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Biology

Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus

Published: January 6, 2023 doi: 10.3791/64448
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2
1Department of Pathology & Immunology, Baylor College of Medicine, 2Center for Drug Discovery, Baylor College of Medicine, 3Departments of Molecular Virology and Microbiology and Medicine, Baylor College of Medicine

Summary

Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Etablierung von Endometrium-Epithel-Organoiden der Maus für die Genexpression und histologische Analysen.

Abstract

Endometriumgewebe kleidet die innere Höhle der Gebärmutter aus und steht unter der zyklischen Kontrolle von Östrogen und Progesteron. Es ist ein Gewebe, das aus luminalem und Drüsenepithel, einem Stromakompartiment, einem vaskulären Netzwerk und einer komplexen Immunzellpopulation besteht. Mausmodelle waren ein leistungsfähiges Werkzeug, um das Endometrium zu untersuchen und kritische Mechanismen aufzudecken, die Implantation, Plazenta und Krebs steuern. Die jüngste Entwicklung von 3D-Endometrium-Organoidkulturen stellt ein hochmodernes Modell dar, um die Signalwege zu analysieren, die der Biologie der Gebärmutterschleimhaut zugrunde liegen. Die Etablierung von Endometrium-Organoiden aus gentechnisch veränderten Mausmodellen, die Analyse ihrer Transkriptome und die Visualisierung ihrer Morphologie in Einzelzellauflösung sind entscheidende Werkzeuge für die Erforschung von Endometriumerkrankungen. Dieser Artikel skizziert Methoden zur Etablierung von 3D-Kulturen von Endometriumepithel aus Mäusen und beschreibt Techniken zur Quantifizierung der Genexpression und zur Analyse der Histologie der Organoide. Ziel ist es, eine Ressource bereitzustellen, die zur Etablierung, Kultur und Untersuchung der Genexpression und morphologischen Eigenschaften von Endometriumepithel-Organoiden verwendet werden kann.

Introduction

Das Endometrium - das innere Schleimhautgewebe der Gebärmutterhöhle - ist ein einzigartiges und hochdynamisches Gewebe, das eine entscheidende Rolle für die reproduktive Gesundheit einer Frau spielt. Während der reproduktiven Lebensspanne hat das Endometrium das Potenzial, Hunderte von Zyklen der Proliferation, Differenzierung und des Abbaus zu durchlaufen, die durch die konzertierte Wirkung der Eierstockhormone - Östrogen und Progesteron - koordiniert werden. Studien an gentechnisch veränderten Mäusen haben grundlegende biologische Mechanismen aufgedeckt, die der Reaktion der Gebärmutterschleimhaut auf Hormone und der Kontrolle der Embryoimplantation, der Stromazelldezidualisierung und der Schwangerschaft zugrunde liegen1. In-vitro-Studien waren jedoch aufgrund von Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung nicht transformierter primärer Endometriumgewebe der Maus in traditionellen 2D-Zellkulturen begrenzt 2,3. Jüngste Fortschritte in der Kultur von Endometriumgewebe als 3D-Organsysteme oder Organoide bieten eine neue Möglichkeit, biologische Signalwege zu untersuchen, die die Regeneration und Differenzierung von Endometriumzellen steuern. Endometrium-Organoidsysteme der Maus und des Menschen wurden aus reinem Endometriusepithel entwickelt, das in verschiedenen Matriceseingekapselt ist 4,5, während menschliches Endometrium als gerüstfreie epitheliale/stromale Co-Kulturen 6,7 und in jüngerer Zeit als kollagenverkapselte Epithel-/Stroma-Assembloide kultiviert wurde8 . Das Wachstum und das regenerative Potenzial von epithelialen Organoidkulturen wird durch einen definierten Cocktail aus Wachstumsfaktoren und niedermolekularen Inhibitoren unterstützt, die empirisch bestimmt wurden, um das Wachstum und die Regeneration der Organoide zu maximieren 4,5,9. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, Endometrium-Organoide einzufrieren und aufzutauen, die langfristige Einlagerung von Endometrium-Organoiden von Mäusen und Menschen für zukünftige Studien.

Gentechnisch veränderte Mäuse haben die komplexen Signalwege aufgedeckt, die die frühe Schwangerschaft und Dezidualisierung steuern, und wurden als Modelle für Schwangerschaftsverlust, Endometriumkarzinom und Endometriose verwendet. Diese genetischen Studien wurden weitgehend mit zellspezifischer Deletion von loxP-flankierten Allelen ("gefloxt") unter Verwendung von Cre-Rekombinasen erreicht, die spezifisch im weiblichen Fortpflanzungsgewebe aktiv sind. Zu diesen Mausmodellen gehören der weit verbreitete Progesteronrezeptor-cre 10, der eine starke Rekombinaseaktivität im Epithel- und Stromagewebe des Endometriums aufweist, Lactoferrin i-cre, das bei erwachsenen Mäusen eine endometriumepitheliale Rekombination induziert11, oder Wnt7a-cre, das eine epithelialspezifische Deletion in Müller-abgeleiteten Geweben auslöst12 . Die Kultivierung von Endometriumgewebe aus gentechnisch veränderten Mausmodellen als 3D-Organoide bietet eine hervorragende Möglichkeit, die Biologie des Endometriums zu untersuchen und die Identifizierung von Wachstumsfaktoren und Signalwegen zu erleichtern, die die Erneuerung und Differenzierung von Endometriumzellen steuern13,14. Verfahren zur Isolierung und Kultur von Endometriumgewebe der Maus sind in der Literatur beschrieben und berichten über die Verwendung verschiedener enzymatischer Strategien zur Isolierung von Uterusepithel für die anschließende Kultivierung von Endometriumepithel-Organoiden4. Während die bisherige Literatur einen kritischen Rahmen für Endometriumepithel-Organoid-Kulturprotokolle 4,5,6 bietet, bietet diese Arbeit eine klare, umfassende Methode zur Generierung, Wartung, Verarbeitung und Analyse dieser Organoide. Die Standardisierung dieser Techniken ist wichtig, um den Fortschritt auf dem Gebiet der Reproduktionsbiologie von Frauen zu beschleunigen. Hier berichten wir über eine detaillierte Methodik zur enzymatischen und mechanischen Reinigung von Endometrium-Epithelgewebe der Maus für die anschließende Kultur von Endometrium-Organoiden in einem Gelmatrix-Gerüst. Wir beschreiben auch die Methoden für nachgeschaltete histologische und molekulare Analysen der Gelmatrix-verkapselten Maus-Endometrium-Epithel-Organoide.

