Summary
Das vorliegende Protokoll erklärt die Erzeugung einer 2D-Monoschicht von Kleinhirnzellen aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Untersuchung der frühen Stadien der Kleinhirnentwicklung.
Abstract
Die präzise und rechtzeitige Entwicklung des Kleinhirns ist nicht nur für eine genaue motorische Koordination und Balance, sondern auch für die Kognition von entscheidender Bedeutung. Darüber hinaus wurde eine Störung der Kleinhirnentwicklung mit vielen neurologischen Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht, darunter Autismus, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung (ADHS) und Schizophrenie. Untersuchungen der Kleinhirnentwicklung beim Menschen waren bisher nur durch Post-mortem-Studien oder Neuroimaging möglich, doch reichen diese Methoden nicht aus, um die molekularen und zellulären Veränderungen in vivo während der frühen Entwicklung zu verstehen, wenn viele neurologische Entwicklungsstörungen entstehen. Das Aufkommen von Techniken zur Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) aus somatischen Zellen und die Fähigkeit, iPS-Zellen weiter in Neuronen umzudifferenzieren, haben den Weg für die In-vitro-Modellierung der frühen Gehirnentwicklung geebnet. Die vorliegende Studie bietet vereinfachte Schritte zur Erzeugung von Kleinhirnzellen für Anwendungen, die eine 2-dimensionale (2D) Monoschichtstruktur erfordern. Kleinhirnzellen, die frühe Entwicklungsstadien repräsentieren, werden aus menschlichen iPS-Zellen über die folgenden Schritte abgeleitet: Zuerst werden embryoide Körper in 3-dimensionaler (3D) Kultur hergestellt, dann werden sie mit FGF2 und Insulin behandelt, um die Spezifikation des Kleinhirnschicksals zu fördern, und schließlich werden sie terminalerweise als Monoschicht auf Poly-L-Ornithin (PLO) / Laminin-beschichteten Substraten differenziert. Nach 35 Tagen Differenzierung exprimieren iPSC-abgeleitete Kleinhirnzellkulturen Kleinhirnmarker wie ATOH1, PTF1α, PAX6 und KIRREL2, was darauf hindeutet, dass dieses Protokoll glutamaterge und GABAerge zerebelläre neuronale Vorläufer sowie Purkinje-Zellvorläufer erzeugt. Darüber hinaus zeigen die differenzierten Zellen eine ausgeprägte neuronale Morphologie und sind positiv für Immunfluoreszenzmarker der neuronalen Identität wie TUBB3. Diese Zellen exprimieren axonale Leitmoleküle, einschließlich Semaphorin-4C, Plexin-B2 und Neuropilin-1, und könnten als Modell für die Untersuchung der molekularen Mechanismen des Neuritenwachstums und der synaptischen Konnektivität dienen. Diese Methode erzeugt menschliche Kleinhirnneuronen, die für nachgelagerte Anwendungen nützlich sind, einschließlich Genexpression, physiologischer und morphologischer Studien, die 2D-Monoschichtformate erfordern.
Introduction
Das Verständnis der menschlichen Kleinhirnentwicklung und der kritischen Zeitfenster dieses Prozesses ist nicht nur wichtig, um die möglichen Ursachen neurologischer Entwicklungsstörungen zu entschlüsseln, sondern auch um neue Ziele für therapeutische Interventionen zu identifizieren. Die Modellierung der menschlichen Kleinhirnentwicklung in vitro war eine Herausforderung, doch im Laufe der Zeit sind viele Protokolle zur Differenzierung menschlicher embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) oder iPS-Zellen mit Kleinhirnlinienschicksalen entstanden 1,2,3,4,5,6,7,8 . Darüber hinaus ist es wichtig, Protokolle zu entwickeln, die reproduzierbare Ergebnisse liefern, relativ einfach sind (um Fehler zu reduzieren) und keine hohen monetären Kosten verursachen.
Die ersten Protokolle für die Kleinhirndifferenzierung wurden aus 2D-Kulturen aus plattierten embryoiden Körpern (EBs) generiert, die das Kleinhirnschicksal mit verschiedenen Wachstumsfaktoren ähnlich der In-vivo-Entwicklung induzierten, einschließlich WNT, BMPs und FGFs 1,9. Neuere veröffentlichte Protokolle induzierten eine Differenzierung hauptsächlich in der 3D-Organoidkultur mit FGF2 und Insulin, gefolgt von FGF19 und SDF1 für rhombische lippenartige Strukturen3,4 oder verwendeten eine Kombination aus FGF2, FGF4 und FGF85. Beide Kleinhirn-Organoid-Induktionsmethoden führten zu ähnlichen 3D-Kleinhirn-Organoiden, da beide Protokolle eine ähnliche Kleinhirnmarkerexpression zu identischen Zeitpunkten berichteten. Holmes und Heine erweiterten ihr 3D-Protokoll5, um zu zeigen, dass 2D-Kleinhirnzellen aus hES-Zellen und iPS-Zellen erzeugt werden können, die als 3D-Aggregate beginnen. Darüber hinaus zeigten Silva et al.7, dass Zellen, die reife Kleinhirnneuronen in 2D repräsentieren, mit einem ähnlichen Ansatz wie Holmes und Heine erzeugt werden können, wobei ein anderer Zeitpunkt für den Wechsel von 3D zu 2D verwendet wird und die Wachstums- und Reifezeit verlängert wird.
