ למטרה.
- עבור כל אזור משוער מחוץ למטרה, הסתכל על אתר התחלת השעתוק הקרוב ביותר (TSS) ועל האזור הקרוב ביותר שעבר מתילציה. שקול כאפקט אמיתי מחוץ למטרה אזור המשויך לגן המוסדר עם FDR <0.01 ומרחק ל- TSS קטן מ- 10 Kb, או אזור שעבר מתילציה המוסדר עם FDR <0.01 ובמרחק נמוך מ- 1 Kb.
- זהו את המספר והמאפיינים של האזורים שעברו שעתוק או מתילציה מוגזמת בדגימות שטופלו בכל אחד משלושת ה-gRNA בעלי הביצועים הטובים ביותר בהשוואה לדגימות שטופלו בדמה (איור 5) כדי לזהות את הספציפיים ביותר מבין ה-gRNAs. דרג את ההשפעה הפוטנציאלית של אתר מחוץ למטרה על הפיזיולוגיה של תאי המטרה בסדר הבא (מהמשפיע ביותר למשפיע פחות):
i) גן תוך גני, אזורי רגולטורי - מבוטא פיזיולוגית
ii) גן תוך גני, אזור אקסוני-מבוטא פיזיולוגית
3) גן תוך גני, אינטרוני, אזור מבוטא פיזיולוגית
4) גן תוך גני, אזור רגולטורי שאינו מבוטא
v) גן תוך גני, אזור אקסוני - לא מבוטא
vi) גן אינטרגני, אינטרוני - לא מבוטא
vii) האזור הבין-גני
(1)
(2)Representative Results
עם מסירת תבנית תורם לשילוב הומולוגי בתיווך רקומבינציה של המדווח הפלואורסצנטי במיקום המטרה יחד עם מערכת CRISPR/Cas9 (למשל, על ידי נוקלאופקציה פלסמידית במקרה של תאי K-562), תאים חיוביים לכתב מופיעים במדגם שטופל (איור 1, למטה). אם זה לא קורה, בדוק שוב את דיוק העיצוב והשכפול הן של תבנית התורם והן של ריאגנטים מסוג CRISPR/Cas9. אם אושר, נסה לייעל את המינונים של ריאגנטים ואת פרוטוקול המסירה עצמו.
לאחר קבלת קו התא המדווח, בחר רצפי מקדם/משפר של גן המטרה ותכנן פאנל של gRNA תואם. השתמשו בכלי חיזוי סיליקו כמו Chopchop כדי לזהות את רצפי ה-gRNA ולדרג אותם במונחים של יעילות וספציפיות חזויות (איור 2). אם לא מאוחזרים gRNAs, שלוט בנוכחות המוטיב הסמוך לפרוטוספייסר Cas9 הקנוני (PAM) (5'-NGG-3') ברצף המטרה. אם לא קיימים רצפי PAM, שקול לעבור ל-ETR בהתבסס על גרסאות Cas9 חלופיות שאינן תלויות ב-PAM (עדיין לא פורסמו ETR עם גרסאות אלה) או לעבור לפלטפורמות דומיין קשירת DNA חלופיות, כגון ZFPs53 או TALEs30. עם זאת, אם רק gRNA עם יעילות/ספציפיות חזויה נמוכה מאוחזרים, לשקול 1) בדיקת gRNA באיכות נמוכה אלה או 2) הרחבת רצף DNA המטרה, בחיפוש אחר gRNA טוב יותר. עם העברה ארעית של שילוב ETR משולש (או CRISPRoff; v2.1) יחד עם gRNAs, בצע ניתוחי ציטומטריה של זרימה אורכית עבור ביטוי הכתב הפלואורסצנטי, ולעתים קרובות צפה בשיא בדיכוי הכתב בניתוחים חריפים, אשר לאחר מכן נספג מחדש לפחות חלקית עקב דילול מיטוטי של פלסמידים מקודדי ETR לאורך זמן (איור 4C). אם שילוב ETRs/gRNA מפקיד ביעילות מתילציה של CpG על מוקד המטרה, דיכוי קבוע של המדווח יתרחש בחלק ניכר של תאים מטופלים (איור 4C). gRNA שונים יכולים להראות יעילות השתקה משתנה לטווח ארוך (איור 4B,C).
