Summary
Den öppna mediala lårbenskondylslagsmodellen hos kaniner är tillförlitlig för att studera posttraumatisk artros (PTOA) och nya terapeutiska strategier för att mildra PTOA-progression. Detta protokoll genererar en isolerad broskdefekt i den bakre mediala lårbenskondylen hos kaniner med hjälp av ett vagnsbaserat falltorn med ett slaghuvud.
Abstract
Posttraumatisk artros (PTOA) står för 12 % av alla artrosfall i USA. PTOA kan initieras av en enda traumatisk händelse, såsom en kraftig belastning som verkar på ledbrosket, eller av ledinstabilitet, vilket inträffar vid främre korsbandsruptur. Det finns för närvarande inga effektiva terapier för att förhindra PTOA. Att utveckla en tillförlitlig djurmodell av PTOA är nödvändigt för att bättre förstå mekanismerna genom vilka broskskador fortskrider och för att undersöka nya behandlingsstrategier för att lindra eller förhindra progressionen av PTOA. Detta protokoll beskriver en öppen, dropptornsbaserad kanin-lårbenskondylslagsmodell för att inducera broskskador. Denna modell levererade toppbelastningar på 579,1 ± 71,1 N och toppspänningar på 81,9 ± 10,1 MPa med en tid-till-topp-belastning på 2,4 ± 0,5 ms. Artikulärt brosk från påverkade mediala lårbenskondyler (MFC) hade högre frekvens av apoptotiska celler (p = 0,0058) och hade högre poäng för Osteoarthritis Research Society International (OARSI) på 3,38 ± 1,43 jämfört med de icke-påverkade kontralaterala MFC (0,56 ± 0,42) och andra broskytor i det påverkade knäet (p < 0,0001). Inga skillnader i OARSI-poäng upptäcktes mellan de icke-påverkade ledytorna (p > 0,05).
Introduction
Posttraumatisk artros (PTOA) är en ledande orsak till funktionsnedsättning över hela världen och står för 12–16 % av symtomatisk artros (OA)1. Den nuvarande guldstandarden för behandling av artros i slutstadiet är total knä- och höftprotesplastik2 eller steloperation, som i fallet med tibiotalar eller subtalarartrit. Även om det i stort sett är framgångsrikt, kan artroplastik ha kostsamma och sjukliga komplikationer3. Dessutom är artroplastik mindre önskvärt hos patienter under 50 år, med tanke på den låga revisionsfria implantatöverlevnaden på 77%-83%4,5. För närvarande finns det inga FDA-godkända behandlingar för att förhindra eller mildra utvecklingen av PTOA.
PTOA påverkar hela leden, inklusive ledvävnaden, subkondralt ben och ledbrosk. Den kännetecknas av ledbroskdegeneration, synovialinflammation, subkondral benombyggnad och osteofytbildning 6,7. Fenotypen av PTOA utvecklas via en komplex process av samspel mellan brosk, synovium och subkondralt ben. Den nuvarande uppfattningen är att broskskador leder till frigörelse av komponenter i extracellulär matris (ECM) såsom kollagen typ 2 (COL2) och aggrekan (ACAN). Dessa ECM-komponentfragment är proinflammatoriska och orsakar ökad produktion av IL-6, IL-1β och reaktiva syrearter. Dessa mediatorer verkar på kondrocyter, vilket orsakar uppreglering av matrixmetalloproteinaser (MMP), såsom MMP-13, som bryter ned ledbrosk samtidigt som matrissyntesen minskar, vilket leder till en övergripande katabol miljö för ledbrosket8. Dessutom finns det belägg för ökad kondrocytapoptos vid primär artros och PTOA 9,10. Mitokondriell dysfunktion uppstår efter suprafysiologisk belastning av brosk 11,12,13,14, vilket kan leda till ökad kondrocytapoptos 12,15. Förbättrad kondrocytapoptos har associerats med ökad proteoglykanutarmning och broskkatabolism och har visat sig föregå förändringar i brosk och subkondral benombyggnad16,17,18.
Som med de flesta mänskliga sjukdomar behövs tillförlitliga och translationella modeller av PTOA för att ytterligare förstå sjukdomens patofysiologi och testa nya terapier. Stora djur som svin och hörntänder har använts i intraartikulära fraktur- och slagmodeller av PTOA17,19, men de är kostsamma. Mindre djurmodeller, såsom möss, råttor och kaniner är billigare och används för att studera PTOA som genereras genom leddestabilisering, vilket vanligtvis innebär kirurgisk transsektion av det främre korsbandet (ACL) och/eller störning av den mediala menisken 20,21,22,23,24,25. Även om ledtrauma kan leda till olika konsekvenser, inklusive ligamentskada26, uppstår mekanisk överbelastning av brosket i nästan alla fall.
Det finns nya bevis för att patologin bakom utvecklingen av PTOA efter ligamentinstabilitet (som vid ACL-transektion) och akut kondral skada beror på distinkta mekanismer27. Därför är det viktigt att utveckla modeller för direkta skador på brosk. Det finns för närvarande ett begränsat antal effektmodeller som genererar osteokondrala eller kondrala skador hos råttor och möss28,29. Murint brosk är dock inte väl lämpat för att generera isolerade kondrala defekter. Detta beror på att murint ledbrosk endast är 3-5 cellager tjockt och saknar organiserade ytliga, radiella och övergångsbroskzoner, såväl som det tjocka förkalkade broskskiktet som finns hos människor och större djur. Murina modeller visar också spontan upplösning av partiella broskdefekter30,31. Därför valde vi kaninen för denna kollisionsmodell eftersom dess brosktjocklek och organisation liknar människors, och det är den minsta djurmodellen som kommer att möjliggöra leverans av en konsekvent kondral påverkan som resulterar i PTOA. Tidigare öppna kirurgiska modeller av lårbenskondylpåverkan hos kanin har använt en pendel32, en handhållen fjäderbelastad broskpåverkansanordning33 och ett falltorn som gjorde det möjligt att skapa kaninspecifika islagsanordningar34. Dessa studier saknade dock in vivo-data. Andra har rapporterat in vivo-data med pendelbaserade 35, pneumatiska36 och fjäderbelastade37 slaganordningar10, och dessa studier visar en hög variabilitet i toppspänning och belastningshastigheter mellan metoderna. Ändå saknar fältet ett konsekvent tillvägagångssätt för att på ett tillförlitligt sätt modellera akut brosktrauma in vivo.
Det nuvarande protokollet använder ett falltornsbaserat system för att ge en konsekvent effekt på den bakre mediala kondylen i kaninknäet. En bakre inflygning till knäet används för att exponera den bakre mediala lårbenskondylen. En Steinman-stift placeras sedan tvärs över lårbenskondylerna från medial till lateral i linje med ledytan och fästs vid plattformen. När den är säkrad levereras en last till den bakre mediala lårbenskondylen. Denna metod gör det möjligt att konsekvent leverera broskskador till den viktbärande ytan på kaninens distala lårben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande procedur utfördes med godkännande från Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alla överlevnadsoperationer utfördes under sterila förhållanden, i enlighet med NIH:s riktlinjer. Smärt- och infektionsrisker hanterades med rätt smärtstillande medel och antibiotika för att optimera framgångsrika resultat. Skelettmogna hankaniner av Nya Zeeland som väger 3,0-4,0 kg användes i den aktuella studien.
1. Tillverkning av falltorn
- Generera CAD-ritningar för komponenter i falltornet, basplattformen och mekanismen för att säkra Steinman-stiftet (tilläggsfigurerna 1-14).
- Köp kommersiellt tillgängliga komponenter (se materialförteckning).
- Skaffa maskinens delar eller ge CAD-ritningar till en maskinist för tillverkning.
ANMÄRKNING: En maskinist med hög precision och kapacitet för verktygstillverkning krävs för att tillverka provislagsspetsen med en diameter på 3 mm (kompletterande figur 1, del 20 och kompletterande figur 13,14). Slaghuvudets islagsyta hade krökningar på 7,14 mm och 5,56 mm i sagittal- respektive koronaplanet för att överensstämma med krökningen av den mediala kaninkondylen35 (tilläggsfigurerna 13,14). - Montera delar så att falltornet består av en vagn som färdas på två vertikala stänger via linjära kullager med fast inriktning, och basplattformen stöder kaninen och säkrar Steinman-stiftet (figur 1 och figur 2).
OBS: Vagnens tvärbalk i denna design har en böjstyvhet som är lika med den hos ett tidigare falltorn38 med en acceptabel vibrationsnivå.
2. Beredning av djur
- Väg kaninen och bedöva den med 2,5 mg/kg alfaxalon och 0,15 mg/kg midazolam intramuskulärt (se materialförteckning). Applicera ögonsalva i båda ögonen efter induktion. Upprätthåll anestesi med ~2%-3% isofluran. Ge buprenorfin SR (0,1 mg/kg) SQ mot analgesi och perioperativt enrofloxacin (10 mg/kg) SQ. I stället för buprenorfin kan NSAID som karprofen, 4 mg/kg eller meloxikam, 0,2 – 0,3 mg/kg eller ketoprofen, 3 mg/kg ges som SQ-injektioner.
- Raka kaninens bakben från fotleden till bakdelen. Extra försiktighet uppmanas vid hårborttagning av kanin för att förhindra kontaminering av snittet. Det är viktigt att använda en uppsättning dedikerade, vassa kaninhårklippare.
- Placera det främre benblocket i rostfritt stål (kompletterande figur 1, del nr 2 och kompletterande figur 4) under änden av slagplattformen och täck plattformen med en värmedyna. Placera kaninsternalen (dvs. liggande) på värmedynan. Placera en vadderad bula under den kontralaterala höften.
- Se till att den operativa extremiteten har knäet centrerat och vilande på polyetenblocket (Figur 2A1). Använd silkestejp för att försiktigt dra in svansen överlägset och kontralateralt mot den operativa extremiteten.
- Torka av operationsområdet med klorhexidin och 70 % alkoholindränkt steril gasbinda. Skrubba operationsområdet, med början vid det bakre knäet, med ett cirkulärt svep utåt. Upprepa minst 3 gånger med färska skrubbar, avsluta med 70 % alkohol.
- Placera en steril handske över opererande fot upp till fotleden och linda in den med en steril sammanhängande omslag.
- Drapera operationsområdet sterilt med tre draperier: ett direkt under den operativa extremiteten och de andra två för att täcka resten av kroppen. Fäst draperierna med handduksklämmor.
3. Kirurgisk exponering
OBS: Före operationen och stöten bör vikten och fallhöjden som ger synliga broskskador utan subkondrala benfrakturer bestämmas empiriskt för kaninens specifika stam, ålder och kön.
- Palpera knäskålens position framåt för att uppskatta knäledens position, som ligger distalt om knäskålen. Använd ett 15-blad och gör ett 3-4 cm snitt längs den bakre aspekten av det förlängda knäet från nivån på den övre polen på knäskålen distalt.
- Utför trubbiga och skarpa dissektioner genom den underliggande ytliga fascian. Utveckla intervallet mellan huden medialt och medial gastrocnemius lateralt. Placera en självhållande Weitlaner-upprullningsdon i detta intervall (se materialtabell).
- Ett sekundärt fasciaskikt kommer att bli synligt precis ovanför den saphenösa artären och venen. Dissekera lateralt om saphena och dra tillbaka kärlet medialt och det bakre gastrocsoleuskomplexet lateralt.
OBS: Var försiktig så att du inte skär i denna kärl. Om denna artär är skadad, se till att ligeringen sker korrekt, eftersom postoperativ hemorragisk chock kan uppstå.
- Ett sekundärt fasciaskikt kommer att bli synligt precis ovanför den saphenösa artären och venen. Dissekera lateralt om saphena och dra tillbaka kärlet medialt och det bakre gastrocsoleuskomplexet lateralt.
- Dissekera distalt tills en liten rörlig fabella identifieras över den bakre mediala lårbenskondylen. Utför en artrotomi för att mobilisera fabella-superolateralen och exponera den underliggande mediala lårbenskondylen. Ta försiktigt bort mjukvävnad genom trubbig och skarp dissektion för att exponera den bakre aspekten av den mediala lårbenskondylen. Använd en Freer and Cricket självhållare (se materialtabell) för att dra tillbaka mjuka vävnader på denna nivå.
- Medan du håller kondylen exponerad, för fram en 0.062 tums Steinman-stift (se materialtabell) över det distala lårbenet, med början vid den övre aspekten av den mediala lårbenskondylen och centrerad i den främre-bakre riktningen av den mediala lårbenskondylen, ungefär 5 mm från den bakre aspekten av kondylen.
- Kör tråden i sidled genom benet och sidohuden parallellt med ledytan med hjälp av en batteridriven Steinman-stiftdrivare. Palpation av den laterala epikondylen kommer att säkerställa lämplig bana för Steinman-stiftet.
- Ta bort upprullningsdonen och stäng huden med en 3-0 polysorb sutur (se materialtabell) på ett löpande sätt. Täck snittet med steril gasbinda.
4. Inverkan av lårbenskondylen
- Ta bort draperiet under den operativa lemmen och fäst Steinman-stiftet på en anpassningsbar och justerbar höjdslagplattform. Placera först den höjdjusterbara, nedre delen av Steinmans stiftsäkringsanordning under stiftet (Figur 2A2). Se till att kabeln är parallell med marken på denna plattform genom att justera skruvhöjderna efter behov.
- Efter att ha säkerställt att Steinman-stiftet är parallellt med marken, placera den övre skruvbaserade aspekten av den säkra plattformen (Figur 2A3) på den nedre skruvbaserade aspekten av den höjdjusterbara delen. Se till att Steinman-stiftet är ordentligt fastsatt genom att skruva fast den övre stången i den nedre höjdjusterbara delen av stifthållarplattformen (Figur 2A2).
- När Steinman-stiftet är fäst vid plattformen, ta bort suturen och öppna snittet igen. Exponera den mediala lårbenskondylen med självhållande Weitlaner och cricket-retraktorer. En extra friare kan behövas för att dra ut ytterligare mjukvävnad ur provkroppsspetsens bana (figur 2B).
- Torka av falltornet med ett godkänt desinfektionsmedel. Fäst det sterila 3 mm provkroppshuvudet (figur 2A4) på falltornets vagn. För falltornet över den operativa extremiteten och placera dess bas (Figur 2A6) under islagsplattformen (Figur 3A).
- Sänk försiktigt ner provkroppen (tilläggsfigur 2, del 20 och tilläggsfigur 13) på mitten av den bakre mediala lårbenskondylen. Se till att ingen mjukvävnad är i vägen för provkroppen.
- Flytta kaninen eller tornet efter behov för att säkerställa att islagarhuvudet är centrerat över den bakre mediala lårbenskondylen (figur 3B). Varje gång kaninen flyttas eller omplaceras ska operationsstället undersökas med avseende på eventuella avbrott i steriliteten och området ska steriliseras på nytt vid behov.
- När lämplig bana har säkerställts, kläm fast tornet på plattformen med vippklämmorna (Figur 2A5, se materialtabell).
- Administrera en dos intravenöst alfaxalon (0,5-0,7 mg/kg) 5-10 minuter före påverkan för djupare anestesi utan att öka inhalationsanestesin.
OBS: Brist på palpebral reflex, pedaltillbakadragande och pinnareflex tyder på djupare anestesi. Denna djupare anestesi hjälper till att förhindra eventuella reaktioner i extremiteterna under placering i apparaten och under stötar.
VARNING: Om alfaxalon ges för snabbt kan det orsaka övergående apné och hypoxi hos kaniner och bör ges långsamt under 1-2 minuter. Om hypoxi uppstår, se till att syresättningen är tillräcklig och att vitala värden återställs innan du fortsätter. - Ställ in slaganordningen på falltornet på önskad höjd över den mediala lårbenskondylen. För den nuvarande vagnsenheten, inklusive lagren, med en massa på 1,41 kg, är detta en höjd på 7 cm.
OBS: Falltornets höjd bestämdes från pilotstudier på kadavervävnad. Denna höjd genererade synliga broskskador men inte subkondrala benfrakturer för kaninerna i denna studie. - Klicka på Start-knappen på LabVIEW datainsamlingsprogramvara (Supplementary Coding File 1) precis innan du frigör spindelstoppet (Supplementary Figure 2, artikel nr 14) för att frigöra vagnen och låta den falla under tyngdkraften.
ANM.: Programvaran för datainsamling samlar in data från en lastcell (figur 1, 6) som är placerad mellan provkroppen och vagnen och en accelerometer (figur 1, 7) under kollisionen vid 100 kHz med hjälp av en bärbar dator som är ansluten till en datainsamlingsmodul. - Placera txt-filen som genereras av datainsamlingsprogramvaran i samma mapp som Matlab-dataanalyskoden (Supplementary Coding File 2) och kör dataanalyskoden för att filtrera rådata och beräkna effektparametrar.
- Se till att den maximala belastningen identifieras. Den associerade tidpunkten anses vara tiden för maximal deformation och nollhastighet.
OBS: Dataanalyskoden analyserar alla txt-filer i mappen och rapporterar resultaten för varje fil. Koden avgör början och slutet av påverkan baserat på ändringar i inläsningstidsdata. Data från accelerometern kommer att integreras numeriskt för att beräkna hastighet och integreras igen för att beräkna förskjutning. Dataanalyskoden kommer numeriskt att beräkna impuls-, arbets- och kinetisk energi från följande formler:
där F är kraften mätt av belastningssensorn, x 0 och t 0 är förskjutningen och tiden i början av islaget, och x och tf är förskjutningen och tiden vid islagets slut. Belastningsgraden beräknas numeriskt som medelvärdet av dσ/dt i islagsfasen. Toppspänningen beräknas genom att toppbelastningen divideras med provkroppens kontaktyta. - Utför visualisering av broskytan för att avgöra om lämplig broskskada har uppstått (Figur 4A).
5. Stängning av operationsområdet
- Ta bort falltornet över den operativa extremiteten. Lägg alla använda kirurgiska verktyg åt sidan och byt till nya sterila handskar.
OBS: Med tanke på att falltornet inte är sterilt bör alla verktyg som användes fram till stöten nu betraktas som förorenade. - Applicera ett sterilt draperi på nedre extremiteten igen och skaffa oanvända sterila självupprullningsdon.
- Exponera den mediala lårbenskondylen igen och skölj operationsområdet noggrant med 50-60 ml steril koksaltlösning.
- Stäng den bakre kapseln med en 5-0 polysorb sutur, följt av hudförslutning med en 4-0 monosorb sutur (se Materialtabell).
- Injicera 2 ml lidokain/bupivakain för lokal smärtlindring runt snittet intrakutant.
- Ta bort Steinman-stiftet med en kraftdrivarsats (se materialtabell) genom att oscillera för att minimera mjukdelsskador.
- Bind såret med ett icke-vidhäftande förband, följt av tejp. Utför en röntgen av den operativa extremiteten för att säkerställa att ingen fraktur uppstod och lämplig stiftplacering (Figur 4B).
6. Postoperativ hantering
- Sätt tillbaka kaninen i buren och övervaka den på uppvärmda filtar tills den återhämtar sig från narkosen (~25 min).
- Fortsätt att noga övervaka kaninerna i flera dagar efter operationen för att säkerställa att de läker ordentligt och återfår rörligheten. Administrera enrofloxacin (10 mg/kg) i 2 dagar postoperativt för infektionsprofylax. Administrera buprenorfin SR-analgesi (0,1 mg/kg) subkutant varannan till var tredje dag efter operationen och vid behov. I stället för buprenorfin kan NSAID som karprofen, 4 mg/kg SQ dagligen, Meloxikam, 0,2 – 0,3 mg/kg SQ dagligen upp till 3 dagar eller Ketoprofen, 3 mg/kg SQ dagligen administreras 3-5 dagar efter operationen och vid behov.
OBS: Vi har lyckats förhindra postoperativ sårruptur, på grund av att kaninen slickar eller tuggar, genom att placera mänskliga neonatalbyxor över bakbenen39. Om kaninen tuggar genom byxorna kan en elisabetansk krage (se materialtabell) placeras för att förhindra att snittet tuggas.
7. Histologisk utvärdering
- 16 veckor efter skadan, skörda knän från avlivade kaniner, fixera dem i 10 % neutralt buffrat formalin i 48 timmar, följt av paraffininbäddning och sektionering i 5 μm tjocka skivor.
- Efter avparaffinisering och rehydrering, färga sektionerna med safranin O fast green enligt standardprotokoll40,41.
- Utför den terminala deoxinukleotidyltransferasen dUTP nick end labeling (TUNEL) -analysen på sektionerna med TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection kit enligt tillverkarens instruktioner, motfärgad med Hematoxylin42 (se materialförteckning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Framgången av denna procedur övervakades omedelbart efter stöten genom visualisering av kondylen av kirurgen (Figur 4A) och genom röntgen för att säkerställa att ingen fraktur inträffade (Figur 4B). Det finns risk för slagfel som leder till en intraoperativ fraktur i leden. Detta berodde vanligtvis på felaktig placering av Steinman-stift (figur 5). Med hjälp av denna modell fanns det en frakturfelfrekvens sekundärt till intraoperativ fraktur på 9,0 % (6 av 67 operationer). Den genomsnittliga maximala slagspänningen var 81,9 ± 10,1 MPa (CV = 12,3 %) och den genomsnittliga belastningshastigheten var 36,6 ± 11,0 MPa/ms (CV = 30,1 %). Andra parametrar var också konsekventa, med CV som varierade mellan 5 % och 23,5 % (tabell 1).
Safranin O-fast grönfärgade histologiska snitt av knälederna från n = 8 kaniner utvärderades med avseende på brosknedbrytning och artrospatologi med hjälp av Osteoarthritis Research Society International (OARSI) poängsystem43. Broskskador observerades inte i den kontralaterala oskadade lårbenskondylen (Figur 6A) och var huvudsakligen lokaliserad till platsen för kollisionen (Figur 6B). Påverkade 16-veckors mediala lårbenskondyler (MFC) hade högre OARSI-poäng på 3,38 ± 1,43 jämfört med de kontralaterala kontroll-MFC:erna med en OARSI-poäng på 0,56 ± 0,42 (p < 0,0001) (Figur 6C). Vidare uppvisade påverkade knä-MFC också högre OARSI-poäng än den mediala tibialplatån (MTP; 0,71 ± 0,59), laterala tibialplatån (LTP; 0,88 ± 0,64) och laterala lårbenskondylen (LFC; 0,81 ± 1,00) i samma knä (p < 0,0001) (Figur 6D). Däremot observerades inga skillnader i OARSI-poäng mellan MFC (0,56 ± 0,42), LTP (0,50 ± 0,46), MTP (0,28 ± 0,45) och LFC (0,25 ± 0,46) i det kontralaterala icke-påverkade knäet (p > 0,05) (Figur 6E). Det fanns inte heller några signifikanta skillnader mellan de påverkade och icke-påverkade LFC-, MTP- och LTP-ledytorna (p >0,05) (figur 6F).
Artikulärt brosk från påverkad MFC skördad vid 16 veckor hade högre nivåer av TUNEL-positivitet (69,1 ± 14,4 %), vilket indikerar ökad kondrocytapoptos jämfört med icke-påverkade MFC (53,4 % ± 12,4 %) (p = 0,0058) (figur 7).
Figur 1: Falltornsapparat. (1) Vertikala stänger. (2) En aluminiumplattform i vilken stängerna presspassas. (3) En platta för att ytterligare hålla fast stavarna. (4) Linjära kullager med fast inriktning. (5) Provkroppshuvud monterat på vagnen. (6) Lastcell. (7) Accelerometer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Komponenter som används vid kirurgiska ingrepp och kaninens placering på slaganordningen. A) Utrustning som används för att orsaka broskskador och identifiering av komponenterna: 1) slagplattform av polyeten, 2) Höj- och sänkbar del av Steinmans stifthållarapparat. 3) Övre delen av den höj- och sänkbara Steinman-anordningen för tapphållarutrustning. 4) Sterilt provimakarhuvud med en diameter på 3 mm. (5) vippklämmor för att hålla slagplattformen mot falltornsapparaten, och (6) basen på slagplattformen. B) Placering av kaninens bakben med Steinmanstiftet (markerat med röda pilar) fäst vid plattformen före islag av den bakre mediala lårbenskondylen. Draperier utelämnades från figurerna i demonstrationssyfte. Ett kadaver användes för att generera bilderna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Korrekt placering av provkroppen på den mediala lårbenskondylen . A) Islagsanordning över kaninens bakben som är fastsatt vid plattformen. B) Korrekt placering av islagsmaskinens spets på den mediala lårbenskondylen före islag. Draperier utelämnades från figurerna i demonstrationssyfte. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Lyckad broskdefekt . (A) Förväntat grovt utseende av broskskada som genererats med denna modell. Infälld är ett förstorat område av den påverkade broskytan, med defekten markerad med en streckad cirkel. B) Lämplig Steinman-pinnposition i det distala lårbenet, med minst 5 mm avstånd från den bakre broskytan och nära approximerad ledytans vinkel (röntgengenomsläpplig cirkel i lårbenskondyler). Skalstreck = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Misslyckad broskdefekt. Röntgenbild som visar ett felplacerat stift i den mediala lårbenskondylen, vilket resulterar i en osteokondral fraktur vid islag. Den röda pilen pekar på felplaceringen av Steinman-stiftet. Den svarta pilen pekar på den brutna mediala lårbenskondylen. Skalstreck = 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Ökad svårighetsgrad av artros i den påverkade mediala lårbenskondylen. Representativa (A) kontralaterala och (B) påverkade mediala lårbenskondyler (MFC) snitt färgade med safranin-O (röd färgning av proteoglykaninnehåll) och Fast Green (blågrön färgning av bindväv med lägre proteoglykanhalt). Förstoring: 400x; skalstapel = 62,3 μm. (C) OARSI-poängsättning av den påverkade och kontroll-MFC. (D) OARSI-poäng för alla ledkompartment från den drabbade knäleden. (E) OARSI-poäng för ledkompartmenten från den icke-påverkade kontralaterala knäleden. (F) OARSI-poäng för ledkompartmenten från påverkade och icke-påverkade knän. Medial lårbenskondyl (MFC), medial tibialplatå (MTP), lateral tibialplatå (LTP) och lateral femoralkondyl (LFC). Gruppjämförelser utfördes med hjälp av Students t-test eller ANOVA, följt av Tukeys HSD post-hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Ökade apoptotiska kondrocyter i den påverkade MFC. Representativa bilder som visar TUNEL-färgade sektioner av (A) kontralateral oskadad MFC och (B) skadad MFC 16 veckor efter kollisionen vid 400x förstoring. Skalstapel = 62,3 μm. TUNEL-positivitet indikeras av brunfärgade kärnor. (C) Kvantifiering av TUNEL-positiva celler i de påverkade och kontroll-MFC:erna. Grupperna jämfördes med parade Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Studiens effektparametrar. Detta inkluderar toppstress (Megapascals; MPa), toppbelastning (Newton; N), laddningshastighet (megapascal per millisekund; MPa/ms), Effektvaraktighet (millisekunder; ms), Arbete (Joule; J), Impuls (Newtonsekunder; N·s), kinetisk energi (joule; J), acceleration (meter per sekund i kvadrat; m/s2) och tid till toppbelastning (millisekunder; ms). Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Operationstider. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: För- och nackdelar med den för närvarande beskrivna modellen. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande figur 1: Detaljerad delbeskrivning och reservdelslista för basplattformen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Detaljerad reservdelsbeskrivning och reservdelslista för Drop Tower. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 3: Ritning av del 01 - Kaninhållarbord. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 4: Ritning av del 02 - Främre ben. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 5: Ritning av del 03 - Huvudben. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 6: Ritning av del 04-K-trådhållarbas. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 7: Ritning av del 05-Skruvhuvud K-trådhållare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 8: Ritning av del 06-polyetenplatta. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 9: Ritning av del 07-plåt. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 10: Ritning av del 11 - Topphållare. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 11: Ritning av del 16 - Provarplatta. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 12: Ritning av del 17 - Slagbalk. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 13: Ritning av del 20 - Provikans spets. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 14: Ritning av krökningen av provkroppens spetshuvud. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: DropTestVIManual(1).vi. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: ImpactAnalysis(1).m. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta kirurgiska ingrepp syftar till att generera konsekventa broskskador på den viktbärande ytan av kaninens mediala lårbenskondyl i en modell av PTOA. En fördel med denna procedur är att den posteriora inflygningen till knäet möjliggör direkt visualisering av hela den bakre mediala lårbenskondylen, och den kan utföras på cirka 37 minuter (tabell 2). Det bör också noteras att detta är en öppen skademodell och kan leda till akuta inflammatoriska förändringar utöver bara påverkan på grund av potentiell skada på synovium och ledkapsel 17,44. Modellens för- och nackdelar sammanfattas i tabell 3. Försiktighet iakttogs för att undvika att skada ligament- och meniskstrukturer för att säkerställa ledstabilitet. Som ett resultat av detta upptäcktes inga skillnader mellan kontralaterala kontrollextremiteter och påverkade extremiteter i ledkompartment utanför islagszonen (mediala och laterala tibiala platåer och laterala femorala kondyler).
Den mest kritiska aspekten av detta protokoll är genereringen av en isolerad broskskada i lårbenskondylen. Steinmans pinbana påverkar i hög grad framgången för denna metod. Om tråden inte är parallell med ledytan eller om den placeras för bakåt i förhållande till mitten av den mediala lårbenskondylen kan det leda till en osteokondral fraktur av lårbenskondylen (Figur 5). Den laterala epikondylen är ett genomgående påtagligt landmärke som kan användas för en lämplig stiftbana.
Djur med frakturer i det subkondrala benet ska avlägsnas från studien. För den aktuella studiemetoden har vi haft en felfrekvens sekundärt till intraoperativ fraktur på 9,0 % (6 av 67 operationer). Denna frakturfrekvens är lägre än en nyligen genomförd öppen pendelbaserad slagmodell av MFC, som hade en frakturfrekvens på 28 %45. Vi rekommenderar att du provar denna metod med kadaverprover tills kirurgen och studieteamet känner sig bekväma med tillvägagångssättet och resultatet. Denna metod testades i kadaverprover av bakben och hela Nya Zeelands vita kaniner innan in vivo-experiment .
Denna metod är jämförbar med tidigare publicerade metoder för generering av akuta broskskador på lapin. Belastningshastigheten för denna slagmodell på 51,0 ± 16,0 MPa/ms var högre än tidigare arbeten med en pendel (cirka 0,5 till 6 MPa/ms)35,46,47 eller en pneumatisk cylinder (~0,4 MPa/ms)36 och lägre än den från en fjäderbelastad slaganordning (~530 MPa/ms)37. Den nuvarande slagtekniken modellerar en måttlig belastning jämfört med tidigare modeller, vilket resulterar i en toppspänning på 81,9 ± 10,1 MPa med en CV på 12,3 % som överensstämmer med tidigare modeller av pendel-, fjäderbelastade och pneumatiska cylinderlevererade laster, med fyra tidigare modeller som levererar spänningar på 10,1-169 MPa, med CV som sträcker sig från 0,85-40,5 %36,37, 45,46.
En begränsning med denna modell är att den inte genererade osteokondrala frakturer och därför inte helt efterliknade de typiska intraartikulära frakturer som ses i den kliniska miljön17. Det noterades också att den genomsnittliga accelerationen för falltornsvagnen före kollisionen var 6,4 ± 0,4 m/s 2, vilket är lägre än den gravitationella fritt fallaccelerationen på 9,8 m/s2, troligen på grund av friktion från kullagren. Ändå gör metoden det möjligt att isolera de påverkade broskmedierade effekterna av PTOA-patogenesen, som inte är helt klarlagda.
Även om flera beskrivna lapinmodeller ger en kondral skada, framstår användningen av det bakre tillvägagångssättet till knäet med drop tower-modellen som en enkel, effektiv och kliniskt relevant metod för att generera PTOA, vilket möjliggör studier av dess patogenes och testning av nya terapier. Sammantaget är lapinemodellen för öppen posteromedial femoral kondyle impact injury en lovande plattform för att studera de cellulära och molekylära händelser som är associerade med PTOA och identifiera nya terapeutiska mål48,49 för att förhindra eller mildra broskskador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Roman Natoli håller föreläsningar för AO Trauma North America, är sektionsredaktör för Current Osteoporosis Reports och har fått royalties från Morgan och Claypool. Todd McKinley får royalties från Innomed. De övriga författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av DoD Peer Reviewed Medical Research Program - Investigator-Initiated Research Award W81XWH-20-1-0304 från U.S. ARMY MEDICAL RESEARCH ACQUISITION ACTIVITY, av NIH NIAMS R01AR076477 och ett omfattande muskuloskeletalt T32-utbildningsprogram från NIH (AR065971) och av NIH NIAMS Grant R01 AR069657. Författarna vill tacka Kevin Carr för att ha bidragit med sin expertis inom bearbetning och tillverkning till detta projekt, och Drew Brown och Indiana Center for Musculoskeletal Health Bone Histology Core för att ha hjälpt till med histologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flat head screw | McMaster-Carr | 92210A194 | Stainless steel hex drive flat head screw, 8-32, 1/2" |
| #15 scalpel blades | McKesson | 1029066 | Scalpel McKesson No. 15 Stainless Steel / Plastic Classic Grip Handle Sterile Disposable |
| 1/2”-20 threaded rod | McMaster-Carr | 99065A120 | 1/2”-20 threaded rod |
| 10 mL syringe | McKesson | 1031801 | For irrigation; General Purpose Syringe McKesson 10 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety |
| 3 mL syringe | McKesson | 1031804 | For lidocaine/bupiviacaine injection; General Purpose Syringe McKesson 3 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety. |
| 3-0 polysorb | Ethicon | J332H | 3-0 Vircryl, CT-2, 1/2 circle, 26 mm, tapered |
| 4-0 monosorb | Ethicon | Z397H | 4-0 PDS 2, FS-2, 3/8 circle, 19mm, cutting edge |
| 5-0 polysorb | Med Vet International | NC9335902 | Med Vet International 5-0 ETHICON COATED VICRYL C-3 |
| Accelerometer | Kistler | 8743A5 | Accelerometer |
| Adson-Browns Forceps | World precision tools | 500177 | Adson-Brown Forceps, 12 cm, Straight, TC Jaws, 7 x 7 Teeth |
| Alfaxalone | Jurox | 49480-002-01 | Alfaxan Multidose by Jurox : 10 mg/mL |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | 42023-0179-05 | Buprenorphine HCL injection: 0.3 mg/mL |
| Butorphanol | Zoetis | 54771-2033 | Butorphanol tartrate 10mg/ml by Zoetis |
| Chlorhexidine Hand Scrub | BD | 371073 | BD E-Z Scrub 107 Surgical Scrub Brush/Sponge, 4% CHG, Red |
| Collet | STRYKER | 14023 | Stryker 4100-62 wire Collet 0.28-0.71'' |
| Cordless Driver handpiece | STRYKER | OR-S4300 | Stryker 4300 CD3 Cordless Driver 3 handpiece |
| Cricket Retractors | Novosurgical | G3510 21 | 2x Heiss (Holzheimer) Cross Action Retractor |
| Dissector Scissors | Jorvet labs | J0662 | Aesculap AG, Metzenbaum, Scissors, Straight 5 3/4″ |
| Elizabethian Collar | ElizaSoft | 62054 | ElizaSoft Elizabethan Recovery Collar |
| Enrofloxacin | Custom Meds | Enrofloxacin compounded by Custom Meds | |
| Eye Ointment | Pivetal | 46066-753-55 | Pivetal Articifical Tears- recently recalled |
| Face-mount shaft collar | McMaster-Carr | 5631T11 | Face-mount shaft collar |
| Fast green | Millipore Sigma | F7258 | Fast green |
| Freer | Jorvet labs | J0226Q | Freer elevator |
| Head screw -1 | McMaster-Carr | 91251A197 | Black-oxide alloy steel socket head screw, 8-32, 3/4" |
| Head screw -2 | McMaster-Carr | 92196A194 | Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2" |
| Head screw -3 | McMaster-Carr | 92196A146 | Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2" |
| Head screw -4 | McMaster-Carr | 92196A151 | Stainless steel socket head screw, 6-32, 3/4" |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | Millipore Sigma | GHS132-1L | Hematoxylin Solution, Gill No. 1 |
| Hex nut | McMaster-Carr | 91841A007 | Stainless steel hex nut, 6-32 |
| Hold-down toggle clamp | McMaster-Carr | 5126A71 | Hold-down toggle clamp |
| Impact device | n/a | n/a | custom made |
| Impact platform | n/a | n/a | custom made |
| K-wires | Jorvet Labs | J0250A | JorVet Intramedullary Steinman Pins, Trocar-Trocar 1/16" x 7" |
| Lab View | National Instruments | n/a | n/a |
| Load cell | Kistler | 9712B5000 | Load cell |
| MATLAB | The MathWorks Inc. | n/a | n/a |
| Microscope | Leica | DMi-8 | Leica DMi8 microscope with LAS-X software |
| Midazolam | Almaject | 72611-749-10 | Midazolam Hydrochloride injection: 5mg/ml by Almaject |
| milling machine depth stops | McMaster-Carr | 2949A71 | Clamp-on milling machine depth stops |
| Mobile C-arm | Philips | 718095 | BV Pulsera, Mobile C-arm |
| Mounted linear ball bearing | McMaster-Carr | 9338T7 | Mounted linear ball bearing |
| Needle Driver | A2Z Scilab | A2ZTCIN39 | TC Webster Needle Holder Smooth Jaws 5", Premium |
| Pentobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | Pentobarbital 390 mg/mL by Vortech |
| Safranin O | Millipore Sigma | HT90432 | Safranin O |
| Small Battery pack | STRYKER | NS014036 | 6212 Small Battery pack- 9.6 V |
| Steel rod, 2’ | McMaster-Carr | 89535K25 | Steel rod, 2’ |
| Sterile Saline | ICU Medical | 6139-22 | AquaLite Solution Pour Bottles, 250 mL |
| Stryker 6110-120 System 6 Battery Charger | STRYKER | OR-S6110-120 | |
| Surgical gloves | McKesson | 1044729 | Surgical Glove McKesson Perry Size 6.5 Sterile Pair Latex Extended Cuff Length Smooth Brown Not Chemo Approved |
| Surgical gown | McKesson | 1104452 | Non-Reinforced Surgical Gown with Towel McKesson Large Blue Sterile AAMI Level 3 Disposable |
| Suture scissors | Jorvet Labs | J0910SA | Super Cut Scissors, Mayo, Straight, 5 1/2″ |
| TUNEL staining kit | ABP Bioscience | A049 | TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection Kit |
| Weitlaner Retractors | Fine Science Tools | 17012-11 | 2x Weitlaner-Locktite Retractors |
References
- Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M.
- Pasquale, M. K., et al. Healthcare Utilization and costs of knee or hip replacements versus pain-relief injections. American Health Drug Benefits. 8 (7), 384-394 (2015).
- Yao, J. J., et al. Direct Inpatient medical costs of operative treatment of periprosthetic hip and knee infections are twofold higher than those of aseptic revisions. Journal of Bone and Joint Surgery America. 103 (4), 312-318 (2021).
- Anatone, A. J., et al. Decreased implant survival is associated with younger patients undergoing total knee arthroplasty. HSS Journal. 18 (2), 290-296 (2022).
- Stone, B., Nugent, M., Young, S. W., Frampton, C., Hooper, G. J. The lifetime risk of revision following total knee arthroplasty : a New Zealand Joint Registry study. The Bone and Joint Journal. 104-B (2), 235-241 (2022).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
- Robinson, W. H., et al. Low-grade inflammation as a key mediator of the pathogenesis of osteoarthritis. Nature Review Rheumatology. 12 (10), 580-592 (2016).
- Perez-Garcia, S., et al. Profile of matrix-remodeling proteinases in osteoarthritis: impact of fibronectin. Cells. 9 (1), 40 (2019).
- Hashimoto, S., Ochs, R. L., Komiya, S., Lotz, M. Linkage of chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in human osteoarthritis. Arthritis Rheumatology. 41 (9), 1632-1638 (1998).
- Natoli, R. M., Athanasiou, K. A. Traumatic loading of articular cartilage: Mechanical and biological responses and post-injury treatment. Biorheology. 46 (6), 451-485 (2009).
- Coleman, M. C., Brouillette, M. J., Andresen, N. S., Oberley-Deegan, R. E., Martin, J. M. Differential effects of superoxide dismutase mimetics after mechanical overload of articular cartilage. Antioxidants (Basel). 6 (4), 98 (2017).
- Goodwin, W., et al. Rotenone prevents impact-induced chondrocyte death. Journal of Orthopaedic Research. 28 (8), 1057-1063 (2010).
- Wolff, K. J., et al. Mechanical stress and ATP synthesis are coupled by mitochondrial oxidants in articular cartilage. Journal of Orthopaedic Research. 31 (2), 191-196 (2013).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial dysfunction is an acute response of articular chondrocytes to mechanical injury. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 739-750 (2018).
- Coleman, M. C., Ramakrishnan, P. S., Brouillette, M. J., Martin, J. A. Injurious loading of articular cartilage compromises chondrocyte respiratory function. Arthritis Rheumatology. 68 (3), 662-671 (2016).
- Bobinac, D., Spanjol, J., Zoricic, S., Maric, I. Changes in articular cartilage and subchondral bone histomorphometry in osteoarthritic knee joints in humans. Bone. 32 (3), 284-290 (2003).
- Coleman, M. C., et al. Targeting mitochondrial responses to intra-articular fracture to prevent posttraumatic osteoarthritis. Science Translational Medicine. 10 (427), eaan5372 (2018).
- Heraud, F., Heraud, A., Harmand, M. F. Apoptosis in normal and osteoarthritic human articular cartilage. Annals of Rheumatological Diseases. 59 (12), 959-965 (2000).
- Narez, G. E., Fischenich, K. M., Donahue, T. L. H. Experimental animal models of post-traumatic osteoarthritis of the knee. Orthopedic Reviews (Pavia). 12 (2), 8448 (2020).
- Fischenich, K. M., et al. Chronic changes in the articular cartilage and meniscus following traumatic impact to the lapine knee. Journal of Biomechanics. 48 (2), 246-253 (2015).
- Isaac, D. I., Meyer, E. G., Kopke, K. S., Haut, R. C. Chronic changes in the rabbit tibial plateau following blunt trauma to the tibiofemoral joint. Journal of Biomechanics. 43 (9), 1682-1688 (2010).
- Wei, F., et al. Post-traumatic osteoarthritis in rabbits following traumatic injury and surgical reconstruction of the knee. Annals of Biomedical Engineering. 50 (2), 169-182 (2022).
- Terracciano, R., et al. Quantitative high-resolution 7T MRI to assess longitudinal changes in articular cartilage after anterior cruciate ligament injury in a rabbit model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage Open. 4 (2), 100259 (2022).
- Huang, K., Cai, H. L., Zhang, P. L., Wu, L. D. Comparison between two rabbit models of posttraumatic osteoarthritis: A longitudinal tear in the medial meniscus and anterior cruciate ligament transection. Journal of Orthopaedic Research. 38 (12), 2721-2730 (2020).
- Sun, Z. B., Peng, H. Experimental Study on the prevention of posttraumatic osteoarthritis in the rabbit knee using a hinged external fixator in combination with exercises. Journal of Investigative Surgery. 32 (6), 552-559 (2019).
- Gardner, M. J., et al. The incidence of soft tissue injury in operative tibial plateau fractures: a magnetic resonance imaging analysis of 103 patients. Journal of Orthopedic Trauma. 19 (2), 79-84 (2005).
- Dilley, J. E. B. M. A., Roman, N., McKinley, T. O., Sankar, U. Post-traumatic osteoarthritis: A review of pathogenic mechanisms and novel targets for mitigation. Bone Reports. 18, 101658 (2023).
- Seol, D., et al. Effects of knockout of the receptor for advanced glycation end-products on bone mineral density and synovitis in mice with intra-articular fractures. Journal of Orthopedic Research. 36 (9), 2439-2449 (2018).
- Furman, B. D., et al. Joint degeneration following closed intraarticular fracture in the mouse knee: a model of posttraumatic arthritis. Journal of Orthopedic Research. 25 (5), 578-592 (2007).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 18 Suppl 3, S17-S23 (2010).
- McCoy, A. M. Animal models of osteoarthritis: comparisons and key considerations. Veterinary Pathology. 52 (5), 803-818 (2015).
- Fening, S. D., Jones, M. H., Moutzouros, V., Downs, B., Miniaci, A. Method for Delivering a controlled impact to articular cartilage in the rabbit knee. Cartilage. 1 (3), 211-216 (2010).
- Leucht, F., et al. Development of a new biomechanically defined single impact rabbit cartilage trauma model for in vivo-studies. Journal of Investigative Surgery. 25 (4), 235-241 (2012).
- Vrahas, M. S., Smith, G. A., Rosler, D. M., Baratta, R. V. Method to impact in vivo rabbit femoral cartilage with blows of quantifiable stress. Journal of Orthopedic Research. 15 (2), 314-317 (1997).
- Borrelli, J. Jr, Burns, M. E., Ricci, W. M., Silva, M. J. A method for delivering variable impact stresses to the articular cartilage of rabbit knees. Journal of Orthopedic Trauma. 16 (3), 182-188 (2002).
- Milentijevic, D., Rubel, I. F., Liew, A. S., Helfet, D. L., Torzilli, P. A. An in vivo rabbit model for cartilage trauma: a preliminary study of the influence of impact stress magnitude on chondrocyte death and matrix damage. Journal of Orthopedic Trauma. 19 (7), 466-473 (2005).
- Alexander, P. G., et al. An In vivo lapine model for impact-induced injury and osteoarthritic degeneration of articular cartilage. Cartilage. 3 (4), 323-333 (2012).
- Bonitsky, C. M., et al. Genipin crosslinking decreases the mechanical wear and biochemical degradation of impacted cartilage in vitro. Journal of Orthopedic Research. 35 (3), 558-565 (2017).
- Bartley, K. A., Johnson, C. H. Human Infant pants for postoperative protection during social housing of new zealand white rabbits (Oryctolagus cuniculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 58 (4), 510-516 (2019).
- Lillie, R. D., Fullmer, H. M. Histopathologic technic and practical histochemistry. , 4th edn, Blakiston Division, McGraw-Hill. (1976).
- Armed Forces Institute of Pathology: Laboratory Methods in Histotechnology. Washington DC: American Registry of Pathology. Prophet, E., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. , (1992).
- Dilley, J. E., et al. CAMKK2 is upregulated in primary human osteoarthritis and its inhibition protects against chondrocyte apoptosis. Osteoarthritis and Cartilage. 31 (7), 908-918 (2023).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Christiansen, B. A., et al. Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).
- Borrelli, J., Zaegel, M. A., Martinez, M. D., Silva, M. J. Diminished cartilage creep properties and increased trabecular bone density following a single, sub-fracture impact of the rabbit femoral condyle. Journal of Orthopaedic Research. 28 (10), 1307-1314 (2010).
- Borrelli, J., Silva, M. J., Zaegel, M. A., Franz, C., Sandell, L. J. Single high-energy impact load causes posttraumatic OA in young rabbits via a decrease in cellular metabolism. Journal of Orthopedic Research. 27 (3), 347-352 (2009).
- Borrelli, J. Jr, Zhu, Y., Burns, M., Sandell, L., Silva, M. J. Cartilage tolerates single impact loads of as much as half the joint fracture threshold. Clinical Orthopedics and Related Research. 426, 266-273 (2004).
- Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 activity is involved in the acute injury response of chondrocytes to ex vivo injurious mechanical overload. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6521 (2023).
- Mevel, E., et al. Systemic inhibition or global deletion of CaMKK2 protects against post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 30 (1), 124-136 (2022).