Das aktuelle Protokoll induziert das Kleinhirnschicksal in feederfreien iPS-Zellen, indem es frei schwebende embryoide Körper (EBs) mit Insulin und FGF2 erzeugt und dann die EBs am Tag 14 auf PLO / Laminin-beschichtetem Geschirr für 2D-Wachstum und Differenzierung plattiert. Am Tag 35 werden Zellen mit Kleinhirnidentität erhalten. Die Fähigkeit, die frühen Stadien der Kleinhirnentwicklung, insbesondere in einer 2D-Umgebung, zu rekapitulieren, ermöglicht es Forschern, spezifische Fragen zu beantworten, die Experimente mit einer Monoschichtstruktur erfordern. Dieses Protokoll ist auch für weitere Modifikationen wie mikrostrukturierte Oberflächen, axonale Auswuchsassays und Zellsortierung zugänglich, um die gewünschten Zellpopulationen anzureichern.
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Protocol
Die Forschung am Menschen wurde unter der Genehmigungsnummer 201805995 des University of Iowa Institutional Review Board und der Zulassungsnummer 2017-02 des Human Pluripotent Stem Cell Committee der University of Iowa genehmigt. Hautbiopsien wurden von den Probanden nach schriftlicher Einverständniserklärung erhalten. Die Fibroblasten wurden in DMEM mit 15% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% MEM-nicht-essentieller Aminosäurenlösung bei 37 °C und 5%CO2 kultiviert. Die Fibroblasten wurden mit einem episomalen Reprogrammierungskit nach dem Protokoll des Herstellers (siehe Materialtabelle) unter Verwendung eines Nukleofektors für die Elektroporation umprogrammiert. Alle Eingriffe wurden in einer biologischen Sicherheitswerkbank der Klasse II Typ A2 (kurz "Haube") durchgeführt. Alle Zellkulturmedien waren antibiotikafrei; Daher wurde jedes Bauteil, das in die Haube gelangte, mit 70% Ethanol gereinigt. Alle Zellkulturmedien und Komponenten wurden steril filtriert oder in der Haube geöffnet, um ihre Sterilität zu erhalten.
1. Versuchsvorbereitung
- Bereiten Sie mit Basalmembranmatrix (BMM) beschichtete Platten vor.
HINWEIS: BMM erstarrt bei wärmeren Temperaturen schneller. Die Platten müssen schnell vorbereitet und sofort bei 4 °C zur Lagerung aufgestellt werden.- Das BMM (siehe Materialtabelle) mindestens 2 h oder über Nacht auf Eis bei 4 °C auftauen.
- Mischen Sie DMEM/F12 und BMM auf eine Endkonzentration von 80 μg/ml. Die BMM-Lösung in Gewebekulturschalen verteilen (1 ml für 35 mm und 2 ml für 60 mm Schalen) und bei 37 °C für mindestens 1 h oder über Nacht inkubieren, bevor die Zellen plattiert werden.
HINWEIS: Das unbenutzte Geschirr kann 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie Poly-L-Ornithin/Laminin (PLO/Laminin)-beschichtete Platten vor.
- Bereiten Sie 20 μg/ml PLO (siehe Materialtabelle) in sterilem DPBS+/+ vor und geben Sie 1 ml in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Über Nacht bei 37 °C im Inkubator inkubieren.
- Am nächsten Tag saugen Sie den PLO mit einem Vakuumsauger ab und waschen Sie ihn zweimal mit DPBS+/+. Lufttrocknen in der Kapuze.
HINWEIS: Luftgetrocknete Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden, eingewickelt in Aluminiumfolie, für die zukünftige Verwendung. - Bereiten Sie 10 μg/ml Laminin (siehe Materialtabelle) in DPBS+/+ vor und geben Sie 1 ml in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Inkubieren Sie mindestens 3 h oder über Nacht bei 37 °C im Inkubator.
- Saugen Sie das Laminin mit einem Vakuumsauger ab und fügen Sie entweder 1 ml mittleres oder steriles DPBS+/+ hinzu.
HINWEIS: Die Lamininbeschichtung darf nicht austrocknen. PBS oder ein geeignetes Kulturmedium sollte sofort hinzugefügt werden, um dies zu verhindern. Beschichtete Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
- Bereiten Sie die PSC-Passaginglösung vor.
HINWEIS: Ein Osmometer (siehe Materialtabelle) ist erforderlich, um PSC-Passaging-Lösung10 herzustellen.- 11,49 g Kaliumchlorid (KCl) und 0,147 g Natriumcitrat-Dihydrat (HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O) werden in 400 ml sterilem Zellkulturwasser gelöst (siehe Materialtabelle).
- Messen Sie das Volumen der Lösung und notieren Sie es als Ausgangsvolumen (Vi).
- Messen Sie die Osmolarität und stellen Sie sie auf 570 mOsm ein, indem Sie steriles Wasser in Zellkulturqualität mit der Formel Vi × Oi = Vf × 570 mOsm hinzufügen.
- Filtersterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,20-μm-Filter und machen Sie 10 mL Aliquots. Lagern Sie die Aliquots bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur (RT).
- Bereiten Sie das Medium der pluripotenten Stammzellen (PSC) vor.
HINWEIS: iPSCs werden in einem Medium gehalten, das hitzestabiles FGF2 enthält (siehe Materialtabelle), was einen wochenendfreien Fütterungsplan bietet. Andere kommerziell erhältliche PSC-Medien wurden für dieses Protokoll nicht ausprobiert.- Das PSC medium Supplement über Nacht bei 4 °C auftauen.
- Fügen Sie 10 ml PSC-Medium-Ergänzung zu 500 ml basalem PSC-Medium hinzu. 25 ml Aliquots herstellen und bei −20 °C lagern.
HINWEIS: Gefrorene Aliquots können 6 Monate bei −20 °C gelagert werden. Aufgetaute Aliquots müssen bei 4 °C gelagert und innerhalb von 2 Wochen verwendet werden. Zellen können für die Langzeitlagerung in einem PSC-Medium mit 10% (v/v) Dimethylsulfoxid (DMSO) eingefroren werden.
- PSC-Auftaumedium vorbereiten.
- Ergänzung PSC-Medium mit 50 nM Chroman, 1,5 μM Emricasan, 1x Polyamin-Supplement und 0,7 μM trans-ISRIB (CEPT-Cocktail11) (siehe Materialtabelle).
- Mit einem 0,20 μm Filter filtern und bei 4 °C bis zu 4 Wochen lagern.
- Ziehen Sie Glaspipetten vor.
- Ziehen Sie 22,9 cm (9 Zoll) Glaspasteurpipetten in zwei Stücke über einem Bunsenbrenner, ~ 2 cm unter dem Hals, wodurch zwei Pipetten entstehen, wobei die dünnere Seite ~ 4 cm kürzer ist als die andere.
- Biegen Sie mit Hilfe der Flamme die Spitzen der gezogenen Seite, um ein glattes "r" zu erzeugen.
- Legen Sie die gezogenen Pipetten zur Sterilisation in Autoklavenhülsen und Autoklaven.
- Bereiten Sie das Kleinhirndifferenzierungsmedium (CDM) vor.
- Mischen Sie IMDM und Ham's F12 Nährstoffmischung im Verhältnis 1:1. Ergänzen Sie die Mischung mit 1x L-Alanin-L-Glutamin-Ergänzung, 1% (v/v) chemisch definiertem Lipidkonzentrat, 0,45 mM 1-Thio-Glycerin, 15 μL/ml Apotransferrin, 5 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) und 7 μg/ml Insulin (siehe Materialtabelle).
- Mit einem 0,20 μm Filter filtern, bei 4 °C lagern und innerhalb von 1 Monat aufbrauchen.
- Zerebelläres Reifungsmedium (KMG) vorbereiten.
- Ergänzen Sie das neurobasale Medium mit 1x L-Alanin-L-Glutamin-Ergänzung und 1x N-2-Ergänzung (siehe Materialtabelle).
- Mit einem 0,20 μm Filter filtern, bei 4 °C lagern und innerhalb von 2 Wochen verbrauchen.
2. Feederfreie iPSC-Kultur
- Tauen Sie die Zellen auf, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Eine BMM-Platte (Schritt 1.1) in den 37 °C-Inkubator geben, um mindestens 1 Stunde oder über Nacht zu gelieren, bevor die Zellen aufgetaut werden.
- 10 mL PSC-Auftaumedium (Schritt 1.5) bei 37 °C vorwärmen.
- Das Kryo mit Zellen aus flüssigem Stickstoff in ein Wasserbad bei 37 °C überführen.
HINWEIS: Um eine Kontaminationsquelle im Zellkulturraum zu vermeiden, wird die Verwendung eines Standard-Wasserbades nicht empfohlen. Stattdessen kann frisches Wasser in einem kleinen Becherglas auf 37 °C erhitzt werden, um ein Einweg-Wasserbad zu erzeugen. - Wenn ein kleines Stück Eis in der Tube verbleibt, entfernen Sie es aus dem Wasserbad, trocknen Sie das Röhrchen und sprühen Sie es mit 70% Ethanol. Übertragen Sie das Röhrchen auf die Haube und verwenden Sie eine 2 ml oder 5 ml serologische Pipette (siehe Materialtabelle), um die Zellen vorsichtig in ein 15 ml konisches Röhrchen zu überführen.
- Geben Sie 8 mL PSC-Auftaumedium zu den Zellen tropfenweise, während Sie das konische Röhrchen schwenken. Zentrifugieren bei 200 x g für 5 min bei RT.
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einem Vakuumsauger ab, ohne das Zellpellet zu stören. Resuspendieren Sie die Zellen in 2 ml PSC-Auftaumedium.
- Saugen Sie das BMM von der Platte ab und fügen Sie die resuspendierten Zellen tropfenweise über die gesamte Platte hinzu, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
- Stellen Sie die Platte bei 37 °C, 5% CO2, in den Inkubator. Aktualisieren Sie das Medium am nächsten Tag mit PSC medium. Danach wechseln Sie das Medium täglich.
- Pflegen Sie die Zellen anhand der folgenden Schritte.
- Das erforderliche Volumen des PSC-Mediums auf 37 °C vorwärmen (z. B. 1 ml Medium pro 35 mm Platte).
- Untersuchen Sie die Platten auf differenzierte Zellen oder Kolonien und entfernen Sie die differenzierten Zellen mit einer gezogenen Glaspipette (Schritt 1.6).
HINWEIS: iPSC-Kolonien haben glatte Kanten mit morphologisch identischen Zellen. - Ändern Sie das verbrauchte Medium täglich und die Passage alle 3-4 Tage oder wenn 70% Konfluenz erreicht ist.
- Durchgang der Zellen.
- Legen Sie die erforderliche Menge an BMM-Platten für mindestens 1 Stunde oder über Nacht in den Inkubator, bevor sie passieren. Die erforderliche Menge PSC-Medium (Schritt 1.3) bei 37 °C vorwärmen.
- Reinigen Sie mit einer gezogenen Glaspipette alle differenzierten Zellen oder Kolonien.
- Das verbrauchte Medium mit einem Vakuumsauger absaugen und PSC-Dissoziationsmedium, 1 ml pro 35 mm Schüssel, hinzufügen. Bei 37 °C 1-3 min inkubieren.
HINWEIS: Wenn Kolonien in der PSC-Passaging-Lösung abheben, bevor PSC-Medium hinzugefügt wird, kann die Inkubationszeit reduziert werden. - Saugen Sie die PSC-Passaging-Lösung ab und fügen Sie das vorgewärmte PSC-Medium hinzu.
- Kratzen Sie mit einer sterilen 200-μL-Pipettenspitze Linien parallel zueinander in eine Richtung, drehen Sie die Platte um 90° und machen Sie einen zweiten Satz von Kratzlinien senkrecht zu den vorherigen (wodurch ein kreuzschraffiertes Muster über die Platte entsteht).
- Saugen Sie die BMM-Lösung von den Setplatten ab. Sammeln Sie die Kolonien mit einer serologischen Pipette und verteilen Sie sie auf neue BMM-Platten.
- Bei 37 °C, 5% CO2 inkubieren. Wechseln Sie das Medium täglich.
- Frieren Sie die Zellen ein.
- Bereiten Sie Kryogeräte vor, indem Sie den Inhalt kennzeichnen und unter ultraviolettem (UV) Licht in der Haube sterilisieren (siehe Materialtabelle) für 30 min.
- Bereiten Sie das PSC-Gefriermedium vor, indem Sie das PSC-Medium mit 10% (v/v) DMSO ergänzen. Folgen Sie den Schritten 2.3.2-2.3.5.
- Die Zellen werden in ein 15 ml konisches Röhrchen mit einer 5 ml serologischen Pipette überführt und bei 200 x g für 5 min bei RT zentrifugiert.
- Saugen Sie das Medium vorsichtig ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in PSC-Gefriermedium.
- In Kryovials verteilen. Die Durchstechflaschen in einen Gefrierbehälter geben und in einen Gefrierschrank von −80 °C stellen.
- Am nächsten Tag werden die Kryoeinheiten zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt.
3. Kleinhirndifferenzierung
HINWEIS: Vor Beginn der Differenzierung werden iPSCs zu sechs 35-mm-Schalen überführt und sind bereit für die Differenzierung, wenn sie bei 70% Konfluenz sind. Jede 35-mm-Platte wird auf eine Vertiefung der 6-Well-Platte übertragen.
- Am Tag 0 heben Sie die gesunden iPSC-Kolonien für die EB-Bildung an.
- Fügen Sie 1 ml CDM (Schritt 1.7), ergänzt mit 10 μM Y-27632 und 10 μM SB431542 (siehe Materialtabelle), in jede Vertiefung einer 6-Well-ULA-Platte (Ultra-Low Attachment) und legen Sie sie in den Inkubator, bis die angehobenen Kolonien bereit sind, den Vertiefungen hinzugefügt zu werden.
- Reinigen Sie die differenzierten Zellen mit einer gezogenen Glaspipette. Das Medium absaugen und 1 ml PSC-Passaging-Lösung für jede 35-mm-Schale hinzufügen. 3 min bei 37 °C inkubieren, aspirieren und 2 ml CDM hinzufügen, ergänzt mit 10 μM Y-27632 und 10 μM SB431542.
HINWEIS: Wenn Kolonien in der PSC-Passaging-Lösung abheben, bevor CDM hinzugefügt wird, kann die Inkubationszeit reduziert werden. - Heben Sie die Kolonien unter einem inversen Durchlichtmikroskop vorsichtig an, indem Sie den gebogenen Rand der gezogenen Glaspipette mit 4-facher Vergrößerung verwenden. Sobald jede Kolonie angehoben ist, geben Sie alle vorsichtig mit einer 10-ml-serologischen Pipette in eine Vertiefung der 6-Well-ULA-Platte. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede iPSC-Platte. Die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 inkubieren.
HINWEIS: Wenn die Kolonien zu groß sind oder verschmolzen sind, können sie mit der Spitze der gezogenen Glaspipette geschnitten werden, um kleinere EBs zu erzeugen.
- An Tag 2 fügen Sie FGF2 zu jeder Vertiefung auf eine Endkonzentration von 50 ng / ml hinzu.
HINWEIS: Das FGF2, das zur Kleinhirndifferenzierung verwendet wird, ist nicht hitzestabil. Dieses Protokoll wurde nicht mit hitzestabilem FGF2 getestet. - Machen Sie an Tag 7 einen 1/3 mittleren Wechsel. Für 3 ml Gesamtmedium in einem Brunnen, mit einem 1.000 μL Pipettor, saugen Sie vorsichtig 1 ml verbrauchtes Medium ab und ersetzen Sie es durch 1 ml frisches CDM. Inkubieren Sie die EBs für 7 Tage.
- Am Tag 14 saugen Sie fast das gesamte verbrauchte Medium vorsichtig mit einem 1.000 μL Pipettor ab. Um eine minimale Beschädigung der EBs zu gewährleisten, schwenken Sie die Platte, um alle EBs in der Mitte der Platte zu sammeln, neigen Sie dann die Platte und saugen Sie langsam vom Rand ab.
- Wenn die mittlere Menge abnimmt, legen Sie die Platte langsam flach und saugen Sie sie weiter ab. Lassen Sie genügend Medium, um das Austrocknen der EBs zu vermeiden. Anschließend fügen Sie 3 ml frisches CDM hinzu, ergänzt mit 10 μM Y-27632. Die EBs werden mit einer 10-ml-serologischen Pipette in eine PLO/Laminin-beschichtete Schale überführt (Schritt 1.2).
HINWEIS: Je nach nachgeschalteter Anwendung können die EBs auf eine 6-Well-PLO/Laminin-Platte oder einzelne EBs auf eine einzelne Vertiefung einer PLO/Laminin-beschichteten 24-Well-Platte oder eines Deckglases übertragen werden.
- Wenn die mittlere Menge abnimmt, legen Sie die Platte langsam flach und saugen Sie sie weiter ab. Lassen Sie genügend Medium, um das Austrocknen der EBs zu vermeiden. Anschließend fügen Sie 3 ml frisches CDM hinzu, ergänzt mit 10 μM Y-27632. Die EBs werden mit einer 10-ml-serologischen Pipette in eine PLO/Laminin-beschichtete Schale überführt (Schritt 1.2).
- Am 15. Tag saugen Sie das Medium ab und ersetzen Sie es durch frisches CDM.
HINWEIS: Es ist wichtig, den Vertiefungen genügend Medium hinzuzufügen, um genügend Medium zwischen den Fütterungen zu gewährleisten, da im Laufe der Zeit eine Verdunstung stattfindet (z. B. für eine Vertiefung in einer 6-Well-Platte 3 ml Medium hinzufügen). Wenn das Medium begonnen hat zu säuern (klar und gelb werden), aktualisieren Sie das Medium, auch wenn es bis zum Ende des Protokolls nicht auf dem Fütterungsplan steht. - Am Tag 21 saugen Sie das verbrauchte Medium ab und ersetzen Sie es durch KMG. Wechseln Sie an Tag 28 das Medium mit einem neuen KMG. Am Tag 35 ernten Sie die Zellen für weitere Anwendungen.
4. Probenvorbereitung für die RNA-Isolierung
- Das Medium wird abgesaugt und 500 μL Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung der 6-Well-Platte gegeben. Lassen Sie es für ein paar Sekunden eingeschaltet und saugen Sie es ab.
- Inkubieren Sie die Platte mit aufgesetztem Deckel bei Raumtemperatur für 2 min. Tippen Sie auf die Seiten der Platte, um die Zellen zu trennen.
- Fügen Sie 1 ml KMG hinzu (Schritt 1.8) und sammeln Sie die Zellen in einem 1,5-ml-Röhrchen.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation mit einer Tisch-Minizentrifuge (siehe Materialtabelle) für 30 s bei RT (maximale Geschwindigkeit 2000 x g), verwerfen Sie das Medium und fügen Sie 1 ml 1x PBS pH 7,4 hinzu, um das Zellpellet zu waschen.
- Pelletieren Sie die Zellen erneut mit einer Minizentrifuge für 30 s bei RT und waschen Sie sie erneut mit PBS.
- Pelletieren Sie die Zellen und entsorgen Sie das PBS. Lysieren Sie die Zellen in phenol- und guanidinisothiocyanat-enthaltendem Reagenz (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Zellen, die in phenol- und guanidinisothiocyanat-haltigem Reagenz lysiert wurden, können bei −80 °C für bis zu 1 Jahr gelagert werden. Abhängig von der RNA-Isolierungsmethode und den verwendeten Reagenzien können Zellen direkt in der Schale lysiert werden. Aufgrund der geringen Anzahl von Zellen in einer Schale führt die Isolierung von RNA mit Siliziumdioxid-Spinsäulen (siehe Materialtabelle) zu höheren RNA-Ausbeuten.
5. Vorbereitung der Zellen auf die Immunfluoreszenzfärbung
HINWEIS: Für eine 24-Well-Platte ist ein EB pro Welle ausreichend.
- Am Tag 35 saugen Sie das verbrauchte Medium ab und waschen Sie die Zellen, indem Sie 1 ml DPBS+/+ pro Vertiefung hinzufügen (für eine Vertiefung einer 24-Well-Platte).
- Das DPBS+/+ wird abgesaugt und 500 μL kaltes 4% Paraformaldehyd (PFA, siehe Materialtabelle) in DPBS+/+ pro Vertiefung hinzugefügt. Inkubieren für 20 min bei RT.
- Entfernen Sie 4% PFA und waschen Sie die Zellen zweimal mit DPBS+/+, wie in Schritt 5.1. Fügen Sie 1 ml DPBS+/+ hinzu und lagern Sie die Zellen bei 4 °C, bis die Färbung abgeschlossen ist.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Immunfluoreszenzfärbung innerhalb von 1 Woche nach der Fixierung durchzuführen, um Zellablösung und den Verlust von Antigenen zu vermeiden. Abhängig vom Antikörper und der zellulären Lage des Ziels kann die Färbung jedoch zu einem späteren Zeitpunkt bis zu 4 Wochen nach der Fixierung erfolgen.
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Representative Results
Überblick über die 3D-zu-2D-Kleinhirndifferenzierung
Kleinhirnzellen werden ausgehend von iPS-Zellen erzeugt. Abbildung 1A zeigt den gesamten Workflow und die Hinzufügung wichtiger Komponenten zur Unterscheidung. Am Tag 0 werden EBs hergestellt, indem die iPSC-Kolonien (Abbildung 1B) vorsichtig mit einer gezogenen Glaspipette aus CDM mit SB431542 und Y-27632 angehoben und in extrem niedrig befestigte Platten gelegt werden. FGF2 wird an Tag 2 hinzugefügt. An Tag 7 wird ein Drittel des Mediums gewechselt und eine EB-Bildung beobachtet (Abbildung 1C). Am Tag 14 werden vergrößerte EBs (Abbildung 1D) auf PLO/Laminin-beschichteten Schalen aus CDM mit Y-27632 plattiert. An Tag 15 wird das Medium durch CDM ohne Y-27632 ersetzt. Die Zellen beginnen von den EBs (Abbildung 1E) entlang der beschichteten Oberfläche nach außen zu wandern. An Tag 21 wird ein kompletter Medienwechsel durchgeführt und das Medium auf KMG umgestellt. Danach wird das Medium einmal wöchentlich gewechselt (oder häufiger, wenn das Medium schnell ansäuert). Am Tag 35 gibt es eine Monoschicht von Zellen mit neuronaler Morphologie und Komplexität (Abbildung 1F, G).
2D-Zellen exprimieren Kleinhirnzellmarker
Die Zellen werden am 35. Tag zur RNA-Isolierung und Immunfluoreszenzmarkierung geerntet. Die Expression von Genen, von denen bekannt ist, dass sie während der Kleinhirnentwicklung vorhanden sind, wird mittels RT-qPCR gemessen (Abbildung 2). Die Zellen exprimieren frühe Kleinhirn-Vorläufermarker wie ATOH1 12,13 (rhombische Lippe, glutamaterge Vorläufer) und PTF1α 14 (ventrikuläre Zone, GABAerge Vorläufer), sowie die Purkinje-Vorläuferzellmarker KIRREL215 und SKOR2 15. Zusätzlich zu den frühentwicklungsbedingten Kleinhirnzellmarkern wird auch die Expression von Entwicklungsgenen im späteren Entwicklungsstadium, OTX2 und SIX3, beobachtet. Die immunfluoreszierende Markierung von Zellen zeigt eine positive Färbung für die Kleinhirnmarker EN2 und PTF1α (Abbildung 3A,D), den neuronalen Marker TUBB3 (Abbildung 3G) sowie für den Proliferationsmarker Ki67 (Abbildung 3J). Die Kernfärbung mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) zeigt Zellkerne (Abbildung 3B,E,H,K). Um dieses Protokoll weiter zu validieren, wurden iPSCs von Patienten mit einer neuropsychiatrischen Störung verwendet, um Kleinhirnzellen zu erzeugen und die Markerexpression von Kleinhirnzellen am Tag 35 zu analysieren. Die RT-qPCR-Daten zeigen ein ähnliches Expressionsprofil wie die Kontroll-iPSCs (ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus ist die Expression von axonalen Leitmolekülen, die für die Kleinhirnentwicklung relevant sind, sowohl in Kontroll- als auch in Patienten-abgeleiteten Kleinhirnzellen vorhanden (ergänzende Abbildung 2).
Abbildung 1: Überblick über die Protokollzeitleiste und repräsentative Bilder. (A) Ein schematischer Umriss des Kleinhirndifferenzierungsprotokolls, der die Art des Kulturmediums, die dem Kulturmedium hinzugefügten Ergänzungen, die Tage, an denen ein Mediumwechsel erforderlich ist (gekennzeichnet durch vertikale Linien) und die Oberflächenbeschichtung der Kulturschale darstellt. (B) Repräsentative Hellfeldbilder von iPS-Zellen am Tag 0 und differenzierten Zellen, die vor der Herstellung von EBs (im roten Kreis), (C) EBs am Tag 7 und (D) Tag 14, (E) am Tag nach der Beschichtung der EBs und (F,G) reifenden Zellen am Tag 35 gereinigt werden. Maßstabsbalken (B-D): 1 mm; (E-G): 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Expression von Kleinhirnzellmarkern in 2D-Kleinhirnzellen am Tag 35. RT-qPCR-Genexpressionsergebnisse am Tag 35 für ausgewählte Gene, die verschiedene zerebelläre Entwicklungsmarker und Zelltypen repräsentieren, normalisiert auf GAPDH. Die -ΔCt-Werte stellen GAPDH-Ct-Werte dar, die von den Ziel-Ct-Werten subtrahiert werden. Werte, die näher an Null liegen, zeigen einen höheren Ausdruck an. Jeder Wert unterhalb der getickten Linie stellt einen Ausdruck unterhalb des erkennbaren Grenzwerts dar. N = 2 iPSC-Linien, die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Immunfluoreszierende Markierung von 2D-Kleinhirnzellen an Tag 35. Die Zellen werden am Tag 35 mit 4% PFA fixiert und mit DAPI nuklear gefärbt und für (A) EN2 (grün), (B) DAPI (blau), (C) EN2-DAPI immunisiert; (D) PTF1α (rot), (E) DAPI (blau), (F) PTF1α-DAPI verschmolzen; (G) TUBB3 (grün), (H) DAPI (blau), (I) TUBB3-DAPI zusammengeführt; und (J) Ki67 (rot), (K) DAPI (blau), (L) Ki67-DAPI zusammengeführt. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Abbildung 1: Repräsentative Bilder der Kleinhirndifferenzierung mit iPS-Zellen von Patienten mit Schizophrenie. (A) iPSC-Kolonien, (B) EBs an Tag 7, (C) Tag 14, (D) Zellen, die aus plattierten EBs auf der PLO/Laminin-beschichteten Schale am Tag 15 herauswachsen, und (E) Kleinhirnzellen am Tag 35. (F) RT-qPCR-Ergebnisse für die Genexpression an Tag 35 für Kleinhirnzellmarker, normalisiert auf GAPDH. Die -ΔCt-Werte stellen GAPDH-Ct-Werte dar, die von den Ziel-Ct-Werten subtrahiert werden. Werte, die näher an Null liegen, zeigen einen höheren Ausdruck an. Jeder Wert unterhalb der getickten Linie stellt einen Ausdruck unterhalb des erkennbaren Grenzwerts dar. N = 2 iPSC-Linien, die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Maßstabsbalken (A-C): 1 mm; (D,E): 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Genexpression von axonalen Leitmolekülen von 2D-Kleinhirnzellen am Tag 35. RT-qPCR-Genexpressionsergebnisse am Tag 35 für ausgewählte Moleküle, die an der Signalübertragung der Axonführung beteiligt sind, normalisiert auf GAPDH. Es ist bekannt, dass alle gezeigten Gene im Kleinhirn exprimiert werden, mit Ausnahme von PlxnB3, das im Kleinhirn während der gesamten Entwicklung eine geringe Expression aufweist. Die -ΔCt-Werte stellen GAPDH-Ct-Werte dar, die von den Ziel-Ct-Werten subtrahiert werden. Werte, die näher an Null liegen, zeigen einen höheren Ausdruck an. Jeder Wert unterhalb der getickten Linie stellt einen Ausdruck unterhalb des erkennbaren Grenzwerts dar. N (Kontrolle) = 1, N (SCZ) = 1, und der Mittelwert der in dreifacher Ausfertigung durchgeführten Experimente wird gezeigt. Abkürzung: SCZ = schizophrenia. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die Fähigkeit, die menschliche Kleinhirnentwicklung in vitro zu modellieren, ist wichtig für die Krankheitsmodellierung sowie für das Verständnis der normalen Gehirnentwicklung. Weniger komplizierte und kostengünstige Protokolle schaffen mehr Möglichkeiten für replizierbare Datengenerierung und breite Implementierung in mehreren wissenschaftlichen Labors. Ein Kleinhirndifferenzierungsprotokoll wird hier unter Verwendung einer modifizierten Methode zur Erzeugung von EBs beschrieben, die keine Enzyme oder Dissoziationsmittel erfordert, unter Verwendung von Wachstumsfaktoren, die von Muguruma et al. 4 und ein modifiziertes 2D-Monolayer-Zellwachstumsprotokoll ähnlich der Methode von Holmes et al. 5.
Das Gesamtprotokoll beginnt mit der Generierung von EBs aus iPSCs, gefolgt von der Induktion der Kleinhirndifferenzierung und schließlich der Beschichtung für die 2D-Monoschichtkultur. Während dieses Prozesses wurde zwischen den Tagen 7-14 ein signifikanter Zelltod beobachtet. Aufgrund dieses Zellverlustes wird empfohlen, mit einer großen Anzahl von EBs zu beginnen; Für eine 6-Well-Platte mit 2D-Zellen wird empfohlen, mit mindestens sechs Platten (entweder 35 mm oder 60 mm Platten) von iPSCs zu beginnen. Darüber hinaus erhöht die Zugabe von Y-27632 zum Zeitpunkt der Beschichtung von EBs auf PLO/Laminin die Bindung der EBs an das Substrat erheblich. Es ist wichtig, das Medium in den Kulturen intermittierend visuell zu überprüfen. Wenn das Medium gelb wird (ansäuernd), wird empfohlen, das Medium zu wechseln, auch wenn es nicht im Fütterungsschema enthalten ist. Die Gesamtzahl der Zellen, die sich anheften, variiert von Experiment zu Experiment, was eine häufigere oder seltenere Auffrischung der Nährstoffe im Medium erfordert.
Die RT-qPCR-Ergebnisse zeigten, dass sich die iPS-Zellen in Zellen differenzierten, die die frühen Stadien des sich entwickelnden Kleinhirns repräsentieren. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass es am Tag 35 der Differenzierung Zellen gibt, die den neuronalen Zellschicksalsmarker (TUBB3 16,17), glutamaterge und GABAerge Vorläufermarker (ATOH1 12,13 bzw. PTF1α14), Mittelhirn-Hinterhirn-Grenzmarker (EN1 18, EN2 18, GBX2 19), isthmische Organisatormarker (WNT1 18, FGF8 19), rhombische Lippenderivat-Zellmarker (PAX6 18 ) und Purkinje-Zell-Vorläufermarker (KIRREL215, SKOR220). Die Expression des rhombischen Lippenmarkers OTX221 wurde ebenfalls beobachtet. Frühere Kleinhirn-Organoid-Protokolle mit hES-Zellen haben beobachtet, dass die FGF2-Induktion zu GBX2-exprimierenden Zellen führt, aber zu sehr wenigen OTX2-positiven Zellen, während ein ähnliches Protokoll mit iPSCs eine identische mRNA-Expression von GBX2 und OTX2 in Kleinhirnorganoiden zeigte8. Von embryonalen Stammzellen (mESC) der Maus abgeleitete Kleinhirnneuronen enthalten jedoch separate OTX2- und GBX2-positive Zellcluster4, und es wurde gezeigt, dass OTX2 während der gesamten Kleinhirnentwicklung von Maus 22 und menschlichen21,23 exprimiert wird. Das differentielle Expressionsprofil von OTX2 zwischen Protokollen, die die gleichen Schicksalsspezifikationsfaktoren verwenden, könnte auf andere Unterschiede zwischen den Protokollen oder individuelle Unterschiede zwischen hESCs und iPSCs zurückzuführen sein; Dies verdient weitere Untersuchungen. Die SIX3-Expression wurde auch in der Kultur am Tag 35 beobachtet. SIX3 wird während der Entwicklung im vorderen Neuralrohr exprimiert, und seine Expression im menschlichen Kleinhirn bleibt während der gesamten Entwicklung und im Erwachsenenalter niedrig 23,24; Es wird jedoch im neonatalen und erwachsenen Kleinhirn der Maus exprimiert25. Dies deutet darauf hin, dass es eine Subpopulation von Zellen geben könnte, die sich zu einem vorderen Schicksal differenzieren, oder sie können eine Subpopulation von Kleinhirnzellen darstellen, die SIX3 während der Entwicklung exprimieren. Diese Zellen könnten weiter erforscht werden.
Differenzierungsprotokolle werden oft unter Verwendung von hES-Zellen oder iPS-Zellen von gesunden Probanden entwickelt, aber es ist wichtig zu bestätigen, dass diese Protokolle auf patientenbasierte iPS-Zellen angewendet werden können, um die molekularen und zellulären Veränderungen bei Krankheiten zu analysieren. Um unser Protokoll weiter zu testen, haben wir neben unseren Kontroll-iPSC-Linien iPSC-Linien unterschieden, die aus Fibroblasten von Patienten mit Schizophrenie umprogrammiert wurden. Die bisherige Literatur hat gezeigt, dass Patienten, bei denen Schizophrenie diagnostiziert wurde, funktionelle und anatomische Kleinhirnanomalien aufweisen26,27,28. Diese Veränderungen werden bei erwachsenen Patienten beobachtet, können aber während der Entwicklung beginnen und weitere Untersuchungen erfordern. Insgesamt wurde beobachtet, dass Kleinhirnzellen von Schizophrenie-Patienten die am Tag 35 getesteten Kleinhirnmarker exprimierten und sich morphologisch nicht von den Kleinhirnzellen unterschieden, die aus Kontroll-iPS-Zellen gewonnen wurden (ergänzende Abbildung 1). Dies deutet darauf hin, dass dieses Protokoll die menschliche Kleinhirnentwicklung im Krankheitskontext untersuchen kann. Darüber hinaus wurde auch die Expression von axonalen Leitmarkern am Tag 35 untersucht, sowohl in Kontroll- als auch in Schizophrenie-Zelllinien, da eine der Hauptkomponenten der Entwicklung die axonale Wegfindung und neuronale Konnektivität ist 29,30,31,32. Tatsächlich wurden am Tag 35 axonale Leitmoleküle nachgewiesen, die in der Kleinhirnentwicklung angezeigt sind, einschließlich Semaphorin-4C, Plexin-B2 und Neuropilin-1 (ergänzende Abbildung 2). Während der Entwicklung ist die Toxinin-B3-Expression im menschlichen Kleinhirnniedrig 23, und eine geringere Expression von Plexin-B3 wurde auch im Vergleich zu den anderen axonalen Leitmolekülen für die Differenzierungen beobachtet. Zusammen mit der Expression der Kleinhirnmarker ist dies ein starker Hinweis darauf, dass dieses Differenzierungsprotokoll Kleinhirnzellen erzeugt, die die richtigen Hinweise für die neuronale Konnektivität in dieser Struktur exprimieren.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Zelltypen, die mit diesem FGF2- und insulininduzierten Kleinhirndifferenzierungsprotokoll erzeugt wurden, nicht mittels Einzelzellanalyse identifiziert wurden. Nayler et al.8 veröffentlichten kürzlich einen Datensatz zur Einzelzell-Profilierung von Kleinhirn-Organoiden, die mit einem ähnlichen Induktionsprotokoll generiert wurden, und es wird erwartet, dass zukünftige Forschung zunehmend Einzelzellmethoden einsetzen wird, um diese Fragen zu beantworten. Die Zellen nach Tag 35 wurden auch nicht auf Expression oder Morphologie getestet. Die Expression von Kleinhirnmarkern zu späteren Zeitpunkten und wie sie sich im Laufe der Zeit verändern, wird mehr Einblicke in die Reife der Zellen geben. Es hat sich gezeigt, dass die Co-Kultivierung von Stammzell-abgeleiteten Kleinhirnzellen mit Kleinhirnzell-Zellvorläufernder Maus 4 oder menschlichen fetalen Kleinhirnschnitten33 reife Kleinhirnzellen erzeugt, insbesondere Purkinje-Neuronen, die in Kleinhirn-Organoiden oft fehlen. Insbesondere zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass Kleinhirnorganoide, die am Differenzierungstag 35 dissoziiert und für das 2D-Wachstum plattiert wurden, auch reife Kleinhirnneuronen hervorbringen, ohne dass eine Co-Kultivierung erforderlich ist7. Diese Anwendungen zielen darauf ab, die späteren Stadien der Kleinhirnentwicklung und der neuronalen Reifung im Vergleich zu diesem Protokoll zu untersuchen, das zur Untersuchung der früheren Entwicklungsstadien verwendet werden kann. Ein weiterer interessanter Vergleich könnte sich aus dem Vergleich kultivierter embryonaler Kleinhirnneuronen34 mit iPSC-abgeleiteten menschlichen Kleinhirnneuronen ergeben, was möglicherweise Unterschiede in der Entwicklung und Schicksalsspezifikation zwischen den beiden Arten hervorhebt.
Zusammenfassend kann das vorliegende Protokoll für Anwendungen verwendet werden, die in vitro 2D-Kleinhirnzellen erfordern, die aus iPS-Zellen erzeugt werden. Dieses Protokoll enthält keine komplexen Schritte oder Materialien, ist kostengünstig und kann als Modell für die frühe Kleinhirnentwicklung verwendet werden, um Genexpression, Zellmorphologie und Physiologie zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken Jenny Gringer Richards für ihre gründliche Arbeit bei der Validierung unserer Kontrollpersonen, aus der wir die Kontroll-iPSCs generiert haben. Diese Arbeit wurde unterstützt von NIH T32 MH019113 (an D.A.M. und K.A.K.), dem Nellie Ball Trust (an T.H.W. und A.J.W.), NIH R01 MH111578 (an V.A.M. und J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (an A.J.W.) und dem Roy J. Carver Charitable Trust (an V.A.M., J.A.W. und A.J.W.). Die Figuren wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90x250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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