להערכות ספציפיות כלל-גנומיות, השתמשו ב-MeDIP-seq כדי לזהות את האזורים שעברו מתילציה דיפרנציאלית בין תאים שבהם המטרה הושתקה לטווח ארוך ותאים שלא טופלו. באופן אידיאלי, gRNA ספציפי מאוד יגרום רק לשיא של מתילציית de novo CpG באתר המטרה (איור 5). אם לא, ניתן לשקול לאפיין את הפעילות מחוץ למטרה של ה-gRNA המדורגים במקום נמוך יותר ברשימת היעילות על המטרה.
איור 1: שילוב של כתב tdTomato תחת האלמנטים הרגולטוריים של גן B2M האנושי על-ידי תיקון מכוון הומולוגיה. למעלה: שרטוטים של האסטרטגיה לשלב כתב פלואורסצנטי tdTomato באינטרון הראשון של גן B2M האנושי על ידי תיקון מכוון הומולוגיה המושרה על ידי CRISPR/Cas9. למטה: חלקות נקודות מייצגות של תאי K-562 לפני ואחרי האינטגרציה של כתב tdTomato באינטרון הראשון של הגן B2M . קיצורים: HA = זרוע הומולוגיה; HDR = תיקון מכוון הומולוגיה; IRES = אתר כניסה פנימי לריבוזום; pa = BGH poly(A); SA = אתר מקבל splice; WT = סוג פראי; 3XSTOP = שלושה קודוני עצירה במקביל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: בזיהוי סיליקו של gRNA המכוון לאי CpG של הגן B2M , מדורג מבחינת יעילות וספציפיות חזויות. ממשק הפלט של Chopchop המציג gRNA המכוון לאי CpG המשובץ ברצף המקדם של הגן B2M , מדורג הן עבור מספר הרצפים מחוץ למטרה עם 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) או 3 (MM3) אי-התאמות והן עבור היעילות החזויה במטרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: שיבוט ונוקלאופקציה מסודרת של gRNA עבור השתקה אפיגנטית בתיווך dCas9 ETR. למעלה: שיבוט פרוטוספייסר בתיווך אוליגו בפלסמיד U6-gRNA אנושי. למטה: מסך ערוך של gRNA ממוקד B2M להשתקה אפיגנטית מבוססת CRISPR/dCas9 על ידי נוקלאופקציה פלסמידית בתאי K-562B2M/tdTomato . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סינון עבור gRNAs הגורם ביעילות להשתקה ארוכת טווח של הגן B2M. (A) למעלה: סכמות של הגןB2M tdTomato המתוארות באזור המוגדל, הסדר היחסי והכיוון של קשירה של ETR מבוססי dCas9 המורכבים עם gRNAs. למטה: חלקות נקודות מייצגות של תאי B2MtdTomato K-562 לפני (משמאל) או אחרי (מימין) השתקת ETR. ניתוח לאחר 30 יום לאחר הטרנספקציה עם פלסמידים המקודדים עבור gRNA והשילוב המשולש dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L. (B) פעילות השתקה של ה-gRNA המצוין (בבריכות או כ-gRNA בודד) המכוונת לאי ה-CpG B2M (חיצים אדומים בסכמה העליונה מציינים את כיוון ה-gRNAs) בתאיtdTomato K-562 B2M ביום ה-30 לאחר הטרנספקציה. הנתונים מראים את אחוז התאים השליליים tdTomato (ממוצע ± SEM; n = ארבע טרנספקציות עצמאיות עבור כל תנאי טיפול). (C) ניתוח מסלול זמן של תאיB2M tdTomato K-562 בעת טרנספקציה עם פלסמידים המבטאים את שילוב ה-ETR המשולש ואת ה-gRNA ממוקד האי B2M CpG או מדומה (טרנספקציה נטולת gRNA ו-ETR). הנתונים מראים את אחוז התאים השליליים tdTomato (ממוצע ± SEM; n = שלוש טרנספקציות עצמאיות עבור כל תנאי טיפול). נתונים