Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Bu protokol, gen ekspresyonu ve histolojik analizler için fare endometriyal epitel organoidlerini oluşturma metodolojilerini açıklamaktadır.

Abstract

Endometriyal doku uterusun iç boşluğunu kaplar ve östrojen ve progesteronun döngüsel kontrolü altındadır. Luminal ve glandüler epitel, stromal kompartman, vasküler ağ ve kompleks immün hücre popülasyonundan oluşan bir dokudur. Fare modelleri, endometriyumu incelemek için güçlü bir araç olmuştur ve implantasyonu, plasentasyonu ve kanseri kontrol eden kritik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. 3D endometriyal organoid kültürlerin son zamanlardaki gelişimi, endometriyal biyolojinin altında yatan sinyal yollarını incelemek için son teknoloji ürünü bir model sunmaktadır. Genetiği değiştirilmiş fare modellerinden endometriyal organoidler oluşturmak, transkriptomlarını analiz etmek ve morfolojilerini tek hücreli bir çözünürlükte görselleştirmek, endometriyal hastalıkların incelenmesi için çok önemli araçlardır. Bu makale, farelerden endometriyal epitelin 3D kültürlerini oluşturma yöntemlerini özetlemekte ve gen ekspresyonunu ölçmek ve organoidlerin histolojisini analiz etmek için teknikleri açıklamaktadır. Amaç, endometriyal epitel organoidlerinin gen ekspresyonunu ve morfolojik özelliklerini oluşturmak, kültürlemek ve incelemek için kullanılabilecek bir kaynak sağlamaktır.

Introduction

Endometriyum - uterus boşluğunun iç astar mukozal dokusu - bir kadının üreme sağlığında kritik rol oynayan benzersiz ve oldukça dinamik bir dokudur. Üreme ömrü boyunca, endometriyum, yumurtalık hormonlarının - östrojen ve progesteronun uyumlu etkisiyle koordine edilen yüzlerce proliferasyon, farklılaşma ve parçalanma döngüsüne girme potansiyeline sahiptir. Genetiği değiştirilmiş fareler üzerinde yapılan çalışmalar, hormonlara endometriyal yanıtı ve embriyo implantasyonunun, stromal hücre desidualizasyonunun ve gebeliğin kontrolünü destekleyen temel biyolojik mekanizmaları ortaya çıkarmıştır1. Bununla birlikte, in vitro çalışmalar, geleneksel 2D hücre kültürlerinde transforme edilmemiş primer fare endometriyal dokularının korunmasındaki zorluklar nedeniyle sınırlandırılmıştır 2,3. 3D organ sistemleri veya organoidler olarak endometriyal dokuların kültüründeki son gelişmeler, endometriyal hücre rejenerasyonunu ve farklılaşmasını kontrol eden biyolojik yolları araştırmak için yeni bir fırsat sunmaktadır. Fare ve insan endometriyal organoid sistemleri, çeşitli matrislerde kapsüllenmiş saf endometriyal epiteldengeliştirilmiştir 4,5, insan endometriyumu ise iskelesiz epitel / stromal ko-kültürler 6,7 ve daha yakın zamanda kollajen kapsüllü epitel / stromal assembloidler8 olarak kültürlenmiştir. . Epitelyal organoid kültürlerin büyüme ve rejeneratif potansiyeli, organoidlerin büyümesini ve rejenerasyonunu en üst düzeye çıkarmak için ampirik olarak belirlenmiş büyüme faktörleri ve küçük molekül inhibitörlerinin tanımlanmış bir kokteyli ile desteklenmektedir 4,5,9. Ayrıca, endometriyal organoidleri dondurma ve çözme yeteneği, endometriyal organoidlerin farelerden ve insanlardan gelecekteki çalışmalar için uzun vadeli bankacılığına izin verir.

Genetiği değiştirilmiş fareler, erken gebelik ve desidualizasyonu kontrol eden karmaşık sinyal yollarını ortaya çıkarmış ve gebelik kaybı, endometriyal kanser ve endometriozis modelleri olarak kullanılmıştır. Bu genetik çalışmalar, özellikle kadın üreme dokularında aktif olan cre rekombinazları kullanılarak loxP yan alellerinin ("floksed") hücreye özgü delesyonuyla büyük ölçüde elde edilmiştir. Bu fare modelleri, endometriyal epitel ve stromal dokularda güçlü rekombinaz aktivitesine sahip olan yaygın olarak kullanılan progesteron reseptörü-cre10'u, yetişkin farelerde endometriyal epitel rekombinasyonunu indükleyen laktoferrin i-cre11'i veya Müllerian türevi dokularda epitelyal spesifik delesyonu tetikleyen Wnt7a-cre'yi içerir12 . Genetiği değiştirilmiş fare modellerinden endometriyal dokuların 3D organoidler olarak kültürlenmesi, endometriyal biyolojiyi araştırmak ve endometriyal hücre yenilenmesini ve farklılaşmasını kontrol eden büyüme faktörlerinin ve sinyal yollarının tanımlanmasını kolaylaştırmak için mükemmel bir fırsat sağlamıştır13,14. Literatürde fare endometriyal dokusunun izolasyonu ve kültürü için yöntemler tanımlanmış ve endometriyal epitel organoidlerinin daha sonraki kültürlenmesi için uterus epitelinin izolasyonu için çeşitli enzimatik stratejilerin kullanımı bildirilmiştir4. Önceki literatür endometriyal epitel organoid kültür protokolleri 4,5,6 için eleştirel bir çerçeve sağlarken, bu makale bu organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi, işlenmesi ve analiz edilmesi için açık ve kapsamlı bir yöntem sunmaktadır. Bu tekniklerin standardizasyonu, kadın üreme biyolojisi alanındaki ilerlemeleri hızlandırmak için önemlidir. Burada, bir jel matriks iskelesinde endometriyal organoidlerin sonraki kültürü için fare endometriyal epitel dokusunun enzimatik ve mekanik saflaştırılması için ayrıntılı bir metodoloji sunuyoruz. Ayrıca, jel matriks kapsüllü fare endometriyal epitel organoidlerinin aşağı akış histolojik ve moleküler analizleri için metodolojileri de açıklıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fare kullanımı ve deneysel çalışmalar, Baylor College of Medicine Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu tarafından oluşturulan kılavuzlar kapsamında gerçekleştirilmiştir.

