Summary
Detta protokoll förklarar genereringen av ett 2D-monolager av cerebellära celler från inducerade pluripotenta stamceller för att undersöka de tidiga stadierna av cerebellär utveckling.
Abstract
Den exakta och snabba utvecklingen av lillhjärnan är avgörande inte bara för exakt motorisk koordination och balans utan också för kognition. Dessutom har störningar i cerebellär utveckling varit inblandade i många neurodevelopmental störningar, inklusive autism, attention deficit-hyperactivity disorder (ADHD) och schizofreni. Undersökningar av cerebellär utveckling hos människor har tidigare endast varit möjliga genom obduktionsstudier eller neuroimaging, men dessa metoder är inte tillräckliga för att förstå de molekylära och cellulära förändringar som sker in vivo under tidig utveckling, vilket är när många neuroutvecklingsstörningar uppträder. Framväxten av tekniker för att generera humaninducerade pluripotenta stamceller (iPSC) från somatiska celler och förmågan att ytterligare omdifferentiera iPSC till nervceller har banat väg för in vitro-modellering av tidig hjärnutveckling. Denna studie ger förenklade steg mot att generera cerebellära celler för applikationer som kräver en 2-dimensionell (2D) monolagerstruktur. Cerebellära celler som representerar tidiga utvecklingsstadier härrör från humana iPSC via följande steg: först tillverkas embryoidkroppar i 3-dimensionell (3D) kultur, sedan behandlas de med FGF2 och insulin för att främja cerebellär ödespecifikation, och slutligen differentieras de terminalt som ett monolager på poly-l-ornitin (PLO) / lamininbelagda substrat. Vid 35 dagars differentiering uttrycker iPSC-härledda cerebellära cellkulturer cerebellära markörer inklusive ATOH1, PTF1α, PAX6 och KIRREL2, vilket tyder på att detta protokoll genererar glutamaterga och GABAerga cerebellära neuronala prekursorer, liksom Purkinje-cellförfäder. Dessutom visar de differentierade cellerna distinkt neuronal morfologi och är positiva för immunofluorescensmarkörer för neuronal identitet såsom TUBB3. Dessa celler uttrycker axonala vägledningsmolekyler, inklusive semaphorin-4C, plexin-B2 och neuropilin-1, och kan fungera som en modell för att undersöka de molekylära mekanismerna för neuritutväxt och synaptisk anslutning. Denna metod genererar mänskliga cerebellära neuroner som är användbara för nedströmsapplikationer, inklusive genuttryck, fysiologiska och morfologiska studier som kräver 2D-monolagerformat.
Introduction
Att förstå mänsklig cerebellär utveckling och de kritiska tidsfönstren i denna process är viktigt inte bara för att avkoda de möjliga orsakerna till neurodevelopmental störningar utan också för att identifiera nya mål för terapeutisk intervention. Modellering av mänsklig cerebellär utveckling in vitro har varit utmanande, men med tiden har många protokoll som skiljer mänskliga embryonala stamceller (hESC) eller iPSC med cerebellär härstamning öden uppstått 1,2,3,4,5,6,7,8 . Dessutom är det viktigt att utveckla protokoll som genererar reproducerbara resultat, är relativt enkla (för att minska fel) och inte är tunga på monetära kostnader.
De första protokollen för cerebellär differentiering genererades från 2D-kulturer från pläterade embryoidkroppar (EBs), vilket inducerade cerebellärt öde med olika tillväxtfaktorer som liknar in vivo-utveckling, inklusive WNT, BMP och FGF 1,9. Nyare publicerade protokoll inducerade differentiering främst i 3D-organoidkultur med FGF2 och insulin, följt av FGF19 och SDF1 för rombiska läppliknande strukturer3,4, eller använde en kombination av FGF2, FGF4 och FGF85. Båda cerebellära organoidinduktionsmetoderna resulterade i liknande 3D-cerebellära organoider eftersom båda protokollen rapporterade liknande cerebellärt marköruttryck vid identiska tidpunkter. Holmes och Heine utökade sitt 3D-protokoll5 för att visa att 2D-cerebellära celler kan genereras från hESC och iPSC, som börjar som 3D-aggregat. Dessutom visade Silva et al.7 att celler som representerar mogna cerebellära neuroner i 2D kan genereras med ett liknande tillvägagångssätt som Holmes och Heine, med hjälp av en annan tidpunkt för att byta från 3D till 2D och förlänga tiden för tillväxt och mognad.