שלא פורסמו. לוחות A ו-B אומצו מ-Amabile et al.30. קיצורים: CGI = אי CpG; IRES = אתר כניסה פנימי לריבוזום; pa = BGH poly(A); SA = אתר מקבל splice; SD = אתר תורם splice; TSS = אתר התחלת תמלול; UT = untransfected; 3XSTOP = 3 קודוני עצירה במקביל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח גנומי רחב של ספציפיות ETR על ידי RNA-seq ועל ידי MeDIP-seq. משמאל: השוואה בין רמות ביטוי בתאי B2MtdTomato K-562 שטופלו בדמה ובתאים שטופלו בשילוב המשולש dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR ועם gRNA המכוון לאי CpG של הגן B2M. הערכים מבוטאים ב- log2 של קריאות לקילו-בסיס למיליון (RPKM) של קריאות ממופות. נקודות שחורות מייצגות גנים המבוטאים ברמות דומות בכל התנאים; עיגולים צהובים מייצגים גנים המווסתים באופן דיפרנציאלי תחת FDR <0.01; עיגול אדום מייצג את תעתיק B2M-IRES-tdTomato. מימין למעלה: עלילת קרקס המציגה פרופילי MeDIP-seq של גנום שלם של תאי B2MtdTomato K-562 שטופלו בדמה (כחול) או תאים שטופלו בשילוב משולש dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR ועם gRNA המכוון לאי CpG (CGI) של הגן B2M (ירוק). מימין למטה: מצב המתילציה של מוקדB2M tdTomato בדגימות שצוינו מוצג. שלושה עותקים משוכפלים מיוצגים בכל ערימה; ערימת הקריאות המיושרות הוחלקה באמצעות חלון גאוסיאני. נתון זה נלקח מתוך Amabile et al.30. קיצור: TSS = אתר התחלת תמלול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
השתקה אפיגנטית ממוקדת עשויה להוות פתרון מבטיח לטיפול בהפרעות שיכולות להפיק תועלת מהשבתה קבועה של גנים, כולל מחלות הנגרמות על ידי מוטציות רווח של תפקוד1, מחלות זיהומיות2, ופתולוגיות שבהן השתקה של גן אחד עשויה לפצות על פגם תורשתי בגן אחר3 או לשחרר את מלוא הפוטנציאל של טיפולים תאיים מאמצים4, 5. על ידי פעולה ברמת הכרומטין והתפשטות אוטומטית על ידי התא 7,30,32, השתקה אפיגנטית יכולה למנוע שינויים רעילים (למשל, סידור מחדש כרומוזומלי) של רצף הדנ"א של גן המטרה והשתקה חלקית וחולפת של המטרה, שהם מגבלות של שיבוש גנטי מלאכותי מבוסס נוקלאז8,34,35 ו knockdown 33 מבוסס RNAi, בהתאמה.
אחד הצעדים המקדימים המרכזיים בכל פרוטוקול השתקה אפיגנטית הוא לזהות את המיקום הנכון על גן המטרה כדי לכוון את ETRs שיפקידו את הסימנים האפיגנטיים המדכאים הדרושים כדי לכבות את פעילות השעתוק של המטרה. אלמנטים רגולטוריים שונים של התחלת שעתוק - פרוקסימליים ודיסטליים עשויים להסכים לתמוך בפלט השעתוק של גן אנושי נתון54. יתר על כן, ניתן לזהות כעת אתרי יעד שונים לכל אלמנט רגולטורי ספציפי הודות למספר ההולך וגדל של טכנולוגיות קישור DNA הניתנות לתכנות6. לכן, פרוטוקולים, כמו זה המתואר כאן בקווי תאים מהונדסים, יכולים לשמש למינוי אתרי מטרה בודדים ו / או אזורים גנומיים המקובלים להשתקה אפיגנטית בתיווך ETR, לפני תחילת מאמצי הערכה מסורבלים וגוזלי זמן של המועמדים הטובים ביותר במסגרת הטיפולית הסופית. כמה היבטים קריטיים של הפרוטוקול מתוארים בהמשך.
