Summary
O presente protocolo explica a geração de uma monocamada 2D de células cerebelares a partir de células-tronco pluripotentes induzidas para investigar os estágios iniciais do desenvolvimento cerebelar.
Abstract
O desenvolvimento preciso e oportuno do cerebelo é crucial não só para a coordenação motora precisa e equilíbrio, mas também para a cognição. Além disso, a interrupção no desenvolvimento cerebelar tem sido implicada em muitos distúrbios do neurodesenvolvimento, incluindo autismo, transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) e esquizofrenia. Investigações do desenvolvimento cerebelar em humanos anteriormente só foram possíveis através de estudos post-mortem ou neuroimagem, mas esses métodos não são suficientes para entender as mudanças moleculares e celulares que ocorrem in vivo durante o desenvolvimento inicial, que é quando muitos distúrbios do neurodesenvolvimento se originam. O surgimento de técnicas para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) a partir de células somáticas e a capacidade de rediferenciar ainda mais as iPSCs em neurônios abriram o caminho para a modelagem in vitro do desenvolvimento cerebral inicial. O presente estudo fornece passos simplificados para a geração de células cerebelares para aplicações que requerem uma estrutura monocamada 2-dimensional (2D). As células cerebelares que representam os estágios iniciais de desenvolvimento são derivadas de iPSCs humanas através das seguintes etapas: primeiro, os corpos embrionários são feitos em cultura tridimensional (3D), depois são tratados com FGF2 e insulina para promover a especificação do destino cerebelar e, finalmente, são terminalmente diferenciados como uma monocamada em substratos revestidos de poli-l-ornitina (PLO) / laminina. Aos 35 dias de diferenciação, as culturas de células cerebelares derivadas de iPSC expressam marcadores cerebelares, incluindo ATOH1, PTF1α, PAX6 e KIRREL2, sugerindo que esse protocolo gera precursores neuronais cerebelares glutamatérgicos e GABAérgicos, bem como progenitores de células de Purkinje. Além disso, as células diferenciadas apresentam morfologia neuronal distinta e são positivas para marcadores de imunofluorescência de identidade neuronal, como o TUBB3. Essas células expressam moléculas de orientação axonal, incluindo semaforina-4C, plexina-B2 e neuropilina-1, e poderiam servir de modelo para investigar os mecanismos moleculares de crescimento de neuritos e conectividade sináptica. Este método gera neurônios cerebelares humanos úteis para aplicações a jusante, incluindo expressão gênica, estudos fisiológicos e morfológicos que exigem formatos de monocamada 2D.
Introduction
Compreender o desenvolvimento cerebelar humano e as janelas de tempo críticas desse processo é importante não apenas para decodificar as possíveis causas dos distúrbios do neurodesenvolvimento, mas também para identificar novos alvos para a intervenção terapêutica. Modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro tem sido um desafio, mas ao longo do tempo, muitos protocolos diferenciando células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou iPSCs com destinos de linhagem cerebelar surgiram 1,2,3,4,5,6,7,8 . Além disso, é importante desenvolver protocolos que gerem resultados reprodutíveis, sejam relativamente simples (para reduzir o erro) e não sejam pesados em custos monetários.
Os primeiros protocolos de diferenciação cerebelar foram gerados a partir de culturas 2D de corpos embrionários banhados (EBs), induzindo o destino cerebelar com vários fatores de crescimento semelhantes ao desenvolvimento in vivo, incluindo WNT, BMPs e FGFs 1,9. Protocolos publicados mais recentemente induziram diferenciação principalmente em cultura organoide 3D com FGF2 e insulina, seguidos por FGF19 e SDF1 para estruturas rômbicas semelhantes a lábios3,4, ou usaram uma combinação de FGF2, FGF4 e FGF85. Ambos os métodos de indução de organoides cerebelares resultaram em organoides cerebelares 3D semelhantes, pois ambos os protocolos relataram expressão de marcadores cerebelares semelhantes em pontos de tempo idênticos. Holmes e Heine estenderam seu protocolo 3D5 para mostrar que as células cerebelares 2D podem ser geradas a partir de hESCs e iPSCs, que começam como agregados 3D. Além disso, Silva et al.7 demonstraram que células que representam neurônios cerebelares maduros em 2D podem ser geradas com uma abordagem semelhante a Holmes e Heine, usando um ponto de tempo diferente para mudar de 3D para 2D e estendendo o tempo de crescimento e maturação.