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Protocol

Die Handhabung von Mäusen und experimentelle Studien wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Baylor College of Medicine genehmigt wurden, und gemäß den Richtlinien des NIH-Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Isolierung von Uterusepithel aus Mäusen mit enzymatischen und mechanischen Methoden

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Schritte beschrieben, die erforderlich sind, um epitheliale Endometrium-Organoide von Mäusen unter Verwendung eines Gelmatrix-Gerüsts zu etablieren, zu passieren, einzufrieren und aufzutauen. Frühere Studien haben ergeben, dass während der Brunstphase4 optimale Kulturen von Endometrium-Organoiden der Maus aus Mäusen etabliert werden, was durch zytologische Untersuchung eines Vaginalabstrichs bestimmt werden kann15. Für alle Experimente wurden erwachsene weibliche WT-Mäuse (6-8 Wochen alt, Hybride C57BL/6J und 129S5/SvEvBrd) verwendet. Die Mäuse wurden gemäß den von der IACUC genehmigten Richtlinien mit Isofluran-Sedierung und anschließender zervikaler Disartikulation auf humane Weise eingeschläfert. Sobald die Mäuse eingeschläfert sind, sollten die folgenden Schritte befolgt werden. Weitere Informationen zu den in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Lösungen finden Sie in der Materialtabelle .

  1. Lassen Sie die Gelmatrix vor Gebrauch ca. 1-2 h auf Eis auftauen.
  2. Um die Maus zu sezieren, verwenden Sie eine Schere, um einen Mittellinienschnitt am Bauch zu machen, und schälen Sie die Haut vorsichtig zurück, um die darunter liegende Peritonealschicht freizulegen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Peritonealschicht hochzuhalten, und machen Sie seitliche Schnitte mit der Schere, um den Bauchinhalt freizulegen.
    1. Lokalisieren Sie die Gebärmutterhörner, indem Sie die Bauchfettpolster vorsichtig zur Seite schieben. Sezieren Sie sie, indem Sie sie zuerst an der zervikalen Verbindung halten und mit einer Schere entlang des Mesenterialfetts schneiden. Entfernen Sie nach der Dissektion der Gebärmutter der Maus mit einer kleinen Schere gründlich Fettgewebe aus dem Uterushorn.
      HINWEIS: Halten Sie die Sterilität während der Zellisolierung aufrecht, indem Sie alle Operationswerkzeuge vor Gebrauch sterilisieren, den Mäusebauch mit 70% Ethanol besprühen und alle Schritte nach der Dissektion unter einer sterilen Gewebekulturhaube durchführen.
  3. Schneiden Sie jedes Gebärmutterhorn in kleine Fragmente, die jeweils ca. 4-5 mm groß sind.
  4. Legen Sie alle Uterusfragmente aus einer Gebärmutter in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 0,5 ml 1% Trypsin enthält. Lassen Sie die enzymatische Lösung in das Uteruslumen eindringen, wodurch das Endometriumepithel vom darunter liegenden Stroma enzymatisch getrennt wird.
  5. Die 24-Well-Platte wird in einem 37 °C warmen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator für ca. 1 h inkubiert.
  6. Nach der 1-stündigen Inkubation werden die Uterusfragmente auf eine 35 mm große Gewebekulturplatte übertragen, die 1 ml Phosphat-gepufferte Lösung (DPBS) von Dulbecco enthält.
  7. Verwenden Sie unter einem Dissektionsmikroskop eine feine Pinzette und eine 1-ml-Pipette, um das Uterusepithel mechanisch von der Gebärmuttersonde zu trennen. Während Sie ein Ende eines Uterusfragments mit der Pinzette nach unten halten, führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in Längsrichtung über das Fragment und drücken Sie das Epithel aus dem anderen Ende der Gebärmutterröhre. Beobachten Sie die vom Uterusfragment abgetrennten Epithelblätter unter dem Dissektionsmikroskop.
  8. Verwenden Sie die 1-ml-Pipette, um die Epithelschichten zu sammeln und vorsichtig in ein 1,5-ml-Röhrchen zu überführen.
  9. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Uterusfragmente und übertragen Sie alle Epithelblätter in dasselbe Sammelröhrchen.
  10. Die dissoziierten Epithelschichten werden durch Zentrifugation für 5 min bei 375 × g pelletiert.
  11. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, um eine Störung des Zellpellets zu vermeiden.
  12. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 ml 2,5 mg/ml Kollagenase + 2 mg/ml DNase-Lösung. Pipettieren Sie ca. 10x auf und ab, oder bis eine einzellige Suspension erreicht ist.
  13. Fügen Sie 0,5 ml DMEM/F12 + 10% fetales Rinderserum (FBS) + Antibiotika hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 375 × g.
    HINWEIS: Weitere Informationen über das Breitbandantibiotikum, das für die Zellkultur verwendet wird, finden Sie in der Materialtabelle.
  14. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + Antibiotika. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 375 × g.

2. Verarbeitung des Stromakompartiments

HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Protokolle beschrieben, die für die Isolierung des Stromakompartiments des Endometriums der Maus erforderlich sind. Angesichts des zunehmenden Interesses an epithelialen/stromalen Kokulturexperimenten ist es wichtig, neben den Epithelzellen, die Organoide erzeugen, auch die Stromazellpopulationen verarbeiten zu können.

  1. Sobald das gesamte Epithel enzymatisch und mechanisch von den Uterusfragmenten getrennt wurde, sind die verbleibenden röhrenförmigen Strukturen die "stromalen / myometrischen" Kompartimente. Sammeln Sie dieses Gewebe in einer 2,5 mg/ml Kollagenase + 2 mg/ml DNase in HBSS-Lösung.
  2. Die stroma-/myometriale Probe wird 15 Minuten lang auf einem 37 °C-Shaker inkubiert.
  3. Nach der Inkubation werden 500 μL DMEM/F12 + 10% FBS + Antibiotika pro Maus hinzugefügt und die nicht dissoziierten Fragmente durch einen 40 μm Zellfilter filtriert.
  4. Die Zellen werden durch Zentrifugation für 5 min bei 375 × g pelletiert.
  5. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml DMEM / F12 + 10% FBS + Antibiotika. Geben Sie die Mischung tropfenweise in 10 ml DMEM/F12 + 10% FBS + Antibiotika in eine 10 cm Zellkulturplatte. Die Platte wird bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank inkubiert.
  6. Um Kokulturen von Endometriumepithel- und Stromazellen der Maus zu erzeugen, sind die für menschliche Endometrium-Organoide beschriebenen Methoden unter Verwendung von gerüstfreien oder Kollagenmatrixsystemen 6,8 anzuwenden.
    HINWEIS: Obwohl diese Techniken noch nicht für Mäuse veröffentlicht wurden, können sie basierend auf den veröffentlichten Protokollen mit menschlichem Endometrium angepasst werden.

3. Verkapselung von Uterusepithel in Gelmatrix zur Etablierung von Organoiden

HINWEIS: Bewahren Sie die Gelmatrix auf Eis auf, bis sie gebrauchsfertig ist.

  1. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Volumen der Gelmatrix, das 20x so groß ist wie das des Zellpellets (d. h. wenn das Zellpellet 20 μl beträgt, resuspendieren Sie die Zellen mit 400 μl Gelmatrix). Resuspendieren Sie das Pellet vorsichtig, um das Auftreten von Blasen zu vermeiden.
  2. Lassen Sie die Gelmatrix/Zellsuspension ~10 min bei Raumtemperatur einwirken.
  3. Sobald die Gelmatrix/Zellsuspension zu einem halbfesten Gel wird, verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit einer breiten 200-μl-Spitze, um 25 μl der Gelmatrix/Zellsuspension vorsichtig abzusaugen. Dosieren Sie drei separate 25-μl-Kuppeln pro Vertiefung einer 12-Well-Platte und lassen Sie die Gelmatrix 15 Minuten lang in einem 37 °C warmen befeuchteten Gewebekulturinkubator aushärten.
  4. Nachdem die Gelmatrix ausgehärtet ist, geben Sie 750 μL Organoidmedium in jede Vertiefung, die Gelmatrixkuppeln enthält. Inkubation bei 37 °C in einem befeuchteten Gewebekulturbrutscher.
    HINWEIS: Die Formulierung der organoiden Medien ist in der Materialtabelle angegeben. Organoide bilden sich typischerweise innerhalb von 4 Tagen nach der ersten Kultur.

4. Genexpressionsanalyse von Endometrium-Organoiden nach Behandlung mit Östradiol

ANMERKUNG: In diesem Abschnitt werden die Methoden beschrieben, die zur Profilierung der Genexpression von Endometriumepithel-Organoiden mittels real-time qPCR nach Behandlung mit Östradiol verwendet werden (E2; siehe Tabelle 1). Da das Endometrium unter der zyklischen Kontrolle des Ovarialhormons E2 steht, ist das Testen der Reaktionsfähigkeit der Organoide auf E2 ein wichtiges Maß für die physiologische Funktion. Wir haben qualitativ hochwertige RNA erhalten und genügend mRNA generiert, um die Genexpression mittels qPCR und/oder RNA-Sequenzierung aus unseren Endometrium-Epithel-Organoiden zu profilieren. In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Organoide gesammelt und für die nachgelagerte Analyse der Genexpression aufbereitet werden. Das gewählte Behandlungsmedium entspricht demjenigen, das zur Behandlung kultivierter Endometriumzellen verwendet wird. Es ist jedoch zu beachten, dass dieses Behandlungsmedium entsprechend optimiert werden kann, wie es bei der Behandlung von humanen Endometrium-3D-Kulturen mit den Hormonen 8,16,17 der Fall ist.

  1. Kultur der Endometrium-Organoide wie oben beschrieben.
  2. Entfernen Sie das Organoidmedium und ersetzen Sie es vier Tage nach der Aussaat durch 750 μL Hungermedium. Über Nacht inkubieren.
  3. Entfernen Sie am nächsten Morgen das Hungermedium. Fügen Sie 750 μL Behandlungsmedium hinzu, das entweder Vehikel oder 10 nM E2 enthält. Inkubieren für 48 h.
  4. Fahren Sie mit der RNA-Isolierung gemäß dem Protokoll des Kit-Herstellers fort.

5. Histologische Analyse von Endometrium-Organoiden

HINWEIS: Die Abbildung der morphologischen Merkmale von Endometrium-Organoiden ist entscheidend für die Beurteilung der zellulären Wirkung von Wachstumsfaktoren, genetischen Manipulationen oder niedermolekularen Inhibitoren. In diesem Abschnitt werden die Techniken beschrieben, die zur Fixierung, Verarbeitung und Abbildung von Endometriumepithelorganoiden unter Verwendung histologischer Färbungen und Antikörper-Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden.

  1. Bereiten Sie 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen vor, die 1 mL 4% Paraformaldehyd in 1x PBS enthalten. Legen Sie sie auf Eis.
  2. Saugen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 12-Well-Platte ab, die die Organoide enthält.
  3. Übertragen Sie mit einer 1-ml-Pipettenspitze mit einer geschnittenen Spitze 500 μL 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und lösen Sie die Gelmatrixdome vorsichtig vom Boden der Platte.
  4. Die gesamten Gelmatrixdome werden vorsichtig in die Pipettenspitze abgesaugt und in das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.
  5. Fixieren Sie die Organoide, indem Sie sie über Nacht bei 4 °C auf einen Rotator legen.
  6. Am nächsten Morgen zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 600 × g für 5 Minuten, um die Organoide zu pelletieren. Entfernen Sie die 4%ige Paraformaldehydlösung vorsichtig mit einer Pipette und entsorgen Sie sie. Waschen Sie die Organoide 2x mit 70% Ethanol.
  7. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche alle bis auf 50-100 μL Ethanol aus dem Röhrchen. Legen Sie das Röhrchen beiseite.
  8. Legen Sie eine Tube Probenverarbeitungsgel für ~ 30 s in ein Wasserbad und in die Mikrowelle, um das Gel zu schmelzen. Stellen Sie sicher, dass das Probenverarbeitungsgel nicht überkocht, indem Sie die Konsistenz des Gels überwachen.
    HINWEIS: Sobald das Probenverarbeitungsgel geschmolzen ist, aber nicht kochend heiß, arbeiten Sie schnell, um die Organoide zu verkapseln.
  9. Übertragen Sie genügend Probenverarbeitungsgel, um die gesamte Oberfläche der Form (ca. 250 μL) zu bedecken.
  10. Während das Probenverarbeitungsgel noch geschmolzen ist, übertragen Sie schnell die 50 μL 70%ige Ethanollösung, die die Organoide enthält. Stellen Sie sicher, dass die Organoide versenkt oder in den unteren Teil der Form gedrückt werden.
  11. Legen Sie die Histologieform auf einen Eimer Eis und lassen Sie das Probenverarbeitungsgel abkühlen und erstarren.
  12. Sobald das Probenverarbeitungsgel vollständig getrocknet ist, übertragen Sie das Probenverarbeitungsgel vorsichtig in einen Probenbeutel und behalten Sie die Ebene im Auge, in der sich die Organoide befinden.
  13. Legen Sie den Beutel in eine Histologiekassette und verarbeiten Sie ihn unter Verwendung von Standardmethoden, die für die Formalinfixierung und die Paraffineinbettung von Gewebenverwendet werden 18.
  14. Nach der Fixierung und Einbettung in Paraffin wird mit einem Mikrotom19 in 5-μm-Abschnitte geschnitten. Fahren Sie mit Standard-Hämatoxylin- und Eosin-Färbungs- oder Immunfärbungsverfahren fort, wie unten beschrieben.

6. Hämatoxylin- und Eosin-Färbung

  1. Entparaffinieren Sie die Abschnitte wie folgt: Xylol, 2 x 10 min; 100% Ethanol, 2 x 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 60% Ethanol, 3 min; dH2O, 2 x 3 min; 1 min in Hämatoxylin; Leitungswasser (3 x 5 s); 1 min in Eosin.
  2. Die Abschnitte wie folgt entwässern: 60% Ethanol, 3 min; 80% Ethanol, 3 min; 95% Ethanol, 3 min; 100% Ethanol, 2 x 3 min; Xylol, 2 x 15 Min.
  3. Montage mit Montagemedium.

7. Immunfluoreszenzfärbung

  1. Entparaffinieren Sie die Abschnitte, wie in Schritt 6.1 beschrieben.
  2. Antigen-Retrieval durchführen
    1. Tauchen Sie die Objektträger in Antigen-Retrieval-Lösung in einem mikrowellengeeigneten Behälter.
    2. Mikrowelle bei hoher Hitze für 20 Minuten in Intervallen von 5 Minuten, um sicherzustellen, dass die Lösung nicht überkocht.
  3. Nachdem der 20-minütige Antigen-Retrieval-Schritt abgeschlossen ist, lassen Sie die Objektträger 40 Minuten lang auf Eis abkühlen, während sie noch in den Antigen-Retrieval-Puffer getaucht sind.
  4. Waschen Sie die Objektträger mit 1x TBST für 3 min
  5. Blockieren Sie die Objektträger, indem Sie 1 Stunde bei Raumtemperatur in 3% BSA in TBST inkubieren.
  6. Inkubation mit primären Antikörpern
    1. Verdünnen Sie den Antikörper in 3% BSA in TBST (1:50-1:1.000, abhängig von Ab).
    2. Über Nacht bei 4 °C in einer befeuchteten Kammer brüten.
    3. 3 x 5 min mit TBST waschen.
  7. Inkubation von sekundären Antikörpern
    1. Verdünnen Sie den Antikörper in 3% BSA (in TBST) (1:250) oder in 5% normalem Eselserum.
    2. Inkubieren Sie für 1 h bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln, da der Antikörper an ein Fluorophor konjugiert ist.
  8. Nukleare Färbung
    1. Verdünntes 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) 1:1.000 in TBST.
    2. Inkubieren Sie für 5 min bei RT.
    3. 2 x 5 min mit TBST waschen.
  9. Montage
    1. Verwenden Sie einen Tropfen Montagemedium, um das Deckglas zu montieren.
    2. Versiegeln Sie das Deckglas am nächsten Tag mit Nagellack.

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Representative Results

Phasenkontrastaufnahmen von Endometrium-Organoiden der Maus
Wir haben Organoide aus dem WT-Maus-Endometriumepithel etabliert, wie im beigefügten Protokoll beschrieben (siehe Diagramm in Abbildung 1). Nach der enzymatischen Dissoziation des Endometrialepithels der Maus wurden die Epithelschichten mechanisch von den Stromazellen der Gebärmutter getrennt und weiter mit Kollagenase dissoziiert, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Bei korrekter Durchführung sollte diese Methode der Trennung von Epithel- und Stromazellen Proben mit einer Kontamination von nicht mehr als 10 % bis 15 % des gegenüberliegenden Zelltyps ergeben (siehe Immunfluoreszenzbilder in Abbildung 2). Das Epithelzellpellet wurde dann in einer Gelmatrix resuspendiert, bei Raumtemperatur gelieren gelassen und in 25 μL Kuppeln auf Gewebekulturplatten plattiert. Nachdem sich die Gelmatrixkuppeln verfestigt hatten, wurden sie mit Organoidmedium überlagert und wachsen gelassen. Wir beobachteten typischerweise, dass sich Endometrialepithelzellen innerhalb von 3-4 Tagen zu Organoiden zusammenfügten, wie in Abbildung 3 dargestellt. Die Organoide wurden in Kultur gehalten, wobei alle 3 Tage ein Medienwechsel stattfand und alle 5-7 Tage erfolgte.

