Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

In vitro Val av konstruerade transkriptionsrepressorer för riktad epigenetisk avstängning

Published: May 5, 2023 doi: 10.3791/64403
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,3, 2, 1,4
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget), IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences, IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för in vitro-selektion av konstruerade transkriptionsrepressorer (ETR) med hög, långsiktig, stabil, on-target avstängningseffektivitet och låg genom-wide, off-target aktivitet. Detta arbetsflöde gör det möjligt att reducera en inledande, komplex repertoar av ETR-kandidater till en kort lista, lämplig för vidare utvärdering i terapeutiskt relevanta miljöer.

Abstract

Geninaktivering är avgörande för att studera genfunktion och representerar en lovande strategi för behandling av ett brett spektrum av sjukdomar. Bland traditionella tekniker lider RNA-interferens av partiell målabrogation och kravet på livslånga behandlingar. Däremot kan artificiella nukleaser införa stabil geninaktivering genom induktion av ett DNA-dubbelsträngsbrott (DSB), men nya studier ifrågasätter säkerheten för detta tillvägagångssätt. Riktad epigenetisk redigering via konstruerade transkriptionsrepressorer (ETR) kan vara en lösning, eftersom en enda administrering av specifika ETR-kombinationer kan leda till varaktig nedtystning utan att inducera DNA-brott.

ETR är proteiner som innehåller en programmerbar DNA-bindande domän (DBD) och effektorer från naturligt förekommande transkriptionsrepressorer. Specifikt visade sig en kombination av tre ETR:er utrustade med KRAB-domänen av humant ZNF10, den katalytiska domänen av humant DNMT3A och humant DNMT3L, inducera ärftliga repressiva epigenetiska tillstånd på ETR-målgenen. Plattformens hit-and-run-karaktär, avsaknaden av påverkan på målets DNA-sekvens och möjligheten att återgå till det repressiva tillståndet genom DNA-demetylering på begäran, gör epigenetisk nedtystning till ett spelförändrande verktyg. Ett kritiskt steg är att identifiera rätt ETR:s position på målgenen för att maximera on-target och minimera off-target tystnad. Att utföra detta steg i den slutliga ex vivo- eller in vivo-prekliniska miljön kan vara besvärligt.

Med CRISPR/katalytiskt dött Cas9-system som en paradigmatisk DBD för ETR, beskriver denna artikel ett protokoll som består av in vitro-screening av guide-RNA (gRNA) kopplade till trippel-ETR-kombinationen för effektiv nedtystning på målet, följt av utvärdering av den genomomfattande specificitetsprofilen för toppträffar. Detta gör det möjligt att reducera den initiala repertoaren av kandidat-gRNA till en kort lista över lovande sådana, vars komplexitet är lämplig för deras slutliga utvärdering i den terapeutiskt relevanta miljön av intresse.

Introduction

Geninaktivering har traditionellt spelat en nyckelroll för att studera genernas funktion i både cell- och djurmodeller. Dessutom, under de senaste två decennierna, med framväxten av genterapi, har det föreslagits som ett potentiellt omvälvande tillvägagångssätt för att behandla sjukdomar orsakade av gain-of-function-mutationer1, infektionssjukdomar2 eller patologier där avstängning av en gen kan kompensera för en ärftlig defekt i en annan3. Slutligen har genetisk inaktivering av nyckelregulatorer för cellkondition och funktionell kontroll föreslagits för att förbättra effektiviteten hos cellprodukter för cancerimmunterapi4 och regenerativ medicin5.

Bland de olika teknikerna för att åstadkomma geninaktivering är en av de mest lovande riktad epigenetisk avstängning 6,7. Kärnan i denna teknik är så kallade Engineered Transcriptional Repressorer (ETR), chimära proteiner som består av en programmerbar DNA-bindande domän (DBD) och en effektordomän (ED) med epigenetisk repressiv funktion. Zinkfingerproteiner (ZFPs)8, transkriptionsaktivatorliknande effektorer (TALEs)9 eller CRISPR/dCas910-baserade DBD:er kan utformas för att selektivt binda ED till promotor-/förstärkarsekvensen för målgenen som ska tystas. Väl där utför ETR:s ED sin tystande aktivitet genom att införa heterokromatininducerande repressiva epigenetiska markörer såsom histonmodifieringar (H3K9 11,12 eller H3K27 13 metylering, H3 eller H4 deacetylering 14) och CpG DNA-metylering 15, beroende på den repressiva domän som används.

I synnerhet, inspirerad av de molekylära processerna för permanent transkriptionell repression av endogena retrovirus som förekommer i det preimplantationella embryot16, har en kombination av tre ETR genererats för att utnyttja följande ED: i) Krüppel-associated box (KRAB) domänen av humant ZNF10; ii) den katalytiska domänen av humant de novo-DNA-metyltransferas 3A (DNMT3A), och iii) det humana DNA-metyltransferas 3-liknande (DNMT3L) i full längd. KRAB är en konserverad repressiv domän som delas av flera ZFP hos högre ryggradsdjur17,18, vars avstängningsaktivitet huvudsakligen baseras på dess förmåga att rekrytera KAP1 19-a scaffold-protein som sedan interagerar med flera andra heterokromatininducerare20-bestående av nukleosomremodellerings- och deacetyleringskomplexet (NuRD) 21, H3K9-histonmetyltransferas SETDB1 22 och H3K9-metyleringsläsaren HP1 23, 24, bland andra.

DNMT3A överför aktivt metylgrupper på DNA vid CpG-sekvenser25. Den katalytiska aktiviteten hos DNMT3A förstärks av dess fysiska association med DNMT3L, en embryo- och könscellsbegränsad paralog av DNMT3A som saknar den katalytiska domänen som är ansvarig för metylgruppöverföring26,27. DNA-metylering i CpG-rika regioner – så kallade CpG-öar (CGI) – inbäddad i promotor-/förstärkarelementen i däggdjursgener är vanligtvis förknippad med nedtystning av transkription28. Det är viktigt att CpG-metylering, när den väl har deponerats, kan ärvas stabilt under hela mitosen av ett UHRF1-DNMT1-baserat molekylkomplex29.

Stabilt överuttryck av ETR i målcellen kan vara problematiskt, sannolikt på grund av de ökande riskerna för aktivitet utanför målet och kvävning av endogena interaktorer från deras fysiologiska målplatser över tid. Övergående uttryck av enstaka ETR-delar kan dock misslyckas med att inducera långvarig avstängning med hög effektivitet30, vilket hämmar deras terapeutiska tillämpning. Ett banbrytande genombrott inom området var därför bevisen för att kombinationen av de tre KRAB-, DNMT3A- och DNMT3L-baserade ETR:erna kan synergisera och, även när de endast levereras tillfälligt, påtvinga promotorsekvensen för målgenen H3K9 och CpG-metylering. Dessa läses sedan av och förökas av cellen genom hela mitosen, vilket leder till ärftlig nedtystning i flera humana och murina cellinjer, såväl som ex vivo-odlade primära celler30.