O protocolo atual induz o destino cerebelar em iPSCs livres de alimentadores, gerando corpos embrionários (EBs) flutuantes livres usando insulina e FGF2 e, em seguida, chapeando os EBs em pratos revestidos de OLP / laminina no dia 14 para crescimento e diferenciação 2D. No dia 35, as células com identidade cerebelar são obtidas. A capacidade de recapitular os estágios iniciais do desenvolvimento cerebelar, especialmente em um ambiente 2D, permite que os pesquisadores respondam a perguntas específicas que exijam experimentos com uma estrutura monocamada. Este protocolo também é passível de modificações adicionais, como superfícies micropadronizadas, ensaios de crescimento axonal e classificação celular para enriquecer as populações celulares desejadas.
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Protocol
A pesquisa em seres humanos foi aprovada sob o número de aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Iowa 201805995 e o número de aprovação do Comitê de Células-Tronco Pluripotentes Humanas da Universidade de Iowa 2017-02. As biópsias de pele foram obtidas dos sujeitos após a obtenção do termo de consentimento livre e esclarecido. Os fibroblastos foram cultivados em DMEM com soro fetal bovino a 15% (FBS) e solução de aminoácidos não essenciais a 1% de MEM a 37 °C e 5% de CO2. Os fibroblastos foram reprogramados usando um kit de reprogramação episómica seguindo o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais) usando um nucleofector para eletroporação. Todos os procedimentos foram realizados em um gabinete de segurança biológica Classe II Tipo A2 ("capuz" para abreviar). Todos os meios de cultura celular eram livres de antibióticos; portanto, cada componente que entrava no capô era limpo com etanol a 70%. Todos os meios e componentes da cultura celular foram filtrados ou abertos estéreis no exaustor para manter sua esterilidade.
1. Preparação experimental
- Preparar placas revestidas com matriz de membrana basal (BMM).
NOTA: BMM solidifica mais rapidamente em temperaturas mais quentes. As placas devem ser preparadas rápida e imediatamente colocadas a 4 °C para armazenagem.- Descongelar o BMM (ver Tabela de Materiais) no gelo, a 4 °C durante, pelo menos, 2 h, ou durante a noite.
- Misture DMEM/F12 e BMM até uma concentração final de 80 μg/mL. Distribuir a solução de BMM em placas de cultura de tecidos (1 ml para 35 mm e 2 ml para placas de 60 mm) e incubar a 37 °C durante, pelo menos, 1 h ou durante a noite antes de chapear as células.
NOTA: Os pratos não utilizados podem ser armazenados a 4 °C durante 2 semanas.
- Preparar placas revestidas com poli-L-ornitina/laminina (PLO/laminina).
- Prepare 20 μg/mL de PLO (ver Tabela de Materiais) em DPBS+/+ estéril e adicione 1 mL a cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar durante a noite a 37 °C na incubadora.
- No dia seguinte, aspirar a OLP com um aspirador a vácuo e lavar duas vezes com DPBS+/+. Seque ao ar livre no capô.
NOTA: As placas secas ao ar podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas, envoltas em papel alumínio, para uso futuro. - Prepare 10 μg/mL de laminina (ver Tabela de Materiais) em DPBS+/+ e adicione 1 mL a cada poço de uma placa de 6 poços. Incubar pelo menos durante 3 h ou durante a noite a 37 °C na incubadora.
- Aspirar a laminina com um aspirador a vácuo e adicionar 1 ml de DPBS+/+ estéril ou estéril.
NOTA: O revestimento de laminina não deve secar. PBS ou um meio de cultura apropriado deve ser adicionado imediatamente para evitar isso. As placas revestidas podem ser armazenadas a 4 °C por até 2 semanas.
- Prepare a solução de passagem de PSC.
NOTA: Um osmômetro (consulte Tabela de Materiais) é necessário para fazer a solução de passagem de PSC10.- Dissolver 11,49 g de cloreto de potássio (KCl) e 0,147 g de citrato de sódio di-hidratado (HOC(COONa)(CH 2 COONa)2*2H2O)em 400 ml de água de cultura celular estéril (ver Tabela de Materiais).
- Meça o volume da solução e registre-o como o volume inicial (Vi).
- Meça a osmolaridade e ajuste-a a 570 mOsm adicionando água de grau de cultura de células estéreis usando a fórmula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
- Filtrar-esterilizar a solução com um filtro de 0,20 μm e fazer alíquotas de 10 mL. Armazenar as alíquotas à temperatura ambiente (RT) por até 6 meses.
- Preparar meio pluripotente de células-tronco (PSC).
NOTA: As iPSCs são mantidas em um meio contendo FGF2 estável ao calor (consulte Tabela de Materiais), fornecendo um cronograma de alimentação sem fim de semana. Outras mídias PSC comercialmente disponíveis não foram testadas para este protocolo.- Descongele o suplemento médio de PSC durante a noite a 4 °C.
