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Bioengineering

In vitro Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64403
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 2, 1,4
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la selección in vitro de represores transcripcionales (ETR) diseñados con una alta eficiencia de silenciamiento estable, estable y a largo plazo y una baja actividad fuera del objetivo en todo el genoma. Este flujo de trabajo permite reducir un repertorio inicial y complejo de ETR candidatos a una lista corta, adecuada para una evaluación posterior en entornos terapéuticamente relevantes.

Abstract

La inactivación génica es fundamental para estudiar la función de los genes y representa una estrategia prometedora para el tratamiento de una amplia gama de enfermedades. Entre las tecnologías tradicionales, la interferencia de ARN sufre la abrogación parcial de la diana y la necesidad de tratamientos de por vida. Por el contrario, las nucleasas artificiales pueden imponer una inactivación génica estable a través de la inducción de una rotura de doble cadena de ADN (DSB), pero estudios recientes cuestionan la seguridad de este enfoque. La edición epigenética dirigida a través de represores transcripcionales (ETR) diseñados puede representar una solución, ya que una sola administración de combinaciones específicas de ETR puede conducir a un silenciamiento duradero sin inducir roturas de ADN.

Las ETR son proteínas que contienen un dominio de unión al ADN (DBD) programable y efectores de represores transcripcionales naturales. Específicamente, se demostró que una combinación de tres ETR equipadas con el dominio KRAB de ZNF10 humano, el dominio catalítico de DNMT3A humano y DNMT3L humano, induce estados epigenéticos represivos hereditarios en el gen ETR-diana. La naturaleza de atropello y fuga de esta plataforma, la falta de impacto en la secuencia de ADN del objetivo y la posibilidad de volver al estado represivo mediante la desmetilación del ADN a pedido, hacen que el silenciamiento epigenético sea una herramienta que cambia las reglas del juego. Un paso crítico es la identificación de la posición adecuada de los ETR en el gen diana para maximizar el silenciamiento en el objetivo y minimizar el silenciamiento fuera del objetivo. Realizar este paso en el entorno preclínico final ex vivo o in vivo puede ser engorroso.

Tomando el sistema CRISPR/Cas9 catalíticamente muerto como un DBD paradigmático para ETRs, este artículo describe un protocolo que consiste en el cribado in vitro de ARNs guía (ARNg) acoplado a la combinación de triple ETR para un silenciamiento eficiente en el objetivo, seguido de la evaluación del perfil de especificidad de todo el genoma de los principales aciertos. Esto permite reducir el repertorio inicial de ARNg candidatos a una lista corta de prometedores, cuya complejidad es adecuada para su evaluación final en el entorno de interés terapéuticamente relevante.

Introduction

La inactivación génica ha desempeñado tradicionalmente un papel clave en el estudio de la función génica tanto en modelos celulares como animales. Además, en las últimas dos décadas, con el auge de la terapia génica, se ha propuesto como un enfoque potencialmente revolucionario para tratar enfermedades causadas por mutaciones de ganancia de función1, enfermedades infecciosas2 o patologías en las que el silenciamiento de un gen puede compensar un defecto hereditario en otro3. Por último, se ha propuesto la inactivación genética de reguladores clave de la aptitud celular y el control funcional para mejorar la eficiencia de los productos celulares para la inmunoterapia contra el cáncer4 y la medicina regenerativa5.

Entre las diferentes tecnologías para lograr la inactivación génica, una de las más prometedoras es el silenciamiento epigenético dirigido 6,7. En el núcleo de esta tecnología se encuentran los llamados represores transcripcionales de ingeniería (ETR), proteínas quiméricas que consisten en un dominio de unión al ADN (DBD) programable y un dominio efector (ED) con función represiva epigenética. Las proteínas dedo de zinc (ZFP)8, los efectores similares a los activadores de transcripción (TALE)9 o los DBD basados en CRISPR/dCas910 pueden diseñarse para vincular selectivamente la DE a la secuencia promotora/potenciadora del gen diana que se va a silenciar. Una vez allí, el DE de la ETR realiza su actividad silenciadora mediante la imposición de marcas epigenéticas represivas inductoras de heterocromatina como las modificaciones de histonas (metilación H3K9 11,12 o H3K27 13, desacetilación H3 o H4 14) y la metilación del ADN CpG 15, según el dominio represivo utilizado.

En particular, inspirándose en los procesos moleculares de represión transcripcional permanente de retrovirus endógenos que ocurren en el embrión preimplantacional16, se ha generado una combinación de tres ETR para explotar los siguientes DE: i) el dominio de la caja asociada a Krüppel (KRAB) del ZNF10 humano; ii) el dominio catalítico de la ADN metiltransferasa 3A humana de novo (DNMT3A); y iii) la metiltransferasa 3-similar a la ADN humana de longitud completa (DNMT3L). KRAB es un dominio represivo conservado compartido por varias ZFP en vertebrados superiores17,18, cuya actividad silenciadora se basa principalmente en su capacidad para reclutar KAP1 19-una proteína de andamio que luego interactúa con varios otros inductores de heterocromatina20 que comprenden el complejo de remodelación y desacetilación de nucleosomas (NuRD) 21, la histona metiltransferasa H3K9 SETDB122 y el lector de metilación H3K9 HP1 23, 24, entre otros.

DNMT3A transfiere activamente grupos metilo en el ADN en las secuencias CpG25. La actividad catalítica de DNMT3A se ve reforzada por su asociación física con DNMT3L, un parálogo de DNMT3A restringido a embriones y células germinales que carece del dominio catalítico responsable de la transferencia del grupo metilo26,27. La metilación del ADN en las regiones ricas en CpG, denominadas islas CpG (CGI), incrustadas en los elementos promotores/potenciadores de los genes de los mamíferos, generalmente se asocia con el silenciamiento de la transcripción28. Es importante destacar que, una vez depositada, la metilación de CpG puede heredarse de manera estable a lo largo de la mitosis mediante un complejo molecular basado en UHRF1-DNMT129.

La sobreexpresión estable de las ETR en la célula diana puede ser problemática, probablemente debido a los crecientes riesgos de actividad fuera de la diana y a la supresión de los interactores endógenos de sus sitios diana fisiológicos a lo largo del tiempo. Sin embargo, la expresión transitoria de fracciones de una sola ETR puede no inducir el silenciamiento a largo plazo con alta eficiencia30, lo que dificulta su aplicación terapéutica. Por lo tanto, un avance seminal en el campo fue la evidencia de que la combinación de los tres ETR basados en KRAB, DNMT3A y DNMT3L puede sinergizar e, incluso cuando solo se administra de forma transitoria, imponer a la secuencia promotora del gen diana H3K9 y la metilación de CpG. A continuación, la célula los lee y propaga a lo largo de la mitosis, lo que conduce a un silenciamiento hereditario en múltiples líneas celulares humanas y murinas, así como en células primarias cultivadas ex vivo 30.