Det bör noteras att den epigenetiska avstängning som ETR medför kan återställas på begäran genom riktad (t.ex. rekrytering av det CRISPR/dCas9-baserade TET1-DNA-demetylaset på det tystade lokuset) eller farmakologiska (administrering av DNA-metyltransferashämmaren 5-Aza) DNA-demetylering30, en potentiell antidot vid ETR-relaterade biverkningar. Allt-i-ett-ETR:er med de tre KRAB-, DNMT3A- och DNMT3L-baserade ED:erna beskrevs också, vilket visade signifikanta avstängningseffektivitet i cellinjer31,32 mot den stora majoriteten av proteinkodande gener. Dessutom rapporterade flera studier där ETR användes en hög säkerhetsprofil, utan någon större aktivitet utanför målet när det gäller de novo CpG-metylering eller förändring av kromatintillgängligheten30,31,32. En särskild analys av specificitetsprofilen för ETR utrustade med en nydesignad DBD rekommenderas dock före kliniska tillämpningar.

Ur ett kliniskt perspektiv kan riktad epigenetisk avstängning ge kritiska fördelar för både RNA-interferens (RNAi)-baserad knockdown33 och artificiell nukleasbaserad genstörning8. Till skillnad från RNAi kan riktad epigenetisk avstängning inducera fullständig upphävning av dess mål per cell och kräver inte periodisk behandling för att säkerställa långvarig avstängning; i motsats till genstörningar lämnar den DNA-sekvensen oförändrad, vilket undviker generering av DNA-dubbelsträngsbrott (DSB). DSB kan sedan inducera apoptos och cellcykelstopp, vilket potentiellt kan leda till en selektion mot celler med en funktionell p53-väg 34,35 och, särskilt i multiplexa genredigeringsinställningar, kromosomala omarrangemang35. Dessutom, genom att vidarebefordra det irreversibla mosaikresultatet av icke-homologt-end-joining-medierad DNA-DSB-reparation36, kan genstörning inte undvika reparation av målet i bildrutan till funktionella kodande sekvenser som ett av de slutliga resultaten och, till skillnad från epigenetisk avstängning, kan den inte raderas på begäran.

Slutligen har epigenetisk avstängning potential att bredda utbudet av målinriktade genetiska element till klasser som är helt eller åtminstone delvis resistenta mot RNAi och genstörningar, såsom icke-transkriberade regulatoriska element och icke-kodande RNA30,32. Det första kritiska steget för en riktad epigenetisk avstängningsapplikation är att utforma en panel av ETR:er som täcker de olika regulatoriska sekvenserna av målgenen och identifiera de bäst presterande. Antalet ETR:er som ska testas kan vara avgörande, med tanke på den ökande andel av genomet som kan angripas av de programmerbara DNA-bindningstekniker som ständigt är under utveckling37. Det mest relevanta alternativet skulle vara att screena ETR direkt på den celltyp där målgenen kan tystas terapeutiskt. Skärmar med hög genomströmning kan dock vara tekniskt besvärliga i primära celler på grund av deras begränsade överlevnad i odling och deras ofta suboptimala tekniska kapacitet. Storskaliga skärmar kan vara ännu mer ogenomförbara in vivo.

Ett mer praktiskt alternativ består av att först utföra en första screening av en stor panel av ETR:er i lätt konstruerade cellinjer, och sedan bara validera de mest lovande i den terapeutiskt relevanta celltypen. En parallell fråga är valet av en lämplig avläsning för att mäta ETR:s ljuddämpningseffektivitet. Att direkt bedöma transkript- eller proteinnivåerna i målgenen med RT-qPCR, western blot eller ELISA kan vara kostsamt och tidskrävande och kan sakna tillräcklig sensibilitet, vilket begränsar deras tillämpning vid storskaliga skalor. Genereringen av ad hoc-konstruerade reportercellinjer där en fluorofor placeras under transkriptionell kontroll av målgenens regulatoriska sekvenser möjliggör utnyttjande av den flödescytometribaserade metoden för att läsa epigenetisk avstängning på encellsnivå och med hög genomströmningstakt.

Efter dessa allmänna överväganden beskriver denna artikel ett protokoll som består av in vitro-arrayad screening av ETR:er för effektivitet av nedtystning på målet, följt av utvärdering av den genomomfattande off-target-aktiviteten hos de bästa träffarna. Detta arbetsflöde gör det möjligt att reducera den initiala repertoaren av ETR-kandidater till en kort lista över lovande sådana, vars komplexitet är lämplig för deras slutliga utvärdering i den terapeutiskt relevanta celltypen av intresse.

Bland de olika programmerbara DBD:er som kan utnyttjas för att generera ETR:er kommer detta protokoll att fokusera på den CRISPR/dCas9-baserade tekniken, på grund av att det är lätt att designa gRNA som spänner över målgenpromotorn i en skala med hög genomströmning. Samma konceptuella arbetsflöde som beskrivs nedan kan dock användas för att utvärdera effektiviteten och specificiteten hos ETR som är utrustade med andra DBD:er.

Protocol

1. Konstruera en fluorescensbaserad reportercellinje för att övervaka målgenens transkriptionsaktivitet genom flödescytometri