- Adicione 10 mL de suplemento de meio PSC a 500 mL de meio PSC basal. Fazer alíquotas de 25 ml e conservar a -20 °C.
NOTA: As alíquotas congeladas podem ser armazenadas a -20 °C durante 6 meses. As alíquotas descongeladas devem ser armazenadas a 4 °C e utilizadas no prazo de 2 semanas. As células podem ser congeladas para armazenamento a longo prazo em um meio PSC com 10% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Prepare o meio de descongelamento PSC.
- Suplemento de meio PSC com 50 nM de cromo, 1,5 μM de emricasan, 1x suplemento de poliamina e 0,7 μM de trans-ISRIB (coquetel CEPT11) (ver Tabela de Materiais).
- Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,20 μm e conservar a 4 °C durante um período máximo de 4 semanas.
- Prepare pipetas de vidro puxadas.
- Puxe pipetas Pasteur de vidro de 22,9 cm (9 pol) em duas peças acima de um queimador Bunsen, ~2 cm abaixo do pescoço, criando duas pipetas, com o lado mais fino sendo ~4 cm mais curto que o outro.
- Com a ajuda da chama, dobre as pontas do lado puxado para criar um "r" suave.
- Coloque as pipetas puxadas nas mangas da autoclave e na autoclave para esterilização.
- Preparar meio de diferenciação cerebelar (MDL).
- Misture IMDM e mistura de nutrientes F12 de Ham em uma proporção de 1: 1. Complemente a mistura com 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina, concentrado lipídico quimicamente definido a 1% (v/v), 0,45 mM 1-tio-glicerol, 15 μL/mL de apo-transferrina, 5 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA) e 7 μg/mL de insulina (ver Tabela de Materiais).
- Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,20 μm, conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 1 mês.
- Preparar o meio de maturação cerebelar (CMM).
- Suplemento de meio neurobasal com 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina e 1x suplemento de N-2 (ver Tabela de Materiais).
- Filtrar-esterilizar com um filtro de 0,20 μm, conservar a 4 °C e utilizar no prazo de 2 semanas.
2. Cultura iPSC sem alimentador
- Descongele as células seguindo as etapas abaixo.
- Colocar uma placa BMM (passo 1.1) na incubadora a 37 °C para gelificar durante, pelo menos, 1 h ou durante a noite antes de descongelar as células.
- Pré-aqueça 10 mL de meio de descongelamento PSC (etapa 1.5) a 37 °C.
- Transferir o criovial com células do azoto líquido para banho-maria a 37 °C.
NOTA: Para evitar a geração de uma fonte de contaminação no espaço de cultura celular, não é recomendado o uso de banho-maria padrão. Em vez disso, a água doce pode ser aquecida em um copo pequeno a 37 ° C para gerar um banho de água de uso único. - Quando houver um pequeno pedaço de gelo deixado no tubo, retire-o do banho-maria, seque o tubo e pulverize com etanol a 70%. Transfira o tubo para o exaustor e use uma pipeta sorológica de 2 mL ou 5 mL (ver Tabela de Materiais) para transferir suavemente as células para um tubo cônico de 15 mL.
- Adicione 8 mL de meio de descongelamento PSC às células gota a gota enquanto gira o tubo cônico. Centrífuga a 200 x g durante 5 min a RT.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo sem perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em 2 mL de meio de descongelamento de PSC.
- Aspirar o BMM da placa e adicionar as células ressuspensas gota a gota sobre a placa para uma distribuição uniforme.
- Colocar a placa na incubadora a 37 °C, 5% de CO2. Atualize o meio no dia seguinte com o PSC médio. Depois disso, mude o meio diariamente.
- Mantenha as células seguindo as etapas abaixo.
- Pré-aqueça o volume necessário do meio PSC a 37 °C (por exemplo, 1 mL de meio por placa de 35 mm).
- Investigar as placas para células ou colônias diferenciadas e remover as células diferenciadas com uma pipeta de vidro puxada (etapa 1.6).
NOTA: As colônias de iPSC têm bordas lisas com células morfologicamente idênticas. - Mude o meio gasto diariamente e a passagem a cada 3-4 dias ou quando 70% de confluência for atingida.
- Passe as células.
- Coloque a quantidade necessária de placas BMM na incubadora por pelo menos 1 h ou durante a noite antes de passar. Pré-aqueça a quantidade necessária de meio PSC (passo 1.3) a 37 °C.