הנדסה של קו תא כתב המנבא את המטרה הטיפולית הסופית
למרות האופטימיזציה המתמדת של פרוטוקולי הנדסת התא - הנדרשים כאן כדי להכניס את קידוד הקלטות עבור המדווח הפלואורסצנטי בגן המטרה ולהעביר את ה- ETR - זה לא מובן מאליו שהם עשויים להיות זמינים כבר עבור קו התא הדומה ביותר למטרה הטיפולית הסופית. במקרה זה, ניתן ליישם אסטרטגיות הפחתה שונות: א) ניצול ערכות אופטימיזציה המסופקות על ידי ספקים כדי לייעל בבית את פרוטוקול הטרנספקציה עבור קו תאי היעד; ב) מעבר לקווי תאים אחרים שעדיין מבטאים את גן המטרה אך שייכים לרקמות שאינן המטרה הטיפולית הסופית - שעבורן פרוטוקולים הנדסיים עברו אופטימיזציה נרחבת. במקרה שאפשרויות אלה אינן זמינות, ניתן לשקול מעבר לסוגי תאים ראשוניים או אורגנואידים המייצגים את המטרה הסופית. כשיקול כללי הן למחקרים פרה-קליניים והן ליישומים טיפוליים של השתקה אפיגנטית מבוססת ETR, יש להיפטר מתרחישים שבהם גן המטרה חיוני לסוג תא היעד. השתקה מלאה וארוכת טווח של גן חיוני המוטל על ידי תעודות הסל תוביל לברירה נגדית של תאי המטרה לאורך זמן (ופוטנציאלית, לרעילות הטיפול). טכנולוגיות חלופיות המספקות ביטול מטרה חלקי, כגון RNAi33, עדיפות במקרים אלה.
הערכת פעילות ההשתקה הממוקדת של תעודות הסל
ETRs המבוססים על שילוב של KRAB, DNMT3A ו- DNMT3L הוכיחו את עצמם כיעילים נגד הרוב הגדול של גנים מקודדי חלבונים, עם חלון מיקוד מתירני ארוך של כ -1 קילו במרכזו אתר התחלת השעתוק32. כדי לקבל מושג כיצד נראה ניסוי השתקה אפיגנטי מבוצע היטב, הפרטים הטכניים והתוצאות של השתקת הגן B2M בתאי K-562 מסופקים כאן. זה יכול להיחשב בקרה חיובית חשובה להיכלל לא רק על ידי חוקרים העובדים עם תאי K-562, אלא גם על ידי אלה המתקרבים לטכנולוגיה מבוססת ETR בפעם הראשונה. כפי שצוין בפרוטוקול, שיבוש גנים מבוסס נוקלאז מלאכותי (למשל, CRISPR/Cas9) מומלץ כבקרה נוספת הן על יעילות העברת הגנים בסוג התא המעניין והן על הפנוטיפ של תאים משוללי גן המטרה. לאחר המסך הראשוני של gRNA להיות משולב עם ETR מבוסס CRISPR/dCas9, אם אף אחד gRNA נבדק אינו מסוגל להשתיק לצמיתות את גן המטרה, יש לשקול, בסדר הבא: 1) להגדיל את כמות gRNA ו ETR נמסר; 2) בדיקת מאגרים של ה-gRNA המובילים בחיפוש אחר השפעות סינרגטיות ביניהם. אם עדיין לא הושגה השתקה ארוכת טווח, יש לשקול: 3) בדיקת gRNA נוספים, שעשויים להתמקד באתרים רלוונטיים יותר להורות על השתקה אפיגנטית; 4) מעבר לפלטפורמות DBD מבוססות ZFP8 או TALE9, אשר עשויות להיות בעלות יכולת קשירה משופרת לכרומטין-המטרה; 5) מעבר מארעי ליציב - לדוגמה, שילוב ביטוי וקטורי נגיפי של ETR (מבני ההיתוך gRNA או dCas9 או שניהם בעת אימוץ טכנולוגיית CRISPR/dCas9). מכיוון שהקבוצה שלנו פיתחה, ויש לנו ניסיון רב עם, המסירה המשותפת של שלושת ETR30 הנפרדים, הפרוטוקול והתוצאות המוצגים כאן מבוססים על גישה זו. עם זאת, זרימת עבודה קונספטואלית דומה עשויה להיות מיושמת עבור מערכת All-in-One מבוססת CRISPR32.