1. Uterus epitelinin enzimatik ve mekanik yöntemler kullanılarak farelerden izole edilmesi

NOT: Bu bölümde, jel matris iskelesi kullanarak farelerden epitelyal endometriyal organoidlerin kurulması, geçişi, dondurulması ve çözülmesi için gereken adımlar açıklanmaktadır. Önceki çalışmalar, fare endometriyal organoidlerinin optimal kültürlerinin, vajinal sürüntü15'in sitolojik incelemesiyle belirlenebilen östrus fazı4 sırasında farelerden kurulduğunu belirlemiştir. Tüm deneyler için yetişkin dişi WT fareleri (6-8 haftalık, hibrid C57BL / 6J ve 129S5 / SvEvBrd) kullanıldı. Fareler, IACUC onaylı kılavuzlara göre, izofluran sedasyonu ve ardından servikal dispartikülasyon kullanılarak insani olarak ötenazi yapıldı. Fareler ötenazi yapıldıktan sonra, aşağıdaki adımlar izlenmelidir. Bu protokolde kullanılan malzemeler ve çözümlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

  1. Jel matrisinin kullanımdan önce yaklaşık 1-2 saat boyunca buz üzerinde çözülmesine izin verin.
  2. Fareyi diseke etmek için, karın üzerinde orta çizgide bir kesi yapmak için makas kullanın ve altta yatan periton tabakasını ortaya çıkarmak için cildi yavaşça geri soyun. Peritoneal tabakayı tutmak için forseps kullanın ve karın içeriğini ortaya çıkarmak için makasla lateral kesikler yapın.
    1. Karın yağ yastıklarını hafifçe bir kenara iterek uterus boynuzlarını bulun. Önce servikal kavşakta tutarak ve mezenterik yağ boyunca kesmek için makas kullanarak onları disseke edin. Fare uterusunun diseksiyonunu takiben, uterus boynuzundan yağ dokusunu küçük makasla iyice çıkarın.
      NOT: Kullanmadan önce tüm ameliyat aletlerini sterilize ederek hücre izolasyonu sırasında steriliteyi koruyun, fare karnına% 70 etanol püskürtün ve steril bir doku kültürü başlığı altında diseksiyonu takip eden tüm adımları uygulayın.
  3. Her uterus boynuzunu her biri yaklaşık 4-5 mm ölçülen küçük parçalar halinde kesin.
  4. Tüm uterus parçalarını bir uterustan 0.5 mL% 1 Tripsin içeren 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Enzimatik çözeltinin uterus lümenine girmesine izin vererek, endometriyal epitelin altta yatan stromadan enzimatik olarak ayrılmasına neden olur.
  5. 24 delikli plakayı 37 °C nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe yaklaşık 1 saat boyunca inkübe edin.
  6. 1 saatlik inkübasyondan sonra, uterus fragmanlarını 1 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu çözeltisini (DPBS) içeren 35 mm'lik bir doku kültürü plakasına aktarın.
  7. Diseksiyon mikroskobu altında, uterus epitelini uterus tüpünden mekanik olarak ayırmak için ince forseps ve 1 mL'lik bir pipet kullanın. Forsepslerle uterus parçasının bir ucunu tutarken, pipet ucunu yavaşça parça boyunca uzunlamasına çalıştırın ve epiteli uterus tüpünün diğer ucundan sıkın. Diseksiyon mikroskobu altında uterus fragmanından ayrılmış epitel tabakalarını gözlemleyin.
  8. Epitel tabakalarını toplamak ve nazikçe 1,5 mL'lik bir tüpe aktarmak için 1 mL pipeti kullanın.
  9. Kalan uterus parçaları için işlemi tekrarlayın, tüm epitel tabakalarını aynı toplama tüpüne aktarın.
  10. Ayrışmış epitel tabakalarını 375 × g'da 5 dakika santrifüjleme ile toplayın.
  11. Hücre peletini rahatsız etmemek için süpernatantı dikkatlice çıkarın.
  12. Hücre peletini 0.5 mL 2.5 mg / mL kollajenaz + 2 mg / mL DNaz çözeltisinde yeniden askıya alın. Pipetleri yaklaşık 10 kat yukarı ve aşağı veya tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar yukarı ve aşağı doğru yapın.
  13. 0.5 mL DMEM / F12 +% 10 fetal sığır serumu (FBS) + antibiyotik ekleyin ve hücreleri 375 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    NOT: Hücre kültürü için kullanılan geniş spektrumlu antibiyotik hakkında daha fazla bilgi için, Malzeme Tablosuna bakın.
  14. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücreleri 1 mL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotik içinde yeniden askıya alın. Hücreleri 375 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın.

2. Stromal bölmenin işlenmesi

NOT: Bu bölümde, fare endometriyumunun stromal bölmesini izole etmek için gerekli protokoller özetlenmektedir. Epitel / stromal ko-kültür deneylerine artan ilgi göz önüne alındığında, organoidleri üretecek epitel hücrelerine ek olarak stromal hücre popülasyonlarını da işleyebilmek önemlidir.

  1. Tüm epitel uterus fragmanlarından enzimatik ve mekanik olarak ayrıldıktan sonra, kalan tüp benzeri yapılar "stromal / miyometriyel" bölmelerdir. Bu dokuyu HBSS çözeltisinde 2.5 mg / mL kollajenaz + 2 mg / mL DNaz içinde toplayın.
  2. Stromal / myometriyal numuneyi 15 dakika boyunca 37 ° C'lik bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
  3. Kuluçkayı takiben, fare başına 500 μL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotik ekleyin ve ayrışmamış parçaları 40 μm hücre filtresinden filtreleyin.
  4. Hücreleri 375 × g'da 5 dakika santrifüjleme ile toplayın.
  5. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve hücre peletini 1 mL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotik içinde yeniden askıya alın. Karışımı 10 cm'lik bir hücre kültürü plakasına 10 mL DMEM / F12 +% 10 FBS + antibiyotiklere damla damla ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Fare endometriyal epitel ve stromal hücrelerinin ortak kültürlerini oluşturmak için, iskelesiz veya kollajen matriks sistemleri kullanarak insan endometriyal organoidleri için açıklanan yöntemleri izleyin 6,8.
    NOT: Bu teknikler fareler için henüz yayınlanmamış olsa da, insan endometriyumu ile yayınlanan protokollere dayanarak uyarlanabilirler.