- Usando uma pipeta de vidro puxada, limpe todas as células ou colônias diferenciadas.
- Aspirar o meio gasto com aspirador a vácuo e adicionar meio de dissociação PSC, 1 mL por prato de 35 mm. Incubar a 37 °C durante 1-3 min.
NOTA: Se as colônias estiverem decolando na solução de passagem de PSC antes de adicionar o meio de PSC, o tempo de incubação pode ser reduzido. - Aspirar a solução de PSC passaging e adicionar o meio PSC pré-aquecido.
- Usando uma ponta de pipeta estéril de 200 μL, risque linhas paralelas umas às outras em uma direção, gire a placa em 90° e faça um segundo conjunto de linhas de risco perpendiculares às anteriores (fazendo um padrão de eclosão cruzada em toda a placa).
- Aspirar a solução BMM das placas ajustadas. Coletar as colônias usando uma pipeta sorológica e distribuí-las para novas placas BMM.
- Incubar a 37 °C, 5% de CO2. Mude o meio diariamente.
- Congele as células.
- Prepare os criovianos rotulando o conteúdo e esterilize sob luz ultravioleta (UV) no exaustor (consulte a Tabela de Materiais) por 30 min.
- Prepare o meio de congelamento PSC suplementando o meio PSC com DMSO a 10% (v/v). Siga as etapas 2.3.2-2.3.5.
- Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL com pipeta sorológica de 5 mL e centrífuga a 200 x g por 5 min no RT.
- Aspirar cuidadosamente o meio e ressuspender o pellet celular em meio de congelamento PSC.
- Distribuir em crioviais. Coloque os frascos para injetáveis num recipiente de congelação e coloque o recipiente num congelador a -80 °C.
- No dia seguinte, transfira os criovitais para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
3. Diferenciação cerebelar
NOTA: Antes de iniciar a diferenciação, as iPSCs são passadas para seis placas de 35 mm e estão prontas para a diferenciação quando estão em 70% de confluência. Cada placa de 35 mm será transferida para um poço da placa de 6 poços.
- No dia 0, levante as colônias saudáveis de iPSC para a formação de EB.
- Adicionar 1 mL de MDL (etapa 1.7) suplementado com 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542 (ver Tabela de Materiais) a cada poço de uma placa de fixação ultrabaixa (ULA) de 6 poços e colocar na incubadora até que as colônias levantadas estejam prontas para serem adicionadas aos poços.
- Limpe as células diferenciadas usando uma pipeta de vidro puxada. Aspirar o meio e adicionar 1 mL de solução de PSC para cada prato de 35 mm. Incubar por 3 min a 37 °C, aspirar, e adicionar 2 mL de MDL suplementado com 10 μM Y-27632 e 10 μM SB431542.
NOTA: Se as colônias estiverem decolando na solução de passagem de PSC antes de adicionar MDL, o tempo de incubação pode ser reduzido. - Sob um microscópio invertido de luz transmitida, levante suavemente as colônias usando a borda dobrada da pipeta de vidro puxada usando ampliação de 4x. Uma vez que cada colônia é levantada, transfira suavemente tudo para um poço da placa ULA de 6 poços usando uma pipeta sorológica de 10 mL. Repita este processo para cada placa iPSC. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO2.
NOTA: Se as colônias forem muito grandes ou forem fundidas, elas podem ser cortadas com a ponta da pipeta de vidro puxada para criar EBs menores.
- No dia 2, adicione FGF2 a cada poço a uma concentração final de 50 ng/mL.
NOTA: O FGF2 utilizado para diferenciação cerebelar não é estável ao calor. Este protocolo não foi testado com FGF2 estável ao calor. - No dia 7, faça uma mudança média de 1/3. Para 3 mL de meio total em um poço, com um pipettor de 1.000 μL, aspirar suavemente 1 mL de meio gasto e substituí-lo por 1 mL de MDL fresco. Incubar os EBs por 7 dias.
- No dia 14, aspirar suavemente quase todo o meio gasto usando um pipettor de 1.000 μL. Para garantir danos mínimos aos EBs, gire a placa para reunir todos os EBs no centro da placa e, em seguida, incline a placa e aspirar lentamente da borda.
- À medida que a quantidade média diminui, coloque lentamente a placa plana e continue a aspirar. Deixe o meio suficiente para evitar secar os EBs. Posteriormente, adicione 3 mL de MDL fresco suplementado com 10 μM Y-27632. Transfira os EBs usando uma pipeta sorológica de 10 mL para um prato revestido de PLO/laminina (etapa 1.2).
NOTA: Dependendo da aplicação a jusante, os EBs podem ser transferidos para uma placa PLO/laminina de 6 poços ou os EBs únicos podem ser transferidos para um único poço de uma placa de 24 poços revestida de PLO/laminina ou deslizamento de cobertura.
- À medida que a quantidade média diminui, coloque lentamente a placa plana e continue a aspirar. Deixe o meio suficiente para evitar secar os EBs. Posteriormente, adicione 3 mL de MDL fresco suplementado com 10 μM Y-27632. Transfira os EBs usando uma pipeta sorológica de 10 mL para um prato revestido de PLO/laminina (etapa 1.2).
- No dia 15, aspirar o meio e substituí-lo por MDL fresco.
NOTA: É importante adicionar meio suficiente aos poços para garantir um meio suficiente entre as mamadas, pois, com o tempo, haverá evaporação (por exemplo, para um poço em uma placa de 6 poços, adicione 3 mL de meio). Se o meio começou a acidificar (ficar claro e amarelo), atualize o meio mesmo que não esteja no cronograma de alimentação até o final do protocolo. - No dia 21, aspirar o meio gasto e substituí-lo por CMM. No dia 28, troque o meio com CMM fresco. No dia 35, colha as células para outras aplicações.
4. Preparação da amostra para isolamento de ARN
- Aspirar o meio e adicionar 500 μL de reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) a cada poço da placa de 6 poços. Deixe-o ligado por alguns segundos e piratee.
- Incubar a placa, com a tampa ligada, à temperatura ambiente durante 2 min. Toque nas laterais da placa para separar as células.
- Adicione 1 mL de CMM (etapa 1.8) e colete as células em um tubo de 1,5 mL.
- Pellet as células por centrifugação usando uma minicentrífuga de bancada (ver Tabela de Materiais) por 30 s a RT (velocidade máxima 2000 x g), descarte o meio e adicione 1 mL de 1x PBS pH 7,4 para lavar o pellet celular.
- Pellet as células novamente usando uma minicentrífuga de bancada por 30 s no RT e lave com PBS mais uma vez.
- Pellet as células e descartar o PBS. Lise as células do fenol e do isotiocianato de guanidina contendo reagente (ver Tabela de Materiais).
NOTA: As células lisadas em fenol e isotiocianato de guanidina contendo reagente podem ser armazenadas a -80 °C por até 1 ano. As células podem ser lisadas diretamente no prato, dependendo do método de isolamento de RNA e dos reagentes que estão sendo usados. Devido ao baixo número de células em um prato, isolar o RNA usando colunas de spin de sílica (ver Tabela de Materiais) resultará em maiores rendimentos de RNA.
5. Preparação de células para coloração imunofluorescente
NOTA: Para uma placa de 24 poços, um EB por poço é suficiente.
- No dia 35, aspirar o meio gasto e lavar as células adicionando 1 mL de DPBS+/+ por poço (para um poço de uma placa de 24 poços).
- Aspirar o DPBS+/+ e adicionar 500 μL de paraformaldeído frio a 4% (PFA, ver Tabela de Materiais) preparado em DPBS+/+ por poço. Incubar por 20 min no RT.
- Remova 4% de PFA e lave as células duas vezes com DPBS+/+, como na etapa 5.1. Adicionar 1 ml de DPBS+/+ e conservar as células a 4 °C até à coloração.
NOTA: Recomenda-se fazer a coloração imunofluorescente dentro de 1 semana após a fixação para evitar o descolamento celular e a perda de antígenos. No entanto, dependendo do anticorpo e da localização celular do alvo, a coloração pode ser feita em momentos posteriores até 4 semanas após a fixação.
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Representative Results
Visão geral da diferenciação cerebelar 3D para 2D
As células cerebelares são geradas a partir de iPSCs. A Figura 1A mostra o fluxo de trabalho geral e a adição dos principais componentes para diferenciação. No dia 0, os EBs são feitos levantando suavemente as colônias de iPSC (Figura 1B) usando uma pipeta de vidro puxada em MDL contendo SB431542 e Y-27632 e colocados em placas de fixação ultrabaixa. FGF2 é adicionado no dia 2. No dia 7, um terço do meio é trocado e observa-se a formação de EB (Figura 1C). No dia 14, os EBs aumentados (Figura 1D) são banhados em placas revestidas de OLP/laminina em MDL suplementado com Y-27632. No dia 15, o meio é substituído pelo MDL sem Y-27632. As células começam a migrar para fora dos EBs (Figura 1E) ao longo da superfície revestida. No dia 21, uma mudança completa de meio é realizada e o meio é alternado para CMM. Depois disso, o meio é trocado uma vez por semana (ou mais frequentemente se o meio acidificar rapidamente). No dia 35, há uma monocamada de células com morfologia e complexidade neuronais (Figura 1F,G).
As células 2D expressam marcadores de células cerebelares
As células são colhidas no dia 35 para isolamento de RNA e marcação imunofluorescente. A expressão de genes conhecidos por estarem presentes durante o desenvolvimento cerebelar é medida por RT-qPCR (Figura 2). As células expressam marcadores progenitores cerebelares precoces como ATOH1 12,13 (lábio rômbico, progenitores glutamatérgicos) e PTF1α14 (zona ventricular, progenitores GABAérgicos), bem como os marcadores de células progenitoras de Purkinje KIRREL2 15 eSKOR2 15. Além dos marcadores de células cerebelares de desenvolvimento precoce, a expressão de genes de desenvolvimento em estágio avançado, OTX2 e SIX3, também é observada. A marcação imunofluorescente das células mostra coloração positiva para os marcadores cerebelares EN2 e PTF1α (Figura 3A,D), o marcador neuronal TUBB3 (Figura 3G), bem como para o marcador de proliferação Ki67 (Figura 3J). A coloração nuclear com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) mostra núcleos celulares (Figura 3B,E,H,K). Para validar ainda mais esse protocolo, as iPSCs derivadas de pacientes com transtorno neuropsiquiátrico foram usadas para gerar células cerebelares e analisar a expressão do marcador de células cerebelares no dia 35. Os dados de RT-qPCR indicam um perfil de expressão semelhante ao das iPSCs de controle (Figura 1 Suplementar). Além disso, a expressão de moléculas de orientação axonal relevantes para o desenvolvimento cerebelar está presente tanto nas células cerebelares de controle quanto nas derivadas do paciente (Figura 2 Suplementar).
Figura 1: Visão geral da linha do tempo do protocolo e imagens representativas. (A) Um esboço esquemático do protocolo de diferenciação cerebelar representando o tipo de meio de cultura, os suplementos adicionados ao meio de cultura, os dias em que uma mudança de meio é necessária (indicada com linhas verticais) e o revestimento superficial do prato de cultura. (B) Imagens representativas de campo brilhante de iPSCs no dia 0 e células diferenciadas que serão limpas antes de fazer EBs (mostradas em círculo vermelho), (C) EBs no dia 7 e (D) dia 14, (E) no dia seguinte ao revestimento dos EBs e (F,G) células maduras no dia 35. Barra de escala (B-D): 1 mm; (E-G): 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão de marcadores de células cerebelares em células cerebelares 2D no dia 35. Resultados de expressão gênica RT-qPCR no dia 35 para genes selecionados que representam diferentes marcadores de desenvolvimento cerebelar e tipos de células, normalizados para GAPDH. Os valores de -ΔCt representam valores de GAPDH-Ct subtraídos dos valores de Ct alvo; valores mais próximos de zero indicam expressão mais alta. Qualquer valor abaixo da linha marcada representa a expressão abaixo do limite detectável. N = 2 linhas iPSC, os dados são apresentados como média ± DP. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Marcação imunofluorescente das células cerebelares 2D no 35º dia. As células são fixadas com 4% de PFA no dia 35 e são coradas nuclear com DAPI e imunomarcadas para (A) EN2 (verde), (B) DAPI (azul), (C) EN2-DAPI fundida; (D) PTF1α (vermelho), (E) DAPI (azul), (F) PTF1α-DAPI fundido; (G) TUBB3 (verde), (H) DAPI (azul), (I) TUBB3-DAPI fundida; e (J) Ki67 (vermelho), (K) DAPI (azul), (L) Ki67-DAPI fundidos. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 1 Suplementar: Imagens representativas da diferenciação cerebelar utilizando iPSCs derivadas de pacientes com diagnóstico de esquizofrenia. (A) colónias de iPSC, (B) EBs no dia 7, (C) dia 14, (D) células que crescem a partir de EBs chapeadas no prato revestido de OLP/laminina no dia 15 e (E) células cerebelares no dia 35. (F) RT-QPCR para expressão gênica no dia 35 para marcadores de células cerebelares, normalizados para GAPDH. Os valores de -ΔCt representam valores de GAPDH-Ct subtraídos dos valores de Ct alvo; valores mais próximos de zero indicam expressão mais alta. Qualquer valor abaixo da linha marcada representa a expressão abaixo do limite detectável. N = 2 linhas de iPSC, os dados são apresentados como média ± DP. Barra da escala (A-C): 1 mm; (D,E): 500 μm. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 2 Suplementar: Expressão gênica de moléculas de orientação axonal de células cerebelares 2D no dia 35. Resultados de expressão gênica RT-qPCR no dia 35 para moléculas selecionadas envolvidas na sinalização de orientação axônica, normalizadas para GAPDH. Todos os genes mostrados são conhecidos por serem expressos no cerebelo, exceto o PlxnB3, que tem baixa expressão no cerebelo ao longo do desenvolvimento. Os valores de -ΔCt representam valores de GAPDH-Ct subtraídos dos valores de Ct alvo; valores mais próximos de zero indicam expressão mais alta. Qualquer valor abaixo da linha marcada representa a expressão abaixo do limite detectável. N (controle) = 1, N (SCZ) = 1, e a média dos experimentos executados em triplicado é mostrada. Abreviação: SCZ = esquizofrenia. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