Cabe destacar que el silenciamiento epigenético impuesto por los ETR puede revertirse a demanda mediante la desmetilación del ADN30 dirigida (por ejemplo, el reclutamiento de la ADN desmetilasa TET1 basada en CRISPR/dCas9 en el locus silenciado) o farmacológica (administración del inhibidor de la metiltransferasa 5-Aza) del ADN, un antídoto potencial en caso de eventos adversos relacionados con ETR. También se describieron ETRs todo en uno que llevan los tres DE basados en KRAB, DNMT3A y DNMT3L, mostrando eficiencias de silenciamiento significativas en las líneas celulares31,32 contra la gran mayoría de los genes codificadores de proteínas. Además, varios estudios que emplearon los ETR reportaron un alto perfil de seguridad, sin actividad significativa fuera del objetivo en términos de metilación de novo de CpG o alteración de la accesibilidad de la cromatina30,31,32. Sin embargo, se recomienda un análisis específico del perfil de especificidad de los ETR equipados con un DBD de nuevo diseño antes de las aplicaciones clínicas.

Desde una perspectiva clínica, el silenciamiento epigenético dirigido puede proporcionar ventajas críticas tanto para el knockdown basado en ARN de interferencia (ARNi)33 como para la disrupción génica artificial basada en nucleasas8. A diferencia del ARNi, el silenciamiento epigenético dirigido puede inducir la abrogación completa de su diana por célula y no requiere tratamiento periódico para garantizar el silenciamiento a largo plazo; a diferencia de la disrupción génica, deja la secuencia de ADN inalterada, evitando la generación de roturas de doble cadena de ADN (DSB). Los DSB pueden entonces inducir la apoptosis y la detención del ciclo celular, lo que podría conducir a una selección contra células con una vía p53 funcional 34,35 y, especialmente en entornos de edición de genes multiplex, reordenamientos cromosómicos35. Además, al transmitir el resultado irreversible en mosaico de la reparación DSB36 del ADN mediada por la unión de extremos no homólogos, la disrupción génica no puede evitar la reparación en el marco de la diana en secuencias codificantes funcionales como uno de los resultados finales y, a diferencia del silenciamiento epigenético, no puede borrarse a demanda.

Por último, el silenciamiento epigenético tiene el potencial de ampliar la gama de elementos genéticos diana a clases total o al menos parcialmente refractarias al ARNi y a la disrupción génica, como los elementos reguladores no transcritos y los ARN no codificantes30,32. El primer paso crítico para cualquier aplicación de silenciamiento epigenético dirigido es diseñar un panel de ETRs que cubra las diferentes secuencias reguladoras del gen diana e identificar las de mejor rendimiento. El número de ETR que se van a probar puede ser crucial, teniendo en cuenta la creciente porción del genoma que puede ser objeto de las tecnologías programables de unión al ADN en constante desarrollo37. Realizar el cribado de las ETRs directamente sobre el tipo celular en el que silenciar terapéuticamente el gen diana representaría la opción más relevante. Sin embargo, los cribados de alto rendimiento pueden ser técnicamente engorrosos en las células primarias debido a su supervivencia limitada en cultivo y a su capacidad de ingeniería, a menudo subóptima. Las pantallas a gran escala pueden ser aún más inviables in vivo.

Una alternativa más práctica consiste en realizar un cribado inicial de un gran panel de ETRs en líneas celulares fácilmente modificables al principio, y luego validar solo las más prometedoras en el tipo de célula terapéuticamente relevante. Un problema paralelo es la selección de una lectura apropiada para medir la eficiencia de silenciamiento de los ETR. La evaluación directa de la transcripción o de los niveles de proteínas del gen diana mediante RT-qPCR, Western blot o ELISA puede ser costosa y llevar mucho tiempo, y puede carecer de suficiente sensibilidad, lo que limita su aplicación a escalas de alto rendimiento. La generación de líneas celulares reporteras de ingeniería ad hoc en las que un fluoróforo se coloca bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras del gen diana permite la explotación del enfoque basado en citometría de flujo para leer el silenciamiento epigenético a nivel de una sola célula y a un ritmo de alto rendimiento.

Siguiendo estas consideraciones generales, este artículo describe un protocolo que consiste en el cribado in vitro de ETRs para la eficiencia del silenciamiento en el objetivo, seguido de la evaluación de la actividad fuera del objetivo en todo el genoma de los principales aciertos. Este flujo de trabajo permite reducir el repertorio inicial de ETRs candidatas a una lista corta de prometedoras, cuya complejidad es adecuada para su evaluación final en el tipo de célula terapéuticamente relevante de interés.

Entre los diferentes DBDs programables que pueden ser explotados para generar ETRs, este protocolo se centrará en la tecnología basada en CRISPR/dCas9, debido a la facilidad de diseñar gRNAs que abarcan el promotor del gen diana a una escala de alto rendimiento. Sin embargo, se puede adoptar el mismo flujo de trabajo conceptual que se describe a continuación para evaluar la eficiencia y la especificidad de los ETR equipados con otros DBD.

Protocol

1. Ingeniería de una línea celular reportera basada en fluorescencia para monitorizar la actividad transcripcional del gen diana mediante citometría de flujo