3. Organoidleri oluşturmak için uterus epitelinin jel matrisine kapsüllenmesi

NOT: Jel matrisini kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.

  1. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini, hücre peletinin 20 katı olan bir jel matrisi hacminde yeniden askıya alın (yani, hücre peleti 20 μL ise, hücreleri 400 μL jel matrisi ile yeniden askıya alın). Kabarcıkların ortaya çıkmasını önlemek için peleti dikkatlice askıya alın.
  2. Jel matris/hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında ~ 10 dakika boyunca yerleşmesine izin verin.
  3. Jel matris/hücre süspansiyonu yarı katı bir jel haline geldiğinde, jel matris/hücre süspansiyonunun 25 μL'sini nazikçe aspire etmek için geniş delikli 200 μL uçlu bir P200 mikropipet kullanın. 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğu başına üç ayrı 25 μL kubbe dağıtın ve jel matrisinin 37 ° C nemlendirilmiş doku kültürü inkübatöründe 15 dakika boyunca sertleşmesine izin verin.
  4. Jel matrisi kürlendikten sonra, jel matris kubbeleri içeren her bir kuyucuğa 750 μL organoid ortam ekleyin. Nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Organoid ortam formülasyonu Malzeme Tablosunda belirtilmiştir. Organoidler tipik olarak ilk kültürden sonraki 4 gün içinde oluşur.

4. Östradiol ile tedaviyi takiben endometriyal organoidlerin gen ekspresyon analizi

NOT: Bu bölümde, östradiol ile tedaviyi takiben gerçek zamanlı qPCR kullanarak endometriyal epitel organoidlerinin gen ekspresyonunun profilini çıkarmak için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır (E2; bakınız Tablo 1). Endometriyum, yumurtalık hormonu E2'nin döngüsel kontrolü altında olduğundan, organoidlerin E2'ye duyarlılığını test etmek, fizyolojik fonksiyonun önemli bir ölçüsüdür. Yüksek kaliteli RNA elde ettik ve endometriyal epitel organoidlerimizden qPCR ve / veya RNA dizilimini kullanarak gen ekspresyonunu profillemek için yeterli mRNA ürettik. Bu bölümde, organoidlerin nasıl toplanacağı ve gen ekspresyonunun aşağı akış analizi için nasıl işleneceği açıklanmaktadır. Seçilen tedavi ortamı, kültürlenmiş endometriyal hücreleri tedavi etmek için kullanılanı yansıtır. Bununla birlikte, bu tedavi ortamının, insan endometriyal 3D kültürlerinin 8,16,17 hormonlarıyla tedavisi için yapıldığı gibi, buna göre optimize edilebileceği belirtilmelidir.

  1. Kültür yukarıda tarif edildiği gibi endometriyal organoidler.
  2. Organoid ortamı çıkarın ve tohumlamadan dört gün sonra 750 μL açlık ortamı ile değiştirin. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
  3. Ertesi sabah, açlık ortamını çıkarın. Araç veya 10 nM E2 içeren 750 μL arıtma ortamı ekleyin. 48 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
  4. Kit üreticisinin protokolünü izleyerek RNA izolasyonuna devam edin.

5. Endometriyal organoidlerin histolojik analizi

NOT: Endometriyal organoidlerin morfolojik özelliklerinin görüntülenmesi, büyüme faktörlerinin, genetik manipülasyonların veya küçük molekül inhibitörlerinin hücresel etkisini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir. Bu bölümde histolojik boyalar ve antikor immünofloresan boyama kullanılarak endometriyal epitel organoidlerinin fiksasyonu, işlenmesi ve görüntülenmesi için kullanılan teknikler açıklanmaktadır.

  1. 1x PBS'de 1 mL% 4 paraformaldehit içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Onları buzun üzerine yerleştirin.
  2. Ortamı, organoidleri içeren 12 delikli plakanın kuyucuklarından aspire edin.
  3. Kesilmiş uçlu 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak, her bir oyuğa 500 μL% 4 paraformaldehit aktarın ve jel matris kubbelerini plakanın altından yavaşça ayırın.
  4. Tüm jel matris kubbelerini pipet ucuna nazikçe aspire edin ve 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Organoidleri gece boyunca 4 ° C'de bir rotatöre yerleştirerek sabitleyin.
  6. Ertesi sabah, organoidleri peletlemek için tüpü 5 dakika boyunca 600 × g'da santrifüj edin. % 4'lük paraformaldehit çözeltisini bir pipetle nazikçe çıkarın ve atın. Organoidleri% 70 etanol ile 2 kat yıkayın.
  7. Son yıkamadan sonra, tüpten 50-100 μL etanol hariç hepsini çıkarın. Tüpü bir kenara koyun.
  8. Jeli eritmek için bir su banyosuna ve mikrodalgaya bir numune işleme jeli tüpü yerleştirin. Jelin kıvamını izleyerek numune işleme jelinin kaynamadığından emin olun.
    NOT: Numune işleme jeli eritildikten sonra, ancak sıcak kaynatılmadığında, organoidleri kapsüllemek için hızlı bir şekilde çalışın.
  9. Kalıbın tüm yüzeyini (yaklaşık 250 μL) kaplayacak kadar numune işleme jeli aktarın.
  10. Numune işleme jeli hala erimiş durumdayken, organoidleri içeren 50 μL% 70 etanol çözeltisini hızlı bir şekilde aktarın. Organoidlerin kalıbın alt kısmına batırıldığından veya itildiğinden emin olun.
  11. Histoloji kalıbını bir kova buz üzerine yerleştirin ve numune işleme jelinin soğumasını ve katılaşmasını bekleyin.
  12. Numune işleme jeli tamamen kuruduktan sonra, numune işleme jeli karesini dikkatlice bir numune torbasına aktarın ve organoidlerin bulunduğu düzlemi takip edin.
  13. Torbayı bir histoloji kasetine yerleştirin ve formalin fiksasyonu ve dokuların parafin gömülmesi için kullanılan standart yöntemleri kullanarak işlemyapın 18.
  14. Fiksasyon ve parafine gömülmeyi takiben, bir mikrotom19 kullanarak 5 μm kesitlere bölün. Aşağıda belirtildiği gibi standart hematoksilin ve eozin (H & E) boyama veya immün boyama prosedürlerine devam edin.