  1. Identifiera cellinjer som uttrycker den målgen som ska tystas. Bläddra i målgenen som ska tystas i Human Protein Atlas38 och navigera genom avsnittet "Cellinje" för att identifiera de linjer som är representativa för den somatiska vävnaden av intresse (t.ex. en levercellinje om de slutliga målen är leverhepatocyter). Alternativt kan du förhöra en offentligt tillgänglig RNA-sekvenseringsdatabas (RNA-Seq) (t.ex. NCBI GEO).
  2. Bland kandidaterna bör man prioritera cellinjer för vilka det finns effektiva transienta genleveransprotokoll – som är avgörande för ETR-leverans.
    OBS: Bland de olika modaliteterna representerar nukleofektion ett av de bästa alternativen, eftersom det säkerställer hög transfektionseffektivitet. Här har humana erytrolukemi K-562-celler valts ut för att generera en cellinje som rapporterar transkriptionsaktiviteten hos beta-2-mikroglobulingenen (B2M) (hädanefter kallad B2MTdTomato K-562-cellerna).
  3. Vidare prioritera kandidaterna för att undvika cellinjer där målgenen är avgörande för cellviabilitet, eftersom detta försämrar underhållet av celler med stabil avstängning av målgenen i odling. Om det inte tidigare rapporterats, för att få en känsla av målgenens väsentlighet i den valda celltypen, generera en genetisk störningskontroll genom att transfektera cellerna med Cas9-nukleas och ett gRNA som riktar sig mot en av de första kodande exonerna av genen.
    OBS: Genetisk störning är per definition en stabil händelse; Motselektion av störda celler över tid indikerar att målgenen är essentiell för den valda cellens fysiologi.
    1. Identifiera den målsplitsningsisoform som företrädesvis används i den valda cellinjen (isoformen NM_004048.4 av B2M-genen är måltavla i detta protokoll).
    2. Identifiera ett gRNA som kan skära effektivt och specifikt i den första kodande exonen av målisoformen (t.ex. Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, som är ett giltigt och användarvänligt onlineverktyg för gRNA-selektion).
    3. För K-562-celler, transfekt 1 μg spCas9-kodande plasmid (hCas9; se materialtabell) och 250 ng gRNA-kodande plasmid (phU6-gRNA; se materialtabell) per 5 × 10 5 celler genom nukleofektion (enligt tillverkarens instruktioner).
    4. Odla cellerna (K-562-celler vid 37 °C under 5 % CO2 i RPMI-1640 kompletterat med 10 % fetalt bovint serum [FBS], L-glutamin och penicillin/streptomycin [100 E/ml]) och övervaka nivåerna av genstörningar över tid genom att utnyttja ett mutationsdetektionskit (följ tillverkarens instruktioner).
  4. Klona en donatormall för homolog rekombinationsmedierad integration av en fluorescerande rapportör under transkriptionell kontroll av målgenen av intresse (Figur 1).
    1. Identifiera regionen av målgenen för att integrera fluoroforuttryckskassetten.
      OBS: Undvik att rikta in dig på transkriptionellt relevanta element, såsom CpG-öar och regioner som är berikade för H3K27-acetylering (markör för aktiva promotorer och förstärkare). Att ändra dessa regulatoriska element (potentiellt viktigt att rikta in sig på av ETR:erna för att instruera epigenetisk avstängning) gör reportercellinjen mindre prediktiv för den fysiologiska regleringen av målgenen.
      1. Om målgenen inte kodar för ett utsöndrat protein, fusionera rapportören till det sista kodonet av målgenen genom en 2A självklyvande peptid för att bibehålla målgenens funktionalitet.
      2. Om målgenen kodar för ett utsöndrat protein, för att undvika potentiell utsöndring av rapportören, placera rapportören i en intronisk region av målgenen. Tvångsintegration av rapportören i den splitsade transkriptionen genom ett skarvacceptorställe (SA) och efterföljande translation genom en intern ribosomingångssekvens (IRES) försämrar målgenens funktionalitet.
    2. Använd Chopchop för att välja gRNA-skärning i målregionen (här väljs ett gRNA för att rikta in sig på sekvensen 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ av den första intron av B2M-genen ).
    3. Designa en donatormall för gRNA-snittstället bestående av: i) en vänster homologiarm (n baspar [bp] som matchar regionen strax uppströms om gRNA-snittstället); ii) en promotorfri transgenuttryckskassett (i det fall som visas här, en SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly(A) som gynnar splitsning med den första intron av B2M-genen ); och iii) en höger homologiarm (n bp som matchar regionen nedströms om gRNA-snittstället).
      OBS: Längden på homologiarmarna som krävs för att effektivt inducera homolog rekombination kan variera mellan olika celltyper (100-500 bp är ett lämpligt intervall för K-562-celler).
  5. Leverera CRISPR/Cas9-nukleassystemet och donatormallen inuti målcellinjen. För K-562-celler, transfekt 1 μg spCas9-kodande plasmid (hCas9; se materialtabell), 250 ng gRNA-kodande plasmid (phU6-gRNA; se materialtabell) och 1 μg donatormallkodande plasmid per 5 × 105 celler genom nukleofektion (enligt tillverkarens instruktioner).
  6. Odla cellerna i minst 14 dagar (för K-562-celler) och övervaka uttrycksnivåerna för den fluorescerande rapportören över tid med hjälp av en flödescytometer (aktivera fykoerytrinkanalen (PE) för att mäta fluorescensintensiteten hos tdTomatrapportören och följ tillverkarens instruktioner för att utföra flödescytometri).
    OBS: Donatormallen - särskilt om den är plasmidbaserad - kan innehålla kryptiska promotorsekvenser, vilket leder till att den fluorescerande reportern uttrycks från icke-integrerade donatorkopior. Odling av cellerna möjliggör utspädning av dessa icke-integrerade kopior genom celldelning och slutligen bibehållande av rapportörens uttryck endast från de donatorkopior som är integrerade i målgenomet.
  7. Klona reporterpositiva celler genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) på encellsnivå. För detta protokoll, aktivera PE-kanalen för att mäta fluorescensintensiteten hos tdTomato-reportern och följ tillverkarens instruktioner för att sortera enstaka tdTomato-positiva K-562-celler per brunn på en 96-hålsplatta.
  8. Vid cellexpansion i odling (vanligtvis 20-30 dagar för K-562-celler), screena reporter-positiva kloner med PCR för att välja en som bär en bi-allelisk integration av reporterkassetten inuti målplatsen.
    OBS: Detta maximerar reporteruttrycket och underlättar ytterligare upplösning mellan reporteruttryckande och reportertystade celler genom flödescytometri vid ETR-behandling.
    1. Extrahera genomiskt DNA från 1 × 105 celler per reporterpositiv klon med hjälp av en DNA-extraktionssats (enligt tillverkarens instruktioner).
    2. Förstärk B2M-målområdet med framåtriktade (5'-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3') och bakåtriktade (5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') primers enligt instruktionerna i PCR-amplifieringssatsen. Glödgningstemperaturen för detta par primers är 47,7 °C med Taq-baserade DNA-polymeraser och 0,5 μM primerkoncentrationer.
    3. Analysera PCR-produkten med 1 % agarosgelelektrofores (enligt tillverkarens instruktioner). Skärm för kloner som visar bandet relaterat till integration av tdTomato i B2M-mållokuset (3 413 bp), utan bandet relaterat till vildtypsmållokuset (1 027 bp).

2. Designa gRNA för CRISPR/dCas 9-baserad epigenetisk avstängning av målgenen

  1. Bläddra i målgenen i UCSC:s genomwebbläsare40 och extrahera nukleotidsekvensen för regioner som potentiellt reglerar dess transkriptionsaktivitet, såsom CpG-öar och platser som är anrikade för H3K27-acetylering (markör för aktiva promotorer och förstärkare).
    OBS: Enligt en nyligen genomförd studie är den bästa målregionen ett fönster på 1 kilobas (kb) centrerat på transkriptionsstartplatsen för målgenen32.
  2. Klistra in de valda sekvenserna i onlineverktyget Chopchop och välj repression som syftet med de gRNA som ska hämtas. Vänta tills Chopchop tillhandahåller en lista över gRNA som kartlagts på den genetiska sekvensen av intresse och listats enligt en poäng som tar hänsyn till både antalet matchningar utanför målet och den förutspådda effektiviteten på målet (figur 2).
  3. Välj minst 10 gRNA per målsekvens. Om möjligt, försök att välja gRNA som spänner över hela regionen som ska undersökas, utan fullständiga matchningar med andra intragena sekvenser i genomet.