A capacidade de modelar o desenvolvimento cerebelar humano in vitro é importante para a modelagem de doenças, bem como para promover a compreensão do desenvolvimento normal do cérebro. Protocolos menos complicados e econômicos criam mais oportunidades para a geração de dados replicáveis e ampla implementação em vários laboratórios científicos. Um protocolo de diferenciação cerebelar é descrito aqui usando um método modificado de geração de EBs que não requer enzimas ou agentes de dissociação, usando fatores de crescimento relatados por Muguruma et al. 4 e um protocolo de crescimento celular monocamada 2D modificado semelhante ao método de Holmes et al. 5.
O protocolo geral inicia-se com a geração de EBs a partir de iPSCs, seguido da indução da diferenciação cerebelar e, por fim, do plaqueamento para cultura de monocamada 2D. Durante esse processo, observou-se uma quantidade significativa de morte celular entre os dias 7 e 14. Devido a essa perda celular, recomenda-se começar com um grande número de EBs; para uma placa de 6 poços de células 2D, recomenda-se começar com um mínimo de seis placas (placas de 35 mm ou 60 mm) de iPSCs. Além disso, a adição de Y-27632 no momento do revestimento de EBs em PLO/laminina aumenta significativamente a fixação dos EBs ao substrato. É importante verificar o meio nas culturas intermitentemente visualmente. Se o meio estiver ficando amarelo (acidificante), é aconselhável mudar o meio, mesmo que não esteja no esquema de alimentação. O número total de células que se ligam irá variar de experimento para experimento, necessitando de refrescamento mais frequente ou menos frequente de nutrientes no meio.
Os resultados da RT-qPCR revelaram que as iPSCs se diferenciaram em células que representam os estágios iniciais do cerebelo em desenvolvimento. Os presentes dados sugerem que, no 35º dia de diferenciação, existem células que expressam o marcador de destino celular neuronal (TUBB3 16,17), marcadores progenitores glutamatérgicos e GABAérgicos (ATOH1 12,13 e PTF1α 14, respectivamente), marcadores de contorno mesencéfalo-rombencéfalo (EN118, EN2 18, GBX2 19), marcadores organizadores ístmicos (WNT1 18, FGF8 19), marcador celular derivado do lábio rômbico (PAX6 18 ) e marcadores progenitores de células de Purkinje (KIRREL215, SKOR220). A expressão do marcador labial rombico OTX221 também foi observada. Protocolos organoides cerebelares anteriores usando hESCs observaram que a indução de FGF2 resulta em células expressas de GBX2, mas muito poucas células positivas para OTX2, enquanto um protocolo semelhante usando iPSCs mostrou expressão idêntica de mRNA de GBX2 e OTX2 em organoides cerebelares8. No entanto, os neurônios cerebelares derivados de células-tronco embrionárias de camundongos (mESC) contêm aglomerados de células positivas OTX2 e GBX24 separados, e foi demonstrado que o OTX2 é expresso em todo o desenvolvimento cerebelar do camundongo22 edo 21,23 humano. O perfil de expressão diferencial do OTX2 entre protocolos que usam os mesmos fatores de especificação de destino pode ser devido a outras diferenças entre os protocolos ou diferenças individuais entre hESCs e iPSCs; isso merece uma investigação mais aprofundada. A expressão de SIX3 também foi observada na cultura no dia 35. A SIX3 é expressa no tubo neural anterior durante o desenvolvimento, e sua expressão no cerebelo humano permanece baixa durante todo o desenvolvimento e idade adulta23,24; no entanto, é expressa no cerebelo neonatal e adulto do camundongo25. Isso sugere que pode haver uma subpopulação de células que se diferenciam em direção a um destino anterior, ou podem representar uma subpopulação de células cerebelares expressando SIX3 durante o desenvolvimento. Essas células poderiam ser mais exploradas.