  1. Identificar líneas celulares que expresan el gen diana que se va a silenciar. Examine el gen diana que se va a silenciar en el Atlas de Proteínas Humanas38 y navegue por su sección "Línea celular" para identificar aquellas líneas representativas del tejido somático de interés (por ejemplo, una línea celular hepática si las dianas finales son hepatocitos hepáticos). Alternativamente, consulte una base de datos de secuenciación de ARN (RNA-Seq) disponible públicamente (p. ej., NCBI GEO).
  2. Entre los candidatos, priorizar las líneas celulares para las que se dispone de protocolos eficientes de administración de genes transitorios, fundamentales para la administración de ETR.
    NOTA: Entre las diferentes modalidades, la nucleofección representa una de las mejores opciones, ya que asegura altas eficiencias de transfección. En este caso, se han elegido células K-562 de eritroucemielia humana para generar una línea celular que informe de la actividad transcripcional del gen beta-2-microglobulina (B2M) (en adelante, célulasB2M TdTomato K-562).
  3. Priorizar aún más los candidatos para evitar líneas celulares en las que el gen diana es esencial para la viabilidad celular, ya que esto perjudica el mantenimiento de las células con un silenciamiento estable del gen diana en cultivo. Si no se ha informado previamente, para tener una idea de la esencialidad del gen diana en el tipo de célula de elección, genere un control de la disrupción genética mediante la transfección de las células con la nucleasa Cas9 y un ARNg dirigido a uno de los primeros exones codificantes del gen.
    NOTA: La disrupción genética es un evento estable por definición; La contraselección de células alteradas a lo largo del tiempo indica que el gen diana es esencial para la fisiología de la célula seleccionada.
    1. Identifique la isoforma de empalme diana utilizada preferentemente en la línea celular seleccionada (la isoforma NM_004048.4 del gen B2M es el objetivo de este protocolo).
    2. Identificar un ARNg que pueda cortar de manera efectiva y específica en el primer exón codificante de la isoforma diana (p. ej., Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, que es una herramienta de selección de ARNg en línea válida y fácil de usar).
    3. En el caso de las células K-562, transfecte 1 μg de plásmido codificante de spCas9 (hCas9; ver Tabla de Materiales) y 250 ng de plásmido que codifica ARNg (pHU6-ARNg; ver Tabla de Materiales) por 5 × 105 células a través de nucleofección (de acuerdo con las instrucciones del fabricante).
    4. Cultivar las células (células K-562 a 37 °C bajo 5% de CO2 en RPMI-1640 suplementadas con suero fetal bovino [FBS] al 10%, L-glutamina y penicilina/estreptomicina [100 U/mL]) y monitorizar los niveles de alteración génica a lo largo del tiempo mediante la explotación de un kit de detección de mutaciones (seguir las instrucciones del fabricante).
  4. Clonar una plantilla donante para la integración mediada por recombinación homóloga de un reportero fluorescente bajo el control transcripcional del gen diana de interés (Figura 1).
    1. Identificar la región del gen diana para integrar el casete de expresión de fluoróforos.
      NOTA: Evite apuntar a elementos transcripcionalmente relevantes, como islas CpG y regiones enriquecidas para la acetilación de H3K27 (marcador de promotores y potenciadores activos). La alteración de estos elementos reguladores (potencialmente importantes para ser atacados por los ETRs para instruir el silenciamiento epigenético) hace que la línea celular reportera sea menos predictiva de la regulación fisiológica del gen diana.
      1. Si el gen diana no codifica para una proteína secretada, fusione el reportero con el último codón del gen diana a través de un péptido autoescindido 2A para mantener la funcionalidad del gen diana.
      2. Si el gen diana codifica una proteína secretada, para evitar la secreción potencial del reportero, coloque el reportero en una región intrónica del gen diana. La integración forzada del reportero en la transcripción empalmada a través de un sitio aceptor de empalme (SA) y la posterior traducción a través de una secuencia de entrada de ribosoma interno (IRES) perjudica la funcionalidad del gen diana.
    2. Utilice Chopchop para seleccionar el corte de ARNg en la región diana (en este caso, se selecciona un ARNg para dirigirse a la secuencia 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ del primer intrón del gen B2M ).
    3. Diseñar una plantilla de donante para el sitio de corte del ARNg que consista en: i) un brazo de homología izquierdo (n pares de bases [pb] que coincidan con la región justo aguas arriba del sitio de corte del ARNg); ii) un casete de expresión transgénica libre de promotor (en el caso que aquí se muestra, un SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly(A) que favorece el empalme con el primer intrón del gen B2M ); y iii) un brazo de homología derecho (n pb que coincide con la región aguas abajo del sitio de corte del ARNg).
      NOTA: La longitud de los brazos de homología necesarios para inducir eficazmente la recombinación homóloga puede variar entre los diferentes tipos de células (100-500 pb es un rango adecuado para las células K-562).
  5. Administre el sistema de nucleasas CRISPR/Cas9 y la plantilla donante dentro de la línea celular diana. En el caso de las células K-562, transfectar 1 μg de plásmido codificante de spCas9 (hCas9; ver Tabla de Materiales), 250 ng de plásmido que codifica el ARNg (phU6-ARNg; ver Tabla de Materiales) y 1 μg de plásmido codificante de plantilla donante por cada 5 × 105 células a través de la nucleofección (de acuerdo con las instrucciones del fabricante).
  6. Cultive las células durante al menos 14 días (para células K-562) y controle los niveles de expresión del indicador fluorescente a lo largo del tiempo utilizando un citómetro de flujo (active el canal de ficoeritrina (PE) para medir la intensidad de fluorescencia del indicador tdTomato y siga las instrucciones del fabricante para realizar la citometría de flujo).
    NOTA: La plantilla del donante, especialmente si está basada en plásmidos, puede contener secuencias promotoras crípticas, lo que conduce a la expresión del reportero fluorescente a partir de copias del donante no integradas. El cultivo de las células permite diluir estas copias no integradas por división celular y, finalmente, mantener la expresión del reportero solo a partir de las copias del donante integradas en el genoma diana.
  7. Clon células reporteras positivas a través de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) a nivel de una sola célula. Para este protocolo, active el canal PE para medir la intensidad de fluorescencia del reportero tdTomato y siga las instrucciones del fabricante para clasificar las células K-562 positivas para tdTomato individuales por pocillo de una placa de 96 pocillos.
  8. Tras la expansión celular en cultivo (normalmente de 20 a 30 días para las células K-562), se examinan los clones positivos para reporteros mediante PCR para seleccionar uno que lleve una integración bialélica del casete indicador dentro del locus diana.
    NOTA: Esto maximiza la expresión del reportero y facilita una mayor resolución entre las células que expresan el reportero y las que silencian el reportero mediante citometría de flujo tras el tratamiento con ETR.
    1. Extraiga ADN genómico de 1 × 105 células por clon reportero positivo utilizando un kit de extracción de ADN (siguiendo las instrucciones del fabricante).
    2. Amplifique la región diana B2M con cebadores directos (5'-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3') e inversos (5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') siguiendo las instrucciones del kit de amplificación de PCR. La temperatura de recocido para este par de cebadores es de 47,7 °C con ADN polimerasas basadas en Taq y concentraciones de cebadores de 0,5 μM.
    3. Analice el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% (siguiendo las instrucciones del fabricante). Cribado de clones que muestra la banda relacionada con la integración del tdTomato en el locus diana B2M (3.413 pb), sin la banda relacionada con el locus diana de tipo salvaje (1.027 pb).