6. Hematoksilin ve eozin boyama

  1. Bölümleri aşağıdaki gibi deparaffinize edin: ksilen, 2 x 10 dakika; %100 etanol, 2 x 3 dakika; % 80 etanol, 3 dakika; % 60 etanol, 3 dakika; dH 2 O,2x 3 dakika; Hematoksilinde 1 dakika; musluk suyu (3 x 5 s); Eozin'de 1 dakika.
  2. Bölümleri aşağıdaki gibi kurutun:% 60 etanol, 3 dakika; % 80 etanol, 3 dakika; % 95 etanol, 3 dakika; %100 etanol, 2 x 3 dakika; ksilen, 2 x 15 dk.
  3. Montaj ortamı kullanarak monte edin.

7. İmmünofloresan boyama

  1. Bölümleri adım 6.1'de açıklandığı gibi ayrıştırın.
  2. Antijen alımı gerçekleştirin
    1. Slaytları antijen alma çözeltisine mikrodalgada güvenli bir kaba batırın.
    2. Mikrodalgayı 20 dakika boyunca yüksek ısıda, çözeltinin kaynamamasını sağlamak için 5 dakikalık aralıklarla kullanın.
  3. 20 dakikalık antijen alma adımı tamamlandıktan sonra, slaytların 40 dakika boyunca buz üzerinde soğumasına izin verirken, antijen alma tamponuna batırılmış halde bırakın.
  4. Slaytları 3 dakika boyunca 1x TBST ile yıkayın
  5. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST'de% 3 BSA'da inkübe ederek slaytları bloke edin.
  6. Birincil antikor inkübasyonu
    1. TBST'de antikoru% 3 BSA ile seyreltin (Ab'ye bağlı olarak 1:50-1:1,000).
    2. Nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
    3. TBST ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  7. İkincil antikor inkübasyonu
    1. Antikoru% 3 BSA (TBST'de) (1:250) veya% 5 normal eşek serumunda seyreltin.
    2. Antikor bir florofora konjuge edildiğinden, karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
  8. Nükleer boyama
    1. TBST'de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:1,000 seyreltin.
    2. RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
    3. TBST ile 2 x 5 dakika yıkayın.
  9. Montaj
    1. Kapak kapağını monte etmek için bir damla montaj ortamı kullanın.
    2. Ertesi gün oje kullanarak kapak kapağını kapatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare endometriyal organoidlerinin faz kontrast görüntüleri
Ekli protokolde açıklandığı gibi WT fare endometriyal epitelinden organoidler oluşturduk ( Şekil 1'deki şemaya bakınız). Fare endometriyal epitelinin enzimatik ayrışmasını takiben, epitel tabakaları uterus stromal hücrelerinden mekanik olarak ayrıldı ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için kollajenaz ile ayrıştı. Doğru yapılırsa, bu epitel ve stromal hücre ayırma yöntemi, karşı hücre tipinin% 10-15'inden daha fazla kontaminasyonu olmayan numuneler vermelidir ( Şekil 2'deki immünofloresan görüntülerine bakınız). Epitel hücreli pelet daha sonra jel matrisinde yeniden askıya alındı, oda sıcaklığında jelleşmesine izin verildi ve doku kültürü plakaları üzerinde 25 μL kubbelere kaplandı. Jel matris kubbeleri katılaştıktan sonra, organoid ortam ile kaplandı ve büyümesine izin verildi. Tipik olarak, endometriyal epitel hücrelerinin, Şekil 3'te gösterildiği gibi, 3-4 gün içinde organoidlere toplandığını gözlemledik. Organoidler kültürde tutuldu, her 3 günde bir medya değişiklikleri meydana geldi ve her 5-7 günde bir geçti.

Histolojik ve immünofloresan boyama kullanılarak fare endometriyal organoidlerinin görüntülenmesi
Fare epitel organoidlerinin morfolojisini analiz etmek için, numune işleme jeli20 kullanılarak hücresel ince iğne aspiratlarının kapsüllenmesi için kullanılan yöntemleri uyarladık. Bu, endometriyal organoid morfolojisinin korunmasını ve parafin gömülmesine hazırlık olarak işleme tabi tutulabilecek bir matris halinde kapsüllenmesini sağlar. Numune işleme jeli, ince iğne aspiratlarının analizi için klinik patoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan ve vajinal organoidleri kapsüllemek için kullanılan modifiye edilmiş bir agardır21,22. Numune işleme jeli / organoid karışımı katılaştıktan sonra, tipik olarak dokuları analiz etmek için kullanılan tekniklerle işlenebilir, boyanabilir ve görüntülenebilir. Şekil 4A,B'de, kesitli formalin-sabit parafin-gömülü endometriyal organoidlerin, organoidlerin tek bir epitel tabakasını ve içi boş merkezlerini (lümenleri) gösteren hematoksilin ve eozin lekeleri ile görselleştirilebileceğini gösteriyoruz. Bazı organoidler ayrıca lümende salgılar içerir, bu da organoidlerin glandüler epitel hücrelerinin fonksiyonel özelliklerini kazandığını gösterir. Ayrıca immün boyama kullanarak organoidleri görselleştirme tekniklerini de açıklıyoruz (Şekil 4C, D); kesitli endometriyal organoidler bir Sitokeratin 8 primer antikoru (TROMA-1) ve bir florofor konjuge sekonder antikor (sekonder anti-rat-594) ile inkübe edildi. Çekirdekler daha sonra DAPI ile görselleştirildi ve slaytlar bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Organoidlerdeki tüm hücrelerin Sitokeratin 8-pozitif olduğunu ve DAPI içerdiğini gözlemledik, bu da endometriyal organoidlerin fiksasyonunun, gömülmesinin ve işlenmesinin antikor bazlı immünoboyama ile uyumlu olduğunu gösterdi.

RNA ekstraksiyonu ve gen ekspresyon analizi
Endometriyal organoidlerin gen ekspresyon yanıtını belirlemek için, WT farelerinden endometriyal organoidlerin ilk geçişten sonra 4 gün boyunca büyümesine izin verdik. Tedaviden önceki akşam, endometriyal organoid ortam açlık ortamına değiştirildi. Organoidler daha sonra toplam 48 saat boyunca araç (etanol; östradiol için kullanılan çözeltide eşit hacim) veya 10 nM estradiol (E2) ile üçlü kuyucuklarda (her biri üç kubbe içeren kuyucuklar) muamele edildi. 48 saat sonra, ortam çıkarıldı ve organoidler RNA ekstraksiyonu için işlendi. Her bir kuyucuktan toplam iki kubbeden yaklaşık 4 μg RNA elde edilebilir ve cDNA'nın transkripsiyonunu tersine çevirmek için 1 μg RNA kullanılmıştır. Lipokalin 2 (Lcn2), laktoferrin (Ltf) ve progesteron reseptörünü (Pgr) kodlayan genlerin amplifikasyonu gerçek zamanlı kantitatif PCR kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 5 ve Tablo 1)23,24,25. Beklendiği gibi, 10 nM E2 ile stimülasyonu takiben epitel organoidlerinde Lcn2, Ltf ve Pgr ekspresyonunun arttığını gözlemledik (Şekil 5). Bu nedenle, bu sonuçlar endometriyal epitel organoidlerinin E2'ye yanıt olarak gen ekspresyon değişikliklerini ölçmek için başarıyla kullanılabileceğini göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Endometriyal organoidleri oluşturmak için kullanılan prosedürler. Diyagram, (A) fare endometriyumundan epitel organoidlerini kurmak ve (B) pasajı yapmak için izlenen temel adımları özetlemektedir. (A) Yöntemler, endometriyal epitelin fare uterusundan enzimatik ve mekanik ayrışmasını, ardından tek hücreli dispersiyonu ve epitelin bir jel matrisine kapsüllenmesini içerir. Enzimatik ayrışma için uterus dokularını elde etmek için, yumurtalıklar ve yumurta kanalları uterus boynuzlarından ince makasla çıkarılır, yanal olarak 4-5 mm parçalar halinde kesilir ve daha sonra enzim çözeltisine yerleştirilir. Enzimatik inkübasyondan sonra, endometriyal epitel, epiteli uterus tüpünden "sıkmak" için forseps ve bir pipet kullanılarak mikroskop altında altta yatan stromadan mekanik olarak ayrılır. Epitel, kollajenazda kısa bir inkübasyon kullanılarak epitel hücrelerine sindirilir, ardından bir jel matrisine kapsüllenir. (B) Endometriyal organoidlerin geçişi, organoidleri matristen serbest bırakmak ve daha küçük organoid fragmanları üretmek için soğuk ortamda mekanik ayrışma ve santrifüjleme gerektirir. Organoidler matristen serbest bırakıldıktan ve mekanik olarak daha küçük parçalara ayrıldıktan sonra, matris halinde kapsüllenir ve yeniden kaplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: İzole endometriyal epitel ve stromal hücre popülasyonlarının immün boyanması. İmmünofloresan görüntülerde uterusun enzimatik ve mekanik olarak ayrılmasını takiben (A,B) epitel hücresinin ve (C,D) stromal hücre fraksiyonlarının epitel ve stromal hücre popülasyonları görülmektedir. Sitokeratin 8 (bir epitel hücre belirteci) kırmızı, vimentin (stromal hücre belirteci) yeşil ve DAPI (nükleer bir belirteç) mavi renkte gösterilir. Ölçek çubukları = 100 μm (A,C), 20 μm (B,D). Kısaltmalar: CK8 = sitokeratin 8; VIM = vimentin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: 4 gün boyunca WT farelerinden endometriyal organoidlerin oluşumu. Endometriyal epitel bir WT fareden izole edildi ve organoidler üretmek için kullanıldı. (A) Sindirimden hemen sonra jel matriksinde kapsüllenen epitel hücrelerinin faz kontrast görüntüsü (gün 0). (B,C) Kültürün 1. (B) ve 2. (C) günlerinde birkaç küçük organoid görülebilir. (D) Daha büyük ve olgun epitel organoidleri kültürün 3. gününde görülebilir. Görüntüler 5x objektifle yakalandı; ölçek çubukları = 200 μm. Kısaltma: WT = wild type. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Endometriyal organoidlerin histolojik analizi . (A,B) FFPE endometriyal epitel organoidleri kesitlendi ve H&E ile boyandı (C,D) FFPE epitel organoidleri epitel hücre belirteci sitokeratin 8 (kırmızı) ile immünoboyandı. Hücre çekirdekleri DAPI (mavi) ile boyandı. Ölçek çubukları = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B,D). Kısaltmalar: FFPE = formalin-sabit parafin gömülü; H&E = hematoksilin ve eozin; CK8 = sitokeratin 8; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Fare endometriyal organoidlerinin gen ekspresyon analizi. WT farelerinden elde edilen fare endometriyal epitel organoidleri, organoid büyüme ortamında 4 gün boyunca kültürlendi, ardından DMEM / F12'de% 2 odun kömürü soyulmuş FBS ile desteklenmiş 48 saat boyunca araç veya 10 nM E2 ile tedavi edildi. (A,B) WT fare organoidlerinin araç (A) veya 10 nM E2 (B) ile tedaviden sonra faz kontrast görüntüleri. (C-E) Araç veya 10 nM E2 ile tedavi edilen epitelyal endometriyal organoidlerin gerçek zamanlı qPCR analizi. E2 ile düzenlenmiş genlerin, lipokalin 2 (Lnc2), laktoferrin (Ltf) ve progesteron reseptörünün (Pgr) ekspresyonu. Çubuklar, iki kuyruklu bir t-testi ile analiz edilen ortalama SEM ± temsil eder; *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Koşul başına n = 3 WT fareden türetilen organoidlerle tekrarlanır. Ölçek çubukları = 200 μm (A,B). Kısaltmalar: WT = wild type; E2 = östradiol; qPCR = kantitatif PCR. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Astar Dizisi İleri (5'-3') Ters (5'-3')
Lipokalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Laktoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCTCTCTCTCTCTTCTC
Progesteron (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Gliseraldehit 3 fosfat dehidrogenaz (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT
PCR karışımı şunları içerir:
2x SYBR Yeşil
0,5 μM Fwd Astar
0,5 μM Devir Astarı
cDNA
RNAse/DNAse-Free H2O
Bisikletçi Koşulları:
Sıcaklık Saat Döngü
Tutmak 95 °C 10 dk 1
Denatüre 95 °C 15 Saniye 40
Uzatmak 60 °C 60 Saniye