3. Arrayad transient leverans av CRISPR/dCas 9-baserade ETR i reportercellinjen

  1. Bland de transgenleveranssystem som tidigare rapporterats för målcellinjen, välj de som endast tillåter transient transgenuttryck, maximerar leveranseffektiviteten och minimerar cellmanipulationsrelaterad toxicitet. När det gäller K-562-celler rekommenderas starkt både plasmid- och mRNA-nukleofektion, där plasmidproduktion representerar ett tekniskt enklare och billigare alternativ.
  2. Klona både de gRNA som valts ut i avsnitt 2 och CRISPR/dCas9-baserade ETR i det transgenleveranssystem som valts. Se följande steg för ett protokoll för kloning av ETR:er i plasmid-DNA.
    OBS: Plasmider som kodar separat för dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A och dCas9:DNMT3L30 är inte tillgängliga på Addgene. De klonades genom att ersätta VP160-transaktivatorn från plasmiden pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (se Materialtabell) med antingen KRAB-, DNMT3A- eller DNMT3L-domänkodningssekvensen30. En plasmidkodning för en allt-i-ett-ETR, kallad CRISPRoff-v2.132, finns tillgänglig (se Materialförteckning).
    1. Transformera plasmider som kodar för ETR i kemiskt kompetenta E. coli-celler (enligt tillverkarens instruktioner). Screena kolonierna för närvaron av den ETR-bärande plasmiden genom restriktionsenzymdigestion och Sanger-sekvensering, och välj slutligen en av de positiva kolonierna för plasmid-DNA Midiprep-produktion (enligt tillverkarens instruktioner).
    2. Klona gRNA:erna inuti phU6-gRNA-ryggraden (figur 3).
      1. Med hjälp av molekylärbiologisk designprogramvara, lägg till en 5'-CACCG-3'-sekvens uppströms protospacern (den första variabeln 20 nukleotider [nt] av det valda gRNA) för att generera en 25 nt-lång oligo in silico, kallad SGfw.
      2. På samma sätt bifogas en 5'-AAAC-3'-sekvens uppströms om det omvända komplementet av protospacern för det valda gRNA:t och en 5'-C-3'-sekvens nedströms om den för att generera en 25 nt-lång oligo kallad SGrv.
      3. Beställ både SGfw- och SGrv-sekvenserna som saltfria enkelsträngade DNA-oligos, resuspenderade i vatten vid 100 μM.
      4. Tillsätt 1 μL av varje oligo till 2 μL glödgningsbuffert (10 mM Tris [pH 7,5-8,0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) och 16 μL vatten.
      5. Utför oligoglödgning genom att placera lösningen i en termocykler som är programmerad att starta vid 95 °C i 10 minuter. Låt sedan svalna gradvis till 25 °C under 45 minuter.
      6. Späd 1 μL av de glödgade oligos med 99 μL nukleasfritt vatten och ligera sedan 1 μL av denna utspädning med 50 ng phU6-gRNA-plasmid som tidigare spjälkats med BsaI-restriktionsenzymet (följ instruktionerna från BsaI- och ligaskit-leverantörerna för matsmältnings- och ligeringsproceduren).
      7. Omvandla 20 μl kemiskt kompetenta E. coli-celler med 2 μl ligeringsprodukten (följ tillverkarens anvisningar för omvandlingsproceduren).
      8. Välj flera kolonier för plasmid-DNA Miniprep-produktion (följ leverantörens instruktioner) och kontrollera den framgångsrika kloningen av protospacern genom Sanger-sekvensering med följande primer som matchar U6-promotorn 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'.
      9. Välj en av de positiva kolonierna för plasmid-DNA Midiprep (följ tillverkarens instruktioner).
  3. Leverera de valda gRNA:erna och CRISPR/dCas9-baserade ETR:erna i reportercellinjen i matris (ett specifikt gRNA per tillstånd) (figur 3).
    OBS: Som ett representativt fall visas arbetsflödet för nukleofektion av plasmider som kodar för dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L och gRNA som riktar sig mot B2M CpG-ön i B2M TdTomato K-562-celler i följande steg.
    1. Bered separata rör som innehåller 500 ng av var och en av plasmiderna dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- och dCas9:DNMT3L-kodande plasmider, men som skiljer sig åt för det gRNA som ska testas (125 ng av en gRNA-kodande plasmid per rör). Inkludera ett gRNA- och ETR-fritt nukleofektionstillstånd som prov. Utför screeningen med minst tre tekniska replikat per prov.
    2. Pellet 5 × 105 B2MTdTomato K-562 celler per rör och nukleofekt dem med plasmidblandningen (enligt tillverkarens instruktioner).
    3. Återsuspendera cellerna i 200 μl tidigare uppvärmda RPMI-1640 däggdjurscellodlingssubstrat och sätt tillbaka dem i inkubatorn.

4. Analysera målgenens transkriptionsaktivitet över tid

  1. Använd flödescytometri för att mäta procentandelen tystade celler vid olika tidpunkter efter leverans av ETR (figur 4). Använd vildtypsceller (WT) - som inte bär den fluoroforkodande sekvensen - för att ställa in tröskeln för reporternegativa celler. Använd det fingerade exemplet för att ange grinden för reporterpositiva celler.
    OBS: Som föreslagits i steg 1.3, inkludera en genetisk störningskontroll i experimentet. Detta kan vara användbart för att både övervaka CRISPR-leveranseffektiviteten och konditionen hos celler som berövats målgenen; Förlusten av både transkriptionell avstängning och genetisk störning över tid kan tillskrivas målgenens essentiella betydelse i den valda celltypen. Inkludera både kort- (dag 3, dag 7, dag 10) och långsiktiga (dag 21, dag 35) tidpunkter för att få en indikation på både akut och långsiktig effektivitet av nedtystning.
  2. Identifiera de tre bästa gRNA:erna när det gäller långsiktig avstängningseffektivitet. Använd FACS för att välja den reporternegativa subpopulationen som stabilt bibehålls i dessa urval. Utför också FACS av de provisoriska bulkproverna för att hålla dem under samma behandling som testproverna för att möjliggöra korrekt jämförelse i de efterföljande analyserna.