2. Diseño de ARNg para el silenciamiento epigenético del gen diana basado en CRISPR/dCas 9

  1. Examine el gen diana en el navegador del genoma40 de la UCSC y extraiga la secuencia de nucleótidos de las regiones que potencialmente regulan su actividad transcripcional, como las islas CpG y los sitios enriquecidos para la acetilación de H3K27 (marcador de promotores y potenciadores activos).
    NOTA: De acuerdo con un estudio reciente, la mejor región objetivo es una ventana de 1 kilobase (kb) centrada en el sitio de inicio de la transcripción del gen diana32.
  2. Pegue las secuencias seleccionadas en la herramienta en línea Chopchop y seleccione la represión como el propósito de los ARNg que se recuperarán. Espere a que Chopchop proporcione una lista de ARNg mapeados en la secuencia genética de interés y enumerados de acuerdo con una puntuación que tenga en cuenta tanto el número de coincidencias fuera del objetivo como la eficiencia prevista en el objetivo (Figura 2).
  3. Seleccione al menos 10 gRNAs por secuencia diana. Si es posible, intente seleccionar ARNg que abarquen toda la región para ser interrogados, sin coincidencias completas con otras secuencias intragénicas en todo el genoma.

3. Entrega transitoria matricada de ETR basadas en CRISPR/dCas 9 en la línea celular reportera

  1. Entre los sistemas de administración de transgenes informados anteriormente para la línea celular diana, elija aquellos que permitan solo la expresión transitoria del transgén, maximizando la eficiencia de la administración y minimizando la toxicidad relacionada con la manipulación celular. En el caso de las células K-562, se recomienda encarecidamente la nucleofección tanto de plásmidos como de ARNm, ya que la producción de plásmidos representa una alternativa técnicamente más fácil y barata.
  2. Clone tanto los ARNg seleccionados en la sección 2 como los ETR basados en CRISPR/dCas9 en el sistema de administración de transgenes de elección. Consulte los siguientes pasos para obtener un protocolo para clonar los ETR en ADN plasmídico.
    NOTA: Los plásmidos que codifican por separado para dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A y dCas9:DNMT3L30 no están disponibles en Addgene. Se clonaron reemplazando el transactivador VP160 del plásmido pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (ver Tabla de materiales) con la secuencia codificante de dominio KRAB, DNMT3A o DNMT3L30. Se dispone de un plásmido que codifica para un ETR todo en uno, denominado CRISPRoff-v2.132 (véase la Tabla de Materiales).
    1. Transformar plásmidos que codifican para los ETR en células de E. coli químicamente competentes (siguiendo las instrucciones del fabricante). Examinar las colonias para detectar la presencia del plásmido portador de ETR mediante la digestión de la enzima de restricción y la secuenciación de Sanger, y finalmente elegir una de las colonias positivas para la producción de Midiprep de ADN plasmídico (siguiendo las instrucciones del fabricante).
    2. Clone los ARNg dentro de la columna vertebral del ARNg-phU6 (Figura 3).
      1. Utilizando un software de diseño de biología molecular, agregue una secuencia 5'-CACCG-3' aguas arriba del protoespaciador (los primeros 20 nucleótidos variables [nt] del ARNg seleccionado) para generar un oligonucleótido in silico de 25 nt de largo, denominado SGfw.
      2. De manera similar, agregue una secuencia 5'-AAAC-3' aguas arriba del complemento inverso del protoespaciador del ARNg seleccionado y una secuencia 5'-C-3' aguas abajo del mismo para generar un oligonucleótido de 25 nt de largo denominado SGrv.
      3. Ordene las secuencias SGfw y SGrv como oligonucleótidos de ADN monocatenario sin sal, resuspendidos en agua a 100 μM.
      4. Añadir 1 μL de cada oligo a 2 μL de tampón de recocido (10 mM de Tris [pH 7,5-8,0], 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA) y 16 μL de agua.
      5. Realice el recocido de oligonucleótidos colocando la solución en un termociclador programado para arrancar a 95 °C durante 10 min. A continuación, enfríe gradualmente a 25 °C durante 45 min.
      6. Diluir 1 μL de los oligonucleótidos recocidos con 99 μL de agua libre de nucleasa, y luego ligar 1 μL de esta dilución con 50 ng de plásmido phU6-gRNA previamente digerido con la enzima de restricción BsaI (siga las instrucciones de los proveedores de kits de BsaI y ligasa para el procedimiento de digestión y ligadura).
      7. Transformar 20 μL de células de E. coli químicamente competentes con 2 μL del producto de ligadura (siga las instrucciones del fabricante para el procedimiento de transformación).
      8. Elija varias colonias para la producción de ADN plasmídico Miniprep (siga las instrucciones del proveedor) y controle la clonación exitosa del protoespaciador mediante secuenciación de Sanger con el siguiente cebador que coincida con el promotor U6 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'.
      9. Elija una de las colonias positivas para la producción de Midiprep de ADN plasmídico (siguiendo las instrucciones del fabricante).
  3. Administre los ARNg seleccionados y los ETR basados en CRISPR/dCas9 en la línea celular reportera en matriz (un ARNg específico por afección) (Figura 3).
    NOTA: Como caso representativo, el flujo de trabajo para la nucleofección de plásmidos que codifican para dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L y gRNAs dirigidos a la isla B2M CpG en célulasB2M TdTomato K-562 se muestra en los siguientes pasos.
    1. Prepare tubos separados que contengan 500 ng de cada uno de los plásmidos que codifican dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- y dCas9:DNMT3L, pero que difieren para el ARNg que se va a analizar (125 ng de un plásmido que codifica ARNg por tubo). Incluya una condición de nucleofección libre de ARNg y ETR como muestra tratada simuladamente. Realice el cribado con al menos tres réplicas técnicas por muestra.
    2. Pellet 5 × 105 célulasB2M TdTomato K-562 por tubo y nucleofectarlas con la mezcla de plásmidos (siguiendo las instrucciones del fabricante).
    3. Resuspenda las células en 200 μL de medio de cultivo de células de mamíferos RPMI-1640 previamente calentado y vuelva a colocarlas en la incubadora.

4. Análisis de la actividad transcripcional del gen diana a lo largo del tiempo

  1. Utilice la citometría de flujo para medir el porcentaje de células silenciadas en diferentes momentos después de la administración de las ETR (Figura 4). Utilice células de tipo salvaje (WT), que no llevan la secuencia codificante de fluoróforos, para establecer el umbral de células reporteras negativas. Utilice la muestra tratada simuladamente para establecer la puerta para las células reporteras positivas.
    NOTA: Como se sugiere en el paso 1.3, incluya un control de alteración genética en el experimento. Esto puede ser útil tanto para monitorizar la eficiencia de la entrega de CRISPR como la aptitud de las células privadas del gen diana; La pérdida tanto del silenciamiento transcripcional como de la disrupción genética a lo largo del tiempo puede atribuirse a la esencialidad del gen diana en el tipo de célula de elección. Incluya puntos de tiempo a corto (día 3, día 7, día 10) y a largo plazo (día 21, día 35) para obtener una indicación de la eficiencia aguda y a largo plazo del silenciamiento.
  2. Identificar los tres principales ARNg en términos de eficiencia de silenciamiento a largo plazo. Utilice FACS para seleccionar la subpoblación reportante-negativa mantenida de forma estable en esas muestras. Además, realice FACS de las muestras a granel tratadas simuladas para mantenerlas bajo el mismo tratamiento que las muestras de prueba para permitir una comparación adecuada en los análisis posteriores.