הערכת הפעילות מחוץ למטרה של תעודות הסל
מחקרים רבים הראו אינדיקציות ראשוניות במבחנה של הספציפיות של ETR בהתבסס על השילוב של KRAB, DNMT3A ו- DNMT3L תחומי אפקט30,31,32. עם זאת, אם מבין ה-gRNA שנבדקו, אף אחד מהם לא מראה פרופיל ספציפיות משביע רצון במונחים של ויסות שעתוק ו/או מתילציה של דנ"א דה נובו, ניתן לנקוט בשתי אסטרטגיות שאינן סותרות זו את זו: א) הפחתת זמן השהייה של ה-ETR בתוך התא (וכתוצאה מכך הפעילות הפוטנציאלית שלהם מחוץ למטרה) על ידי הפחתת המינונים של ETR או בדיקת מערכות אספקה חלופיות. לדוגמה, בהשוואה לפלסמידים, הן mRNA והן אספקת חלבונים צפויים להפחית את זמן החשיפה התאית ל-ETRs, וכתוצאה מכך, את הסבירות לפעילות מחוץ למטרה55; ב) מעבר לגרסאות Cas9 עדכניות יותר, המותאמות להפחתת הקישור מחוץ למטרה של פלטפורמת56, או לטכנולוגיות קשירת DNA חלופיות מבוססות ZFP8 או TALE9. חשוב לקחת בחשבון כי בהשוואה לדגימות שטופלו במדומה, הפעילות על המטרה ומחוץ למטרה של השתקת גנים מושפעות לא רק מהקישור של DBD לרצף המטרה שלהם, אלא גם מהיכולת הפוטנציאלית של תחומי ההשפעה האפיגנטית להיות מגויסים לאתרים אחרים על ידי הגורמים המשותפים הטבעיים והאנדוגניים שלהם. לכן, קיצור זמן השהייה של ה-ETR בתא היעד עשוי להקטין לא רק את הסבירות לקשירת ה-DBD לאתרים מחוץ ליעד, אלא גם את הסבירות של ה-ETR לקיים אינטראקציה עם גורמים משלימים אנדוגניים, עם יתרונות פוטנציאליים במונחים של ספציפיות וחסרונות במונחים של פעילות על המטרה. לבסוף, בהשוואה לדגימות שטופלו בדמה, חלק משינויי המתילציה של CpG השעתוק והפחות סבירים שנמדדו בתאים מושתקים יכולים פשוט להיגזר על ידי שלילת גן המטרה. אלה אינם נחשבים מחוץ למטרות של טכנולוגיית ההשתקה. כדי לזהות אותם, יש לכלול גם שיבוש גנים על ידי נוקלאז מלאכותי בלוח הניסוי 8,9,10. שינויים ביולוגיים עקב אובדן תפקודי של גן המטרה יתחלקו בין השתקה אפיגנטית לבין טכנולוגיה חלופית זו.
Disclosures
AL היא מייסדת שותפה, בעלת מכסה ויועצת של Chroma Medicine, Inc. .
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לאנג'לו אמבילה, פאולה קאפאסו, אילריה קסרטה, טניה באצ'גה, אליס רשיניה, ולריה מוליקה ודבורה צ'יפריה על המאמץ המשותף בפיתוח טכנולוגיית ההשתקה האפיגנטית לאורך השנים; דז'אן לזרביץ' ופרנצ'סקה ג'יאנזה לסקירה ביקורתית של ניתוחי RNA-seq ו-MeDIP-seq המתוארים בפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל- A.L. מקרן Telethon (מענק TIGET מס 'F1) ותוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי (UPGRADE). האיורים נוצרו עם BioRender.com.
תרומת המחברים
A.M, M.A.C., F.G. ו-A.C. תרמו לעיצוב הפרוטוקול ולכתיבת כתב היד; S.V., I.M. ו-D.C. עיצבו את מדורי הביואינפורמטיקה של הפרוטוקול ותיקנו את כתב היד; א.מ. וא.ל. עיצבו את הפרוטוקול, הגו וכתבו את כתב היד עם קלט מכל המחברים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
| 4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
| B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
| B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
| B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
| BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
| bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
| bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
| Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
| Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
| cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
| CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
| CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
| CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
| Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
| E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
| edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
| EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
| Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
| Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
| Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
| gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
| hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
| High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
| High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
| IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
| K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
| KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
| MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
| MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
| NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
| NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
| One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
| pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
| pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
| pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
| pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
| phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
| PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
| Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
| Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
| Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
| Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
| Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
| Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
| SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
| SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
| STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
| T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
| TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
| TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |
References
- Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics. 9 (6), 909-916 (2000).