5. Utvärdering av specificiteten hos ETR-behandlingen med RNA-seq och metylerad DNA-immunoprecipitation (MeDIP)-seq

  1. Använd RNA-seq för att utvärdera eventuell transkriptionell avreglering av hela genomet vid ETR-leverans.
    1. För både den reportertystade subpopulationen av proverna som behandlats med de tre bäst presterande gRNA:erna och skenbehandlade celler, extrahera RNA med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit. Bedöm kvaliteten och koncentrationen av RNA med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit.
    2. Utför RNA-fragmentering, retrotranskription och biblioteksberedning med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit för framställning av RNA-seq-bibliotek (enligt tillverkarens instruktioner).
    3. Utför bibliotekskvantifiering och kvalitetskontroll med hjälp av kvalitetskontrollinstrument som är kompatibla med nästa generations sekvensering och digital elektrofores.
    4. Sekvensbibliotek på nästa generations sequencer enligt tillverkarens instruktioner, med ett 100 bp parat protokoll och sikte på i genomsnitt 45 M läsningar/sampling.
    5. Justera lästaggar till lämpligt referensgenom och kvantifiera transkriptionsuttrycket. Utför justering på tdTomato-sekvensen och kvantifiera den separat.
      OBS: Här används STAR aligner (v 2.3.0)43, med standardparametrar, kopplad till Rsubread-paket44.
    6. Utföra analys av RNA-seq-data enligt publicerad bästa praxis45.
      OBS: R/Bioconductor-paketet edgeR46 används här, med ett filter på minst ett antal per miljon (cpm) i minst tre samples för att kassera lågt uttryckta gener. Alternativt kan funktionen filterByExpr i edgeR användas.
    7. Utvärdera differentiellt genuttryck med hjälp av en negativ binomial generaliserad log-linjär modell implementerad edgeR (funktion glmFit)47. Sätt ett tröskelvärde på 0,01 för justerade p-värden (Benjamini-Hochberg [BH] korrigering) för att behålla differentiellt reglerade gener.
  2. Utvärdera eventuell off-target CpG-metyleringsaktivitet för ETR:erna med MeDIP-seq.
    1. För både den reportertystade subpopulationen av proverna som behandlats med de tre bästa gRNA:erna och skenbehandlade celler, extrahera genomiskt DNA med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit (enligt tillverkarens instruktioner).
    2. Ultraljudsbehandling 500 ng av genomiskt DNA med hjälp av en ultraljudsapparat och följande parametrar: Tull: 20 %; PIP: 175; Cykler per serie: 200; Tid: 40 s.
    3. Förbered sekvenseringsbibliotek med de kommersiellt tillgängliga kiten för MeDIP-seq (följ tillverkarens instruktioner).
    4. Efter adapterligeringssteget, kvantifiera biblioteken med fluorometrisk analys och kontrollera ligeringseffektiviteten med qPCR med hjälp av kommersiellt tillgängliga bibliotekskvantifieringssatser (enligt tillverkarens instruktioner).
    5. Hämta bibliotekspooler genom att blanda slumpmässigt valda bibliotek för att minska tekniska biaser. Använd ett lika stort biblioteksbelopp (ng) för varje bibliotek för att balansera poolerna. Till varje pool, tillsätt det metylerade och ometylerade spik-in-kontroll-DNA:t som finns i satsen. I kontrollsyfte bör du behålla en volym på 10 % av biblioteket, märkt som "indata" och inte immunprecipiterad. Utför immunoprecipitering på de återstående 90 % av biblioteket med hjälp av den monoklonala antikroppen riktad mot 5-metylcytosin som finns i MeDIP-seq-kitet.
    6. Rena berikade bibliotek och ingångsbibliotek med hjälp av satserna för rening av 5-metylcytosinimmunprecipitationsprodukten, enligt tillverkarens instruktioner.
    7. Utvärdera anrikningseffektiviteten genom att utföra kvantitativ realtids-PCR på den interna spiken i kontroller med hjälp av primers som medföljer satsen. För varje immunoprecipitation (IP), beräkna anrikningsspecificiteten från utbytet av metylerat och ometylerat DNA, med hjälp av cykeltröskelvärdena (Ct) för MeDIP och ingångsfraktioner erhållna från qPCR-reaktionen (se ekvationerna 1 och 2):
      Equation 1 (1)
      Equation 2 (2)
      Överväg att IP-bibliotek lyckas om specificitetsvärdena är ≥0,95.
    8. Förstärk biblioteken med hjälp av MeDIP-seq-biblioteksförberedelsesatser, enligt tillverkarens instruktioner, och utför kvantifiering och analys av biblioteksstorleksfördelning av produkten.
    9. Utför bibliotekssekvensering på nästa generations sekvenserare. Använd parad sekvensering, med en läslängd på 100 bp, med sikte på i genomsnitt 30 M läsningar/sampling.
    10. Justera sekvenseringslästaggarna till lämpligt referensgenom (t.ex. hg38) med hjälp av bwa (v 0.7.5 eller högre)48 och identifiera sedan toppar med MACS (v 2.0.10 eller högre)49, vilket möjliggör identifiering av breda toppar (-slocal = 0,-llocal = 500000).
    11. Skapa en gemensam uppsättning regioner från olika prover med hjälp av BEDTools multiskärningsverktyg50, vilket aktiverar klustringsalternativet.
    12. Beräkna täckningen per exempel över den slutliga regionlistan med hjälp av BEDTools multicov och ta bort duplicerade läsningar.
    13. Utför analys av matrisantalet med hjälp av edgeR. Använd ett filter med minst ett antal per miljon (cpm) i minst tre exempel för att ta bort lågberikade regioner.
      OBS: Alternativt kan funktionen filterByExpr i edgeR användas.
    14. Identifiera differentiell metylering genom att anta den generaliserade log-linjära modellen implementerad i edgeR (funktion glmFit) och normalisera med hjälp av villkorlig kvantilnormalisering51 för att korrigera för regionvis GC-innehåll. Välj differentiellt metylerade regioner genom att tillämpa ett tröskelvärde på 0,01 på BH-justerade p-värden . Utför analysen av upprepade sekvenser enligt följande.
      OBS: Se användarhandboken för edgeR för en fullständig lista över alternativ och parametrar (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).
      1. Filtrera MeDIP-seq-resultat för ett nominellt p-värde <0,01 och skapa två uppsättningar regioner: välj regioner som har logFC >1 i den första uppsättningen och regioner som har logFC <-1 i den andra uppsättningen.
      2. Hämta RepeatMasker-anteckningen för det valda genomet som en bäddfil och räkna antalet element i varje uppsättning. Konvertera antalet som ett förhållande över antalet regioner för varje datauppsättning.
      3. Extrahera förhållandet mellan metylom som överlappar varje klass av upprepningar och utför ett Chi-två-test för att upptäcka eventuell betydande anrikning.
  3. Utvärdera om differentiellt transkriberade eller differentiellt metylerade regioner mellan ETR- och mock-behandlade prover mappas till in silico-predikterad gRNA-bindning utanför målet.
    1. Använd CRISPR design suite52 som verktyg för förutsägelse av gRNA-bindning utanför målet.
    2. För varje förmodad off-target-region tittar du på den närmaste transkriptionsstartplatsen (TSS) och den närmaste metylerade regionen. Betrakta som en verklig off-target-effekt en region som är associerad antingen med en gen som regleras med FDR <0,01 och ett avstånd till TSS som är mindre än 10 Kb, eller en metylerad region som regleras med FDR <0,01 och ett avstånd som är lägre än 1 Kb.
    3. Identifiera antalet och egenskaperna hos de regioner som transkriptionellt förändrats eller övermetylerats i prover som behandlats med vart och ett av de tre bäst presterande gRNA:erna jämfört med proverna som behandlats med simulerade prover (figur 5) för att identifiera de mest specifika bland gRNA:erna. Rangordna den potentiella effekten av ett icke-målställe på målcellernas fysiologi i följande ordning (från den mest påverkande till den mindre påverkande):
      i) Intragen, regulatorisk region-fysiologiskt uttryckt gen
      ii) Intragen, exonisk region-fysiologiskt uttryckt gen
      iii) Intragen, intronic region-fysiologiskt uttryckt gen
      iv) Intragen, regulatorisk region-ej uttryckt gen
      v) Intragen, exonisk region-ej uttryckt gen
      vi) Intragen, intronic region-ej uttryckt gen
      vii) Intergen region

Representative Results

Vid leverans av en donatormall för homolog rekombinationsmedierad integration av den fluorescerande reportern i mållokuset kopplat till CRISPR/Cas9-systemet (t.ex. genom plasmidnukleofektion i fallet med K-562-celler), uppträder reporterpositiva celler i det behandlade provet (figur 1, nederst). Om detta inte inträffar, kontrollera noggrannheten i design och kloning av både donatormallen och CRISPR/Cas9-reagenserna. Om det bekräftas, försök att optimera doserna av reagenser och själva leveransprotokollet.

När reportercellinjen har erhållits, välj promotor-/förstärkarsekvenser av målgenen och designa en panel av matchande gRNA. Använda in silico-prediktionsverktyg som Chopchop för att både identifiera gRNA-sekvenserna och rangordna dem i termer av förutspådd effektivitet och specificitet (figur 2). Om inga gRNA hämtas, kontrollera närvaron av det kanoniska Cas9-protospacer-intilliggande motivet (PAM) (5'-NGG-3') i målsekvensen. Om det inte finns några PAM-sekvenser kan du överväga att antingen byta till ETR:er baserade på alternativa PAM-oberoende Cas9-varianter (inga ETR:er har publicerats med dessa varianter ännu) eller byta till alternativa DNA-bindande domänplattformar, till exempel ZFP:er53 eller TALE:er30. Men om endast gRNA med låg predikterad effekt/specificitet hämtas, överväg att antingen 1) testa dessa gRNA av låg kvalitet eller 2) utöka mål-DNA-sekvensen i sökandet efter bättre gRNA. Vid transient tillförsel av trippel-ETR-kombinationen (eller CRISPRoff; v2.1) tillsammans med gRNA, utför longitudinella flödescytometrianalyser för uttrycket av den fluorescerande reportern, ofta observerande en topp i reporterrepression vid akuta analyser, som sedan åtminstone delvis reabsorberas på grund av mitotisk utspädning av de ETR-kodande plasmiderna över tid (Figur 4C). Om ETR/gRNA-kombinationen effektivt deponerar CpG-metylering på mållokuset, kommer permanent undertryckning av rapportören att ske i en betydande del av de behandlade cellerna (figur 4C). Olika gRNA kan uppvisa varierande långsiktig avstängningseffektivitet (Figur 4B,C).