5. Evaluación de la especificidad del tratamiento con ETR mediante RNA-seq e inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP)-seq

  1. Utilice RNA-seq para evaluar cualquier eventual desregulación transcripcional de todo el genoma tras la administración de ETR.
    1. Tanto para la subpoblación silenciada por reporteros de las muestras tratadas con los tres ARNg de mayor rendimiento como para las células tratadas simuladamente, extraiga el ARN utilizando kits disponibles comercialmente. Evaluar la calidad y la concentración del ARN mediante el uso de kits disponibles en el mercado.
    2. Realice la fragmentación de ARN, la retrotranscripción y la preparación de bibliotecas utilizando kits disponibles comercialmente para la preparación de bibliotecas de secuenciación de ARN (siguiendo las instrucciones del fabricante).
    3. Realice la cuantificación de bibliotecas y el control de calidad utilizando instrumentos de control de calidad compatibles con la secuenciación de próxima generación y la electroforesis digital.
    4. Bibliotecas de secuencias en un secuenciador de última generación siguiendo las instrucciones del fabricante, con un protocolo de extremo emparejado de 100 pb y con un objetivo medio de 45 M de lecturas/muestra.
    5. Alinee las etiquetas de lectura con el genoma de referencia adecuado y cuantifique la expresión de la transcripción. Realice la alineación en la secuencia tdTomato y cuantififíquela por separado.
      NOTA: En este caso, se utiliza el alineador STAR (v 2.3.0)43, con los parámetros predeterminados, acoplado al paquete Rsubread44.
    6. Realizar análisis de los datos de RNA-seq de acuerdo con las mejores prácticas publicadas45.
      NOTA: Aquí se utiliza el paquete R/Bioconductor edgeR46, aplicando un filtro de al menos un recuento por millón (cpm) en al menos tres muestras para descartar los genes de baja expresión. Alternativamente, se puede usar la función filterByExpr en edgeR.
    7. Evaluar la expresión génica diferencial utilizando un modelo log-lineal generalizado binomial negativo implementado edgeR (función glmFit)47. Establecer un umbral de 0,01 en los valores de p ajustados (corrección de Benjamini-Hochberg [BH]) para retener genes regulados diferencialmente.
  2. Evalúe cualquier actividad de metilación de CpG fuera del objetivo de los ETR mediante MeDIP-seq.
    1. Tanto para la subpoblación silenciada por reporteros de las muestras tratadas con los tres ARNg principales como para las células tratadas simuladamente, extraiga el ADN genómico utilizando kits disponibles comercialmente (siguiendo las instrucciones del fabricante).
    2. Sonicar 500 ng de ADN genómico utilizando un ultrasonido y los siguientes parámetros: Derecho: 20 %; PIP: 175; Ciclos por ráfaga: 200; Tiempo: 40 s.
    3. Prepare bibliotecas de secuenciación con los kits disponibles comercialmente para MeDIP-seq (siguiendo las instrucciones del fabricante).
    4. Después de la etapa de ligadura del adaptador, cuantifique las bibliotecas mediante ensayo fluorométrico y verifique la eficiencia de la ligadura mediante qPCR utilizando kits de cuantificación de bibliotecas disponibles en el mercado (siguiendo las instrucciones del fabricante).
    5. Obtenga grupos de bibliotecas mezclando bibliotecas seleccionadas aleatoriamente para reducir los sesgos técnicos. Utilice una cantidad de biblioteca igual (ng) para cada biblioteca a fin de equilibrar los grupos. A cada grupo, agregue el ADN de control de espiga metilado y no metilado que se proporciona en el kit. Para fines de control, mantenga un volumen del 10% de la biblioteca, etiquetado como "entrada" y no inmunoprecipitado. Realizar inmunoprecipitación en el 90% restante de la biblioteca utilizando el anticuerpo monoclonal dirigido contra la 5-metilcitosina proporcionado en el kit MeDIP-seq.
    6. Purifique las bibliotecas enriquecidas y de entrada utilizando los kits para la purificación del producto de inmunoprecipitación de 5-metilcitosina, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    7. Evalúe la eficiencia del enriquecimiento mediante la realización de una PCR cuantitativa en tiempo real en el pico interno de los controles utilizando los cebadores proporcionados con el kit. Para cada inmunoprecipitación (IP), calcule la especificidad de enriquecimiento a partir de la recuperación de ADN metilado y no metilado, utilizando los valores del umbral del ciclo (Ct) de MeDIP y las fracciones de entrada obtenidas de la reacción de qPCR (véanse las ecuaciones 1 y 2):
      Equation 1 (1)
      Equation 2 (2)
      NOTA: Considere que las bibliotecas IP son correctas si los valores de especificidad son ≥0,95.
    8. Amplíe las bibliotecas utilizando los kits de preparación de bibliotecas MeDIP-seq, siguiendo las instrucciones del fabricante, y realice la cuantificación y el análisis de distribución del tamaño de la biblioteca del producto.
    9. Realice la secuenciación de bibliotecas en secuenciadores de próxima generación. Utilice la secuenciación de extremos emparejados, con una longitud de lectura de 100 pb, con el objetivo de obtener un promedio de 30 M de lecturas/muestra.
    10. Alinear las etiquetas de lectura de secuenciación con el genoma de referencia apropiado (p. ej., hg38) utilizando bwa (v 0.7.5 o superior)48 y, a continuación, identificar los picos utilizando MACS (v 2.0.10 o superior)49, lo que permite la identificación de picos amplios (-slocal = 0,-llocal = 500000).
    11. Cree un conjunto común de regiones a partir de diferentes muestras utilizando la herramienta de intersección múltiple50 de BEDTools, habilitando la opción de agrupación.
    12. Calcule la cobertura por muestra en la lista final de regiones utilizando el multicov de BEDTools, descartando las lecturas duplicadas.
    13. Realice un análisis del recuento de matrices con edgeR. Aplique un filtro de al menos un recuento por millón (cpm) en al menos tres muestras para descartar las regiones poco enriquecidas.
      NOTA: Alternativamente, se puede usar la función filterByExpr en edgeR.
    14. Identifique la metilación diferencial adoptando el modelo log-lineal generalizado implementado en edgeR (función glmFit) y normalizando utilizando la normalización de cuantiles condicionales51 para corregir el contenido de GC por región. Seleccione regiones metiladas diferencialmente aplicando un umbral de 0,01 en los valores de p ajustados por BH. Realice el análisis de secuencias repetidas de la siguiente manera.
      NOTA: Consulte la guía del usuario de edgeR para obtener la lista completa de opciones y parámetros (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).
      1. Filtre los resultados de MeDIP-seq para un valor p nominal <0,01 y cree dos conjuntos de regiones: seleccione las regiones que tengan logFC >1 en el primer conjunto y las regiones que tengan logFC <-1 en el segundo conjunto.
      2. Recupere la anotación RepeatMasker para el genoma elegido como un archivo de cama y cuente el número de elementos de cada conjunto. Convierta el recuento como una relación entre el número de regiones de cada conjunto de datos.
      3. Extraiga la proporción de metiloma que se superpone a cada clase de repeticiones y realice una prueba de Chi-cuadrado para detectar cualquier enriquecimiento significativo.
  3. Evalúe si las regiones transcritas diferencialmente o metiladas diferencialmente entre las muestras tratadas con ETR y simuladas se asignan a la unión de ARNg fuera del objetivo predicha in silico.
    1. Utilice el conjunto de diseño CRISPR52 como herramienta de predicción de unión de ARNg fuera del objetivo.
    2. Para cada región putativa fuera del objetivo, observe el sitio de inicio de la transcripción (TSS) más cercano y la región metilada más cercana. Considere como un verdadero efecto fuera del objetivo una región asociada a un gen regulado con FDR <0.01 y una distancia a SST menor de 10 Kb, o una región metilada regulada con FDR <0.01 y una distancia menor a 1 Kb.
    3. Identificar el número y las características de las regiones transcripcionalmente alteradas o sobremetiladas en muestras tratadas con cada uno de los tres ARNg de mayor rendimiento en comparación con las muestras tratadas con simulacro (Figura 5) para identificar el más específico entre los ARNg. Clasifique el impacto potencial de un sitio fuera del objetivo en la fisiología de las células objetivo en el siguiente orden (de la más impactante a la menos impactante):
      i) Gen intragénico y regulador de la región que se expresa fisiológicamente
      ii) Gen intragénico y exónico expresado fisiológicamente por la región
      iii) Gen intragénico, de la región intrónica, expresado fisiológicamente
      iv) Gen intragénico, no expresado en la región reguladora
      v) Gen intragénico, no expresado en la región exónica
      vi) Gen intragénico, no expresado en la región intrónica
      vii) Región intergénica