Tablo 1: Astar dizileri ve PCR koşulları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, fare endometriyumundan endometriyal epitel organoidleri üretme yöntemlerini ve bunların aşağı akış analizi için rutin olarak kullanılan protokolleri açıklıyoruz. Endometriyal organoidler, endometriozis, endometriyal kanser ve implantasyon başarısızlığı gibi endometriyal ilişkili hastalıkları kontrol eden mekanizmaları incelemek için güçlü bir araçtır. 2017 yılında yayınlanan dönüm noktası çalışmaları, fare ve insan epitelinden endometriyal organoidlerin uzun vadeli ve yenilenebilir kültürlerini kültüre 4,5 olarak bildirmiştir. Organoidler diğer sistemlerdeki biyolojik yolları incelemek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, endometriyal dokunun in vitro olarak incelenmesi, kültür26'daki transforme edilmemiş primer epiteli incelemek için uygun bir modelin bulunmaması ile sınırlandırılmıştır. İnsan ve fare endometriyumundan türetilen endometriyal organoidler, tipik olarak bağırsak, böbrek ve akciğer gibi diğer organ dokularından organoidleri kültürlemek için kullanılan koşullar kullanılarak ve bunları jel matris4'ten oluşan hücre dışı bir matris iskelesine gömerek başarıyla kurulmuştur. Bu ilk raporlardan bu yana, endometriyumun biyolojisini incelemek için endometriyal organoidlerin kullanımı bilimsel toplulukta önemli ölçüde artmıştır.

Fare uterusu27,28'den daha önce yayınlanmış bir epitel izolasyon yöntemini değiştirerek, bu protokol, dokuyu doğrudan bir enzim çözeltisine yerleştirerek, uterusu transekte etme veya filtrasyon kullanma ihtiyacını atlayarak fare uterusunu izole etmek için temel adımları benzersiz bir şekilde vurgulamaktadır. Bu yöntemi kullanarak, sitokeratin 8 ve vimentin immün boyama ile belirlenen ~% 85-% 90 saflıkta epitel elde ettik (Şekil 2). Bu protokol ayrıca, izole epitel hücrelerinin organoidlerin üretimi, bakımı ve geçişi için büyüme matrisine kapsüllenmesi için temel ayrıntıları açıkça özetlemektedir. Şekil 4'teki görüntüler ve yayınlanmamış çalışmalarımız, organoid kültürlerimizde müsinlerin ve glandüler hücrelerin (yani, FOXA2-pozitif) varlığını tanımlamıştır29. Bunlar, burada sunulan yöntemin hem glandüler hem de luminal-epitel hücre popülasyonlarının fare endometriyumundan izole edilmesinde etkili olduğunu göstermektedir.

Bu organoidlerin büyümesi için anahtar sınırlamalar, partiden partiye varyasyonlara neden olabilecek ve organoid büyümesini etkileyebilecek büyüme faktörleri içeren ticari matrisin (yani Matrigel) kullanımını içerir. Ayrıca, bu organoidler saf uterus epiteli içerirken, endometriyumun insan organoid sistemlerinde ek endometriyal hücre tiplerinin (yani bağışıklık, stromal) kullanımı yakın zamanda tanımlanmıştır 8,30. Diğer gruplar, organoid kültürler için hem luminal hem de glandüler epitel hücrelerini fare uterusundan izole etme yeteneğini göstermiştir14.

Bu yaklaşım, nispeten yaygın olan ve çoğu araştırmacı için mevcut olan küçük bir hayvan modelinden dokular kullanır; Daha büyük hayvan modellerinden veya insanlardan endometriyal organoidler üretmek, indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) tabanlı teknikler kullanılarak üstesinden gelinebilecek etik veya teknik zorluklar doğurabilir. Bu tür teknolojiler daha önce endometriyal dokular31, üreme sisteminin diğer dokuları32 için tanımlanmış ve in vitro33 endometriyal / plasental etkileşimleri incelemek için etkili bir şekilde kullanılmıştır. Bu nedenle, iPSC'leri endometriyumun endometriyumun endometriyal stromal ve epitel hücrelerinin bir kaynağı olarak insanlardan ve diğer büyük hayvan modellerinden kullanmak, endometriyal organoidler üretmek için yenilenebilir ve erişilebilir bir kaynak oluşturmaktadır.

Fare, implantasyon çalışması için yaygın olarak kullanılan bir model olsa da, fareler ve insanlar arasındaki implantasyon mekanizmasında dikkat edilmesi gereken önemli evrimsel farklılıklar vardır. Örneğin, interstisyel implantasyon, luminal epitel yoluyla altta yatan stromaya derin trofoblastik invazyon ile karakterize edilirken, invazyon sürecinin mekanizması fareler ve primatlar arasında farklılık gösterir34. Farelerde, luminal epitel yoluyla trofoblast invazyonu apoptoz veya entoz 35,36'yı içerirken, trofoblastlar luminal epitel arasında primatlarda altta yatan stromaya göç eder34,35.

Endometriyal organoidlerin kendi kendine toplanmasını ve uzun süreli yenilenmeyi desteklemek için gerekli büyüme faktörleriyle sağlanması, doğal dokuyu özetleyen endometriyal organoid kültürleri elde etmek için esastır. Endometriyal organoidler için karmaşık ortam bileşimi, epitel hücre özelliklerine katkıda bulunan ve hem parakrin hem de otokrin kaynaklardan kaynaklanan çoklu sinyal yollarını gösterir. Endometriyumun stromal bölmesi, fibroblast benzeri stromal hücreler, endotel, makrofajlar ve östrojen ve progesteron37'ye yanıt olarak sürekli değişen diğer uzmanlaşmış bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere çok sayıda hücre tipinin karmaşık bir birleşimidir.

Örneğin, organoid kültür ortamı, WNT3a ve R-Spondin gibi organoidlerde WNT / β-katenin sinyalini aktive eden faktörler içerir. Farelerde yapılan çalışmalar, WNT ligandlarının uterus gelişimi ve glandüler fonksiyon için kritik olduğunu göstermiştir; bu nedenle, bu sinyal yolunun aktivasyonu organoid gelişimi ve bakımı için kritik öneme sahiptir38,39. R-Spondin, WNT sinyallemesini güçlendirir ve lösin bakımından zengin tekrar-içeren G-protein eşleşmiş reseptörünün (LGR5) ligandıdır40. Endometriyal organoid kültürler ayrıca dönüştürücü büyüme faktörü β (TGFβ) ve kemik morfogenetik protein (BMP) sinyal yolaklarının inhibisyonunu gerektirir. Örneğin, endometriyal organoid kültür ortamı, BMP2, BMP4 ve BMP741'e bağlanan ve inaktive eden salgılanan bir protein olan BMP inhibitörü Noggin'i içerir. Farmakolojik inhibitör A83-01, endometriyal organoid ortamda da bulunur. A83-01, ALK4, ALK5 ve ALK742 reseptörlerine yüksek özgüllüğe sahip küçük moleküllü bir inhibitördür. ALK4/5/7, TGFβ, aktivin veya nodal gibi ligandlar tarafından ortaya çıkan sinyallere bağlanan ve ileten TGFβ sinyal ailesinin tip 1 reseptörleridir. BMP sinyalleri, bağırsak 43 ve saç kökleri44 gibi dokularda kök hücre bakımı için kritiköneme sahiptir. TGFβ sinyallemesinin inhibisyonu, kromatin46'daki kilit bölgelerin yeniden şekillendirilmesiyle ortaya çıkan endometriyal mezenkimal kök hücrelerin45'inin proliferatif kapasitesine ve koloni oluşum verimliliğine katkıda bulunur. Bu nedenle, bu iki anahtar sinyal yolunun modülasyonu, BMP ve TGFβ, organoid kültürleri kendi kendini yenileme kapasitesine sahip tutmak için gereklidir.

Burada gösterilmemesine rağmen, ALK4/5/7 inhibitörü A83-01 ile fare organoidlerinin uzun süreli kültürünün, üç veya dört sürekli pasajdan sonra epitel organoidlerinde morfolojik değişikliklere yol açtığını bulduk. Epitel organoidlerindeki morfolojik değişiklikler, Boretto ve ark.4 tarafından tanımlanan "yoğun" epitel organoidlerini hatırlatıyordu; burada WNT ligandlarının parakrin sekresyonunun azalması nedeniyle daha fazla sekretuar benzeri hücrelerin gelişimi meydana geldi. Bu nedenle, TGFβ ve WNT sinyal yollarının endometriyal epitelyal organoid rejenerasyonunu ve farklılaşmasını kontrol etmek için kesişmesi muhtemeldir.

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, insan dokularından 3D endometriyal epitel / stromal ko-kültür sistemleri üretmiştir 7,8,16. Bir ortak kültürleme yöntemi, endometriyal epitel ve stromal hücrelerin birleştirildiği ve tanımlanmış bir kültür ortamı kullanılarak iskelesiz bir kuyuda 3D yapılara monte edilmesine izin verilen iskelesiz bir sistem kullanır. Bu 3D endometriyal epitel / stromal organoidler sadece östrojen, progesteron ve androjen için reseptörleri eksprese etmekle kalmaz, aynı zamanda yumurtalık hormonlarına - östrojen ve progesteron 6,7'ye verilen cevabı sadık bir şekilde özetler. Rawlings ve ark. tarafından yapılan bir çalışmada kullanılan başka bir ortak kültürleme yönteminde, endometriyal epitel organoidleri bir kollajen matrisindeki stromal hücrelerle birleştirilir ve modifiye edilmiş bir organoid ortamda yetiştirilir8. Bu epitel / stromal birlikte kültürlenmiş organoidler veya assembloidler, stromal hücrelerin epitel bezi benzeri yapıları çevrelediği askıya alınmış bir 3D sistemde organize olurlar.