För genomomfattande specificitetsbedömningar, använd MeDIP-seq för att identifiera de differentiellt metylerade regionerna mellan celler där målet har varit långvarigt tystat och obehandlat celler. I idealfallet kommer ett mycket specifikt gRNA endast att inducera en topp av de novo CpG-metylering vid målstället (Figur 5). Om inte, kan man överväga att karakterisera aktiviteten utanför målet för de gRNA som rankas i en lägre position i listan över måleffektivitet.

Figure 1
Figur 1: Integrering av en tdTomato-rapportör under de regulatoriska elementen i den humana B2M-genen genom homologiriktad reparation. Överst: Scheman över strategin för att integrera en tdTomat-fluorescerande reporter i den första intron av den humana B2M-genen genom CRISPR/Cas9-inducerad homologiriktad reparation. Nederst: representativa punktdiagram av K-562-celler före och efter integration av tdTomatoreportern i den första intronen av B2M-genen . Förkortningar: HA = homologiarm; HDR = homologiriktad reparation; IRES = ingång till inre ribosom. pa = BGH poly(A), SA = plats för skarvacceptor, WT = vildtyp; 3XSTOP = tre in-tandem stoppkodon. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: In silico-identifiering av gRNA riktade mot CpG-ön i B2M-genen , rankad för förutspådd effektivitet och specificitet. Chopchops utgångsgränssnitt visar gRNA som riktar sig mot CpG-ön inbäddad i promotorsekvensen av B2M-genen , rankad för både antalet off-target-sekvenser med 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) eller 3 (MM3) missmatchningar och den förutsagda måleffektiviteten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Kloning och arrayad nukleofektion av gRNA för dCas9 ETR-medierad epigenetisk avstängning. Överst: oligomedierad protospacerkloning i en human U6-gRNA-uttryckande plasmid. Nederst: arrayad skärm av B2M-riktade gRNA för CRISPR/dCas9-baserad epigenetisk avstängning genom plasmidnukleofektion i K-562B2M/tdTomatceller . Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Screening för gRNA som effektivt inducerar långvarig avstängning av B2M-genen. (A) Överst: scheman över B2MtdTomato-genen avbildad i det förstorade området, den relativa ordningen och orienteringen av bindningen av dCas9-baserade ETR:er komplexerade med gRNA. Nederst: representativa punktdiagram av B2MtdTomato K-562-celler antingen före (vänster) eller efter (höger) ETR-avstängning. Analyser 30 dagar efter transfektion med plasmider som kodar för gRNA och trippelkombinationen dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L. (B) Avstängningsaktivitet hos de angivna gRNA:erna (antingen i pooler eller som enskilda gRNA) riktade mot CpG-ön B2M (röda pilar i det övre schemat indikerar orienteringen av gRNA) i K-562 B2M tdTomatoceller dag 30 efter transfektion. Data visar procentandelen tdTomato-negativa celler (medelvärde ± SEM; n = fyra oberoende transfektioner för varje behandlingstillstånd). (C) Tidsförloppsanalys av B2MtdTomato K-562-celler vid transfektion med plasmider som uttrycker trippel-ETR-kombinationen och de indikerade B2M CpG-ö-riktade gRNA:erna eller mock (gRNA- och ETR-fri transfektion). Data visar procentandelen tdTomato-negativa celler (medelvärde ± SEM; n = tre oberoende transfektioner för varje behandlingstillstånd). Opublicerade data. Panel A och B anpassade från Amabile et al.30. Förkortningar: CGI = CpG-ön; IRES = ingång till inre ribosom. pa = BGH poly(A), SA = plats för skarvacceptor, SD = skarvgivarplats; TSS = startplats för transkription; UT = ej transfekt; 3XSTOP = 3 in-tandem stoppkodon. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Genomomfattande analys av ETR-specificiteten med RNA-seq och MeDIP-seq. Till vänster: jämförelse av uttrycksnivåer i mock-behandlade B2MtdTomat K-562-celler och celler som behandlats med trippelkombinationen dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR och med ett gRNA som riktar sig mot CpG-ön i B2M-genen. Värdena uttrycks i log2 av läsningar per kilobas per miljon (RPKM) mappade läsningar. Svarta prickar representerar gener som uttrycks på jämförbara nivåer under alla förhållanden. gula cirklar representerar gener som regleras differentiellt under en FDR <0,01; röd cirkel representerar B2M-IRES-tdTomato-transkriptionen. Överst till höger: circos-diagram som visar MeDIP-seq-profiler för mock-behandlade B2MtdTomat K-562-celler (blå) eller celler som behandlats med trippelkombinationen dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR och med ett gRNA som riktar sig mot CpG-ön (CGI) i B2M-genen (grön). Nederst till höger: metyleringsstatusen för B2MtdTomato-lokus i de angivna proverna visas. Tre replikat finns representerade i varje hög; Högen av justerade läsningar utjämnades med hjälp av ett gaussiskt fönster. Denna siffra har anpassats från Amabile et al.30. Förkortning: TSS = transkriptionens startsida. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Riktad epigenetisk avstängning kan utgöra en lovande lösning för att behandla sjukdomar som kan dra nytta av permanent geninaktivering, inklusive sjukdomar orsakade av gain-of-function-mutationer1, infektionssjukdomar2 och patologier där avstängning av en gen antingen kan kompensera för en ärftlig defekt i en annan3 eller frigöra den fulla potentialen hos adoptiva cellterapier4, 5. veckor Genom att verka på kromatinnivå och förökas automatiskt av cellen 7,30,32 kan epigenetisk avstängning undvika toxiska förändringar (t.ex. kromosomala omlagringar) av målgenens DNA-sekvens och partiell, övergående avstängning av målet, vilket är begränsningar för artificiell nukleasbaserad genstörning 8,34,35 respektive RNAi-baserad knockdown 33.

Ett av de viktigaste preliminära stegen i alla epigenetiska avstängningsprotokoll är att identifiera den rätta positionen på målgenen för att styra de ETR:er som kommer att deponera de repressiva epigenetiska markörer som är nödvändiga för att stänga av målets transkriptionsaktivitet. Olika transkriptionella startplats-proximala och -distala regulatoriska element kan samverka för att stödja transkriptionsproduktionen av en given human gen54. Dessutom kan olika målplatser per specifikt regulatoriskt element nu identifieras tack vare det växande antalet programmerbara DNA-bindningstekniker6. Därför kan protokoll, som det som beskrivs här i Engineered Cellines, användas för att nominera enskilda målplatser och/eller genomiska regioner som är mottagliga för ETR-medierad epigenetisk avstängning, innan man påbörjar besvärliga och tidskrävande utvärderingsinsatser av de bästa kandidaterna i den slutliga terapeutiska miljön. Några kritiska aspekter av protokollet beskrivs närmare nedan.