Representative Results

Tras la entrega de una plantilla donante para la integración mediada por recombinación homóloga del indicador fluorescente en el locus diana junto con el sistema CRISPR/Cas9 (por ejemplo, mediante nucleofección plásmida en el caso de las células K-562), aparecen células reporteras positivas en la muestra tratada (Figura 1, abajo). Si esto no ocurre, vuelva a comprobar la precisión del diseño y la clonación tanto de la plantilla donante como de los reactivos CRISPR/Cas9. Si se confirma, intente optimizar las dosis de reactivos y el protocolo de administración en sí.

Una vez obtenida la línea celular reportera, se seleccionan las secuencias promotoras/potenciadoras del gen diana y se diseña un panel de ARNg compatibles. Utilice herramientas de predicción in silico como Chopchop para identificar las secuencias de ARNg y clasificarlas en términos de eficiencia y especificidad predichas (Figura 2). Si no se recuperan gRNAs, controlar la presencia del motivo adyacente del protoespaciador Cas9 canónico (PAM) (5'-NGG-3') en la secuencia diana. Si no hay secuencias de PAM presentes, considere la posibilidad de cambiar a ETR basadas en variantes alternativas de Cas9 independientes de PAM (aún no se han publicado ETR con estas variantes) o cambiar a plataformas alternativas de dominio de unión al ADN, como ZFP53 o TALEs30. Sin embargo, si solo se recuperan los ARNg con baja eficacia/especificidad prevista, considere 1) probar estos ARNg de baja calidad o 2) expandir la secuencia de ADN diana, en busca de mejores ARNg. Tras la administración transitoria de la combinación triple ETR (o CRISPRoff; v2.1) junto con los ARNg, se realizan análisis de citometría de flujo longitudinal para la expresión del reportero fluorescente, a menudo observando un pico en la represión del reportero en los análisis agudos, que luego se reabsorbe, al menos parcialmente, debido a la dilución mitótica de los plásmidos que codifican ETR a lo largo del tiempo (Figura 4C). Si la combinación ETRs/ARNg deposita efectivamente la metilación de CpG en el locus diana, se producirá una represión permanente del reportero en una fracción considerable de las células tratadas (Figura 4C). Diferentes ARNg pueden mostrar una eficiencia de silenciamiento variable a largo plazo (Figura 4B,C).

Para las evaluaciones de la especificidad de todo el genoma, utilice MeDIP-seq para identificar las regiones metiladas diferencialmente entre las células en las que la diana ha sido silenciada a largo plazo y las células no tratadas. Idealmente, un ARNg altamente específico solo inducirá un pico de metilación de novo de CpG en el sitio diana (Figura 5). De lo contrario, se puede considerar la caracterización de la actividad fuera del objetivo de los ARNg clasificados en una posición más baja en la lista de eficiencia en el objetivo.

