Summary
토끼의 개방성 내측 대퇴골 과두 충격 모델은 외상 후 골관절염(PTOA)과 PTOA 진행을 완화하기 위한 새로운 치료 전략을 연구하는 데 신뢰할 수 있습니다. 이 프로토콜은 임팩터 헤드가 있는 캐리지 기반 드롭 타워를 사용하여 토끼의 후방 내측 대퇴골 과두의 고립된 연골 결손을 생성합니다.
Abstract
외상 후 골관절염(PTOA)은 미국 내 모든 골관절염 사례의 12%를 차지합니다. PTOA는 관절 연골에 작용하는 고충격 하중과 같은 단일 외상성 사건 또는 전방 십자인대 파열과 같은 관절 불안정에 의해 시작될 수 있습니다. 현재 PTOA를 예방할 수 있는 효과적인 치료법은 없습니다. 연골 손상이 진행되는 메커니즘을 더 잘 이해하고 PTOA의 진행을 완화하거나 예방하기 위한 새로운 치료 전략을 조사하기 위해서는 신뢰할 수 있는 PTOA 동물 모델을 개발하는 것이 필요합니다. 이 프로토콜은 연골 손상을 유도하기 위한 개방형 낙하탑 기반 토끼 대퇴골 과두 충격 모델을 설명합니다. 이 모델은 579.1 ± 71.1N의 피크 하중과 81.9 ± 10.1MPa의 피크 응력과 2.4 ± 0.5ms의 피크 하중을 제공했습니다. 매복 내측 대퇴 과두(MFC)의 관절 연골은 비매복 무릎의 반대측 MFC(0.56 ± 0.42) 및 기타 연골 표면(p < 0.0001)에 비해 세포사멸 세포의 비율이 더 높았고(p=0.0058) 3.38 ± 1.43으로 더 높았습니다. OARSI 점수의 차이는 영향을 받지 않은 관절 표면 사이에서 감지되지 않았습니다(p > 0.05).
Introduction
외상 후 골관절염(PTOA)은 전 세계적으로 장애의 주요 원인이며 증상이 있는 골관절염(OA)의 12%-16%를 차지합니다1. 현재 말기 골관절염 관리의 표준은 무릎 및 고관절 전치환술(total knee and hip arthroplasty)2 또는 말기 경골 또는 거골하 관절염의 경우와 같이 관절 고정술이다. 인공관절 치환술은 대체로 성공적이기는 하지만, 비용이 많이 들고 병적인 합병증을 유발할 수 있다3. 또한, 인공관절 치환술은 50세 미만의 환자에서 교정이 필요 없는 임플란트 생존율이 77%-83%로 낮기 때문에 덜 바람직합니다4,5. 현재 PTOA의 진행을 예방하거나 완화하기 위해 FDA가 승인한 치료법은 없습니다.
PTOA는 활막 조직, 연골하 뼈 및 관절 연골을 포함한 전체 관절에 영향을 미칩니다. 관절 연골 퇴행, 활막 염증, 연골하 뼈 리모델링 및 골극 형성이 특징입니다 6,7. PTOA의 표현형은 연골, 활막 및 연골하 뼈 사이의 복잡한 상호 작용 과정을 통해 발달합니다. 현재 알려진 바에 따르면 연골 손상은 제2형 콜라겐(COL2) 및 아그레칸(ACAN)과 같은 세포외 기질(ECM) 성분의 방출로 이어집니다. 이러한 ECM 구성 요소 단편은 염증을 유발하며 IL-6, IL-1β 및 활성 산소 종의 생산을 증가시킵니다. 이러한 매개체는 연골세포에 작용하여 MMP-13과 같은 기질 금속단백분해효소(MMP)의 상향조절을 유발하여 관절 연골을 저하시키는 동시에 기질 합성을 감소시켜 관절 연골의 전반적인 이화 환경을 유발한다8. 또한 원발성 골관절염 및 PTOA 9,10에서 연골 세포 사멸이 증가했다는 증거가 있습니다. 미토콘드리아 기능 장애는 연골 11,12,13,14의 생 리학적 부하 후에 발생하며, 이는 연골 세포 사멸을 증가시킬 수 있다12,15. 향상된 연골세포 사멸은 프로테오글리칸 고갈 및 연골 이화작용 증가와 관련이 있으며, 연골 및 연골하골 리모델링의 변화에 선행하는 것으로 나타났다16,17,18.
대부분의 인간 질병과 마찬가지로 질병의 병태생리학을 더 깊이 이해하고 새로운 치료법을 테스트하기 위해서는 PTOA의 신뢰할 수 있는 중개 모델이 필요합니다. 돼지 및 송곳니와 같은 대형 동물은 PTOA17,19의 관절 내 골절 및 충격 모델에 사용되었지만 비용이 많이 듭니다. 생쥐, 쥐 및 토끼와 같은 더 작은 동물 모델은 비용이 저렴하며 일반적으로 전방 십자인대(ACL)의 외과적 절개 및/또는 내측 반월상 연골의 파괴를 포함하는 관절 불안정화를 통해 생성된 PTOA를 연구하는 데 사용됩니다 20,21,22,23,24,25. 관절 외상은 인대 손상을 포함한 다양한 결과를 초래할 수 있지만26 거의 모든 경우에 연골의 기계적 과부하가 발생한다.
인대 불안정성(전방십자인대 절개에서와 같이)과 급성 연골손상 후 PTOA의 발병 이면에 있는 병리학이 뚜렷한 메커니즘에 기인한다는 새로운 증거가 있다27. 따라서 연골에 대한 직접적인 손상 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 현재 쥐와 생쥐에서 골연골 또는 연골 손상을 일으키는 충격 모델의 수는 제한되어 있다28,29. 그러나 쥐 연골은 고립된 연골 결손을 생성하는 데 적합하지 않습니다. 쥐 관절 연골은 3-5 세포층의 두께에 불과하고 조직화된 표재성, 요골 및 전이 연골 영역과 인간과 더 큰 동물에서 발견되는 두꺼운 석회화 연골층이 없기 때문입니다. 쥐 모델은 또한 부분적인 연골 결손의 자발적 해소를 나타낸다30,31. 따라서 토끼의 연골 두께와 조직이 인간과 유사하고 PTOA를 초래하는 일관된 연골 충격을 전달할 수 있는 가장 작은 동물 모델이기 때문에 이 충격 모델을 선택했습니다. 토끼의 대퇴 과두 충격에 대한 이전의 개방 수술 모델은 진자(32), 휴대용 스프링-장착된 연골 매복 장치(33) 및 토끼 특이적 충격기 생성(34)을 가능하게 하는 드롭 타워를 사용했다. 그러나 이러한 연구는 생체 내 데이터가 부족했습니다. 다른 연구들은 진자 기반35, 공압36 및 스프링 장착37 충격 장치(10)를 사용한 생체 내 데이터를 보고했으며, 이러한 연구는 방법 간에 피크 응력 및 하중 속도의 높은 변동성을 보여줍니다. 그러나 이 분야에서는 생체 내 급성 연골 외상을 안정적으로 모델링할 수 있는 일관된 접근 방식이 부족합니다.
현재 프로토콜은 토끼 무릎의 후방 내측 과두에 일관된 충격을 전달하기 위해 드롭 타워 기반 시스템을 사용합니다. 무릎에 대한 후방 접근은 후방 내측 대퇴골 과두를 노출시키기 위해 사용됩니다. 그런 다음 Steinman 핀을 관절면과 일직선으로 내측에서 외측으로 대퇴골 과두를 가로질러 배치하고 플랫폼에 고정합니다. 일단 고정되면 하중이 후방 내측 대퇴 과두에 전달됩니다. 이 방법을 사용하면 토끼 대퇴골 원위부의 체중 지지 표면에 일관된 연골 손상이 전달될 수 있습니다.
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Protocol
다음 절차는 인디애나 대학교 의과대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받아 수행되었습니다. 모든 생존 수술은 NIH 지침에 명시된 대로 무균 상태에서 수행되었습니다. 통증 및 감염 위험은 성공적인 결과를 최적화하기 위해 적절한 진통제와 항생제로 관리되었습니다. 본 연구에는 3.0-4.0kg의 골격적으로 성숙한 수컷 뉴질랜드 흰 토끼가 사용되었습니다.
1. 드롭 타워 제작
- 드롭 타워, 베이스 플랫폼 및 메커니즘의 구성 요소에 대한 CAD 도면을 생성하여 Steinman 핀을 고정합니다(보충 그림 1-14).
- 시중에서 판매되는 구성 요소를 구입하십시오( 재료 표 참조).
- 장치의 기계 부품을 조달하거나 제작을 위해 CAD 도면을 기계공에게 제공하십시오.
알림: 3mm 직경의 임팩터 팁을 제작하려면 공구 제작 능력이 있는 고정밀 기계공이 필요합니다(보충 그림 1, 파트 20 및 추가 그림 13,14). 임팩터 헤드의 충격면은 내측 토끼 과두(35)의 곡률에 맞추기 위해 시상면 및 관상면에서 각각 7.14mm 및 5.56mm의 곡률을 가졌다(보충 그림 13,14). - 드롭 타워가 고정 정렬 선형 볼 베어링을 통해 두 개의 수직 막대를 따라 이동하는 캐리지로 구성되고 기본 플랫폼이 토끼를 지지하고 Steinman 핀을 고정하도록 부품을 조립합니다(그림 1 및 그림 2).
알림: 이 설계의 캐리지 대들보는 허용 가능한 진동 수준으로 이전 드롭 타워38 과 동일한 굽힘 강성을 가지고 있습니다.
2. 동물 준비
- 토끼의 무게를 측정하고 2.5mg/kg 알팍살론 및 0.15mg/kg 미다졸람 IM을 사용하여 마취합니다( 재료 표 참조). 유도 후 양쪽 눈에 눈 연고를 바릅니다. ~2%-3% 이소플루란을 사용하여 마취를 유지합니다. 진통을 위해 부프레노르핀 SR(0.1mg/kg) SQ를, 수술 전후 엔로플록사신(10mg/kg) SQ를 투여합니다. 부프레노르핀 대신에, 카프로펜, 4mg/kg 또는 멜록시캄, 0.2 – 0.3mg/kg 또는 케토프로펜, 3mg/kg과 같은 NSAIDs는 SQ 주사로 주어질 수 있습니다.
- 토끼의 뒷다리를 발목에서 뒷다리까지 면도합니다. 토끼 털 제거 시 절개 부위의 오염을 방지하기 위해 각별한 주의가 요구됩니다. 전용 날카로운 토끼 이발기 세트를 사용하는 것이 중요합니다.
- 스테인리스 스틸 앞다리 블록(보충 그림 1, 부품 번호 2 및 보충 그림 4)을 임팩트 플랫폼 끝 아래에 놓고 플랫폼을 가열 패드로 덮습니다. 토끼 흉골(즉, 엎드린 자세)을 가열 패드에 놓습니다. 반대쪽 엉덩이 아래에 패딩 처리된 범프를 놓습니다.
- 수술 말단이 무릎 중앙에 있고 폴리에틸렌 블록에 놓여 있는지 확인합니다(그림 2A1). 실크 테이프를 사용하여 꼬리를 수술 사지의 위쪽과 반대쪽 방향으로 부드럽게 집어넣습니다.
- 클로로헥시딘과 70% 알코올에 적신 멸균 거즈로 수술 부위를 닦아냅니다. 무릎 뒤쪽에서 시작하여 바깥쪽으로 원을 그리며 수술 부위를 문지릅니다. 신선한 스크럽으로 최소 3회 반복하고 알코올 70%로 끝납니다.
- 멸균 장갑을 수술 발에 발목까지 놓고 멸균 점착성 랩으로 감쌉니다.
- 수술 부위를 세 개의 드레이프로 무균 상태로 드레이프합니다: 하나는 수술 사지 바로 아래에 있고 다른 두 개는 신체의 나머지 부분을 덮습니다. 수건 클램프로 커튼을 고정하십시오.
3. 외과적 노출
참고: 수술 및 충격 전에 연골하 골절 없이 눈에 띄는 연골 손상을 제공하는 체중과 낙하 높이는 토끼의 특정 변형, 연령 및 성별에 대해 경험적으로 결정되어야 합니다.
- 슬개골의 앞쪽 위치를 촉진하여 슬개골의 원위부에 위치한 무릎 관절의 위치를 추정합니다. 15개의 날을 사용하여 슬개골의 상극 높이에서 확장된 무릎의 뒤쪽을 따라 3-4cm를 절개합니다.
- 밑에 있는 표재성 근막을 통해 뭉툭하고 날카로운 절개를 수행합니다. 내측의 피부와 측면의 내측 비복근 사이의 간격을 발달시킵니다. 이 간격에 자체 고정 Weitlaner 견인기를 놓습니다( 재료 표 참조).
- 복재동맥과 정맥 바로 위에 2차 근막층이 보입니다. 복재 측방을 절개하고 내측으로 혈관을 수축시키고 후방 위염 복합체를 측면으로 수축시킵니다.
알림: 이 혈관을 자르지 않도록 주의하십시오. 이 동맥이 손상된 경우 수술 후 출혈성 쇼크가 발생할 수 있으므로 적절한 결찰을 확인하십시오.
- 복재동맥과 정맥 바로 위에 2차 근막층이 보입니다. 복재 측방을 절개하고 내측으로 혈관을 수축시키고 후방 위염 복합체를 측면으로 수축시킵니다.
- 뒤쪽 내측 대퇴골 과두에서 작은 이동식 fabella가 식별될 때까지 원위부로 절개합니다. 관절 절개술을 수행하여 fabella superolateral을 동원하여 기저 내측 대퇴 과두를 노출시킵니다. 내측 대퇴골 과두의 후방을 노출시키기 위해 뭉툭하고 날카로운 해부로 연조직을 부드럽게 제거합니다. Freer 및 Cricket 자가 유지장치( 재료 표 참조)를 사용하여 이 수준에서 연조직을 수축시킵니다.
- 과두를 노출된 상태로 유지하면서 원위 대퇴골을 가로질러 0.062인치 Steinman 핀( 재료 표 참조)을 전진시키되, 내측 대퇴 과두의 상부 측면에서 시작하여 내측 대퇴 과두의 전후 방향, 과두의 후방 측면에서 약 5mm 떨어진 곳에 있습니다.
- 배터리로 구동되는 Steinman 핀 드라이버를 사용하여 관절 표면과 평행한 뼈와 외측 피부를 통해 와이어를 측면으로 구동합니다. 외측 상과를 촉진하면 Steinman 핀의 적절한 궤적이 보장됩니다.
- 견인기를 제거하고 3-0 다착 봉합사( 재료 표 참조)로 피부를 닫으십시오. 멸균 거즈로 절개 부위를 덮습니다.
4. 대퇴골 과두의 영향
- 작동 다리 아래의 드레이프를 제거하고 Steinman 핀을 사용자 정의 및 높이 조절 가능한 임팩트 플랫폼에 고정합니다. 먼저 높이 조절이 가능한 Steinman 핀 고정 장치의 아래쪽을 핀 아래에 놓습니다(그림 2A2). 필요에 따라 나사 높이를 조정하여 와이어가 이 플랫폼의 접지와 평행한지 확인하십시오.
- Steinman 핀이 지면과 평행한지 확인한 후 보안 플랫폼의 상단 나사 기반 측면(그림 2A3)을 높이 조절 부품의 하단 나사 기반 측면에 놓습니다. 상단 막대를 핀 고정 플랫폼의 낮은 높이 조절 부분에 나사로 고정하여 Steinman 핀이 단단히 고정되었는지 확인합니다(그림 2A2).
- Steinman 핀이 플랫폼에 고정되면 봉합사를 제거하고 절개 부위를 다시 엽니다. 내측 대퇴골 과두를 자체 유지 Weitlaner 및 크리켓 견인기로 노출시킵니다. 임팩터 팁의 경로에서 추가 연조직을 집어넣기 위해 추가 Freer가 필요할 수 있습니다(그림 2B).
- 승인된 소독제로 드롭 타워를 닦으십시오. 멸균 3mm 임팩터 헤드(그림 2A4)를 드롭 타워 캐리지에 부착합니다. 낙하 타워를 작동 말단 위로 가져오고 베이스(그림 2A6)를 충격 플랫폼(그림 3A) 아래에 놓습니다.
- 임팩터(보충 그림 2, 파트 20 및 보충 그림 13)를 후측 내측 대퇴골 과두의 중앙으로 부드럽게 내립니다. 임팩터의 경로에 연조직이 없는지 확인하십시오.
- 필요에 따라 토끼 또는 탑을 움직여 임팩터 헤드가 후방 내측 대퇴골 과두의 중앙에 오도록 합니다(그림 3B). 토끼를 옮기거나 위치를 변경할 때마다 수술 부위에 무균 손상이 발생할 수 있는지 평가하고 필요한 경우 해당 부위를 다시 멸균해야 합니다.
- 적절한 궤적이 보장되면 clamp 토글 cl을 사용하여 플랫폼에 타워를 올립니다.amps(그림 2A5, 재료 표 참조).
- 흡입제 마취를 증가시키지 않고 더 깊은 마취를 위해 충격 5-10분 전에 알팍살론(0.5-0.7mg/kg) 정맥 주사(0.5-0.7mg/kg)를 투여합니다.
참고: palpebral reflex, pedal withdrawal 및 pinna reflex의 부족은 더 깊은 마취의 증거입니다. 이 더 깊은 마취는 장치에 배치하는 동안 그리고 충격 중에 발생할 수 있는 사지 반응을 방지하는 데 도움이 됩니다.
주의: 알팍살론을 너무 빨리 투여하면 토끼에게 일시적인 무호흡증과 저산소증을 유발할 수 있으므로 1-2분에 걸쳐 천천히 투여해야 합니다. 저산소증이 발생하면 진행하기 전에 적절한 산소 공급과 바이탈 회복을 확인하십시오. - 임팩터를 내측 대퇴골 과두 위의 원하는 높이에 드롭 타워에 설정합니다. 베어링을 포함한 현재 캐리지 어셈블리의 경우 질량이 1.41kg이고 높이는 7cm입니다.
참고: 낙하 타워 높이는 사체 조직에 대한 파일럿 연구에서 결정되었습니다. 이 키는 눈에 띄는 연골 손상을 일으켰지만 이 연구에서 토끼의 연골하 골절은 일으키지 않았습니다. - 스핀들 스톱을 해제하기 직전에 LabVIEW 데이터 수집 소프트웨어 (보충 코딩 파일 1)의 시작 버튼 (보충 그림 2, 항목 번호 14)을 클릭하여 캐리지를 해제하고 중력에 의해 떨어지도록하십시오.
참고: 데이터 수집 소프트웨어는 데이터 수집 모듈에 연결된 노트북을 사용하여 100kHz에서 충격을 가하는 동안 임팩터와 캐리지 사이에 위치한 로드셀(그림 1, 6)과 가속도계(그림 1, 7) 사이에 위치한 로드셀(그림 1, 7)에서 데이터를 수집합니다. - 데이터 수집 소프트웨어에서 생성된 txt 파일을 Matlab 데이터 분석 코드(보충 코딩 파일 2)와 동일한 폴더에 넣고 데이터 분석 코드를 실행하여 원시 데이터를 필터링하고 영향 파라미터를 계산합니다.
- 최대 부하가 식별되었는지 확인합니다. 연결된 시점은 최대 변형 및 0 속도의 시간으로 간주됩니다.
참고: 데이터 분석 코드는 폴더의 모든 txt 파일을 분석하고 각 파일에 대한 결과를 보고합니다. 이 코드는 로드 시간 데이터의 변경 사항에 따라 영향의 시작과 끝을 결정합니다. 가속도계의 데이터는 속도를 계산하기 위해 수치적으로 적분되고 변위를 계산하기 위해 다시 적분됩니다. 데이터 분석 코드는 다음 공식에서 임펄스, 일 및 운동 에너지를 수치적으로 계산합니다.
여기서 F는 하중 센서에 의해 측정된 힘, x 0 및 t 0은 충격 시작 시 변위 및 시간, x 및 tf는 충격 종료 시 변위 및 시간입니다. 하중 속도는 충격 하중 단계에서 dσ/dt의 평균으로 수치적으로 계산됩니다. 피크 응력은 피크 하중을 임팩터 헤드의 접촉 영역으로 나누어 계산됩니다. - 연골 표면의 시각화를 수행하여 적절한 연골 손상이 발생했는지 확인합니다(그림 4A).
5. 수술 부위 폐쇄
- 수술 말단 위에서 드롭 타워를 제거합니다. 사용한 수술 도구를 모두 옆에 두고 새 멸균 장갑으로 갈아입습니다.
알림: 낙하 타워가 멸균되지 않았다는 점을 감안할 때 충격까지 사용된 모든 도구는 이제 오염된 것으로 간주되어야 합니다. - 멸균 드레이프를 하지에 다시 적용하고 사용하지 않은 멸균 자체 견인기를 얻습니다.
- 내측 대퇴 과두를 다시 노출시키고 50-60mL의 멸균 식염수로 수술 부위를 철저히 세척합니다.
- 5-0 다착 봉합사로 후방 캡슐을 닫은 다음 4-0 단흡 봉합사로 피부를 봉합합니다( 재료 표 참조).
- 피내 절개 부위 주변의 국소 진통을 위해 리도카인/부피바카인 2mL를 주사합니다.
- 연조직 손상을 최소화하기 위해 진동하여 파워 드라이버 세트( 재료 표 참조)가 있는 Steinman 핀을 제거합니다.
- 비접착 드레싱으로 상처를 드레싱한 다음 접착 테이프를 붙입니다. 수술 사지의 X-ray를 수행하여 골절이 발생하지 않았는지, 핀이 적절하게 배치되었는지 확인합니다(그림 4B).
6. 수술 후 관리
- 토끼를 케이지로 돌려보내고 마취에서 회복될 때까지 가열된 담요에서 모니터링합니다(~25분).
- 수술 후 며칠 동안 토끼를 계속 면밀히 관찰하여 적절하게 치유되고 이동성을 회복하는지 확인하십시오. 감염 예방을 위해 수술 후 2일 동안 엔로플록사신(10mg/kg)을 투여합니다. 부프레노르핀 SR 진통제(0.1mg/kg)를 수술 후 2-3일마다 필요에 따라 피하 투여합니다. 부프레노르핀 대신에, 카프로펜(Carprofen), 4mg/kg SQ 데일리, 멜록시캄(Meloxicam), 0.2 – 0.3mg/kg SQ 데일리(최대 3일) 또는 케토프로펜(Ketoprofen, 3mg/kg SQ 데일리)과 같은 비스테로이드성 소염진통제(NSAIDs)는 수술 후 3-5일 후와 필요에 따라 투여할 수 있습니다.
참고: 토끼가 핥거나 씹는 것으로 인한 수술 후 상처 탈구를 예방하는 데 성공했으며, 인간의 신생아 바지를 뒷다리 위에 배치하는 데 성공했습니다39. 토끼가 바지를 씹는 경우 절개 부위가 씹히는 것을 방지하기 위해 엘리자베스 칼라( 재료 표 참조)를 착용할 수 있습니다.
7. 조직학적 평가
- 부상 후 16주가 되면 안락사된 토끼의 무릎을 채취하여 10% 중성 완충 포르말린으로 48시간 동안 고정한 다음 파라핀을 삽입하고 5μm 두께의 조각으로 절단합니다.
- 탈파라핀화 및 재수화 후 표준 프로토콜40,41에 따라 사프라닌 O 빠른 녹색으로 섹션을 염색합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 Hematoxylin42 로 대조염색된 TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection 키트를 사용하여 절편에 대해 말단 deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling(TUNEL) 분석을 수행합니다( 재료 표 참조).
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Representative Results
이 시술의 성공 여부는 충격 직후 외과의가 과두를 시각화하고(그림 4A) 방사선 촬영을 통해 골절이 발생하지 않도록 모니터링했습니다(그림 4B). 과두의 수술 중 골절로 이어지는 충격 실패의 위험이 있습니다. 이는 일반적으로 Steinman 핀이 잘못 배치되었기 때문입니다(그림 5). 이 모델을 사용하면 수술 중 골절에 의한 이차성 골절 실패율이 9.0%(67건 중 6건)였습니다. 평균 최대 충격 응력은 81.9MPa ± 10.1MPa(CV = 12.3%)였으며 평균 하중 속도는 36.6 ± 11.0MPa/ms(CV = 30.1%)였습니다. 다른 매개 변수도 CV가 5 % -23.5 % 범위로 일관되었습니다 (표 1).
n = 8 토끼로부터 무릎 관절의 사프라닌 O-패스트 녹색 염색 조직학적 절편을 OARSI(Osteoarthritis Research Society International) 채점 시스템(43)을 사용하여 연골 분해 및 골관절염 병리학에 대해 평가하였다. 연골 손상은 손상되지 않은 반대쪽 대퇴 과두에서 관찰되지 않았으며(그림 6A), 주로 충돌 부위에 국한되었습니다(그림 6B). 영향을 받은 16주 내측 대퇴골 과두(MFC)는 OARSI 점수가 0.56 ±± 0.42(p < 0.0001)인 반대측 대조군 MFC에 비해 3.38 1.43으로 더 높았습니다(p 0.0001)(그림 6C). 또한, 매복 무릎 MFC는 동일한 무릎의 내측 경골 고원(MTP; 0.71 ± 0.59), 외측 경골 고원(LTP; 0.88 ± 0.64) 및 외측 대퇴 과두(LFC; 0.81 ± 1.00)보다 더 높은 OARSI 점수를 나타냈습니다(<그림 6D). 대조적으로, 반대쪽 비매복 무릎(p > 0.05)의 MFC(0.56 ± 0.42), LTP(0.50 ± 0.46), MTP(0.28 ± 0.45) 및 LFC(0.25 ± 0.46) 구획 간에는 OARSI 점수의 차이가 관찰되지 않았습니다(그림 6E). 또한 충격을 받은 LFC, MTP 및 LTP 접합면과 충격을 받지 않은 LFC, MTP 및 LTP 접합면 간에 유의한 차이가 없었습니다(p >0.05)(그림 6F).
16주에 채취한 환부 MFC의 관절 연골은 TUNEL 양성률이 더 높았으며(69.1 ± 14.4%), 이는 영향을 받지 않은 MFC(53.4% ± 12.4%)에 비해 연골세포 세포사멸이 증가했음을 나타냅니다(p =0.0058)(그림 7).
그림 1: 드롭 타워 장치. (1) 수직 막대. (2) 막대가 압입되는 알루미늄 플랫폼. (3) 막대를 더욱 구속하는 플레이트. (4) 고정 정렬 선형 볼 베어링. (5) 캐리지에 장착된 임팩터 헤드. (6) 로드셀. (7) 가속도계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 수술 절차 및 충격 장치에 토끼를 배치하는 동안 사용되는 구성 요소. (A) 연골 손상 및 구성 요소 식별을 생성하는 데 사용되는 장치: (1) 폴리에틸렌 충격 플랫폼, (2) Steinman 핀 고정 장치의 높이 조절 부분, (3) 높이 조절이 가능한 Steinman 핀 고정 장치의 상부, (4) 직경 3mm의 멸균 임팩터 헤드, (5) 토글 클램프를 임팩트 플랫폼을 드롭 타워 장치에 고정하고 (6) 임팩트 플랫폼의 베이스를 고정합니다. (B) 후내측 대퇴골 과두가 충격하기 전에 플랫폼에 고정된 Steinman 핀(빨간색 화살표로 표시)이 있는 토끼 뒷다리의 위치. 커튼은 시연을 위해 그림에서 생략되었습니다. 시체를 사용하여 사진을 생성했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 내측 대퇴 과두에 임팩터를 적절하게 배치 한 모습. (A) 플랫폼에 고정된 토끼 뒷다리 위의 충격 장치. (B) 임팩트 전에 임팩터 팁을 내측 대퇴골 과두에 적절하게 배치합니다. 커튼은 시연을 위해 그림에서 생략되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 성공적인 연골 결손 . (A) 이 모델로 생성된 연골 손상의 예상 총 모양. 삽입은 영향을 받은 연골 표면의 확대된 영역으로, 결손은 점선 원으로 윤곽이 그려져 있습니다. (B) 후방 연골 표면에서 최소 5mm의 거리를 두고 관절 표면의 각도(대퇴부 과두의 방사선 투과 원)에 가까운 원위 대퇴골의 적절한 Steinman 핀 위치. 축척 막대 = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 연골 결손 실패. 내측 대퇴골 과두에 핀이 잘못 배치되어 충격으로 골연골 골절이 발생한 방사선 사진. 빨간색 화살표는 Steinman 핀의 잘못된 배치를 가리킵니다. 검은색 화살표는 골절된 내측 대퇴골 과두를 가리킵니다. 축척 막대 = 5mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 매복된 내측 대퇴골 과두의 골관절염 중증도 증가. 대표적인 (A) 반대측 및 (B) 매복 내측 대퇴 과두(MFC) 절편은 사프라닌-O(프로테오글리칸 함량의 빨간색 염색) 및 Fast Green(프로테오글리칸 함량이 낮은 결합 조직의 청록색 염색)으로 염색되었습니다. 배율 : 400x; 척도 막대 = 62.3μm. (C) 영향을 받은 MFC와 대조군 MFC의 OARSI 점수. (D) 충격을 받은 무릎 관절의 모든 관절 구획에 대한 OARSI 점수. (E) 영향을 받지 않은 반대측 무릎 관절의 관절 구획의 OARSI 점수. (F) 충격 및 비충격 무릎의 관절 구획에 대한 OARSI 점수. 내측 대퇴 과두(MFC), 내측 경골 고원(MTP), 외측 경골 고원(LTP) 및 외측 대퇴 과두(LFC). 그룹 비교는 Student's t-test 또는 ANOVA를 사용하여 수행되었으며, Tukey의 HSD 사후 테스트를 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 영향을 받은 MFC에서 세포사멸 연골세포 증가. 충격 후 16주 동안 400배 배율로 (A) 반대측 손상되지 않은 MFC 및 (B) 손상된 MFC의 TUNEL 염색 부분을 묘사한 대표 이미지. 눈금 막대 = 62.3 μm. TUNEL 양성은 갈색 핵으로 표시됩니다. (C) 영향을 받은 MFC와 대조군 MFC에서 TUNEL 양성 세포의 정량화. 그룹은 쌍을 이룬 Student's t-test로 비교되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 연구의 영향 매개변수. 여기에는 피크 스트레스(메가파스칼; MPa), 피크 하중(뉴턴; N), 로딩 속도(밀리초당 메가파스칼; MPa/ms), 영향 기간(밀리초, ms), 작업(줄; J), 임펄스(뉴턴 초; N·s), 운동 에너지(줄; J), 가속도(초당 미터 제곱, m/s2) 및 최대 부하까지의 시간(밀리초, ms). 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 충격 수술 시간. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 현재 설명된 모델의 장점과 단점. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 기본 플랫폼의 자세한 부품 설명 및 부품 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: Drop Tower의 자세한 부품 설명 및 부품 목록. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 파트 01-토끼 홀더 테이블 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 4: 파트 02-앞 다리 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 5: 파트 03-메인 레그 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 6: 파트 04-K-와이어 홀더 베이스 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 7: 파트 05 - 나사 머리 K-와이어 홀더 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 8: 파트 06-폴리에틸렌 플레이트 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 9: 파트 07-플레이트 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 10: 파트 11-상단 홀더 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 11: 파트 16-임팩터 플레이트 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 12: Part 17-Impactor 빔 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 13: 파트 20-임팩터 팁 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 14: 임팩터 팁 헤드의 곡률 도면. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1: DropTestVIManual(1).vi. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 2: ImpactAnalysis(1).m. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 수술 절차는 PTOA 모델에서 토끼 내측 대퇴골 과두의 체중 지지 표면에 일관된 연골 손상을 생성하는 것을 목표로 합니다. 이 시술의 장점은 무릎에 대한 후방 접근을 통해 전체 후측 대퇴골 과두를 직접 시각화할 수 있으며 약 37분 내에 수행할 수 있다는 것입니다(표 2). 또한, 이것은 개방성 손상 모델이며, 활막 및 관절낭(17,44)에 대한 잠재적 손상으로 인한 충격을 넘어 급성 염증성 변화를 야기할 수 있다는 점에 유의해야 한다. 모델의 장점과 단점은 표 3에 요약되어 있습니다. 관절 안정성을 보장하기 위해 인대와 반월상 연골 구조가 손상되지 않도록 주의를 기울였습니다. 그 결과, 반대측 대조군과 충격 영역 밖의 관절 구획(내측 및 외측 경골 고원 및 외측 대퇴 과두)의 매복 사지 간에 차이가 발견되지 않았습니다.
이 프로토콜의 가장 중요한 측면은 대퇴골 과두에서 고립된 연골 병변의 생성입니다. Steinman 핀 궤적은 이 방법의 성공에 큰 영향을 미칩니다. 와이어가 관절면과 평행하지 않거나 내측 대퇴 과두의 중심에 비해 너무 뒤쪽에 배치되면 대퇴 과두의 골연골 골절이 발생할 수 있습니다(그림 5). 측면 상과(lateral epicondyle)는 적절한 핀 궤적에 사용할 수 있는 일관되게 만질 수 있는 랜드마크입니다.
연골하 뼈가 골절된 동물은 연구에서 제외해야 합니다. 현재 연구 방법의 경우 수술 중 골절에 의한 이차적 실패율은 9.0%(67건 중 6건)였습니다. 이 파괴율은 28%45의 파괴율을 보인 MFC의 최근 개방 진자 기반 충격 모델보다 낮습니다. 외과의와 연구팀이 접근 방식과 결과에 익숙해질 때까지 사체 표본으로 이 방법을 시도하는 것이 좋습니다. 이 방법은 생체 내 실험에 앞서 뒷다리와 전체 뉴질랜드 흰 토끼의 사체 표본에서 시험되었습니다.
이 방법은 이전에 발표된 라핀 급성 연골 손상 생성 방법과 유사합니다. 51.0 ± 16.0 MPa/ms의 이 충격 모델의 하중 속도는 진자(약 0.5-6MPa/ms)35,46,47 또는 공압 실린더(~0.4MPa/ms)36를 사용한 이전 작업보다 높았고 스프링 장착 충격 장치(~530MPa/ms)37보다 낮았습니다. 현재 충격 기술은 이전 모델에 비해 적당한 하중을 모델링하여 진자, 스프링 하중 및 공압 실린더 전달 하중의 이전 모델과 일치하는 12.3%의 CV로 81.9 ± 10.1MPa의 피크 응력을 제공하며, 이전 4개 모델은 0.85-40.5%36,37 범위의 CV로 10.1-169MPa의 응력을 전달합니다. 45,46.
이 모델의 한 가지 한계는 골연골 골절을 일으키지 않아 임상 환경에서 볼 수 있는 전형적인 관절 내 골절을 완전히 모방하지 못했다는 것이다17. 또한 충돌 전 드롭 타워 캐리지의 평균 가속도는 6.4 ± 0.4m/s2로 중력 자유 낙하 가속도 9.8m/s2보다 낮았으며, 이는 볼 베어링의 마찰로 인한 것으로 보입니다. 그럼에도 불구하고 이 방법을 사용하면 완전히 이해되지 않은 PTOA 발병의 영향을 받은 연골 매개 효과를 분리할 수 있습니다.
설명된 여러 라파인 모델이 연골 손상을 전달하지만, 드롭 타워 모델과 함께 무릎에 대한 후방 접근을 활용하는 것은 PTOA를 생성하는 간단하고 효율적이며 임상적으로 관련된 방법으로 두드러져 발병 기전을 연구하고 새로운 치료법을 테스트할 수 있습니다. 전반적으로, lapine open posteromedial femoral condyle impact injury model은 PTOA와 관련된 세포 및 분자 사건을 연구하고 연골 손상을 예방하거나 완화하기 위한 새로운 치료 표적48,49을 식별하기 위한 유망한 플랫폼입니다.
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Disclosures
Roman Natoli는 AO Trauma North America에서 강의를 하고 Current Osteoporosis Reports의 섹션 편집자이며 Morgan and Claypool로부터 교과서 로열티를 받았습니다. Todd McKinley는 Innomed로부터 로열티를 받습니다. 나머지 저자는 공개할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 미 육군 의학 연구 획득 활동(U.S. ARMY MEDICAL RESEARCH ACQUISITION ACTIVITY)의 DoD Peer Reviewed Medical Research Program - Investigator-Initiated Research Award W81XWH-20-1-0304, NIH NIAMS R01AR076477, NIH(AR065971)의 종합 근골격계 T32 교육 프로그램(Comprehensive Musculoskeletal T32 Training Program) 및 NIH NIAMS Grant R01 AR069657의 지원을 받았습니다. 저자들은 이 프로젝트에 기계 가공 및 제작에 대한 전문 지식을 제공한 Kevin Carr와 조직학을 지원해 준 Drew Brown과 Indiana Center for Musculoskeletal Health Bone Histology Core에 감사의 뜻을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flat head screw | McMaster-Carr | 92210A194 | Stainless steel hex drive flat head screw, 8-32, 1/2" |
| #15 scalpel blades | McKesson | 1029066 | Scalpel McKesson No. 15 Stainless Steel / Plastic Classic Grip Handle Sterile Disposable |
| 1/2”-20 threaded rod | McMaster-Carr | 99065A120 | 1/2”-20 threaded rod |
| 10 mL syringe | McKesson | 1031801 | For irrigation; General Purpose Syringe McKesson 10 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety |
| 3 mL syringe | McKesson | 1031804 | For lidocaine/bupiviacaine injection; General Purpose Syringe McKesson 3 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety. |
| 3-0 polysorb | Ethicon | J332H | 3-0 Vircryl, CT-2, 1/2 circle, 26 mm, tapered |
| 4-0 monosorb | Ethicon | Z397H | 4-0 PDS 2, FS-2, 3/8 circle, 19mm, cutting edge |
| 5-0 polysorb | Med Vet International | NC9335902 | Med Vet International 5-0 ETHICON COATED VICRYL C-3 |
| Accelerometer | Kistler | 8743A5 | Accelerometer |
| Adson-Browns Forceps | World precision tools | 500177 | Adson-Brown Forceps, 12 cm, Straight, TC Jaws, 7 x 7 Teeth |
| Alfaxalone | Jurox | 49480-002-01 | Alfaxan Multidose by Jurox : 10 mg/mL |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | 42023-0179-05 | Buprenorphine HCL injection: 0.3 mg/mL |
| Butorphanol | Zoetis | 54771-2033 | Butorphanol tartrate 10mg/ml by Zoetis |
| Chlorhexidine Hand Scrub | BD | 371073 | BD E-Z Scrub 107 Surgical Scrub Brush/Sponge, 4% CHG, Red |
| Collet | STRYKER | 14023 | Stryker 4100-62 wire Collet 0.28-0.71'' |
| Cordless Driver handpiece | STRYKER | OR-S4300 | Stryker 4300 CD3 Cordless Driver 3 handpiece |
| Cricket Retractors | Novosurgical | G3510 21 | 2x Heiss (Holzheimer) Cross Action Retractor |
| Dissector Scissors | Jorvet labs | J0662 | Aesculap AG, Metzenbaum, Scissors, Straight 5 3/4″ |
| Elizabethian Collar | ElizaSoft | 62054 | ElizaSoft Elizabethan Recovery Collar |
| Enrofloxacin | Custom Meds | Enrofloxacin compounded by Custom Meds | |
| Eye Ointment | Pivetal | 46066-753-55 | Pivetal Articifical Tears- recently recalled |
| Face-mount shaft collar | McMaster-Carr | 5631T11 | Face-mount shaft collar |
| Fast green | Millipore Sigma | F7258 | Fast green |
| Freer | Jorvet labs | J0226Q | Freer elevator |
| Head screw -1 | McMaster-Carr | 91251A197 | Black-oxide alloy steel socket head screw, 8-32, 3/4" |
| Head screw -2 | McMaster-Carr | 92196A194 | Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2" |
| Head screw -3 | McMaster-Carr | 92196A146 | Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2" |
| Head screw -4 | McMaster-Carr | 92196A151 | Stainless steel socket head screw, 6-32, 3/4" |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | Millipore Sigma | GHS132-1L | Hematoxylin Solution, Gill No. 1 |
| Hex nut | McMaster-Carr | 91841A007 | Stainless steel hex nut, 6-32 |
| Hold-down toggle clamp | McMaster-Carr | 5126A71 | Hold-down toggle clamp |
| Impact device | n/a | n/a | custom made |
| Impact platform | n/a | n/a | custom made |
| K-wires | Jorvet Labs | J0250A | JorVet Intramedullary Steinman Pins, Trocar-Trocar 1/16" x 7" |
| Lab View | National Instruments | n/a | n/a |
| Load cell | Kistler | 9712B5000 | Load cell |
| MATLAB | The MathWorks Inc. | n/a | n/a |
| Microscope | Leica | DMi-8 | Leica DMi8 microscope with LAS-X software |
| Midazolam | Almaject | 72611-749-10 | Midazolam Hydrochloride injection: 5mg/ml by Almaject |
| milling machine depth stops | McMaster-Carr | 2949A71 | Clamp-on milling machine depth stops |
| Mobile C-arm | Philips | 718095 | BV Pulsera, Mobile C-arm |
| Mounted linear ball bearing | McMaster-Carr | 9338T7 | Mounted linear ball bearing |
| Needle Driver | A2Z Scilab | A2ZTCIN39 | TC Webster Needle Holder Smooth Jaws 5", Premium |
| Pentobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | Pentobarbital 390 mg/mL by Vortech |
| Safranin O | Millipore Sigma | HT90432 | Safranin O |
| Small Battery pack | STRYKER | NS014036 | 6212 Small Battery pack- 9.6 V |
| Steel rod, 2’ | McMaster-Carr | 89535K25 | Steel rod, 2’ |
| Sterile Saline | ICU Medical | 6139-22 | AquaLite Solution Pour Bottles, 250 mL |
| Stryker 6110-120 System 6 Battery Charger | STRYKER | OR-S6110-120 | |
| Surgical gloves | McKesson | 1044729 | Surgical Glove McKesson Perry Size 6.5 Sterile Pair Latex Extended Cuff Length Smooth Brown Not Chemo Approved |
| Surgical gown | McKesson | 1104452 | Non-Reinforced Surgical Gown with Towel McKesson Large Blue Sterile AAMI Level 3 Disposable |
| Suture scissors | Jorvet Labs | J0910SA | Super Cut Scissors, Mayo, Straight, 5 1/2″ |
| TUNEL staining kit | ABP Bioscience | A049 | TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection Kit |
| Weitlaner Retractors | Fine Science Tools | 17012-11 | 2x Weitlaner-Locktite Retractors |
References
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