Konstruktion av en reportercellinje som förutsäger det slutliga terapeutiska målet
Trots den ständiga optimeringen av celltekniska protokoll - som krävs här för att sätta in kassetten som kodar för den fluorescerande reportern i målgenen och för att leverera ETR:erna - kan det inte tas för givet att de kanske redan är tillgängliga för den cellinje som mest liknar det slutliga terapeutiska målet mest. I det här fallet kan olika begränsningsstrategier tillämpas: a) dra nytta av optimeringssatser som tillhandahålls av leverantörer för att internt optimera transfektionsprotokollet för målcellinjen; b) byte till andra cellinjer som fortfarande uttrycker målgenen men som tillhör andra vävnader än det slutliga terapeutiska målet - för vilka tekniska protokoll har optimerats i stor utsträckning. Om dessa alternativ inte är tillgängliga kan man överväga att byta till primära celltyper eller organoider som representerar det slutliga målet. Som ett allmänt övervägande för både prekliniska studier och terapeutiska tillämpningar av ETR-baserad epigenetisk avstängning bör scenarier där målgenen är avgörande för målcelltypen förkastas. En fullständig, långsiktig nedtystning av en essentiell gen som påtvingas av ETR kommer att leda till motselektion av målcellerna över tid (och, potentiellt, toxicitet av behandlingen). Alternativa tekniker som ger partiell målabrogation, såsom RNAi33, är att föredra i dessa fall.

Utvärdering av den målinriktade nedtystningsaktiviteten hos de effektiva återkommande aktörerna
ETR:er baserade på kombinationen av KRAB-, DNMT3A- och DNMT3L-effektordomäner har visat sig vara effektiva mot den stora majoriteten av proteinkodande gener, med ett brett 1 kilobas långt tillåtande målfönster centrerat på transkriptionsstartstället32. För att få en känsla av hur ett väl utfört epigenetiskt avstängningsexperiment ser ut, finns de tekniska detaljerna och resultaten av att tysta B2M-genen i K-562-celler här. Detta kan betraktas som en viktig positiv kontroll som ska inkluderas inte bara av forskare som arbetar med K-562-celler utan också av dem som närmar sig den ETR-baserade tekniken för första gången. Som anges i protokollet rekommenderas artificiell nukleas (t.ex. CRISPR/Cas9)-baserad genstörning som en ytterligare kontroll av både effektiviteten av genleverans i den aktuella celltypen och av fenotypen hos celler som berövats målgenen. Efter den första screeningen av gRNA som ska kopplas till CRISPR/dCas9-baserade ETR, om ingen av de testade gRNA:erna permanent kan tysta målgenen, bör man överväga, i följande ordning: 1) öka mängden gRNA och ETR som levereras; 2) testa pooler av de bästa gRNA:erna och leta efter synergistiska effekter mellan dem. Om långvarig avstängning fortfarande inte uppnås bör man överväga: 3) testa ytterligare gRNA, som kan rikta in sig på platser som är mer relevanta för att instruera epigenetisk avstängning; 4) byte till ZFP8- eller TALE9-baserade DBD-plattformar, som kan ha en förbättrad bindningsförmåga till målkromatinet; 5) byta från transient till stabil - till exempel integrera viralt vektorbaserat uttryck av ETR:erna (antingen gRNA- eller dCas9-fusionskonstruktionerna eller båda när man använder CRISPR/dCas9-tekniken). Eftersom vår grupp utvecklade, och har gedigen erfarenhet av, samleverans av de tre separata ETR:erna30, är protokollet och resultaten som visas här baserade på detta tillvägagångssätt. Ett liknande konceptuellt arbetsflöde kan dock sannolikt tillämpas för ett allt-i-ett CRISPR-baserat system32.

Utvärdering av de effektiva skattesatsernas verksamhet utanför målet
Flera studier har visat preliminära in vitro-indikationer på specificiteten hos ETR baserat på kombinationen av KRAB-, DNMT3A- och DNMT3L-effektordomänerna30,31,32. Om dock ingen av de testade gRNA:erna uppvisar en tillfredsställande specificitetsprofil när det gäller transkriptionsreglering och/eller de novo-DNA-metylering, kan man använda sig av två icke-ömsesidigt uteslutande strategier: a) att minska ETR:ernas uppehållstid inuti cellen (och följaktligen deras potentiella aktivitet utanför målet) genom att antingen minska doserna av ETR eller testa alternativa leveranssystem. Jämfört med plasmider förväntas till exempel både mRNA- och proteinleverans minska cellens exponeringstid för ETR och därmed sannolikheten för aktivitet utanför målet55. b) byta till nyare Cas9-varianter, optimerade för att minska off-target-bindningen av plattformen56, eller till alternativa ZFP8- eller TALE9-baserade DNA-bindningstekniker. Det är viktigt att ta hänsyn till att, jämfört med prover, påverkas aktiviteten vid nedtystning av gener inte bara av DBD:ns bindning till målsekvensen utan också av den potentiella kapaciteten hos de epigenetiska effektordomänerna att rekryteras till andra loci av deras naturliga, endogena kofaktorer. En minskning av uppehållstiden för ETR i målcellen kan därför minska inte bara sannolikheten för DBD-bindning till platser utanför målområdet, utan även sannolikheten för att ETR interagerar med endogena kofaktorer, med potentiella fördelar i form av specificitet och nackdelar i form av aktivitet på målet. Slutligen, jämfört med skenbehandlade prover, kan några av de transkriptionella och mindre sannolika CpG-metyleringsförändringarna som uppmätts i tystade celler helt enkelt härledas genom berövande av målgenen. Dessa anses inte vara off-targets för ljuddämpningstekniken. För att identifiera dem bör man också inkludera genstörning av artificiellt nukleas i experimentpanelen 8,9,10. Biologiska förändringar på grund av funktionsförlusten av målgenen kommer att delas mellan epigenetisk avstängning och denna alternativa teknik.

Disclosures

AL är medgrundare, kvotinnehavare och konsult för Chroma Medicine, Inc.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica och Deborah Cipria för samarbetet för att utveckla den epigenetiska avstängningstekniken genom åren; Dejan Lazarevic och Francesca Giannese för kritisk granskning av RNA-seq- och MeDIP-seq-analyserna som beskrivs i protokollet. Detta arbete stöddes av bidrag till A.L. från Telethon Foundation (TIGET-anslag nr F1) och EU:s Horizon 2020-program (UPGRADE). Illustrationer har skapats med BioRender.com.