Figure 1
Figura 1: Integración de un reportero tdTomato bajo los elementos reguladores del gen B2M humano mediante reparación dirigida por homología. Arriba: Esquema de la estrategia para integrar un reportero fluorescente tdTomato en el primer intrón del gen B2M humano mediante reparación dirigida por homología inducida por CRISPR/Cas9. Abajo: diagramas de puntos representativos de las células K-562 antes y después de la integración del reportero tdTomato en el primer intrón del gen B2M . Abreviaturas: HA = brazo de homología; HDR = reparación dirigida por homología; IRES = sitio interno de entrada del ribosoma; pa = BGH poli(A); SA = sitio del aceptor de empalme; WT = tipo salvaje; 3XSTOP = tres codones de parada en tándem. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Identificación in silico de ARNg dirigidos a la isla CpG del gen B2M , clasificados según la eficiencia y especificidad predichas. La interfaz de salida de Chopchop muestra los ARNg dirigidos a la isla CpG incrustada en la secuencia promotora del gen B2M , clasificados tanto por el número de secuencias fuera del objetivo con 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) o 3 (MM3) desajustes como por la eficiencia prevista en el objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Clonación y nucleofección matricial de ARNg para el silenciamiento epigenético mediado por dCas9 ETR. Arriba: clonación de protoespaciadores mediada por oligocitos en un plásmido humano que expresa U6-gRNA. Abajo: cribado matricado de ARNg dirigidos a B2M para el silenciamiento epigenético basado en CRISPR/dCas9 mediante nucleofección de plásmidos en células K-562B2M/tdTomato . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Cribado de ARNg que induce eficazmente el silenciamiento a largo plazo del gen B2M. (A) Arriba: esquemas del genb2M tdTomato representado en el área ampliada, el orden relativo y la orientación de la unión de ETRs basados en dCas9 complejados con gRNAs. Abajo: diagramas de puntos representativos de las células B2MtdTomato K-562 antes (izquierda) o después (derecha) del silenciamiento de ETR. Análisis a los 30 días post-transfección con plásmidos que codifican para los gRNAs y la combinación triple dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L. (B) Actividad de silenciamiento de los ARNg indicados (ya sea en grupos o como ARNg individuales) dirigidos a la isla CpG de B2M (las flechas rojas en el esquema superior indican la orientación de los ARNg) en células K-562B2M tdTomato en el día 30 después de la transfección. Los datos muestran el porcentaje de células tdTomato-negativas (media ± SEM; n = cuatro transfecciones independientes para cada condición de tratamiento). (C) Análisis de curso temporal de células B2MtdTomato K-562 tras la transfección con plásmidos que expresan la combinación triple ETR y los gRNAs indicados B2M CpG dirigidos a la isla o simulacro (transfección sin gRNA y ETR). Los datos muestran el porcentaje de células tdTomato-negativas (media ± SEM; n = tres transfecciones independientes para cada condición de tratamiento). Datos inéditos. Paneles A y B adaptados de Amabile et al.30. Abreviaturas: CGI = isla CpG; IRES = sitio interno de entrada del ribosoma; pa = BGH poli(A); SA = sitio del aceptor de empalme; DE = sitio donante de empalme; TSS = sitio de inicio de la transcripción; UT = no transfectado; 3XSTOP = 3 codones de parada en tándem. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis de todo el genoma de la especificidad de ETR por RNA-seq y por MeDIP-seq. Izquierda: comparación de los niveles de expresión en células B2MtdTomato K-562 tratadas simuladamente y células tratadas con la combinación triple dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR y con un ARNg dirigido a la isla CpG del gen B2M. Los valores se expresan en log2 de lecturas por kilobase por millón (RPKM) de lecturas asignadas. Los puntos negros representan genes expresados en niveles comparables en todas las condiciones; los círculos amarillos representan genes regulados diferencialmente bajo un FDR <0.01; El círculo rojo representa la transcripción B2M-IRES-tdTotomato. Arriba a la derecha: gráfico circos que muestra los perfiles MeDIP-seq del genoma completo de células B2MtdTomato K-562 tratadas simuladamente (azul) o células tratadas con la combinación triple dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR y con un ARNg dirigido a la isla CpG (CGI) del gen B2M (verde). Abajo a la derecha: se muestra el estado de metilación del locusB2M tdTomato en las muestras indicadas. En cada pila se representan tres réplicas; La acumulación de lecturas alineadas se suavizó mediante una ventana gaussiana. Esta figura fue adaptada de Amabile et al.30. Abreviatura: TSS = sitio de inicio de la transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El silenciamiento epigenético dirigido puede representar una solución prometedora para tratar trastornos que pueden beneficiarse de la inactivación permanente de genes, incluidas las enfermedades causadas por mutaciones de ganancia de función1, las enfermedades infecciosas2 y las patologías en las que el silenciamiento de un gen puede compensar un defecto hereditario en otro3 o liberar todo el potencial de las terapias celulares adoptivas4. 5. Al actuar a nivel de la cromatina y ser autopropagado por la célula 7,30,32, el silenciamiento epigenético puede evitar alteraciones tóxicas (por ejemplo, reordenamientos cromosómicos) de la secuencia de ADN del gen diana y el silenciamiento parcial y transitorio de la diana, que son limitaciones de la disrupción génica artificial basada en nucleasas8,34,35 y la knockdown basada en ARNi 33, respectivamente.

Uno de los pasos preliminares clave en cualquier protocolo de silenciamiento epigenético es identificar la posición adecuada en el gen diana para dirigir los ETRs que depositarán las marcas epigenéticas represivas necesarias para desactivar la actividad transcripcional de la diana. Diferentes elementos reguladores del sitio de inicio transcripcional, proximal y distal pueden concurrir para apoyar la salida transcripcional de un gen humano dado54. Además, ahora se pueden identificar diferentes sitios diana por elemento regulador específico gracias al creciente número de tecnologías programables de unión al ADN6. Por lo tanto, los protocolos, como el que se describe aquí en líneas celulares modificadas, se pueden utilizar para nominar sitios diana individuales y/o regiones genómicas susceptibles de silenciamiento epigenético mediado por ETR, antes de embarcarse en esfuerzos de evaluación engorrosos y lentos de los mejores candidatos en el entorno terapéutico final. A continuación se describen algunos aspectos críticos del protocolo.

Ingeniería de una línea celular reportera predictiva de la diana terapéutica final
A pesar de la constante optimización de los protocolos de ingeniería celular, necesarios aquí para insertar el casete que codifica el indicador fluorescente en el gen diana y para administrar los ETR, no se puede dar por sentado que ya estén disponibles para la línea celular que más se parezca a la diana terapéutica final. En este caso, se pueden aplicar diferentes estrategias de mitigación: a) aprovechar los kits de optimización proporcionados por los proveedores para optimizar internamente el protocolo de transfección para la línea celular objetivo; b) cambiar a otras líneas celulares que aún expresan ese gen diana, pero que pertenecen a tejidos distintos de la diana terapéutica final, para lo cual se han optimizado ampliamente los protocolos de ingeniería. En caso de que estas opciones no estén disponibles, se puede considerar cambiar a tipos de células primarias u organoides que representen el objetivo final. Como consideración general tanto para los estudios preclínicos como para las aplicaciones terapéuticas del silenciamiento epigenético basado en ETR, se deben descartar los escenarios en los que el gen diana es esencial para el tipo de célula diana. El silenciamiento completo y a largo plazo de un gen esencial impuesto por las ETR conducirá a la contraselección de las células diana a lo largo del tiempo (y, potencialmente, a la toxicidad del tratamiento). En estos casos, se prefieren las tecnologías alternativas que proporcionan la abrogación parcial de la diana, como el ARNi33.