Endometriyal organoidlerin çoğunluğu büyüme faktörü indirgenmiş jel matriksinde kültürlenir; Bununla birlikte, matriksteki aktif bileşiklerin varlığı, organoidler içinde istenmeyen hücresel tepkiler verebilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, organoidler, bireysel organoidlerin kendi kendine monte edilmesine izin verilen 3D baskılı agaroz kalıpları gibi jel matrissiz iskelelerde kurulmuştur6. Diğer gruplar, endometriyal organoidlerin kültürü için 3D matrisler olarak hizmet etmek üzere sentetik hidrojeller geliştirdiler47. Bu organoidler apikobazal polariteye sahip 3D yapılara toplanır ve ayrıca karmaşık organoidler oluşturmak için endometriyumun stromal hücreleri ile birleştirilebilir48. Organoidler, dönüştürülmemiş birincil insan ve fare endometriyal dokularını 2D hücre kültürlerinin yapamayacağı şekilde kültürlemek için başarıyla kullanılabildiğinden, endometriyal organoidlerin kadınların üreme sağlığı alanını ilerleteceğine ve tekrarlayan gebelik kaybı, endometriozis ve endometriyal kanser gibi üreme patolojilerini incelemek için inanılmaz bir araç olacağına şüphe yoktur16, 49,50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Dr. Stephanie Pangas ve Dr. Martin M. Matzuk'a (M.M.M.) makalemizin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz. Çalışmalar, Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü hibeleri R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.), ve R01-HD110038 (M.M.) ve NCI- P30 Kanser Merkezi Destek Hibesi (NCI-CA125123) tarafından desteklenmiştir. Diana Monsivais, Ph.D. Burroughs Wellcome Fund'dan Yeni Nesil Hamilelik Ödülü'ne sahiptir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
  2. Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 84 (2020).
  3. Rawlings, T. M., Makwana, K., Tryfonos, M., Lucas, E. S. Organoids to model the endometrium: implantation and beyond. Reproduction & Fertility. 2 (3), 85-101 (2021).
  4. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  5. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  6. Murphy, A. R., Wiwatpanit, T., Lu, Z., Davaadelger, B., Kim, J. J. Generation of multicellular human primary endometrial organoids. Journal of Visualized Experiments. (152), e60384 (2019).
  7. Wiwatpanit, T., et al. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 105 (3), 769-780 (2020).
  8. Rawlings, T. M., et al. Modelling the impact of decidual senescence on embryo implantation in human endometrial assembloids. Elife. 10, 69603 (2021).
  9. Lou, L., Kong, S., Sun, Y., Zhang, Z., Wang, H. Human endometrial organoids: recent research progress and potential applications. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 844623 (2022).
  10. Soyal, S. M., et al. Cre-mediated recombination in cell lineages that express the progesterone receptor. Genesis. 41 (2), 58-66 (2005).
  11. Daikoku, T., et al. Lactoferrin-iCre: a new mouse line to study uterine epithelial gene function. Endocrinology. 155 (7), 2718-2724 (2014).
  12. Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (45), 19272-19277 (2010).
  13. Seishima, R., et al. Neonatal Wnt-dependent Lgr5 positive stem cells are essential for uterine gland development. Nature Communications. 10 (1), 5378 (2019).
  14. Syed, S. M., et al. Endometrial Axin2(+) cells drive epithelial homeostasis, regeneration, and cancer following oncogenic transformation. Cell Stem Cell. 26 (1), 64-80 (2020).
  15. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
  16. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: evolution and application for women's health. Biology of Reproduction. 104 (2), 282-293 (2021).
  17. Hewitt, S. C., et al. Progesterone signaling in endometrial epithelial organoids. Cells. 11 (11), 1760 (2022).
  18. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods in Molecular Biology. 1897, 253-268 (2019).
  19. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288 (2018).
  20. Rekhtman, N., et al. Novel modification of HistoGel-based cell block preparation method: improved sufficiency for molecular studies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 142 (4), 529-535 (2018).
  21. Shidham, V. B. CellBlockistry: Chemistry and art of cell-block making - A detailed review of various historical options with recent advances. Cytojournal. 16, 12 (2019).
  22. Ali, A., Syed, S. M., Tanwar, P. S. Protocol for in vitro establishment and long-term culture of mouse vaginal organoids. STAR Protocols. 1 (2), 100088 (2020).
  23. Kurihara, I., et al. COUP-TFII mediates progesterone regulation of uterine implantation by controlling ER activity. PLoS Genet. 3 (6), 102 (2007).
  24. McMaster, M. T., Teng, C. T., Dey, S. K., Andrews, G. K. Lactoferrin in the mouse uterus: analyses of the preimplantation period and regulation by ovarian steroids. Molecular Endocrinology. 6 (1), 101-111 (1992).
  25. Huang, H. L., Chu, S. T., Chen, Y. H. Ovarian steroids regulate 24p3 expression in mouse uterus during the natural estrous cycle and the preimplantation period. The Journal of Endocrinology. 162 (1), 11-19 (1999).
  26. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  27. Bigsby, R. M., Cunha, G. R. Estrogen stimulation of deoxyribonucleic acid synthesis in uterine epithelial cells which lack estrogen receptors. Endocrinology. 119 (1), 390-396 (1986).
  28. Clementi, C., et al. Activin-like kinase 2 functions in peri-implantation uterine signaling in mice and humans. PLoS Genetics. 9 (11), 1003863 (2013).
  29. Jeong, J. W., et al. Foxa2 is essential for mouse endometrial gland development and fertility. Biology of Reproduction. 83 (3), 396-403 (2010).
  30. Song, Y., et al. Endometriotic organoids: a novel in vitro model of endometriotic lesion development. bioRxiv. , (2022).
  31. Miyazaki, K., et al. Generation of progesterone-responsive endometrial stromal fibroblasts from human induced pluripotent stem cells: role of the WNT/CTNNB1 pathway. Stem Cell Reports. 11 (5), 1136-1155 (2018).
  32. Yoshimatsu, S., Kisu, I., Qian, E., Noce, T. A new horizon in reproductive research with pluripotent stem cells: successful in vitro gametogenesis in rodents, its application to large animals, and future in vitro reconstitution of reproductive organs such as "Uteroid" and "Oviductoid". Biology. 11 (7), 987 (2022).
  33. Cheung, V. C., et al. Pluripotent stem cell-derived endometrial stromal fibroblasts in a cyclic, hormone-responsive, coculture model of human decidua. Cell Reports. 35 (7), 109138 (2021).
  34. McGowen, M. R., Erez, O., Romero, R., Wildman, D. E. The evolution of embryo implantation. The International Journal of Development Biology. 58 (2-4), 155-161 (2014).
  35. Carson, D. D., et al. Embryo implantation. Developmental Biology. 223 (2), 217-237 (2000).
  36. Li, Y., Sun, X., Dey, S. K. Entosis allows timely elimination of the luminal epithelial barrier for embryo implantation. Cell Reports. 11 (3), 358-365 (2015).
  37. Jain, V., Chodankar, R. R., Maybin, J. A., Critchley, H. O. D. Uterine bleeding: how understanding endometrial physiology underpins menstrual health. Nature Reviews Endocrinology. 18 (5), 290-308 (2022).
  38. Hayashi, K., et al. Wnt genes in the mouse uterus: potential regulation of implantation. Biology of Reproduction. 80 (5), 989-1000 (2009).
  39. Dunlap, K. A., et al. Postnatal deletion of Wnt7a inhibits uterine gland morphogenesis and compromises adult fertility in mice. Biology of Reproduction. 85 (2), 386-396 (2011).
  40. Ter Steege, E. J., Bakker, E. R. M. The role of R-spondin proteins in cancer biology. Oncogene. 40 (47), 6469-6478 (2021).
  41. Brazil, D. P., Church, R. H., Surae, S., Godson, C., Martin, F. BMP signalling: agony and antagony in the family. Trends in Cell Biology. 25 (5), 249-264 (2015).
  42. Tojo, M., et al. The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta. Cancer Science. 96 (11), 791-800 (2005).
  43. Zhang, Y., Que, J. BMP signaling in development, stem cells, and diseases of the gastrointestinal tract. Annual Review of Physiology. 82, 251-273 (2020).
  44. Plikus, M. V., et al. Cyclic dermal BMP signalling regulates stem cell activation during hair regeneration. Nature. 451 (7176), 340-344 (2008).
  45. Gurung, S., Werkmeister, J. A., Gargett, C. E. Inhibition of transforming growth factor-β receptor signaling promotes culture expansion of undifferentiated human endometrial mesenchymal stem/stromal cells. Scientific Reports. 5, 15042 (2015).
  46. Lucciola, R., et al. Impact of sustained transforming growth factor-β receptor inhibition on chromatin accessibility and gene expression in cultured human endometrial MSC. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 567610 (2020).
  47. Hernandez-Gordillo, V., et al. Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids. Biomaterials. 254, 120125 (2020).
  48. Gnecco, J. S., et al. Physiomimetic Models of Adenomyosis. Seminars in Reproductive Medicine. 38 (2-03), 179-196 (2020).
  49. Nikolakopoulou, K., Turco, M. Y. Investigation of infertility using endometrial organoids. Reproduction. 161 (5), 113-127 (2021).
  50. Kim, J. J. Preparing for implantation. Elife. 10, 73739 (2021).

Tags

Biyoloji Sayı 191 endometriyum organoidler kısırlık uterus rejenerasyon
Fare Rahiminden 3D Endometriyal Organoidlerin Kurulması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter