Summary
このプロトコルは、遺伝子発現および組織学的分析のためのマウス子宮内膜上皮オルガノイドを確立するための方法論を説明しています。
Abstract
子宮内膜組織は子宮の内腔を裏打ちし、エストロゲンとプロゲステロンの周期的な制御下にあります。これは、管腔および腺上皮、間質コンパートメント、血管網、および複雑な免疫細胞集団で構成される組織です。マウスモデルは子宮内膜を研究するための強力なツールであり、着床、胎盤形成、および癌を制御する重要なメカニズムを明らかにしています。3D子宮内膜オルガノイド培養の最近の開発は、子宮内膜生物学の根底にあるシグナル伝達経路を解剖するための最先端のモデルを提示します。遺伝子操作されたマウスモデルから子宮内膜オルガノイドを確立し、それらのトランスクリプトームを解析し、単一細胞分解能でそれらの形態を視覚化することは、子宮内膜疾患の研究にとって重要なツールです。本論文では、マウスの子宮内膜上皮の3D培養を樹立する方法を概説し、遺伝子発現を定量化し、オルガノイドの組織像を解析する技術について説明します。目標は、子宮内膜上皮オルガノイドの遺伝子発現と形態学的特徴を確立、培養、および研究するために使用できるリソースを提供することです。
Introduction
子宮内膜 - 子宮腔の内層粘膜組織 - は、女性のリプロダクティブヘルスに重要な役割を果たすユニークで非常に動的な組織です。生殖寿命の間、子宮内膜は卵巣ホルモン - エストロゲンとプロゲステロンの協調作用によって調整されて、増殖、分化、および分解の数百サイクルを経験する可能性を秘めています。遺伝子操作マウスの研究により、ホルモンに対する子宮内膜の反応と、胚着床、間質細胞の脱落膜化、妊娠の制御を支える基本的な生物学的メカニズムが明らかになりました1。しかし、in vitro研究は、従来の2D細胞培養で形質転換されていない初代マウス子宮内膜組織を維持することが困難であるため、制限されていました2,3。3D臓器系(オルガノイド)としての子宮内膜組織の培養における最近の進歩は、子宮内膜細胞の再生と分化を制御する生物学的経路を研究する新しい機会を提供します。マウスおよびヒトの子宮内膜オルガノイドシステムは、さまざまなマトリックスに封入された純粋な子宮内膜上皮から開発されており4,5、ヒト子宮内膜は足場のない上皮/間質共培養6,7として、最近ではコラーゲンカプセル化された上皮/間質集合体として培養されています8。.上皮オルガノイド培養の成長と再生の可能性は、オルガノイドの成長と再生を最大化するように経験的に決定された成長因子と低分子阻害剤の定義されたカクテルによってサポートされています4、5、9。さらに、子宮内膜オルガノイドを凍結および解凍する能力により、将来の研究のためにマウスおよびヒト由来の子宮内膜オルガノイドの長期的なバンクが可能になります。
遺伝子操作マウスは、妊娠初期と脱落膜化を制御する複雑なシグナル伝達経路を明らかにし、妊娠喪失、子宮内膜がん、子宮内膜症のモデルとして使用されています。これらの遺伝学的研究は、女性の生殖組織で特異的に活性なcreリコンビナーゼを使用して、loxP隣接対立遺伝子(「floxed」)の細胞特異的欠失によって大部分達成されました。これらのマウスモデルには、広く使用されているプロゲステロン受容体-cre10(子宮内膜上皮組織および間質組織で強力なリコンビナーゼ活性を有する)、成体マウスにおいて子宮内膜上皮組換えを誘導するラクトフェリンi-cre11、またはミュラー管由来組織において上皮特異的欠失を引き起こすWnt7a-creが含まれる12。.遺伝子操作されたマウスモデルから子宮内膜組織を3Dオルガノイドとして培養することは、子宮内膜生物学を調査し、子宮内膜細胞の再生と分化を制御する成長因子とシグナル伝達経路の同定を容易にする絶好の機会を提供しました13,14。マウス子宮内膜組織の単離および培養のための方法は文献に記載されており、その後の子宮内膜上皮オルガノイドの培養のための子宮上皮の単離のための様々な酵素戦略の使用を報告している4。以前の文献は子宮内膜上皮オルガノイド培養プロトコル4,5,6の重要なフレームワークを提供しますが、この論文はこれらのオルガノイドを生成、維持、処理、および分析するための明確で包括的な方法を提供します。これらの技術の標準化は、女性の生殖生物学の分野における進歩を加速させるために重要です。ここでは、ゲルマトリックス足場での子宮内膜オルガノイドのその後の培養のためのマウス子宮内膜上皮組織の酵素的および機械的精製のための詳細な方法論を報告します。また、ゲルマトリックス封入マウス子宮内膜上皮オルガノイドの下流組織学的および分子学的解析の方法論についても説明します。
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Protocol
マウスの取り扱いと実験的研究は、ベイラー医科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルと、実験動物の世話と使用のためのNIHガイドによって確立されたガイドラインの下で実施されました。
1.酵素的および機械的方法を用いたマウスからの子宮上皮の単離
注:このセクションでは、ゲルマトリックススキャフォールドを使用してマウスから上皮子宮内膜オルガノイドを確立、継代、凍結、および解凍するために必要な手順について説明します。以前の研究では、マウス子宮内膜オルガノイドの最適な培養物が発情期4の間にマウスから確立されることが決定されており、これは膣スワブ15の細胞学的検査によって決定することができる。成体雌WTマウス(6〜8週齢、ハイブリッドC57BL/6Jおよび129S5/SvEvBrd)を全ての実験に使用した。マウスは、IACUC承認のガイドラインに従って、イソフルラン鎮静とそれに続く子宮頸部関節脱離を使用して人道的に安楽死させた。マウスを安楽死させたら、次の手順に従う必要があります。このプロトコルで使用される材料とソリューションに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
- 使用前に、ゲルマトリックスを氷上で約1〜2時間解凍します。
- マウスを解剖するには、ハサミを使用して腹部を中線切開し、皮膚をそっと剥がして下にある腹膜層を露出させます。鉗子を使用して腹膜層を支え、ハサミで横方向を切開して腹部の内容物を露出させます。
- 腹部の脂肪パッドをそっと脇に動かして、子宮角を見つけます。最初に頸部接合部でそれらを保持し、ハサミを使用して腸間膜脂肪に沿って切断することによってそれらを解剖します。マウスの子宮を解剖した後、小さなハサミで子宮角から脂肪組織を完全に取り除きます。
注:使用前にすべての手術器具を滅菌することにより、細胞分離中の無菌性を維持し、マウスの腹部に70%エタノールをスプレーし、滅菌組織培養フードの下で解剖後のすべての手順を実行します。
- 腹部の脂肪パッドをそっと脇に動かして、子宮角を見つけます。最初に頸部接合部でそれらを保持し、ハサミを使用して腸間膜脂肪に沿って切断することによってそれらを解剖します。マウスの子宮を解剖した後、小さなハサミで子宮角から脂肪組織を完全に取り除きます。
- 各子宮角をそれぞれ約4〜5 mmの小さな断片に切ります。
- 1つの子宮からのすべての子宮断片を、0.5 mLの1%トリプシンを含む24ウェルプレートの1ウェルに入れます。酵素溶液が子宮内腔に入るのを許し、子宮内膜上皮を下にある間質から酵素的に分離させる。
- 24ウェルプレートを37°Cの加湿組織培養インキュベーター内で約1時間インキュベートします。
- 1時間のインキュベーション後、子宮の断片を、1 mLのダルベッコリン酸緩衝溶液(DPBS)を含む35 mm組織培養プレートに移します。
- 解剖顕微鏡下で、細かい鉗子と1 mLピペットを使用して、子宮上皮を子宮管から機械的に分離します。子宮片片の一端を鉗子で押さえながら、ピペットチップを断片を縦方向にゆっくりと動かし、子宮管のもう一方の端から上皮を絞り出します。子宮断片から分離した上皮シートを解剖顕微鏡で観察する。
- 1 mLピペットを使用して上皮シートを回収し、1.5 mLチューブに穏やかに移します。
- 残りの子宮片についてもこのプロセスを繰り返し、すべての上皮シートを同じ収集チューブに移します。
- 解離した上皮シートを375 × gで5分間遠心分離することによりペレット化する。
- 細胞ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
- 細胞ペレットを0.5 mLの2.5 mg/mLコラゲナーゼ+ 2 mg/mLのDNase溶液に再懸濁します。ピペットで上下に約10倍、またはシングルセル懸濁液が得られるまで。
- 0.5 mLのDMEM/F12 + 10%ウシ胎児血清(FBS)+抗生物質を加え、細胞を375 × gで5分間遠心分離します。
注:細胞培養に使用される広域抗生物質の詳細については、 材料表を参照してください。 - 上清を注意深く除去し、1 mLのDMEM/F12 + 10%FBS +抗生物質に細胞を再懸濁します。細胞を375 × gで5分間遠心分離します。
2.間質コンパートメントの処理
注:このセクションでは、マウス子宮内膜の間質コンパートメントを分離するために必要なプロトコルの概要を説明します。上皮/間質共培養実験への関心が高まっていることを考えると、オルガノイドを生成する上皮細胞に加えて、間質細胞集団を処理できることが重要です。
- すべての上皮が子宮片から酵素的および機械的に分離されると、残りの管状構造は「間質/子宮筋層」コンパートメントです。この組織をHBSS溶液中の2.5 mg / mLコラゲナーゼ+ 2 mg / mLDNaseに集めます。
- 間質/子宮筋層サンプルを37°Cのシェーカーで15分間インキュベートします。
- インキュベーション後、マウスあたり500 μLのDMEM/F12 + 10%FBS + 抗生物質を加え、解離していないフラグメントを40 μmのセルフィルターでろ過します。
- 375 × gで5分間遠心分離することにより細胞をペレット化します。
- 上清を注意深く除去し、細胞ペレットを1 mLのDMEM/F12 + 10%FBS +抗生物質に再懸濁します。混合物を10 cm細胞培養プレート内のDMEM/F12 + 10%FBS +抗生物質10 mLに滴下します。プレートを加湿した細胞培養インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
- マウス子宮内膜上皮細胞および間質細胞の共培養を生成するには、スキャフォールドフリーまたはコラーゲンマトリックス系を使用するヒト子宮内膜オルガノイドについて記載された方法に従う6、8。
注:これらの技術はまだマウスに対して公開されていませんが、ヒト子宮内膜で公開されているプロトコルに基づいて適応させることができます。
3. 子宮上皮をゲルマトリックスに封入し、オルガノイドを樹立
注意: 使用する準備ができるまで、ゲルマトリックスを氷の上に置いておきます。
- 上清を除去し、細胞ペレットの20倍の量のゲルマトリックスに細胞ペレットを再懸濁します(すなわち、細胞ペレットが20 μLの場合は、400 μLのゲルマトリックスで細胞を再懸濁します)。気泡が発生しないように、ペレットを注意深く再懸濁します。