- Tebas, P., et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. The New England Journal of Medicine. 370 (10), 901-910 (2014).
- Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
- Murty, T., Gene Mackall, C. L. Gene editing to enhance the efficacy of cancer cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3153-3162 (2021).
- Lanza, R., Russell, D. W., Nagy, A. Engineering universal cells that evade immune detection. Nature Reviews Immunology. 19 (12), 723-733 (2019).
- Matharu, N., Ahituv, N. Modulating gene regulation to treat genetic disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (11), 757-775 (2020).
- Sgro, A., Blancafort, P. Epigenome engineering: New technologies for precision medicine. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12453-12482 (2020).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
- Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Gilbert, L. A., et al. XCRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442 (2013).
- Snowden, A. W., Gregory, P. D., Case, C. C., Pabo, C. O. Gene-specific targeting of H3K9 methylation is sufficient for initiating repression in vivo. Current Biology. 12 (24), 2159-2166 (2002).
- Chen, X., et al. Construction and validation of the CRISPR/dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification. Biochemical and Biophysical Research Communications. 511 (2), 246-252 (2019).
- Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature Communications. 8, 15215 (2017).
- Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
- Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D.
- Witzgall, R., O'leary, E., Leaf, A., Onaldi, D., Bonventre, J. The Kruppel-associated box-A (KRAB-A) domain of zinc finger proteins mediates transcriptional repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (10), 4514-4518 (1994).
- Mannini, R., et al. Structure/function of KRAB repression domains: Structural properties of KRAB modules inferred from hydrodynamic, circular dichroism, and FTIR spectroscopic analyses. Proteins: Structure, Function and Genetics. 62 (3), 604-616 (2006).
- Friedman, J. R., et al. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes and Development. 10 (16), 2067-2078 (1996).
- Iyengar, S., Farnham, P. J. KAP1 protein: An enigmatic master regulator of the genome. The Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26267-26276 (2011).
- Schultz, D. C., Friedman, J. R., Rauscher, F. J. Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2α subunit of NuRD. Genes and Development. 15 (4), 428-443 (2001).
- Schultz, D. C., Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G. G., Rauscher, F. J. SETDB1: A novel KAP-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1-mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes and Development. 16 (8), 919-932 (2002).
- Nielsen, A. L., et al. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. The EMBO Journal. 18 (22), 6385-6395 (1999).
- Sripathy, S. P., Stevens, J., Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 26 (22), 8623-8638 (2006).
- Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. ChemBioChem. 12 (2), 206-222 (2011).
- Jia, D., Jurkowska, R. Z., Zhang, X., Jeltsch, A., Cheng, X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449 (7159), 248-251 (2007).
- Tajima, S., Suetake, I., Takeshita, K., Nakagawa, A., Kimura, H. Domain structure of the Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 945, 63-86 (2016).
- Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
- Ishiyama, S., et al. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenance. Molecular Cell. 68 (2), 350.e7-360.e7 (2017).
- Amabile, A., et al. Inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-run targeted epigenetic editing. Cell. 167 (1), 219.e14-232.e14 (2016).
- Mlambo, T., et al. Designer epigenome modifiers enable robust and sustained gene silencing in clinically relevant human cells. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4456-4468 (2018).
- Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503.e17-2519.e17 (2021).
- Davidson, B. L., McCray, P. B. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 329-340 (2011).
- Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine. 24 (7), 927-930 (2018).
- Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
- Uhlén, M., et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), (2015).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (W1), W171-W174 (2019).
- Kent, W. J., et al. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Research. 41 (10), e108-e108 (2013).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. GenomeBiology. 17, 13 (2016).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
- Zhang, Y., et al.
- Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 47, (2014).
- Hansen, K. D., Irizarry, R. A., Wu, Z. Removing technical variability in RNA-seq data using conditional quantile normalization. Biostatistics. 13 (2), 204-216 (2012).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Zeitler, B., et al. Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington's disease. Nature Medicine. 25 (7), 1131-1142 (2019).
- Andersson, R., Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nature Reviews Genetics. 21 (2), 71-87 (2020).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Han, H. A., Pang, J. K. S., Soh, B. -S. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. Journal of Molecular Medicine. 98 (5), 615-632 (2020).