Evaluación de la actividad de silenciamiento en blanco de los ETR
Las ETR basadas en la combinación de dominios efectores KRAB, DNMT3A y DNMT3L han demostrado ser eficaces contra la gran mayoría de los genes codificadores de proteínas, con una ventana de orientación permisiva de 1 kilobase centrada en el sitio de inicio de la transcripción32. Para tener una idea de cómo se ve un experimento de silenciamiento epigenético bien realizado, aquí se proporcionan los detalles técnicos y los resultados del silenciamiento del gen B2M en las células K-562. Esto puede considerarse un control positivo importante que debe incluirse no solo por los investigadores que trabajan con células K-562, sino también por aquellos que se acercan a la tecnología basada en ETR por primera vez. Como se indica en el protocolo, se recomienda la disrupción génica basada en nucleasas artificiales (por ejemplo, CRISPR/Cas9) como un control adicional tanto de la eficiencia de la entrega de genes en el tipo de célula de interés como del fenotipo de células privadas del gen diana. Después de la selección inicial de los ARNg que se acoplarán con los ETR basados en CRISPR/dCas9, si ninguno de los ARNg probados es capaz de silenciar permanentemente el gen diana, se debe considerar, en el siguiente orden: 1) aumentar la cantidad de ARNg y ETR entregados; 2) grupos de pruebas de los principales ARNg en busca de efectos sinérgicos entre ellos. Si aún no se logra el silenciamiento a largo plazo, se debe considerar: 3) probar ARNg adicionales, que pueden dirigirse a sitios más relevantes para instruir el silenciamiento epigenético; 4) cambiar a plataformas DBD basadas en ZFP8 o TALE9, que pueden tener una capacidad de unión mejorada a la cromatina objetivo; 5) cambiar de transitorio a estable, por ejemplo, integrando la expresión basada en vectores virales de los ETR (ya sea el ARNg o las construcciones de fusión dCas9 o ambas cuando se adopta la tecnología CRISPR/dCas9). Dado que nuestro grupo desarrolló, y tiene una sólida experiencia con, la entrega conjunta de los tres ETR30 separados, el protocolo y los resultados que se muestran aquí se basan en este enfoque. Sin embargo, es probable que se pueda aplicar un flujo de trabajo conceptual similar para un sistema todo en uno basado en CRISPR32.

Evaluación de la actividad fuera del objetivo de los ETR
Múltiples estudios han mostrado indicaciones preliminares in vitro de la especificidad de las ETR basadas en la combinación de los dominios efectores KRAB, DNMT3A y DNMT3L30,31,32. Sin embargo, si entre los ARNg analizados, ninguno de ellos muestra un perfil de especificidad satisfactorio en términos de regulación transcripcional y/o metilación de novo del ADN, se pueden seguir dos estrategias no mutuamente excluyentes: a) reducir el tiempo de residencia de los ETR dentro de la célula (y, en consecuencia, su posible actividad fuera del objetivo) disminuyendo las dosis de ETR o probando sistemas de administración alternativos. Por ejemplo, en comparación con los plásmidos, se espera que tanto el ARNm como la administración de proteínas reduzcan el tiempo de exposición celular a los ETR y, en consecuencia, la probabilidad de actividad fuera del objetivo55; b) cambiar a variantes más recientes de Cas9, optimizadas para reducir la unión fuera del objetivo de la plataforma56, o a tecnologías alternativas de unión al ADN basadas en ZFP8 o TALE9. Es importante tener en cuenta que, en comparación con las muestras tratadas simuladamente, la actividad del silenciamiento génico en la diana y fuera de la diana se ve afectada no sólo por la unión de la DBD a su secuencia diana, sino también por la capacidad potencial de los dominios efectores epigenéticos para ser reclutados a otros loci por sus cofactores endógenos naturales. Por lo tanto, la reducción del tiempo de residencia de las ETR en la célula diana puede disminuir no solo la probabilidad de unión de la DBD a sitios fuera de la diana, sino también la probabilidad de que las ETR interactúen con cofactores endógenos, con posibles ventajas en términos de especificidad y desventajas en términos de actividad en la diana. Por último, en comparación con las muestras tratadas con simulacro, algunas de las alteraciones de la metilación transcripcional y, menos probables, de CpG medidas en las células silenciadas pueden derivarse simplemente de la privación del gen diana. Estos no se consideran fuera de los objetivos de la tecnología de silenciamiento. Para identificarlos, también se debe incluir la disrupción génica por nucleasa artificial en el panel experimental 8,9,10. Las alteraciones biológicas debidas a la pérdida funcional del gen diana serán compartidas entre el silenciamiento epigenético y esta tecnología alternativa.

Disclosures

AL es cofundador, titular de cuotas y consultor de Chroma Medicine, Inc.

Acknowledgments

Los autores quieren agradecer a Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica y Deborah Cipria por el esfuerzo colaborativo en el desarrollo de la tecnología de silenciamiento epigenético a lo largo de los años; Dejan Lazarevic y Francesca Giannese por la revisión crítica de los análisis RNA-seq y MeDIP-seq descritos en el protocolo. Este trabajo fue apoyado por subvenciones a A.L. de la Fundación Teletón (beca TIGET nº F1) y del Programa Horizonte 2020 de la UE (UPGRADE). Las ilustraciones han sido creadas con BioRender.com.

CONTRIBUCIÓN DE LOS AUTORES
A.M, M.A.C., F.G. y A.C. contribuyeron al diseño del protocolo y a la redacción del manuscrito; S.V., I.M. y D.C. diseñaron las secciones de bioinformática del protocolo y revisaron el manuscrito; A.M. y A.L. diseñaron el protocolo, concibieron y escribieron el manuscrito con el aporte de todos los autores.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt
actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg
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aggtggcctggtactcctccttctccccacagc
ctcccagacaaggaggagtagctgccttttag
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ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga
aaaatatagagtttataatattttcttcccacttc
cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 

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References

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Bioingeniería Número 195 Silenciamiento Epigenético Dirigido Inactivación de Genes Interferencia de ARN Nucleasas Artificiales Rotura de Doble Cadena de ADN Edición Epigenética Dominio de Unión al ADN Programable Dominio KRAB DNMT3A DNMT3L Estados Epigenéticos Represivos Hereditarios Naturaleza de Atropello y Fuga Desmetilación del ADN
<em>In vitro</em> Selección de represores transcripcionales diseñados para el silenciamiento epigenético dirigido
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Migliara, A., Cappelluti, M. A.,… More

Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).

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