FÖRFATTARENS BIDRAG
A.M., M.A.C., F.G. och A.C. bidrog till utformningen av protokollet och till att skriva manuskriptet; S.V., I.M. och D.C. utformade de bioinformatiska avsnitten i protokollet och reviderade manuskriptet; A.M. och A.L. utformade protokollet, utarbetade och skrev manuskriptet med input från alla författare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt
actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg
aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc
agtaactggttgagcccaaattcaaacccagc
ctgtctgatacttgtcctcttcttagaaaagattac
agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct
caaacagagagttccaggcaggatgaatctgt
gctctgatccctgaggcatttaatatgttcttatta
ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagct
tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga
ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttct
cttcctcccacagggataactagatgactcgag
ggatccgaattcctgcaggcctcgacgagggc
cggcgcgccgcggccgctacgtaaattccgc
cccccccccccctctccctcccccccccctaac
gttactggccgaagccgcttggaataaggccg
gtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgc
cgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacct
ggccctgtcttcttgacgagcattcctagggg
tctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtc
tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg
gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc
gaccctttgcaggcagcggaaccccccacctg
gcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacg
tgtataagatacacctgcaaaggcggcacaac
cccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga
aagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaac
aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc
attgtatgggatctgatctggggcctcggtgcaca
tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacg
tctaggccccccgaaccacggggacgtggtttt
cctttgaaaaacacgatgataatatggccacaa
ccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaa
agagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcgaggg
cgagggcgagggccgcccctacgagggcac
ccagaccgccaagctgaaggtgaccaaggg
cggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc
cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg
tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag
aagctgtccttccccgagggcttcaagtgggag
cgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtg
accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg
cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca
ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag
aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg
agcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaa
gggcgagatccaccaggccctgaagctgaa
ggacggcggccactacctggtggagttcaag
accatctacatggccaagaagcccgtgcaac
tgcccggctactactacgtggacaccaagctg
gacatcacctcccacaacgaggactacacca
tcgtggaacagtacgagcgctccgagggccg
ccaccacctgttcctggggcatggcaccggca
gcaccggcagcggcagctccggcaccgcctc
ctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaa
gagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcga
gggcgagggcgagggccgcccctacgag
ggcacccagaccgccaagctgaaggtgac
caagggcggccccctgcccttcgcctgggac
atcctgtccccccagttcatgtacggctccaa
ggcgtacgtgaagcaccccgccgacatcccc
gattacaagaagctgtccttccccgagggcttc
aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggac
ggcggtctggtgaccgtgacccaggactcct
ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt
gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga
cggccccgtaatgcagaagaagaccatggg
ctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccc
cgcgacggcgtgctgaagggcgagatccac
caggccctgaagctgaaggacggcggcca
ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc
caagaagcccgtgcaactgcccggctactact
acgtggacaccaagctggacatcacctccca
caacgaggactacaccatcgtggaacagtac
gagcgctccgagggccgccaccacctgttcct
gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg
ccgcgtcgacctgtgccttctagttgccagccatc
tgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct
ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataa
aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg
tgtcattctattctggggggtggggtggggcag
gacagcaagggggaggattgggaagacaat
agcaggcatgctggggatgcggtgggctctat
ggcttaagtgatggggctagtagcctttccttaa
tgatagggtgtttctagagagatatatctggtca
aggtggcctggtactcctccttctccccacagc
ctcccagacaaggaggagtagctgccttttag
tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaaaag
aattttatacacatatatttagtgtcaatctgtatat
ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga
aaaatatagagtttataatattttcttcccacttc
cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics. 9 (6), 909-916 (2000).
  2. Tebas, P., et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. The New England Journal of Medicine. 370 (10), 901-910 (2014).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Murty, T., Gene Mackall, C. L. Gene editing to enhance the efficacy of cancer cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3153-3162 (2021).
  5. Lanza, R., Russell, D. W., Nagy, A. Engineering universal cells that evade immune detection. Nature Reviews Immunology. 19 (12), 723-733 (2019).
  6. Matharu, N., Ahituv, N. Modulating gene regulation to treat genetic disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (11), 757-775 (2020).
  7. Sgro, A., Blancafort, P. Epigenome engineering: New technologies for precision medicine. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12453-12482 (2020).
  8. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  9. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  11. Gilbert, L. A., et al. XCRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442 (2013).
  12. Snowden, A. W., Gregory, P. D., Case, C. C., Pabo, C. O. Gene-specific targeting of H3K9 methylation is sufficient for initiating repression in vivo. Current Biology. 12 (24), 2159-2166 (2002).
  13. Chen, X., et al. Construction and validation of the CRISPR/dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification. Biochemical and Biophysical Research Communications. 511 (2), 246-252 (2019).
  14. Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature Communications. 8, 15215 (2017).
  15. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  16. Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D. KRAB zinc finger proteins. Development. 144 (15), 2719-2729 (2017).
  17. Witzgall, R., O'leary, E., Leaf, A., Onaldi, D., Bonventre, J. The Kruppel-associated box-A (KRAB-A) domain of zinc finger proteins mediates transcriptional repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (10), 4514-4518 (1994).
  18. Mannini, R., et al. Structure/function of KRAB repression domains: Structural properties of KRAB modules inferred from hydrodynamic, circular dichroism, and FTIR spectroscopic analyses. Proteins: Structure, Function and Genetics. 62 (3), 604-616 (2006).
  19. Friedman, J. R., et al. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes and Development. 10 (16), 2067-2078 (1996).
  20. Iyengar, S., Farnham, P. J. KAP1 protein: An enigmatic master regulator of the genome. The Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26267-26276 (2011).
  21. Schultz, D. C., Friedman, J. R., Rauscher, F. J. Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2α subunit of NuRD. Genes and Development. 15 (4), 428-443 (2001).
  22. Schultz, D. C., Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G. G., Rauscher, F. J. SETDB1: A novel KAP-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1-mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes and Development. 16 (8), 919-932 (2002).
  23. Nielsen, A. L., et al. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. The EMBO Journal. 18 (22), 6385-6395 (1999).
  24. Sripathy, S. P., Stevens, J., Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 26 (22), 8623-8638 (2006).
  25. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. ChemBioChem. 12 (2), 206-222 (2011).
  26. Jia, D., Jurkowska, R. Z., Zhang, X., Jeltsch, A., Cheng, X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449 (7159), 248-251 (2007).
  27. Tajima, S., Suetake, I., Takeshita, K., Nakagawa, A., Kimura, H. Domain structure of the Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 945, 63-86 (2016).
  28. Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  29. Ishiyama, S., et al. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenance. Molecular Cell. 68 (2), 350.e7-360.e7 (2017).
  30. Amabile, A., et al. Inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-run targeted epigenetic editing. Cell. 167 (1), 219.e14-232.e14 (2016).
  31. Mlambo, T., et al. Designer epigenome modifiers enable robust and sustained gene silencing in clinically relevant human cells. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4456-4468 (2018).
  32. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503.e17-2519.e17 (2021).
  33. Davidson, B. L., McCray, P. B. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 329-340 (2011).
  34. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine. 24 (7), 927-930 (2018).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  37. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  38. Uhlén, M., et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), (2015).
  39. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  40. Kent, W. J., et al. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).
  41. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  42. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
  43. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  44. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Research. 41 (10), e108-e108 (2013).
  45. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. GenomeBiology. 17, 13 (2016).
  46. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  47. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  48. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  49. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), R137 (2008).
  50. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 47, (2014).
  51. Hansen, K. D., Irizarry, R. A., Wu, Z. Removing technical variability in RNA-seq data using conditional quantile normalization. Biostatistics. 13 (2), 204-216 (2012).
  52. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  53. Zeitler, B., et al. Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington's disease. Nature Medicine. 25 (7), 1131-1142 (2019).
  54. Andersson, R., Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nature Reviews Genetics. 21 (2), 71-87 (2020).
  55. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  56. Han, H. A., Pang, J. K. S., Soh, B. -S. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. Journal of Molecular Medicine. 98 (5), 615-632 (2020).

Tags

Bioteknik utgåva 195 riktad epigenetisk avstängning geninaktivering RNA-interferens artificiella nukleaser DNA-dubbelsträngsbrott epigenetisk redigering programmerbar DNA-bindande domän KRAB-domän DNMT3A DNMT3L ärftliga repressiva epigenetiska tillstånd smitningsförmåga DNA-demetylering
<em>In vitro</em> Val av konstruerade transkriptionsrepressorer för riktad epigenetisk avstängning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Migliara, A., Cappelluti, M. A.,… More

Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter