Summary
Il presente protocollo spiega la generazione di un monostrato 2D di cellule cerebellari da cellule staminali pluripotenti indotte per studiare le prime fasi dello sviluppo cerebellare.
Abstract
Lo sviluppo preciso e tempestivo del cervelletto è fondamentale non solo per un'accurata coordinazione motoria e l'equilibrio, ma anche per la cognizione. Inoltre, l'interruzione dello sviluppo cerebellare è stata implicata in molti disturbi dello sviluppo neurologico, tra cui l'autismo, il disturbo da deficit di attenzione-iperattività (ADHD) e la schizofrenia. Le indagini sullo sviluppo cerebellare negli esseri umani sono state precedentemente possibili solo attraverso studi post-mortem o neuroimaging, ma questi metodi non sono sufficienti per comprendere i cambiamenti molecolari e cellulari che si verificano in vivo durante lo sviluppo precoce, che è quando hanno origine molti disturbi dello sviluppo neurologico. L'emergere di tecniche per generare cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) da cellule somatiche e la capacità di ridifferenziare ulteriormente le iPSC in neuroni hanno spianato la strada alla modellazione in vitro dello sviluppo precoce del cervello. Il presente studio fornisce passaggi semplificati verso la generazione di cellule cerebellari per applicazioni che richiedono una struttura monostrato 2-dimensionale (2D). Le cellule cerebellari che rappresentano le prime fasi di sviluppo sono derivate dalle iPSC umane attraverso le seguenti fasi: in primo luogo, i corpi embrioidi sono realizzati in coltura 3-dimensionale (3D), quindi sono trattati con FGF2 e insulina per promuovere la specifica del destino cerebellare e, infine, sono differenziati terminalmente come monostrato su substrati rivestiti di poli-l-ornitina (PLO) / laminina. A 35 giorni di differenziazione, le colture cellulari cerebellari derivate da iPSC esprimono marcatori cerebellari tra cui ATOH1, PTF1α, PAX6 e KIRREL2, suggerendo che questo protocollo genera precursori neuronali cerebellari glutammatergici e GABAergici, nonché progenitori delle cellule di Purkinje. Inoltre, le cellule differenziate mostrano una morfologia neuronale distinta e sono positive per marcatori di immunofluorescenza dell'identità neuronale come TUBB3. Queste cellule esprimono molecole guida assonali, tra cui semaforina-4C, plexina-B2 e neuropilina-1, e potrebbero servire come modello per studiare i meccanismi molecolari della crescita dei neuriti e della connettività sinaptica. Questo metodo genera neuroni cerebellari umani utili per applicazioni a valle, tra cui studi di espressione genica, fisiologici e morfologici che richiedono formati monostrato 2D.
Introduction
Comprendere lo sviluppo cerebellare umano e le finestre temporali critiche di questo processo è importante non solo per decodificare le possibili cause dei disturbi dello sviluppo neurologico, ma anche per identificare nuovi bersagli per l'intervento terapeutico. La modellazione dello sviluppo cerebellare umano in vitro è stata impegnativa, ma nel tempo sono emersi molti protocolli che differenziano le cellule staminali embrionali umane (hESC) o iPSC con i destini della linea cerebellare 1,2,3,4,5,6,7,8 . Inoltre, è importante sviluppare protocolli che generino risultati riproducibili, siano relativamente semplici (per ridurre l'errore) e non siano pesanti sui costi monetari.
I primi protocolli per la differenziazione cerebellare sono stati generati da colture 2D da corpi embrioidi placcati (EB), inducendo il destino cerebellare con vari fattori di crescita simili allo sviluppo in vivo, tra cui WNT, BMP e FGF 1,9. Protocolli pubblicati più recenti hanno indotto la differenziazione principalmente nella coltura di organoidi 3D con FGF2 e insulina, seguita da FGF19 e SDF1 per strutture rombiche simili a labbro3,4, o utilizzato una combinazione di FGF2, FGF4 e FGF85. Entrambi i metodi di induzione degli organoidi cerebellari hanno portato a organoidi cerebellari 3D simili poiché entrambi i protocolli hanno riportato un'espressione di marcatori cerebellari simili in punti temporali identici. Holmes e Heine hanno esteso il loro protocollo 3D5 per dimostrare che le cellule cerebellari 2D possono essere generate da hESC e iPSC, che iniziano come aggregati 3D. Inoltre, Silva et al.7 hanno dimostrato che le cellule che rappresentano i neuroni cerebellari maturi in 2D possono essere generate con un approccio simile a Holmes e Heine, utilizzando un punto temporale diverso per passare da 3D a 2D ed estendere il tempo di crescita e maturazione.
L'attuale protocollo induce il destino cerebellare nelle iPSC prive di alimentazione generando corpi embrioidi (EB) fluttuanti utilizzando insulina e FGF2 e quindi placcando gli EB su piatti rivestiti di PLO / laminina il giorno 14 per la crescita e la differenziazione 2D. Entro il giorno 35, si ottengono cellule con identità cerebellare. La capacità di ricapitolare le prime fasi dello sviluppo cerebellare, specialmente in un ambiente 2D, consente ai ricercatori di rispondere a domande specifiche che richiedono esperimenti con una struttura monostrato. Questo protocollo è anche suscettibile di ulteriori modifiche come superfici micromodellate, saggi di escrescenza assonale e ordinamento cellulare per arricchire le popolazioni cellulari desiderate.
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Protocol
La ricerca sui soggetti umani è stata approvata sotto il numero di approvazione del comitato di revisione istituzionale dell'Università dell'Iowa 201805995 e il numero di approvazione del comitato per le cellule staminali pluripotenti umane dell'Università dell'Iowa 2017-02. Le biopsie cutanee sono state ottenute dai soggetti dopo aver ottenuto il consenso informato scritto. I fibroblasti sono stati coltivati in DMEM con il 15% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di soluzione di aminoacidi non essenziali MEM a 37 °C e 5% di CO2. I fibroblasti sono stati riprogrammati utilizzando un kit di riprogrammazione episomiale seguendo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un nucleofector per l'elettroporazione. Tutte le procedure sono state eseguite in un armadio di sicurezza biologica di classe II tipo A2 ("cappuccio" in breve). Tutti i terreni di coltura cellulare erano privi di antibiotici; Pertanto, ogni componente che è entrato nel cofano è stato pulito con etanolo al 70%. Tutti i terreni e i componenti di coltura cellulare sono stati filtrati sterili o aperti nel cappuccio per mantenere la loro sterilità.
1. Preparazione sperimentale
- Preparare piastre rivestite con matrice di membrana basale (BMM).
NOTA: BMM si solidifica più rapidamente a temperature più calde. Le piastre devono essere preparate rapidamente e immediatamente poste a 4 °C per la conservazione.- Scongelare il BMM (vedi tabella dei materiali) su ghiaccio, a 4 °C per almeno 2 ore, o durante la notte.
- Miscelare DMEM/F12 e BMM fino ad una concentrazione finale di 80 μg/ml. Distribuire la soluzione di BMM in piastre di coltura tissutale (1 mL per piatti da 35 mm e 2 mL per piatti da 60 mm) e incubare a 37 °C per almeno 1 ora o per una notte prima di placcare le cellule.
NOTA: Le stoviglie non utilizzate possono essere conservate a 4 °C per 2 settimane.
- Preparare poli-L-ornitina / laminina (PLO / laminina)-piastre rivestite.
- Preparare 20 μg/mL di PLO (vedi Tabella dei materiali) in DPBS+/+ sterile e aggiungere 1 mL a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare per una notte a 37 °C nell'incubatore.
- Il giorno seguente, aspirare l'OLP con un aspiratore a vuoto e lavare due volte con DPBS+/+. Asciugare all'aria nel cofano.
NOTA: Le piastre essiccate all'aria possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane, avvolte in un foglio di alluminio, per un uso futuro. - Preparare 10 μg/mL di laminina (vedere Tabella dei materiali) in DPBS+/+ e aggiungere 1 mL a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare almeno per 3 ore o per una notte a 37 °C nell'incubatore.
- Aspirare la laminina con un aspiratore a vuoto e aggiungere 1 mL di DPBS+/+ medio o sterile.
NOTA: Il rivestimento in lamina non deve asciugarsi. PBS o un terreno di coltura appropriato dovrebbe essere aggiunto immediatamente per evitare che ciò accada. Le piastre rivestite possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare la soluzione di passaggio PSC.
NOTA: è necessario un osmometro (vedere la tabella dei materiali) per effettuare la soluzione di passaggio PSC10.- Sciogliere 11,49 g di cloruro di potassio (KCl) e 0,147 g di citrato di sodio diidrato (HOC(COONa)(CH 2 COONa)2*2H2O) in 400 mL di acqua per coltura cellulare sterile (vedere Tabella dei materiali).
- Misurare il volume della soluzione e registrarlo come volume iniziale (Vi).
- Misurare l'osmolarità e regolarla a 570 mOsm aggiungendo acqua di coltura cellulare sterile usando la formula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
- Filtrare-sterilizzare la soluzione con un filtro da 0,20 μm e fare 10 ml di aliquote. Conservare le aliquote a temperatura ambiente (RT) per un massimo di 6 mesi.
- Preparare il terreno di coltura con cellule staminali pluripotenti (PSC).
NOTA: le iPSC sono mantenute in un mezzo contenente FGF2 termostabile (vedere la tabella dei materiali), fornendo un programma di alimentazione senza fine settimana. Altri supporti PSC disponibili in commercio non sono stati provati per questo protocollo.- Scongelare il PSC medio per una notte a 4 °C.
- Aggiungere 10 mL di PSC medium supplemento a 500 mL di PSC terreno basale. Produrre 25 mL di aliquote e conservare a -20 °C.
NOTA: Le aliquote congelate possono essere conservate a -20 °C per 6 mesi. Le aliquote scongelate devono essere conservate a 4 °C e utilizzate entro 2 settimane. Le cellule possono essere congelate per la conservazione a lungo termine in un mezzo PSC con il 10% (v / v) di dimetilsolfossido (DMSO).
- Preparare il mezzo di scongelamento PSC.
- Integrare PSC mezzo con 50 nM di cromo, 1,5 μM di emricasan, 1x integratore di poliammina e 0,7 μM trans-ISRIB (cocktail CEPT11) (vedere Tabella dei materiali).
- Filtrare-sterilizzare con un filtro da 0,20 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 4 settimane.
- Preparare pipette di vetro tirato.
- Tirare pipette Pasteur di vetro da 22,9 cm (9 pollici) in due pezzi sopra un bruciatore Bunsen, ~ 2 cm sotto il collo, creando due pipette, con il lato più sottile ~ 4 cm più corto dell'altro.
- Con l'aiuto della fiamma, piegare le punte del lato tirato per creare una "r" liscia.
- Posizionare le pipette tirate in manicotti di autoclave e autoclave per la sterilizzazione.
- Preparare il mezzo di differenziazione cerebellare (CDM).
- Mescolare IMDM e la miscela di nutrienti F12 di Ham in un rapporto 1: 1. Integrare la miscela con 1x integratore di L-alanina-L-glutammina, concentrato lipidico chimicamente definito all'1% (v/v), 0,45 mM di 1-tio-glicerolo, 15 μL/mL di apotransferrina, 5 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) e 7 μg/ml di insulina (vedere Tabella dei materiali).
- Filtrare-sterilizzare con un filtro da 0,20 μm, conservare a 4 °C e utilizzare entro 1 mese.
- Preparare il mezzo di maturazione cerebellare (CMM).
- Integrare il mezzo neurobasale con 1x integratore di L-alanina-L-glutammina e 1x integratore N-2 (vedi Tabella dei materiali).
- Filtrare-sterilizzare con un filtro da 0,20 μm, conservare a 4 °C e utilizzare entro 2 settimane.
2. Coltura iPSC senza alimentatore
- Scongelare le celle seguendo i passaggi seguenti.
- Posizionare una piastra BMM (fase 1.1) nell'incubatore a 37 °C per gelificare per almeno 1 ora o durante la notte prima di scongelare le cellule.
- Preriscaldare 10 mL di mezzo di scongelamento PSC (fase 1.5) a 37 °C.
- Trasferire il crioviale con cellule da azoto liquido a bagnomaria a 37 °C.
NOTA: Per evitare di generare una fonte di contaminazione nello spazio della coltura cellulare, non è consigliabile utilizzare un bagno d'acqua standard. Invece, l'acqua dolce può essere riscaldata in un piccolo becher a 37 ° C per generare un bagno d'acqua monouso. - Quando rimane un piccolo pezzo di ghiaccio nel tubo, rimuoverlo dal bagnomaria, asciugare il tubo e spruzzare con etanolo al 70%. Trasferire il tubo sulla cappa e utilizzare una pipetta sierologica da 2 mL o 5 mL (vedere Tabella dei materiali) per trasferire delicatamente le cellule in un tubo conico da 15 ml.
- Aggiungere 8 ml di mezzo di scongelamento PSC alle cellule nel senso della goccia mentre si ruota il tubo conico. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT.
- Aspirare con attenzione il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere le cellule in 2 ml di mezzo di scongelamento PSC.
- Aspirare il BMM dalla piastra e aggiungere le celle risospese a goccia su tutta la piastra per una distribuzione uniforme.
- Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2. Aggiornare il mezzo il giorno successivo con PSC medium. Successivamente, cambia il mezzo ogni giorno.
- Mantenere le celle seguendo i passaggi seguenti.
- Preriscaldare il volume necessario di mezzo PSC a 37 °C (ad esempio, 1 mL di terreno per piastra da 35 mm).
- Studiare le piastre per cellule o colonie differenziate e rimuovere le cellule differenziate con una pipetta di vetro tirato (punto 1.6).
NOTA: le colonie iPSC hanno bordi lisci con celle morfologicamente identiche. - Cambiare il mezzo speso ogni giorno e passare ogni 3-4 giorni o quando viene raggiunta la confluenza del 70%.
- Passare le celle.
- Posizionare la quantità necessaria di piastre BMM nell'incubatore per almeno 1 ora o durante la notte prima di passare. Preriscaldare la quantità necessaria di PSC (fase 1.3) a 37 °C.
- Utilizzando una pipetta di vetro tirato, pulire eventuali cellule o colonie differenziate.
- Aspirare il mezzo esaurito con un aspiratore a vuoto e aggiungere il mezzo di dissociazione PSC, 1 mL per piatto da 35 mm. Incubare a 37 °C per 1-3 min.
NOTA: Se le colonie si sollevano nella soluzione di passaggio PSC prima di aggiungere il mezzo PSC, il tempo di incubazione può essere ridotto. - Aspirare la soluzione di passaggio PSC e aggiungere il mezzo PSC preriscaldato.
- Utilizzando una punta sterile per pipetta da 200 μL, graffiare le linee parallele tra loro in una direzione, ruotare la piastra di 90° e creare una seconda serie di linee di graffio perpendicolari alle precedenti (creando un motivo a tratteggio incrociato attraverso la piastra).
- Aspirare la soluzione BMM dalle piastre di fissaggio. Raccogliere le colonie utilizzando una pipetta sierologica e distribuirle su nuove piastre BMM.
- Incubare a 37 °C, 5% CO2. Cambia il mezzo ogni giorno.
- Congelare le celle.
- Preparare i crioviali etichettando il contenuto e sterilizzare sotto la luce ultravioletta (UV) nel cappuccio (vedi Tabella dei materiali) per 30 minuti.
- Preparare il mezzo di congelamento PSC integrando il mezzo PSC con DMSO al 10% (v/v). Seguire i passaggi 2.3.2-2.3.5.
- Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL con una pipetta sierologica da 5 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT.
- Aspirare con cautela il mezzo e risospendere il pellet cellulare nel mezzo di congelamento PSC.
- Distribuire in crioviali. Introdurre i flaconcini in un contenitore di congelamento e porre il contenitore in un congelatore a -80 °C.
- Il giorno seguente, trasferire i crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
3. Differenziazione cerebellare
NOTA: Prima di iniziare la differenziazione, le iPSC vengono passate a sei piatti da 35 mm e sono pronte per la differenziazione quando sono al 70% di confluenza. Ogni piastra da 35 mm verrà trasferita in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
- Il giorno 0, sollevare le colonie di iPSC sane per la formazione di EB.
- Aggiungere 1 mL di CDM (fase 1.7) integrato con 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542 (vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa (ULA) a 6 pozzetti e collocarli nell'incubatore fino a quando le colonie sollevate sono pronte per essere aggiunte ai pozzetti.
- Pulire le celle differenziate utilizzando una pipetta di vetro tirato. Aspirare il mezzo e aggiungere 1 mL di soluzione di passaggio PSC per ogni piatto da 35 mm. Incubare per 3 minuti a 37 °C, aspirare e aggiungere 2 mL di CDM integrato con 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542.
NOTA: Se le colonie si sollevano nella soluzione di passaggio PSC prima di aggiungere CDM, il tempo di incubazione può essere ridotto. - Sotto un microscopio invertito a luce trasmessa, sollevare delicatamente le colonie usando il bordo piegato della pipetta di vetro tirata usando un ingrandimento 4x. Una volta sollevata ogni colonia, trasferire delicatamente tutto in un pozzetto della piastra ULA a 6 pozzetti utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Ripetere questa procedura per ogni piastra iPSC. Incubare le cellule a 37 °C con il 5% di CO2.
NOTA: Se le colonie sono troppo grandi o sono unite, possono essere tagliate con la punta della pipetta di vetro tirata per creare EB più piccoli.
- Il giorno 2, aggiungere FGF2 a ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di 50 ng / ml.
NOTA: L'FGF2 utilizzato per la differenziazione cerebellare non è termostabile. Questo protocollo non è stato testato con FGF2 termostabile. - Il giorno 7, fai un cambio medio di 1/3. Per 3 ml di terreno totale in un pozzetto, con un pipettatore da 1.000 μL, aspirare delicatamente 1 mL di mezzo esaurito e sostituirlo con 1 mL di CDM fresco. Incubare gli EB per 7 giorni.
- Il giorno 14, aspirare delicatamente quasi tutto il mezzo esaurito utilizzando un pipettatore da 1.000 μL. Per garantire un danno minimo agli EB, ruotare la piastra per raccogliere tutti gli EB al centro della piastra, quindi inclinare la piastra e aspirare lentamente dal bordo.
- Man mano che la quantità media diminuisce, appoggiare lentamente la piastra piatta e continuare ad aspirare. Lasciare abbastanza mezzo per evitare di asciugare gli EB. Successivamente, aggiungere 3 ml di CDM fresco integrato con 10 μM Y-27632. Trasferire gli EB utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL su un piatto rivestito di OLP/laminina (punto 1.2).
NOTA: A seconda dell'applicazione a valle, gli EB possono essere trasferiti su una piastra PLO/laminina a 6 pozzetti o singoli EB possono essere trasferiti in un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti rivestita di PLO / laminina o di un coprifoglio.
- Man mano che la quantità media diminuisce, appoggiare lentamente la piastra piatta e continuare ad aspirare. Lasciare abbastanza mezzo per evitare di asciugare gli EB. Successivamente, aggiungere 3 ml di CDM fresco integrato con 10 μM Y-27632. Trasferire gli EB utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL su un piatto rivestito di OLP/laminina (punto 1.2).
- Il giorno 15, aspirare il mezzo e sostituirlo con CDM fresco.
NOTA: È importante aggiungere abbastanza terreno ai pozzetti per garantire un mezzo sufficiente tra un'alimentazione e l'altra poiché, nel tempo, ci sarà evaporazione (ad esempio, per un pozzo in una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 3 ml di mezzo). Se il terreno ha iniziato ad acidificarsi (diventa chiaro e giallo), rinfrescare il terreno anche se non è nel programma di alimentazione fino alla fine del protocollo. - Il giorno 21, aspirare il mezzo esaurito e sostituirlo con CMM. Il giorno 28, sostituisci il mezzo con una nuova CMM. Il giorno 35, raccogliere le celle per ulteriori applicazioni.
4. Preparazione del campione per l'isolamento dell'RNA
- Aspirare il mezzo e aggiungere 500 μL di reagente di dissociazione cellulare (vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Lasciare agire per un paio di secondi e aspirare.
- Incubare la piastra, con il coperchio, a temperatura ambiente per 2 min. Picchiettare i lati della piastra per staccare le celle.
- Aggiungere 1 mL di CMM (fase 1.8) e raccogliere le celle in una provetta da 1,5 mL.
- Pellettare le celle mediante centrifugazione utilizzando una mini centrifuga da banco (vedi tabella dei materiali) per 30 s a RT (velocità massima 2000 x g), scartare il mezzo e aggiungere 1 mL di 1x PBS pH 7,4 per lavare il pellet cellulare.
- Pellettare nuovamente le celle utilizzando una mini centrifuga da banco per 30 secondi a RT e lavare nuovamente con PBS.
- Pellet le cellule e scartare il PBS. Lisare le cellule nel reagente contenente fenolo e guanidina isotiocianato (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: Le cellule lisate in fenolo e isotiocianato contenente reattivo possono essere conservate a -80 °C fino a 1 anno. Le cellule possono essere lisate direttamente nel piatto a seconda del metodo di isolamento dell'RNA e dei reagenti utilizzati. A causa del basso numero di cellule in un piatto, isolare l'RNA usando colonne di spin di silice (vedi Tabella dei materiali) si tradurrà in rese più elevate di RNA.
5. Preparazione delle cellule per la colorazione immunofluorescente
NOTA: Per una piastra a 24 pozzetti, è sufficiente un EB per pozzetto.
- Il giorno 35, aspirare il mezzo esaurito e lavare le celle aggiungendo 1 ml di DPBS +/+ per pozzetto (per un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti).
- Aspirare il DPBS+/+ e aggiungere 500 μL di paraformaldeide fredda al 4% (PFA, vedi Tabella dei materiali) preparata in DPBS+/+ per pozzetto. Incubare per 20 minuti a RT.
- Rimuovere il 4% di PFA e lavare le celle due volte con DPBS+/+, come al punto 5.1. Aggiungere 1 mL di DPBS+/+ e conservare le celle a 4 °C fino al termine della colorazione.
NOTA: Si consiglia di eseguire la colorazione immunofluorescente entro 1 settimana dalla fissazione per evitare il distacco cellulare e la perdita di antigeni. Tuttavia, a seconda dell'anticorpo e della posizione cellulare del bersaglio, la colorazione può essere eseguita in momenti successivi fino a 4 settimane dopo la fissazione.
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Representative Results
Panoramica della differenziazione cerebellare da 3D a 2D
Le cellule cerebellari sono generate a partire da iPSC. La Figura 1A mostra il flusso di lavoro complessivo e l'aggiunta di componenti principali per la differenziazione. Il giorno 0, gli EB vengono realizzati sollevando delicatamente le colonie iPSC (Figura 1B) utilizzando una pipetta di vetro tirata in CDM contenente SB431542 e Y-27632 e posizionati in piastre di fissaggio ultra-basse. FGF2 viene aggiunto il giorno 2. Il giorno 7, un terzo del terreno viene modificato e si osserva la formazione di EB (Figura 1C). Il giorno 14, gli EB ingranditi (Figura 1D) sono placcati su piatti rivestiti di PLO / laminina in CDM integrato con Y-27632. Il giorno 15, il mezzo viene sostituito con CDM senza Y-27632. Le cellule iniziano a migrare verso l'esterno dagli EB (Figura 1E) lungo la superficie rivestita. Il giorno 21, viene eseguita una modifica completa del fluido e il mezzo viene commutato in CMM. Successivamente, il mezzo viene cambiato una volta alla settimana (o più frequentemente se il terreno si acidifica rapidamente). Al giorno 35, c'è un monostrato di cellule con morfologia e complessità simili a quelle neuronali (Figura 1F,G).
Le cellule 2D esprimono marcatori cellulari cerebellari
Le cellule vengono raccolte il giorno 35 per l'isolamento dell'RNA e la marcatura immunofluorescente. L'espressione di geni noti per essere presenti durante lo sviluppo cerebellare è misurata mediante RT-qPCR (Figura 2). Le cellule esprimono marcatori progenitori cerebellari precoci come ATOH1 12,13 (labbro rombico, progenitori glutammatergici) e PTF1α14 (zona ventricolare, progenitori GABAergici), così come i marcatori cellulari progenitori di Purkinje KIRREL2 15 e SKOR2 15. Oltre ai marcatori delle cellule cerebellari dello sviluppo precoce, si osserva anche l'espressione di geni di sviluppo in fase avanzata, OTX2 e SIX3. La marcatura immunofluorescente delle cellule mostra una colorazione positiva per i marcatori cerebellari EN2 e PTF1α (Figura 3A,D), il marcatore neuronale TUBB3 (Figura 3G), così come per il marcatore di proliferazione Ki67 (Figura 3J). La colorazione nucleare con 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) mostra nuclei cellulari (Figura 3B,E,H,K). Per convalidare ulteriormente questo protocollo, sono state utilizzate iPSC derivate da pazienti con un disturbo neuropsichiatrico per generare cellule cerebellari e analizzare l'espressione dei marcatori delle cellule cerebellari al giorno 35. I dati RT-qPCR indicano un profilo di espressione simile a quello delle iPSC di controllo (Figura supplementare 1). Inoltre, l'espressione di molecole guida assonale rilevanti per lo sviluppo cerebellare è presente sia nelle cellule cerebellari di controllo che in quelle derivate dal paziente (Figura supplementare 2).
Figura 1: Panoramica della sequenza temporale del protocollo e immagini rappresentative. (A) Uno schema del protocollo di differenziazione cerebellare che raffigura il tipo di terreno di coltura, gli integratori aggiunti al terreno di coltura, i giorni in cui è richiesto un cambiamento del terreno (indicato con linee verticali) e il rivestimento superficiale del piatto di coltura. (B) Immagini rappresentative in campo luminoso delle iPSC il giorno 0 e delle cellule differenziate che saranno ripulite prima di produrre EB (mostrate in cerchio rosso), (C) EB il giorno 7 e (D) giorno 14, (E) il giorno dopo la placcatura delle EB e (F,G) cellule in maturazione il giorno 35. Barra scala (B-D): 1 mm; (E-G): 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Espressione di marcatori di cellule cerebellari in cellule cerebellari 2D al giorno 35. Risultati dell'espressione genica RT-qPCR al giorno 35 per geni selezionati che rappresentano diversi marcatori di sviluppo cerebellare e tipi di cellule, normalizzati a GAPDH. I valori -ΔCt rappresentano i valori GAPDH-Ct sottratti dai valori target-Ct; Valori più vicini allo zero indicano un'espressione più elevata. Qualsiasi valore al di sotto della linea selezionata rappresenta un'espressione al di sotto del limite rilevabile. N = 2 linee iPSC, i dati sono presentati come media ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Marcatura immunofluorescente di cellule cerebellari 2D al giorno 35. Le cellule sono fissate con PFA al 4% al giorno 35 e sono colorate con DAPI e immunomarcate per (A) EN2 (verde), (B) DAPI (blu), (C) EN2-DAPI fuso; (D) PTF1α (rosso), (E) DAPI (blu), (F) PTF1α-DAPI fuso; (G) TUBB3 (verde), (H) DAPI (blu), (I) TUBB3-DAPI fuso; e (J) Ki67 (rosso), (K) DAPI (blu), (L) Ki67-DAPI fuso. Barre di scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare 1: Immagini rappresentative della differenziazione cerebellare mediante iPSC derivate da pazienti con diagnosi di schizofrenia. (A) colonie di iPSC, (B) EB il giorno 7, (C) giorno 14, (D) cellule che crescono da EB placcati sul piatto rivestito di PLO / laminina il giorno 15 e (E) cellule cerebellari il giorno 35. (F) Risultati RT-qPCR per l'espressione genica al giorno 35 per i marcatori delle cellule cerebellari, normalizzati a GAPDH. I valori -ΔCt rappresentano i valori GAPDH-Ct sottratti dai valori target-Ct; Valori più vicini allo zero indicano un'espressione più elevata. Qualsiasi valore al di sotto della linea selezionata rappresenta un'espressione al di sotto del limite rilevabile. N = 2 linee iPSC, i dati sono presentati come media ± SD. Barra di scala (A-C): 1 mm; (D,E): 500 μm. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Espressione genica delle molecole guida assonale delle cellule cerebellari 2D al giorno 35. Risultati dell'espressione genica RT-qPCR al giorno 35 per molecole selezionate coinvolte nella segnalazione della guida degli assoni, normalizzati a GAPDH. Tutti i geni mostrati sono noti per essere espressi nel cervelletto ad eccezione di PlxnB3, che ha una bassa espressione nel cervelletto durante lo sviluppo. I valori -ΔCt rappresentano i valori GAPDH-Ct sottratti dai valori target-Ct; Valori più vicini allo zero indicano un'espressione più elevata. Qualsiasi valore al di sotto della linea selezionata rappresenta un'espressione al di sotto del limite rilevabile. N (controllo) = 1, N (SCZ) = 1, e viene mostrata la media degli esperimenti eseguiti in triplice copia. Abbreviazione: SCZ = schizofrenia. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
La capacità di modellare lo sviluppo cerebellare umano in vitro è importante per la modellazione della malattia e per promuovere la comprensione del normale sviluppo del cervello. Protocolli meno complicati ed economici creano maggiori opportunità per la generazione di dati replicabili e un'ampia implementazione in più laboratori scientifici. Un protocollo di differenziazione cerebellare è descritto qui utilizzando un metodo modificato di generazione di EB che non richiede enzimi o agenti di dissociazione, utilizzando fattori di crescita riportati da Muguruma et al. 4 e un protocollo di crescita cellulare monostrato 2D modificato simile al metodo di Holmes et al. 5.
Il protocollo generale inizia generando EB da iPSC, seguito dall'induzione della differenziazione cerebellare e, infine, dalla placcatura per la coltura monostrato 2D. Durante questo processo, è stata osservata una quantità significativa di morte cellulare tra i giorni 7-14. A causa di questa perdita di cellule, si consiglia di iniziare con un gran numero di EB; per una piastra a 6 pozzetti di celle 2D, si consiglia di iniziare con un minimo di sei piastre (piastre da 35 mm o 60 mm) di iPSC. Inoltre, l'aggiunta di Y-27632 al momento della placcatura degli EB su PLO/laminina aumenta significativamente l'attaccamento degli EB al substrato. È importante controllare visivamente il mezzo nelle culture in modo intermittente. Se il mezzo sta diventando giallo (acidificante), si consiglia di cambiare il mezzo anche se non è nello schema di alimentazione. Il numero totale di cellule che si attaccano varierà da esperimento a esperimento, richiedendo un aggiornamento più frequente o meno frequente dei nutrienti nel mezzo.
I risultati di RT-qPCR hanno rivelato che le iPSC si sono differenziate in cellule che rappresentano le prime fasi del cervelletto in via di sviluppo. I dati attuali suggeriscono che, al giorno 35 del differenziamento, ci sono cellule che esprimono il marcatore del destino delle cellule neuronali (TUBB3 16,17), marcatori progenitori glutammatergici e GABAergici (ATOH1 12,13 e PTF1α 14, rispettivamente), marcatori di confine mesencefalo-posteriore (EN1 18, EN2 18, GBX2 19), marcatori di organizzatore istmico (WNT1 18, FGF819), marcatori di cellule derivate del labbro rombico (PAX6 18 ) e marcatori progenitori delle cellule di Purkinje (KIRREL215, SKOR220). È stata osservata anche l'espressione del marcatore rombico del labbro OTX221. Precedenti protocolli di organoidi cerebellari che utilizzano hESC hanno osservato che l'induzione di FGF2 provoca cellule che esprimono GBX2 ma pochissime cellule OTX2 positive, mentre un protocollo simile che utilizza iPSC ha mostrato un'espressione identica di mRNA di GBX2 e OTX2 negli organoidi cerebellari8. Tuttavia, i neuroni cerebellari derivati dalle cellule staminali embrionali di topo (mESC) contengono cluster separati di cellule OTX2 e GBX2 positive4, ed è stato dimostrato che OTX2 è espresso in tutto lo sviluppo cerebellare del topo 22 e dell'uomo21,23. Il profilo di espressione differenziale di OTX2 tra protocolli che utilizzano gli stessi fattori di specifica del destino potrebbe essere dovuto ad altre differenze tra i protocolli o differenze individuali tra hESC e iPSC; Ciò merita ulteriori indagini. L'espressione di SIX3 è stata osservata anche nella coltura il giorno 35. SIX3 è espresso nel tubo neurale anteriore durante lo sviluppo e la sua espressione nel cervelletto umano rimane bassa durante lo sviluppo e l'età adulta23,24; Tuttavia, è espresso nel cervelletto del topo neonatale e adulto25. Ciò suggerisce che potrebbe esserci una sottopopolazione di cellule che si differenziano verso un destino anteriore, o potrebbero rappresentare una sottopopolazione di cellule cerebellari che esprimono SIX3 durante lo sviluppo. Queste cellule potrebbero essere ulteriormente esplorate.
I protocolli di differenziazione sono spesso sviluppati utilizzando hESC o iPSC da soggetti sani, ma è importante confermare che questi protocolli possono essere applicati alle iPSC derivate dal paziente per sezionare i cambiamenti molecolari e cellulari nella malattia. Per testare ulteriormente il nostro protocollo, insieme alle nostre linee iPSC di controllo, abbiamo differenziato le linee iPSC che sono state riprogrammate da fibroblasti ottenuti da pazienti con diagnosi di schizofrenia. La letteratura precedente ha dimostrato che i pazienti con diagnosi di schizofrenia presentano anomalie cerebrali funzionali e anatomiche26,27,28. Questi cambiamenti sono osservati nei pazienti adulti, ma possono iniziare durante lo sviluppo e richiedere ulteriori indagini. Nel complesso, è stato osservato che le cellule cerebellari di pazienti schizofrenici esprimevano i marcatori cerebellari testati al giorno 35 e morfologicamente non erano diverse dalle cellule cerebellari derivate da iPSC di controllo (Figura supplementare 1). Ciò suggerisce che questo protocollo può studiare lo sviluppo cerebellare umano nel contesto della malattia. Inoltre, è stata esaminata anche l'espressione dei marcatori di guida assonale al giorno 35, sia nelle linee cellulari di controllo che in quelle di schizofrenia, poiché una delle principali componenti dello sviluppo è il pathfinding assonale e la connettività neuronale 29,30,31,32. Infatti, il giorno 35, sono state verificate molecole guida assonale indicate nello sviluppo cerebellare, tra cui semaforina-4C, plexina-B2 e neuropilina-1 (Figura supplementare 2). Durante lo sviluppo, l'espressione della plexina-B3 è bassa nel cervelletto umano23, ed è stata osservata anche un'espressione inferiore di plexina-B3 rispetto alle altre molecole guida assonale per le differenziazioni. Insieme all'espressione dei marcatori cerebellari, questa è una forte indicazione che questo protocollo di differenziazione genera cellule cerebellari che esprimono i segnali corretti per la connettività neuronale in quella struttura.
È importante notare che i tipi di cellule generati utilizzando questo FGF2 e il protocollo di differenziazione cerebellare indotta dall'insulina non sono stati identificati tramite analisi a singola cellula. Nayler et al.8 hanno recentemente pubblicato un set di dati sulla profilazione a singola cellula di organoidi cerebellari generati utilizzando un protocollo di induzione simile, e si prevede che la ricerca futura impiegherà sempre più metodi a singola cellula per affrontare queste domande. Anche le cellule oltre il giorno 35 non sono state testate per l'espressione o la morfologia. L'espressione dei marcatori cerebellari in punti temporali successivi e come cambiano nel tempo fornirà maggiori informazioni sulla maturità delle cellule. È stato dimostrato che la co-coltura di cellule cerebellari derivate da cellule staminali con precursori di cellule cerebellari di topo4 o fette cerebellari fetali umane33 genera cellule cerebellari mature, in particolare i neuroni di Purkinje, che sono spesso assenti negli organoidi cerebellari. In particolare, uno studio recente ha dimostrato che gli organoidi cerebellari dissociati al giorno 35 di differenziazione e placcati per la crescita 2D danno anche origine a neuroni cerebellari maturi senza bisogno di co-coltura7. Queste applicazioni mirano a studiare le fasi successive dello sviluppo cerebellare e della maturazione neurale rispetto a questo protocollo, che può essere utilizzato per studiare le prime fasi dello sviluppo. Un altro confronto interessante potrebbe derivare dal confronto tra i neuroni cerebellari embrionali di topo in coltura34 e i neuroni cerebellari umani derivati da iPSC, evidenziando potenzialmente le differenze nello sviluppo e nelle specifiche del destino tra le due specie.
In sintesi, il presente protocollo può essere utilizzato per applicazioni che richiedono cellule cerebellari 2D in vitro generate da iPSC. Questo protocollo non include passaggi o materiali complessi, è efficiente in termini di costi e può essere utilizzato come modello per lo sviluppo cerebellare precoce per studiare l'espressione genica, la morfologia cellulare e la fisiologia.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo Jenny Gringer Richards per il suo accurato lavoro nella convalida dei nostri soggetti di controllo, da cui abbiamo generato le iPSC di controllo. Questo lavoro è stato supportato da NIH T32 MH019113 (a D.A.M. e K.A.K.), dal Nellie Ball Trust (da T.H.W. e A.J.W.), NIH R01 MH111578 (da V.A.M. e J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (a A.J.W.), e dal Roy J. Carver Charitable Trust (a V.A.M., J.A.W. e A.J.W.). Le figure sono state create con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90x250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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