Os protocolos de diferenciação são frequentemente desenvolvidos usando hESCs ou iPSCs de indivíduos saudáveis, mas é importante confirmar que esses protocolos podem ser aplicados a iPSCs derivadas de pacientes para dissecar as alterações moleculares e celulares na doença. Para testar ainda mais nosso protocolo, juntamente com nossas linhas de iPSC de controle, diferenciamos as linhas de iPSC que foram reprogramadas a partir de fibroblastos obtidos de pacientes diagnosticados com esquizofrenia. A literatura anterior mostrou que pacientes com diagnóstico de esquizofrenia apresentam anormalidades cerebelares funcionais e anatômicas26,27,28. Essas alterações são observadas em pacientes adultos, mas podem começar durante o desenvolvimento e requerem investigação adicional. De modo geral, observou-se que as células cerebelares de pacientes com esquizofrenia expressaram os marcadores cerebelares testados no 35º dia e morfologicamente não foram diferentes das células cerebelares derivadas de iPSCs controle (Figura Suplementar 1). Isso sugere que este protocolo pode investigar o desenvolvimento cerebelar humano no contexto da doença. Além disso, a expressão de marcadores de orientação axonal no 35º dia também foi examinada, tanto em linhagens celulares de controle quanto de esquizofrenia, uma vez que um dos principais componentes do desenvolvimento é o pathfinding axonal e a conectividade neuronal 29,30,31,32. De fato, no dia 35, foram verificadas moléculas de orientação axonal que são indicadas no desenvolvimento cerebelar, incluindo semaforina-4C, plexina-B2 e neuropilina-1 (Figura Suplementar 2). Durante o desenvolvimento, a expressão de plexina-B3 é baixa no cerebelo humano23, e uma menor expressão de plexina-B3 também foi observada em comparação com as outras moléculas de orientação axonal para as diferenciações. Juntamente com a expressão dos marcadores cerebelares, esta é uma forte indicação de que este protocolo de diferenciação gera células cerebelares que expressam as pistas corretas para a conectividade neuronal nessa estrutura.
É importante notar que os tipos celulares gerados usando este FGF2 e protocolo de diferenciação cerebelar induzida por insulina não foram identificados por meio da análise de célula única. Nayler et al.8 publicaram recentemente um conjunto de dados de perfil unicelular de organoides cerebelares gerados usando um protocolo de indução semelhante, e espera-se que pesquisas futuras empreguem cada vez mais métodos de célula única para abordar essas questões. As células após o dia 35 também não foram testadas quanto à expressão ou morfologia. A expressão de marcadores cerebelares em pontos de tempo posteriores e como eles mudam ao longo do tempo dará mais insights sobre a maturidade das células. A co-cultura de células cerebelares derivadas de células-tronco com precursores de células de grânulos cerebelares de camundongos 4 ou fatias cerebelares fetais humanas33 demonstrou gerar células cerebelares maduras, especialmente neurôniosde Purkinje, que muitas vezes estão ausentes em organoides cerebelares. Notavelmente, um estudo recente mostrou que organoides cerebelares dissociados no dia de diferenciação 35 e banhados para crescimento 2D também dão origem a neurônios cerebelares maduros sem a necessidade de co-cultura7. Essas aplicações visam investigar os estágios posteriores do desenvolvimento cerebelar e da maturação neural em comparação com este protocolo, que pode ser utilizado para investigar os estágios iniciais de desenvolvimento. Outra comparação interessante poderia surgir da comparação de neurônios cerebelares embrionários de camundongos cultivados34 com neurônios cerebelares humanos derivados de iPSC, potencialmente destacando diferenças no desenvolvimento e especificação de destino entre as duas espécies.
Em resumo, o presente protocolo pode ser utilizado para aplicações que necessitem de células cerebelares 2D in vitro geradas a partir de iPSCs. Este protocolo não inclui etapas ou materiais complexos, é econômico e pode ser usado como um modelo para o desenvolvimento cerebelar precoce para investigar a expressão gênica, a morfologia celular e a fisiologia.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Jenny Gringer Richards por seu trabalho minucioso na validação de nossos sujeitos de controle, a partir do qual geramos as iPSCs de controle. Este trabalho foi apoiado pelo NIH T32 MH019113 (para D.A.M. e K.A.K.), o Nellie Ball Trust (para T.H.W. e A.J.W.), NIH R01 MH111578 (para V.A.M. e J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (para A.J.W.), e o Roy J. Carver Charitable Trust (para V.A.M., J.A.W. e A.J.W.). As figuras foram criadas com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90x250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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