Bildgebung von Endometrium-Organoiden der Maus mittels histologischer und immunfluoreszierender Färbung
Um die Morphologie der epithelialen Organoide der Maus zu analysieren, haben wir Methoden angepasst, die für die Verkapselung von zellulären Feinnadelaspiraten unter Verwendung von Probenverarbeitungsgel20 verwendet werden. Dies ermöglicht die Erhaltung der Organoidmorphologie des Endometriums und die Verkapselung in eine Matrix, die zur Vorbereitung der Paraffineinbettung verarbeitet werden kann. Probenverarbeitungsgel ist ein modifiziertes Agar, das in klinischen Pathologielaboratorien für die Analyse von Feinnadelaspiraten weit verbreitet ist und zur Verkapselung von vaginalen Organoiden verwendet wurde21,22. Nachdem sich das Gel / Organoid-Gemisch der Probe verfestigt hat, kann es mit Techniken, die typischerweise zur Analyse von Geweben verwendet werden, verarbeitet, gefärbt und abgebildet werden. In Abbildung 4A,B zeigen wir, dass geschnittene formalinfixierte Paraffin-eingebettete Endometrium-Organoide durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen sichtbar gemacht werden können, die die einzelne Schicht des Epithels und der Hohlzentren - die Lumen - der Organoide zeigen. Bestimmte Organoide enthalten auch Sekrete im Lumen, was darauf hindeutet, dass die Organoide die funktionellen Eigenschaften von Drüsenepithelzellen erwerben. Wir beschreiben auch Techniken zur Visualisierung der Organoide mittels Immunfärbung (Abbildung 4C, D); Sektionierte Endometrium-Organoide wurden mit einem Cytokeratin-8-Primärantikörper (TROMA-1) und einem Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (Sekundär-Anti-Ratten-594) inkubiert. Die Kerne wurden dann mit DAPI sichtbar gemacht, und die Objektträger wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet. Wir beobachteten, dass alle Zellen in den Organoiden Cytokeratin 8-positiv waren und DAPI enthielten, was darauf hindeutet, dass die Fixierung, Einbettung und Verarbeitung der Endometrium-Organoide mit der Antikörper-basierten Immunfärbung kompatibel ist.

RNA-Extraktion und Genexpressionsanalyse
Um die Genexpressionsantwort von Endometrium-Organoiden zu bestimmen, ließen wir Endometrium-Organoide von WT-Mäusen 4 Tage nach der ersten Passage wachsen. Am Abend vor der Behandlung wurde das Organoid-Medium der Gebärmutterschleimhaut in ein Hungermedium umgewandelt. Die Organoide wurden dann in dreifachen Vertiefungen (jeweils mit drei Kuppeln) mit Vehikel (Ethanol; gleiches Volumen in Lösung wie bei Östradiol) oder 10 nM Östradiol (E2) für insgesamt 48 h behandelt. Nach 48 h wurde das Medium entfernt und die Organoide für die RNA-Extraktion aufbereitet. Ungefähr 4 μg RNA können aus insgesamt zwei Kuppeln aus jeder Vertiefung gewonnen werden, und 1 μg RNA wurde verwendet, um cDNA rückwärts zu transkribieren. Die Amplifikation der Gene, die für Lipocalin 2 (Lcn2), Lactoferrin (Ltf) und den Progesteronrezeptor (Pgr) kodieren, wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR durchgeführt (Abbildung 5 und Tabelle 1)23,24,25. Wie erwartet, beobachteten wir, dass die Expression von Lcn2, Ltf und Pgr in den epithelialen Organoiden nach Stimulation mit 10 nM E2 zunahm (Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen somit, dass Endometriumepithel-Organoide erfolgreich eingesetzt werden können, um die Veränderungen der Genexpression als Reaktion auf E2 zu messen.

Figure 1
Abbildung 1: Verfahren zur Etablierung von Endometrium-Organoiden. Das Diagramm zeigt die wichtigsten Schritte, die befolgt wurden, um (A) epitheliale Organoide aus dem Endometrium der Maus zu etablieren und (B) zu passagen. (A) Die Verfahren umfassen die enzymatische und mechanische Dissoziation des Endometriumepithels aus der Gebärmutter der Maus, gefolgt von der Einzelzelldispersion und der Verkapselung des Epithels in eine Gelmatrix. Um das Gebärmuttergewebe für die enzymatische Dissoziation zu erhalten, werden die Eierstöcke und Eileiter mit einer feinen Schere aus den Gebärmutterhörnern entfernt, seitlich in 4-5 mm große Fragmente geschnitten und dann in die Enzymlösung gegeben. Nach der enzymatischen Inkubation wird das Endometriumepithel unter dem Mikroskop mit einer Pinzette und einer Pipette mechanisch vom darunter liegenden Stroma getrennt, um das Epithel aus der Gebärmutterröhre zu "quetschen". Das Epithel wird weiter in Epithelzellen verdaut, wobei eine kurze Inkubation in Kollagenase erfolgt, gefolgt von der Verkapselung in eine Gelmatrix. (B) Das Passieren der Endometrium-Organoide erfordert eine mechanische Dissoziation in kaltem Medium und eine Zentrifugation, um die Organoide aus der Matrix zu lösen und kleinere Organoidfragmente zu erzeugen. Sobald die Organoide aus der Matrix gelöst und mechanisch in kleinere Fragmente dissoziiert wurden, werden sie in die Matrix eingekapselt und neu plattiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Immunfärbung von isolierten Endometriumepithel- und Stromazellpopulationen. Immunfluoreszenzaufnahmen zeigen Epithel- und Stromazellpopulationen der (A,B) Epithelzelle und (C,D) Stromazellfraktionen nach enzymatischer und mechanischer Trennung der Gebärmutter. Cytokeratin 8 (ein Epithelzellmarker) ist rot dargestellt, Vimentin (ein Stromazellmarker) ist grün und DAPI (ein Kernmarker) ist blau dargestellt. Maßstabsbalken = 100 μm (A,C), 20 μm (B,D). Abkürzungen: CK8 = Cytokeratin 8; VIM = Vimentin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Bildung von Endometrium-Organoiden aus WT-Mäusen über einen Zeitraum von 4 Tagen. Endometriumepithel wurde aus einer WT-Maus isoliert und zur Erzeugung von Organoiden verwendet. (A) Phasenkontrastaufnahme der Epithelzellen, die unmittelbar nach der Verdauung (Tag 0) in der Gelmatrix eingekapselt sind. (B,C) Einige kleine Organoide können an Tag 1 (B) und Tag 2 (C) der Kultur beobachtet werden. (D) Größere und reife epitheliale Organoide können am Tag 3 der Kultur beobachtet werden. Die Bilder wurden mit einem 5-fach-Objektiv aufgenommen; Maßstabsbalken = 200 μm. Abkürzung: WT = Wildtyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Histologische Analyse von Endometrium-Organoiden. (A,B) FFPE-Endometrium-Epithel-Organoide wurden geschnitten und mit H&E gefärbt. (C,D) FFPE-Epithel-Organoide wurden mit dem Epithelzellmarker Cytokeratin 8 (rot) immungefärbt. Zellkerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsbalken = 200 μm (A), 100 μm (C), 50 μm (B,D). Abkürzungen: FFPE = formalinfixiertes Paraffin eingebettet; H&E = Hämatoxylin & Eosin; CK8 = Zytokeratin 8; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Genexpressionsanalyse von Endometrium-Organoiden der Maus. Maus-Endometrium-Epithel-Organoide von WT-Mäusen wurden 4 Tage lang in organoidem Wachstumsmedium kultiviert, gefolgt von einer Behandlung mit Vehikel oder 10 nM E2 für 48 h in DMEM/F12, ergänzt mit 2% anthrazistabgelassenem FBS. (A,B) Phasenkontrastaufnahmen der WT-Maus-Organoide nach Behandlung mit Vehikel (A) oder 10 nM E2 (B). (C-E) Echtzeit-qPCR-Analyse von epithelialen Endometrium-Organoiden, die mit Vehikel oder 10 nM E2 behandelt wurden. Expression von E2-regulierten Genen, Lipocalin 2 (Lnc2), Lactoferrin (Ltf) und Progesteronrezeptor (Pgr). Die Balken stellen den mittleren ± SEM dar, der durch einen zweiseitigen t-Test analysiert wurde. *p < 0,033, **p < 0,002, ***p < 0,001. Wiederholt mit Organoiden, die von n = 3 WT-Mäusen pro Bedingung abgeleitet sind. Maßstabsbalken = 200 μm (A,B). Abkürzungen: WT = Wildtyp; E2 = Östradiol; qPCR = quantitative PCR. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Primer-Sequenz Vorwärts (5'-3') Rückwärts (5'-3')
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (LTF) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesteron (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCTTCTT
PCR-Gemisch enthält:
2x SYBR Grün
0,5 μM Fwd-Primer
0,5 μM Rev Primer
cDNA
RNAse/DNAse-freiesH2O
Bedingungen für Radfahrer:
Temperatur Zeit Zyklen
Halten 95 °C 10 Min. 1
Vergällen 95 °C 15 Sek. 40
Ausdehnen 60 °C 60 Sekunden

Tabelle 1: Primer-Sequenzen und PCR-Bedingungen.

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Discussion

Hier beschreiben wir Methoden zur Erzeugung von Endometriumepithel-Organoiden aus dem Endometrium der Maus und die Protokolle, die routinemäßig für ihre nachgeschaltete Analyse verwendet werden. Endometrium-Organoide sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die Endometrium-bedingte Erkrankungen wie Endometriose, Endometriumkarzinom und Implantationsversagen kontrollieren. Bahnbrechende Studien, die 2017 veröffentlicht wurden, berichteten über die Bedingungen für die Kultivierung langfristiger und erneuerbarer Kulturen von Endometrium-Organoiden aus Maus und menschlichem Epithel 4,5. Obwohl Organoide weit verbreitet sind, um biologische Signalwege in anderen Systemen zu untersuchen, wurde die Untersuchung von Endometriumgewebe in vitro durch das Fehlen eines geeigneten Modells zur Untersuchung des nicht transformierten primären Epithels in Kultureingeschränkt 26. Endometrium-Organoide, die aus dem menschlichen und dem Endometrium der Maus gewonnen wurden, wurden erfolgreich unter Bedingungen etabliert, die typischerweise zur Kultivierung von Organoiden aus anderen Organgeweben wie Darm, Niere und Lunge verwendet werden, und indem sie in ein extrazelluläres Matrixgerüst eingebettet wurden, das aus der Gelmatrix4 besteht. Seit diesen ersten Berichten hat die Verwendung von Endometrium-Organoiden zur Untersuchung der Biologie des Endometriums in der wissenschaftlichen Gemeinschaft deutlich zugenommen.

Durch die Modifikation einer zuvor veröffentlichten Methode der epithelialen Isolierung aus der Gebärmutter der Maus27,28 hebt dieses Protokoll auf einzigartige Weise die wichtigsten Schritte zur Isolierung der Gebärmutter der Maus hervor, indem das Gewebe direkt in eine Enzymlösung gegeben wird, wobei die Notwendigkeit einer Durchquerung der Gebärmutter oder der Verwendung von Filtration umgangen wird. Mit dieser Methode erhielten wir Epithel mit einer Reinheit von ~ 85% -90%, wie durch Cytokeratin 8 und Vimentin-Immunfärbung bestimmt (Abbildung 2). Dieses Protokoll umreißt auch die wichtigsten Details für die Einkapselung der isolierten Epithelzellen in die Wachstumsmatrix für die Erzeugung, Aufrechterhaltung und Weitergabe der Organoide. Die Bilder in Abbildung 4 und unsere unveröffentlichten Studien haben das Vorhandensein von Mucinen und Drüsenzellen (d.h. FOXA2-positiv) in unseren Organoidkulturenidentifiziert 29. Diese deuten darauf hin, dass die hier vorgestellte Methode sowohl für die Isolierung von Drüsen- als auch von luminal-epithelialen Zellpopulationen aus dem Endometrium der Maus wirksam ist.

Zu den wichtigsten Einschränkungen für das Wachstum dieser Organoide gehört die Verwendung der kommerziellen Matrix (d.h. Matrigel), die zu Chargen-zu-Chargen-Variationen führen kann und Wachstumsfaktoren enthält, die das Organoidwachstum beeinflussen können. Während diese Organoide reines Uterusepithel enthalten, wurde kürzlich die Verwendung zusätzlicher Endometriumzelltypen (d.h. Immun, Stroma) in humanen Organoidsystemen des Endometriums 8,30 beschrieben. Andere Gruppen haben die Fähigkeit gezeigt, sowohl luminale als auch Drüsenepithelzellen für Organoidkulturen aus der Gebärmutter der Maus zu isolieren14.

Bei diesem Ansatz werden Gewebe aus einem Kleintiermodell verwendet, das den meisten Forschern relativ häufig und zur Verfügung steht. Die Erzeugung von Endometrium-Organoiden aus größeren Tiermodellen oder Menschen kann ethische oder technische Herausforderungen mit sich bringen, die durch den Einsatz von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-basierten Techniken überwunden werden können. Solche Technologien wurden zuvor für Endometriumgewebe31 und andere Gewebe des Fortpflanzungstraktes 32 beschrieben und wurden effektiv verwendet, um Endometrium/Plazenta-Wechselwirkungen in vitrozu untersuchen33. Daher stellt die Verwendung von iPS-Zellen als Quelle für Endometrium-Stroma- und Epithelzellen des Endometriums von Menschen und anderen Großtiermodellen eine erneuerbare und zugängliche Quelle für die Erzeugung von Endometrium-Organoiden dar.

Während die Maus ein weit verbreitetes Modell für die Untersuchung der Implantation ist, gibt es wichtige evolutionäre Unterschiede im Mechanismus der Implantation zwischen Mäusen und Menschen, die beachtet werden sollten. Während beispielsweise die interstitielle Implantation durch eine tiefe trophoblastische Invasion durch das luminale Epithel in das darunter liegende Stroma gekennzeichnet ist, unterscheidet sich der Mechanismus des Invasionsprozesses zwischen Mäusen und Primaten34. Bei Mäusen erfolgt die Invasion der Trophoblasten durch das luminale Epithel mit Apoptose oder Entose 35,36, während Trophoblasten bei Primaten 34,35 zwischen luminalem Epithel in das darunter liegende Stroma wandern.

Die Versorgung von Endometrium-Organoiden mit den notwendigen Wachstumsfaktoren, um die Selbstorganisation und langfristige Erneuerung zu unterstützen, ist unerlässlich, um Endometrium-Organoidkulturen zu erhalten, die das native Gewebe rekapitulieren. Die komplexe Medienzusammensetzung für die Endometrium-Organoide weist auf die vielfältigen Signalwege hin, die zu den Eigenschaften der Epithelzellen beitragen und sowohl aus parakrinen als auch aus autokrinen Quellen stammen würden. Das Stromakompartiment des Endometriums ist eine komplexe Ansammlung zahlreicher Zelltypen, einschließlich fibroblastenähnlicher Stromazellen, Endothel, Makrophagen und anderer spezialisierter Immunzellen, die sich als Reaktion auf Östrogen und Progesteron ständig verändern37.

Zum Beispiel enthält das Organoid-Kulturmedium Faktoren, die den WNT/β-Catenin-Signalweg in den Organoiden aktivieren, wie WNT3a und R-Spondin. Studien an Mäusen haben gezeigt, dass WNT-Liganden für die Entwicklung der Gebärmutter und die Drüsenfunktion entscheidend sind. Daher ist die Aktivierung dieses Signalwegs entscheidend für die Entwicklung und Erhaltung von Organoiden38,39. R-Spondin verstärkt den WNT-Signalweg und ist der Ligand des Leucin-reichen G-Protein-gekoppelten G-Protein-gekoppelten Rezeptors (LGR5)40. Endometrium-Organoidkulturen erfordern auch eine Hemmung der Signalwege des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) und des knochenmorphogenetischen Proteins (BMP). Zum Beispiel enthält das Organoid-Kulturmedium des Endometriums den BMP-Inhibitor Noggin, ein sezerniertes Protein, das an BMP2, BMP4 und BMP741 bindet und diese inaktiviert. Der pharmakologische Inhibitor A83-01 ist auch im Organoidmedium des Endometriums vorhanden. A83-01 ist ein niedermolekularer Inhibitor mit hoher Spezifität für die Rezeptoren ALK4, ALK5 und ALK742. ALK4/5/7 sind Typ-1-Rezeptoren der TGFβ-Signalfamilie, die an Signale binden und diese weiterleiten, die von Liganden wie TGFβ, Activin oder Nodal ausgelöst werden. BMP-Signale sind entscheidend für die Aufrechterhaltung von Stammzellen in Geweben wie dem Darm43 und den Haarfollikeln44. Die Hemmung des TGFβ-Signalwegs trägt zur proliferativen Kapazität und Koloniebildungseffizienz von mesenchymalen Stammzellen des Endometriums45 bei, die durch Umbau von Schlüsselregionen im Chromatin46 erfolgt. Daher ist die Modulation dieser beiden Schlüsselsignalwege, BMP und TGFβ, notwendig, um Organoidkulturen mit Selbsterneuerungsfähigkeit zu erhalten.

Obwohl hier nicht dargestellt, fanden wir heraus, dass die Langzeitkultur der Maus-Organoide mit dem ALK4/5/7-Inhibitor A83-01 nach drei oder vier kontinuierlichen Passagen zu morphologischen Veränderungen in den epithelialen Organoiden führte (Kriseman et al., im Review). Die morphologischen Veränderungen in den epithelialen Organoiden erinnerten an die von Boretto et al.4 beschriebenen "dichten" epithelialen Organoide, bei denen die Entwicklung von sekretorischeren Zellen aufgrund einer verminderten parakrinen Sekretion von WNT-Liganden auftrat. Daher ist es wahrscheinlich, dass sich TGFβ- und WNT-Signalwege überschneiden, um die Regeneration und Differenzierung von Endometriumepithelorganoiden zu steuern.

Jüngste Studien haben 3D-Endometrium-Epithel-/Stroma-Kokultursysteme aus menschlichem Gewebe erzeugt 7,8,16. Eine Methode der Co-Kultivierung verwendet ein gerüstfreies System, in dem Endometriumepithel- und Stromazellen kombiniert werden und sich in einer gerüstfreien Vertiefung unter Verwendung eines definierten Kulturmediums zu 3D-Strukturen zusammenfügen können. Diese 3D-Endometrium-Epithel-/Stroma-Organoide exprimieren nicht nur Rezeptoren für Östrogen, Progesteron und Androgen, sondern rekapitulieren auch die Reaktion auf Eierstockhormone - Östrogen und Progesteron 6,7. In einer anderen Co-Kultivierungsmethode, die in einer Studie von Rawlings et al. verwendet wurde, werden Endometriumepithel-Organoide mit Stromazellen in einer Kollagenmatrix kombiniert und in einem modifizierten Organoidmediumgezüchtet 8. Diese epithelialen / stromalen kokultivierten Organoide oder Assembloide organisieren sich in einem suspendierten 3D-System, in dem Stromazellen epitheliale drüsenartige Strukturen umgeben.

Die Mehrzahl der Endometrium-Organoide wird in einer wachstumsfaktorreduzierten Gelmatrix kultiviert; Das Vorhandensein von Wirkstoffen in der Matrix kann jedoch unerwünschte zelluläre Reaktionen innerhalb der Organoide ausüben. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden Organoide in Gelmatrix-freien Gerüsten etabliert, wie z. B. 3D-gedruckte Agaroseformen, in denen sich einzelne Organoide selbst zusammensetzen dürfen6. Andere Gruppen haben synthetische Hydrogele entwickelt, die als 3D-Matrizen für die Kultur von Endometrium-Organoiden dienen47. Diese Organoide lagern sich zu 3D-Strukturen mit apikobasaler Polarität zusammen und können auch mit Stromazellen des Endometriums kombiniert werden, um komplexe Organoide zu bilden48. Da Organoide erfolgreich für die Kultivierung von nicht transformiertem primärem Endometriumgewebe von Mensch und Maus auf eine Weise verwendet werden können, die 2D-Zellkulturen nicht können, besteht kein Zweifel, dass Endometrium-Organoide den Bereich der reproduktiven Gesundheit von Frauen voranbringen und ein unglaubliches Werkzeug für die Untersuchung von Fortpflanzungspathologien wie wiederholten Fehlgeburten, Endometriose und Endometriumkarzinom sein werden16. 49,50.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Stephanie Pangas und Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) für die kritische Lektüre und Bearbeitung unseres Manuskripts. Die Studien wurden durch die Zuschüsse R00-HD096057 (DM), R01-HD105800 (DM), R01-HD032067 (M.M.M.) und R01-HD110038 (M.M.M.) sowie durch NCI-P30 Cancer Center Support Grant (NCI-CA125123) unterstützt. Diana Monsivais, Ph.D. erhält einen Next Gen Schwangerschaftspreis des Burroughs Wellcome Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid Media Formulation
Name Company Catalog Number Final concentration
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free Corning 354230 100%
Trypsin from Bovine Pancreas Sigma Aldrich T1426-1G 1%
Advanced DMEM/F12 Life Technologies 12634010 1X
N2 supplement Life Technologies 17502048 1X
B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A Life Technologies 12587010 1X
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma Aldrich A9165-5G 1.25 mM
L-glutamine Life Technologies 25030024 2 mM
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636-100G 10 nM
ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 Tocris 2939 500 nM
Recombinant human EGF Peprotech AF-100-15 50 ng/mL
Recombinant human Noggin Peprotech 120-10C 100 ng/mL
Recombinant human Rspondin-1 Peprotech 120-38 500 ng/mL
Recombinant human FGF-10 Peprotech 100-26 100 ng/mL
Recombinant human HGF Peprotech 100-39 50 ng/mL
WNT3a R&D systems 5036-WN 200 ng/mL
Other supplies and reagents
Name Company Catalog Number Final concentration
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C0130-1G 5 mg/mL
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma Aldrich DN25-100MG 2 mg/mL
DPBS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14190-250 1X
HBSS, no calcium, no magnesium ThermoFisher 14170112 1X
Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) Fisher Scientific #08-772-51
Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) Fisher Scientific #0877229
Falcon Cell Strainers, 40 µm Fisher Scientific #08-771-1
Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) Genesee Scientific 11-331
Trizol reagent Invitrogen 15596026
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red ThermoFisher 11039021
Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped Sigma Aldrich F6765-500ML 2%
Estratiol (E2) Sigma Aldrich E1024-1G 10 nM
Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade VWR 15710 4%
Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes Fisher Scientific 1000961
Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds Fisher Scientific 64-010-15 
Ethanol, 200 proof (100%) Fisher Scientific 22-032-601 
Histoclear Fisher Scientific 50-899-90147
Permount Mounting Medium Fisher Scientific 50-277-97
Epredia Nylon Biopsy Bags Fisher Scientific 6774010
HistoGel Specimen Processing Gel VWR 83009-992
Hematoxylin solution Premium VWR 95057-844
Eosin Y (yellowish) solution Premium VWR 95057-848
TBS Buffer, 20X, pH 7.4 GenDEPORT T8054 1X
TBST (10X), pH 7.4 GenDEPORT T8056 1X
Citric acid  Sigma Aldrich C0759-1KG
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma Aldrich S4641-500G
Tween20 Fisher Scientific BP337-500 
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich A2153-100G 3%
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher 62248 1:1000 dilution
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium Vector Labs H-1000-10
Clear Nail Polish Fisher Scientific NC1849418
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 22037246
VWR Micro Cover Glasses VWR 48393-106
SuperScript VILO Master Mix ThermoFisher 11755050
SYBR Green PCR Master Mix ThermoFisher 4364346
Krt8 Antibody (TROMA-I)  DSHB TROMA-I  1:50 dilution
Vimentin Antobody Cell Signaling 5741S 1:200 dilution
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 594		 ThermoFisher A-21209 1:250 dilution
Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary
Antibody, Alexa Fluor 488		 ThermoFisher A-21206 1:250 dilution
ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope ZEISS
ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera ZEISS
Primer Sequence Forward (5'-3') Reverse (5'-3') _
Lipocalin 2 (Lcn2) GCAGGTGGTACGTTGTGGG CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC
Lactoferrin (Ltf) TGAGGCCCTTGGACTCTGT ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC
Progesterone (Pgr) CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC TAACTTCAGACATCATTTCCGG
Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) CAATGTGTCCGTCGTGGATCT GCCTGCTTCACCACCTTCTT

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Biologie Heft 191 Endometrium Organoide Unfruchtbarkeit Gebärmutter Regeneration
Etablierung von 3D-Endometrium-Organoiden aus der Gebärmutter der Maus
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Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z.,… More

Tang, S., Parks, S. E., Liao, Z., Cope, D. I., Blutt, S. E., Monsivais, D. Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus. J. Vis. Exp. (191), e64448, doi:10.3791/64448 (2023).

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