- ゲルマトリックス/細胞懸濁液を室温で~10分間沈降させます。
- ゲルマトリックス/細胞懸濁液が半固体ゲルになったら、200 μLのワイドボアチップを備えたP200マイクロピペットを使用して、25 μLのゲルマトリックス/細胞懸濁液を穏やかに吸引します。12ウェルプレートのウェルごとに3つの別々の25 μLドームを分注し、37°Cの加湿組織培養インキュベーターでゲルマトリックスを15分間硬化させます。
- ゲルマトリックスが硬化したら、ゲルマトリックスドームを含む各ウェルに750 μLのオルガノイド培地を追加します。加湿した組織培養インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。
注:オルガノイド培地の処方は、 材料の表に記載されています。オルガノイドは通常、最初の培養から4日以内に形成されます。
4. エストラジオール投与後の子宮内膜オルガノイドの遺伝子発現解析
注:このセクションでは、エストラジオールによる処理後のリアルタイムqPCRを使用して子宮内膜上皮オルガノイドの遺伝子発現をプロファイリングするために使用される方法について説明します(E2;表1を参照)。子宮内膜は卵巣ホルモンE2の周期的な制御下にあるため、E2に対するオルガノイドの反応性をテストすることは、生理学的機能の重要な尺度です。高品質のRNAを取得し、子宮内膜上皮オルガノイドからqPCRおよび/またはRNAシーケンシングを使用して遺伝子発現をプロファイリングするのに十分なmRNAを生成しました。このセクションでは、オルガノイドを収集し、遺伝子発現のダウンストリーム解析のためにそれらを処理する方法について説明します。選択された処理培地は、培養子宮内膜細胞を処理するために使用されるものを反映しています。しかしながら、この治療培地は、ホルモン8、16、17によるヒト子宮内膜3D培養物の治療のために行われるように、それに応じて最適化され得ることに留意すべきである。
- 上記のように子宮内膜オルガノイドを培養する。
- オルガノイド培地を取り出し、播種の4日後に750 μLの飢餓培地と交換します。一晩インキュベートします。
- 翌朝、飢餓培地を取り除きます。ビヒクルまたは10 nM E2を含む750 μLの治療培地を追加します。48時間インキュベートします。
- キットメーカーのプロトコルに従ってRNA単離を進めてください。
5. 子宮内膜オルガノイドの組織学的解析
注:子宮内膜オルガノイドの形態学的特徴を画像化することは、成長因子、遺伝子操作、または低分子阻害剤の細胞効果を評価するために重要です。このセクションでは、組織学的染色と抗体免疫蛍光染色を使用して子宮内膜上皮オルガノイドを固定、処理、および画像化するために使用される技術について説明します。
- 1 mLの4%パラホルムアルデヒドを1x PBSで含む1.5 mLの微量遠心チューブを準備します。それらを氷の上に置きます。
- オルガノイドを含む12ウェルプレートのウェルから培地を吸引する。
- チップをカットした1 mLピペットチップを使用して、500 μLの4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに移し、ゲルマトリックスドームをプレートの底から静かに取り外します。
- ゲルマトリックスドーム全体をピペットチップに静かに吸引し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
- オルガノイドを4°Cのローテーターに一晩置き、固定します。
- 翌朝、チューブを600 × g で5分間遠心分離し、オルガノイドをペレット化します。4%パラホルムアルデヒド溶液をピペットで静かに取り除き、廃棄します。オルガノイドを70%エタノールで2回洗浄します。
- 最後の洗浄後、50〜100μLを除くすべてのエタノールをチューブから取り除きます。チューブを脇に置きます。
- 試料処理ゲルのチューブを水浴に入れ、電子レンジで~30秒間マイクロ波でゲルを溶かします。ゲルの粘稠度を監視して、検体処理ゲルが沸騰しないようにします。
注:試料処理ゲルが溶けても熱く沸騰しなかったら、オルガノイドをカプセル化するために迅速に作業します。 - 金型の表面全体を覆うのに十分な試料処理ゲル(約250μL)を移します。
- 検体処理ゲルがまだ溶融している間に、オルガノイドを含む50 μLの70%エタノール溶液を素早く移します。オルガノイドが沈んでいるか、金型の底部に押し込まれていることを確認します。
- 組織学型を氷の入ったバケツの上に置き、標本処理ゲルを冷まして固化させます。
- 検体処理ゲルが完全に乾いたら、オルガノイドが配置されている平面を追跡しながら、標本処理ゲルの正方形を標本バッグに慎重に移します。
- バッグを組織学カセットに入れ、組織のホルマリン固定およびパラフィン包埋に使用される標準的な方法を用いて処理する18。
- パラフィンに固定および包埋した後、ミクロトーム19を用いて5μm切片に切片化する。以下に概説するように、標準的なヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色または免疫染色手順を進めてください。
6. ヘマトキシリン&エオジン染色
- 次のように切片を脱パラフィンする:キシレン、2 x 10分;100%エタノール、2 x 3分;80%エタノール、3分;60%エタノール、3分;dH 2 O,2x 3 分;ヘマトキシリンで1分;水道水(3 x 5秒);エオシンで1分。
- 次のように切片を脱水する:60%エタノール、3分;80%エタノール、3分;95%エタノール、3分;100%エタノール、2 x 3分;キシレン、2 x 15分
- 封入剤を使用してマウントします。
7. 免疫蛍光染色
- 手順6.1の説明に従ってセクションをパラフィン除去します。
- 抗原賦活化の実行
- スライドをマイクロ波対応容器の抗原賦活化溶液に浸します。
- 溶液が沸騰しないように5分間隔を使用して、強火で20分間電子レンジで加熱します。
- 20分間の抗原賦活化ステップが完了したら、抗原賦活化バッファーに浸したまま、スライドを氷上で40分間冷却します。
- スライドを1x TBSTで3分間洗浄します
- TBST中の3%BSA中で室温で1時間インキュベートすることにより、スライドをブロックします。
- 一次抗体インキュベーション
- 抗体をTBSTの3%BSAで希釈します(Abに応じて1:50-1:1,000)。
- 加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。
- TBSTで3 x 5分洗ってください。
- 二次抗体インキュベーション
- 抗体を3%BSA(TBST)(1:250)または5%正常ロバ血清で希釈します。
- 抗体は蛍光色素に結合しているため、暗所で室温(RT)で1時間インキュベートします。
- 核染色
- 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)をTBSTで1:1,000に希釈します。
- RTで5分間インキュベートします。
- TBSTで2 x 5分洗ってください。
- マウンティング
- 1滴の封入剤を使用してカバーガラスを取り付けます。
- 翌日、マニキュアを使用してカバーガラスを密封します。
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Representative Results
マウス子宮内膜オルガノイドの位相差画像
添付のプロトコルに記載されているように、WTマウス子宮内膜上皮からオルガノイドを樹立しました(図 1の図を参照)。マウス子宮内膜上皮の酵素的解離に続いて、上皮シートを子宮間質細胞から機械的に分離し、さらにコラゲナーゼで解離して単一細胞懸濁液を生成した。この上皮細胞と間質細胞分離の方法を正しく実行すれば、反対の細胞タイプの10%〜15%以下の汚染を持つサンプルが得られるはずです( 図2の免疫蛍光画像を参照)。次に、上皮細胞ペレットをゲルマトリックスに再懸濁し、室温でゲル化させ、組織培養プレート上の25 μLドームに播種しました。ゲルマトリックスドームが固化した後、それらをオルガノイド培地で覆い、成長させた。通常、図3に示すように、子宮内膜上皮細胞が 3〜4日以内にオルガノイドに集合することが観察されました。オルガノイドは培養中に維持され、培地の交換は3日ごとに発生し、継代は5〜7日ごとに発生しました。
組織学的および免疫蛍光染色を用いたマウス子宮内膜オルガノイドのイメージング
マウス上皮オルガノイドの形態を解析するために、検体処理ゲル20を用いた細胞細針吸引物の封入に用いられる方法を適応させた。これにより、子宮内膜オルガノイド形態の保存およびパラフィン包埋の準備のための処理に供することができるマトリックスへのカプセル化が可能になる。検体処理ゲルは、細針吸引液の分析のために臨床病理学検査室で広く使用されている修飾寒天であり、膣オルガノイドをカプセル化するために使用されています21,22。試料処理ゲル/オルガノイド混合物が固まった後、組織の分析に通常使用される技術で処理、染色、および画像化することができます。図4A,Bでは、ホルマリン固定パラフィン包埋子宮内膜オルガノイドを、オルガノイドの上皮と中空中心の単層(内腔)を表示するヘマトキシリン染色とエオジン染色によって視覚化できることを示しています。特定のオルガノイドは内腔内に分泌物も含み、オルガノイドが腺上皮細胞の機能特性を獲得することを示しています。また、免疫染色を使用してオルガノイドを視覚化する技術についても説明します(図4C、D)。切片化された子宮内膜オルガノイドを、サイトケラチン8一次抗体(TROMA-1)および蛍光色素標識二次抗体(二次抗ラット-594)とともにインキュベートしました。次に、核をDAPIで視覚化し、スライドを蛍光顕微鏡を使用して画像化しました。オルガノイド中のすべての細胞がサイトケラチン8陽性であり、DAPIを含むことが観察され、子宮内膜オルガノイドの固定、埋め込み、および処理が抗体ベースの免疫染色に適合することを示しています。
RNA抽出と遺伝子発現解析
子宮内膜オルガノイドの遺伝子発現応答を決定するために、WTマウスの子宮内膜オルガノイドを最初の継代後4日間増殖させました。治療前晩に、子宮内膜オルガノイド培地を飢餓培地に変更した。次に、オルガノイドを3つのドームを含むトリプリケートウェル(各ウェルに3つのドームを含む)でビヒクル(エタノール;エストラジオールに使用される溶液中の等量)または10 nMエストラジオール(E2)で合計48時間処理しました。48時間後、培地を除去し、オルガノイドをRNA抽出のために処理した。各ウェルから合計2つのドームから約4μgのRNAを得ることができ、1μgのRNAを使用してcDNAを逆転写しました。リポカリン2(Lcn2)、ラクトフェリン(Ltf)、およびプロゲステロン受容体(Pgr)をコードする遺伝子の増幅は、リアルタイム定量PCRを用いて行った(図5および表1)23、24、25。予想通り、Lcn2、Ltf、およびPgrの発現は、10 nM E2による刺激後に上皮オルガノイドで増加することが観察されました(図5)。したがって、これらの結果は、子宮内膜上皮オルガノイドがE2に応答した遺伝子発現変化を測定するために首尾よく使用できることを示している。
図1:子宮内膜オルガノイドを確立するために使用される手順。 図は、(A)マウス子宮内膜から上皮オルガノイドを確立し、(B)継代するために従った重要なステップを概説する。(A)方法には、マウス子宮からの子宮内膜上皮の酵素的および機械的解離、それに続く単一細胞分散および上皮のゲルマトリックスへのカプセル化が含まれる。酵素解離のための子宮組織を得るために、卵巣および卵管を細かいハサミで子宮角から除去し、横方向に4〜5mmの断片に切断し、次いで酵素溶液に入れる。酵素的インキュベーション後、子宮内膜上皮は、鉗子およびピペットを使用して顕微鏡下で下にある間質から機械的に分離され、子宮管から上皮を「絞り出す」。上皮は、コラゲナーゼ中での短いインキュベーションを使用してさらに上皮細胞に消化され、続いてゲルマトリックスにカプセル化されます。(B)子宮内膜オルガノイドを継代するには、低温培地中での機械的解離と遠心分離により、オルガノイドをマトリックスから放出し、より小さなオルガノイド断片を生成する必要があります。オルガノイドがマトリックスから放出され、機械的に解離してより小さな断片になると、それらはマトリックスにカプセル化され、再メッキされます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単離された子宮内膜上皮および間質細胞集団の免疫染色。 免疫蛍光画像は、子宮の酵素的および機械的分離後の(A、B)上皮細胞および(C、D)間質細胞画分の上皮および間質細胞集団を示す。サイトケラチン8(上皮細胞マーカー)は赤、ビメンチン(間質細胞マーカー)は緑、DAPI(核マーカー)は青で示されています。スケールバー = 100 μm (A、C)、20 μm (B、D)。略語:CK8 =サイトケラチン8;VIM = ビメンチン;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:4日間の経時にわたるWTマウスからの子宮内膜オルガノイドの形成。 子宮内膜上皮をWTマウスから単離し、オルガノイドの生成に用いた。(a)消化直後(0日目)のゲルマトリックスに封入された上皮細胞の位相差像。(B,C)培養1日目(B)と2日目(C)にいくつかの小さなオルガノイドが観察されます。(D)培養3日目に、より大きく成熟した上皮オルガノイドが観察されます。画像は5倍の対物レンズでキャプチャされました。スケールバー= 200μm。略語:WT =野生型。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:子宮内膜オルガノイドの組織学的解析 。 (A,B)FFPE子宮内膜上皮オルガノイドを切片化し、H&Eで染色した。 (C,D)FFPE上皮オルガノイドを上皮細胞マーカーサイトケラチン8(赤色)で免疫染色した。細胞核をDAPI(青色)で染色した。スケールバー = 200 μm (A)、100 μm (C)、50 μm (B、D)。略語:FFPE =ホルマリン固定パラフィン包埋;H&E = ヘマトキシリン & エオシン;CK8 =サイトケラチン8;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マウス子宮内膜オルガノイドの遺伝子発現解析。WTマウスのマウス子宮内膜上皮オルガノイドをオルガノイド増殖培地で4日間培養した後、2%木炭除去FBSを添加したDMEM/F12中でビヒクルまたは10 nM E2で48時間処理しました。(A,B)ビヒクル(A)または10nM E2(B)で処理した後のWTマウスオルガノイドの位相差画像。(C-E)ビヒクルまたは10 nM E2で処理した上皮子宮内膜オルガノイドのリアルタイムqPCR分析。E2調節遺伝子、リポカリン2(Lnc2)、ラクトフェリン(Ltf)、およびプロゲステロン受容体(Pgr)の発現。棒グラフは、両側t検定によって分析されたSEM±平均値を表します。*p < 0.033, **p < 0.002, ***p < 0.001.n=3WTマウス由来のオルガノイドを条件ごとに繰り返した。スケールバー= 200 μm(A、B)。略語:WT =野生型。E2 =エストラジオール;qPCR = 定量的 PCR。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| プライマー配列 | フォワード (5'-3') | リバース (5'-3') |
| リポカリン2(Lcn2) | GCAGGTGGTGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC |
| ラクトフェリン | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC |
| プロゲステロン(Pgr) | CCCACAGGAGTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG |
| グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCTTCTT |
| PCR混合物には以下が含まれます: |
| 2x SYBR グリーン |
| 0.5 μM Fwdプライマー |
| 0.5 μM レブプライマー |
| ティッカー |
| RNAse/DNAseフリーH2O |
| サイクラーの条件: | |||
| 温度 | 時間 | サイクル | |
| 持つ | 95 °C | 10 ミン | 1 |
| 変性 | 95 °C | 15秒 | 40 |
| 延ばす | 60 °C | 60秒 |
表1:プライマー配列およびPCR条件。
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Discussion
ここでは、マウス子宮内膜から子宮内膜上皮オルガノイドを生成する方法と、それらのダウンストリーム分析に日常的に使用されているプロトコルについて説明します。子宮内膜オルガノイドは、子宮内膜症、子宮内膜がん、着床不全などの子宮内膜関連疾患を制御するメカニズムを研究するための強力なツールです。2017年に発表された画期的な研究では、マウスおよびヒト上皮由来の子宮内膜オルガノイドの長期および再生可能な培養物を培養する条件が報告されています4,5。オルガノイドは他の系における生物学的経路の研究に広く使用されてきたが、in vitroでの子宮内膜組織の研究は、培養中の非形質転換初代上皮を研究するための適切なモデルがないために制限されてきた26。ヒトおよびマウスの子宮内膜由来の子宮内膜オルガノイドは、腸、腎臓、肺などの他の臓器組織からのオルガノイドを培養するために通常使用される条件を使用し、それらをゲルマトリックス4で構成される細胞外マトリックス足場に埋め込むことによって首尾よく確立されました。これらの最初の報告以来、子宮内膜の生物学を研究するための子宮内膜オルガノイドの使用は、科学界で著しく増加しています。
マウス子宮から上皮単離の以前に公開された方法を変更することにより27、28、このプロトコルは、組織を酵素溶液に直接配置するか、子宮を横断する必要性をバイパスするか、または濾過を使用することによって、マウス子宮を単離するための重要なステップを独自に強調する。この方法を用いて、サイトケラチン8およびビメンチン免疫染色によって測定された~85%-90%の純度の上皮を得た(図2)。このプロトコルはまた、オルガノイドの生成、維持、および継代のために、単離された上皮細胞を成長マトリックスにカプセル化するための重要な詳細を明確に概説しています。図4の画像と未発表の研究により、オルガノイド培養におけるムチンと腺細胞(すなわち、FOXA2陽性)の存在が確認されています29。これらは、ここで提示された方法が、マウス子宮内膜からの腺細胞集団および管腔上皮細胞集団の両方の単離に有効であることを示している。
これらのオルガノイドの増殖に関する主な制限には、バッチ間のばらつきをもたらす可能性があり、オルガノイドの成長に影響を与える可能性のある成長因子を含む市販のマトリックス(すなわち、Matrigel)の使用が含まれます。さらに、これらのオルガノイドは純粋な子宮上皮を含むが、さらなる子宮内膜細胞型(すなわち、免疫、間質)の使用が、子宮内膜のヒトオルガノイド系において最近記載されている8、30。他の群は、オルガノイド培養のための管腔および腺上皮細胞の両方をマウス子宮から単離する能力を示している14。
このアプローチでは、比較的一般的でほとんどの研究者が利用できる小動物モデルの組織を使用します。より大きな動物モデルまたはヒトから子宮内膜オルガノイドを生成することは、倫理的または技術的な課題をもたらす可能性がありますが、これは人工多能性幹細胞(iPSC)ベースの技術を使用することで克服できます。このような技術は、子宮内膜組織31、生殖管の他の組織32について以前に説明されており、in vitroで子宮内膜/胎盤相互作用を研究するために効果的に使用されてきた33。 したがって、ヒトおよび他の大型動物モデルからの子宮内膜の子宮内膜間質および上皮細胞の供給源としてiPS細胞を使用することは、子宮内膜オルガノイドを生成するための再生可能でアクセス可能な供給源をもたらす。
マウスは着床の研究に広く使用されているモデルですが、マウスとヒトの間で着床のメカニズムには注意すべき重要な進化上の違いがあります。例えば、間質移植は、管腔上皮を通って下にある間質への深い絨毛性浸潤を特徴とするが、浸潤過程のメカニズムはマウスと霊長類の間で異なる34。マウスでは、管腔上皮を介した栄養膜の浸潤はアポトーシスまたはエントーシスを伴います35,36が、栄養膜は霊長類の管腔上皮の間をその下にある間質に移動します34,35。
自己組織化と長期再生をサポートするために必要な成長因子を子宮内膜オルガノイドに提供することは、天然組織を再現する子宮内膜オルガノイド培養を得るために不可欠です。子宮内膜オルガノイドの複雑な培地組成は、上皮細胞の特徴に寄与する複数のシグナル伝達経路を示しており、パラクリン源とオートクリン源の両方から生じます。子宮内膜の間質区画は、線維芽細胞様間質細胞、内皮、マクロファージ、およびエストロゲンおよびプロゲステロンに応答して絶えず変化している他の特殊な免疫細胞を含む多数の細胞型の複雑な集合体である37。
例えば、オルガノイド培地には、WNT3aやR-スポンジンなどのオルガノイドにおけるWNT/β-カテニンシグナル伝達を活性化する因子が含まれています。マウスでの研究は、WNTリガンドが子宮の発達と腺機能に重要であることを示しています。したがって、このシグナル伝達経路の活性化は、オルガノイドの発生および維持にとって重要である38,39。R-スポンジンはWNTシグナル伝達を増幅し、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体(LGR5)40のリガンドです。子宮内膜オルガノイド培養では、形質転換増殖因子β(TGFβ)および骨形成タンパク質(BMP)シグナル伝達経路の阻害も必要です。例えば、子宮内膜オルガノイド培養培地は、BMP2、BMP4、およびBMP7に結合して不活性化する分泌タンパク質であるBMP阻害剤、Nogginを含有する41。薬理学的阻害剤であるA83-01は、子宮内膜オルガノイド培地にも存在します。A83-01は、受容体ALK4、ALK5、およびALK7に対して高い特異性を有する低分子阻害剤である42。ALK4/5/7は、TGFβ、アクチビン、リンパ節などのリガンドに結合して誘導されるシグナルを伝達するTGFβシグナル伝達ファミリーの1型受容体です。BMPシグナルは、腸43および毛包44などの組織における幹細胞の維持に重要である。TGFβシグナル伝達の阻害は、子宮内膜間葉系幹細胞45の増殖能力およびコロニー形成効率に寄与し、これはクロマチン46における重要な領域をリモデリングすることによって生じる。したがって、これら2つの重要なシグナル伝達経路であるBMPおよびTGFβの調節は、自己複製能力を有するオルガノイド培養を維持するために必要である。
ここには表示していませんが、ALK4/5/7阻害剤A83-01を用いたマウスオルガノイドの長期培養は、3〜4回の連続継代後に上皮オルガノイドの形態学的変化をもたらすことを見出しました(Krisemanら、レビュー中)。上皮オルガノイドの形態学的変化は、Wntリガンドのパラクリン分泌の減少により、より分泌様な細胞の発生が起こったBorettoら4によって記述された「高密度」上皮オルガノイドを彷彿とさせた。したがって、TGFβおよびWntシグナル伝達経路が交差して、子宮内膜上皮オルガノイドの再生および分化を制御する可能性があります。
最近の研究では、ヒト組織から3D子宮内膜上皮/間質共培養システムが生成されています7,8,16。共培養の1つの方法は、子宮内膜上皮細胞と間質細胞を結合し、定義された培養培地を使用して足場のないウェル内で3D構造に組み立てるスキャフォールドフリーシステムを利用します。これらの3D子宮内膜上皮/間質オルガノイドは、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲンの受容体を発現するだけでなく、卵巣ホルモンであるエストロゲンとプロゲステロンへの反応を忠実に再現します6,7。Rawlingsらの研究で使用された別の共培養方法では、子宮内膜上皮オルガノイドはコラーゲンマトリックス中の間質細胞と結合し、修飾オルガノイド培地中で増殖させる8。これらの上皮/間質共培養オルガノイド、または集合体は、間質細胞が上皮腺様構造を取り囲む吊り下げ3Dシステムに組織化されます。
子宮内膜オルガノイドの大部分は、成長因子還元ゲルマトリックスで培養されます。しかしながら、マトリックス中の活性化合物の存在は、オルガノイド内で望ましくない細胞応答を発揮する可能性がある。この制限を克服するために、オルガノイドは、個々のオルガノイドが自己組織化することができる3Dプリントされたアガロースモールドなどのゲルマトリックスフリーの足場において確立されている6。他のグループは、子宮内膜オルガノイドの培養のための3Dマトリックスとして機能する合成ヒドロゲルを開発しました47。これらのオルガノイドは、尖端基底極性を有する3D構造に集合し、子宮内膜の間質細胞と結合して複雑なオルガノイドを形成することもできる48。オルガノイドは、2D細胞培養では不可能な方法で、形質転換されていない初代ヒトおよびマウスの子宮内膜組織の培養にうまく使用できるため、子宮内膜オルガノイドが女性のリプロダクティブヘルスの分野を前進させ、再発性妊娠喪失、子宮内膜症、子宮内膜がんなどの生殖病理学を研究するための素晴らしいツールになることは間違いありません16。49,50。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
ステファニー・パンガス博士とマーティン・M・マツク博士(M.M.M.)には、私たちの原稿を批判的に読み、編集していただき、ありがとうございます。研究は、 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development Grants R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.)、R01-HD032067 (M.M.M.)、R01-HD110038 (M.M.M.)、およびNCI-P30 Cancer Center Support Grant(NCI-CA125123)の支援を受けた。ダイアナ・モンシバイス博士は、バロウズウェルカム基金から次世代妊娠賞を受賞しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid Media Formulation | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
| Trypsin from Bovine Pancreas | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ Supplement (50X), minus vitamin A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4, -5, -7 inhibitor, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| Recombinant human EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Recombinant human Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| Recombinant human Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| Recombinant human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| Recombinant human HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| Other supplies and reagents | |||
| Name | Company | Catalog Number | Final concentration |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/mL |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon Polystyrene Microplates (24-Well) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon Polystyrene Microplates (12-Well) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Falcon Cell Strainers, 40 µm | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
| Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| Formaldehyde 16% in aqueous solution, EM Grade | VWR | 15710 | 4% |
| Epredia Cassette 1 Slotted Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia Stainless-Steel Embedding Base Molds | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| Ethanol, 200 proof (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia Nylon Biopsy Bags | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
| Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
| Eosin Y (yellowish) solution Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Buffer, 20X, pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 dilution |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Labs | H-1000-10 | |
| Clear Nail Polish | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 22037246 | |
| VWR Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | 1:50 dilution |
| Vimentin Antobody | Cell Signaling | 5741S | 1:200 dilution |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 |
ThermoFisher | A-21209 | 1:250 dilution |
| Donkey anti-Rabbin IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
ThermoFisher | A-21206 | 1:250 dilution |
| ZEISS Stemi 508 Stereo Microscope | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 Inverted Routine Microscope with digital camera | ZEISS | ||
| Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| Lactoferrin (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
| Progesterone (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATTTCCGG | |
| Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
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