Det nuvarande protokollet inducerar cerebellärt öde i matarfria iPSC genom att generera fritt flytande embryoidkroppar (EB) med insulin och FGF2 och sedan plätera EBs på PLO / lamininbelagda rätter på dag 14 för 2D-tillväxt och differentiering. Vid dag 35 erhålls celler med cerebellär identitet. Förmågan att rekapitulera de tidiga stadierna av cerebellär utveckling, särskilt i en 2D-miljö, gör det möjligt för forskare att svara på specifika frågor som kräver experiment med en monolagerstruktur. Detta protokoll är också mottagligt för ytterligare modifieringar såsom mikromönstrade ytor, axonala utväxtanalyser och cellsortering för att berika de önskade cellpopulationerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forskningen på människor godkändes under University of Iowa Institutional Review Board godkännandenummer 201805995 och University of Iowa Human Pluripotent Stem Cell Committee godkännandenummer 2017-02. Hudbiopsier erhölls från försökspersonerna efter att ha fått skriftligt informerat samtycke. Fibroblasterna odlades i DMEM med 15% fetalt bovint serum (FBS) och 1% MEM-icke-essentiell aminosyralösning vid 37 ° C och 5%CO2. Fibroblaster omprogrammerades med hjälp av ett episomalt omprogrammeringssats enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning) med hjälp av en nukleofektor för elektroporering. Alla procedurer utfördes i ett biologiskt säkerhetsskåp av klass II typ A2 ("huva" för kort). Alla cellodlingsmedier var antibiotikafria; Därför rengjordes varje komponent som kom in i huven med 70% etanol. Alla cellodlingsmedier och komponenter sterilfiltrerades eller öppnades i huven för att bibehålla sin sterilitet.
1. Experimentell förberedelse
- Förbered källarmembranmatris (BMM) -belagda plattor.
BMM stelnar snabbare vid varmare temperaturer. Plattorna skall beredas snabbt och omedelbart placeras vid 4 °C för förvaring.- Tina BMM (se materialtabell) på is, vid 4 °C i minst 2 timmar, eller över natten.
- Blanda DMEM/F12 och BMM till en slutlig koncentration på 80 μg/ml. Fördela BMM-lösningen i vävnadsodlingsskålar (1 ml för 35 mm och 2 ml för 60 mm diskar) och inkubera vid 37 °C i minst 1 timme eller över natten innan cellerna pläteras.
OBS: De oanvända rätterna kan förvaras vid 4 °C i 2 veckor.
- Förbered poly-L-ornitin / laminin (PLO / laminin) belagda plattor.
- Bered 20 μg/ml PLO (se materialtabell) i steril DPBS+/+ och tillsätt 1 ml till varje brunn på en 6-brunnsplatta. Inkubera över natten vid 37 °C i inkubatorn.
- Dagen efter aspirerar du PLO med vakuumaspirator och tvättar två gånger med DPBS+/+. Lufttorka i huven.
OBS: Lufttorkade plattor kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor, inslagna i aluminiumfolie, för framtida bruk. - Bered 10 μg/ml laminin (se materialtabell) i DPBS+/+ och tillsätt 1 ml till varje brunn på en 6-brunnsplatta. Inkubera minst 3 timmar eller över natten vid 37 °C i inkubatorn.
- Aspirera laminin med en vakuumsugare och tillsätt antingen 1 ml medium eller steril DPBS +/+.
OBS: Lamininbeläggningen får inte torka ut. PBS eller ett lämpligt odlingsmedium bör tillsättas omedelbart för att förhindra detta. Belagda plattor kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Förbered PSC-passeringslösningen.
OBS: En osmometer (se materialförteckning) krävs för att göra PSC-passeringslösning10.- Lös upp 11,49 g kaliumklorid (KCl) och 0,147 g natriumcitratdihydrat (HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O) i 400 ml sterilt vatten av cellodlingskvalitet (se materialtabell).
- Mät lösningens volym och registrera den som den ursprungliga volymen (Vi).
- Mät osmolariteten och justera den till 570 mOsm genom att tillsätta sterilt cellodlingsvatten med formeln Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
- Filtrera lösningen med ett 0,20 μm filter och gör 10 ml alikvoter. Förvara alikvoterna vid rumstemperatur (RT) i upp till 6 månader.
- Förbered pluripotent stamcellsmedium (PSC).
OBS: iPSC hålls i ett medium som innehåller värmestabil FGF2 (se materialtabell), vilket ger ett helgfritt utfodringsschema. Andra kommersiellt tillgängliga PSC-medier har inte prövats för detta protokoll.- Tina PSC-tillskottet över natten vid 4 °C.
- Tillsätt 10 ml PSC-mediumtillskott till 500 ml basal PSC-medium. Gör alikvoter på 25 ml och förvara vid −20 °C.
OBS: Frysta alikvoter kan förvaras vid −20 °C i 6 månader. Upptinade alikvoter måste förvaras vid 4 °C och användas inom 2 veckor. Celler kan frysas för långvarig lagring i ett PSC-medium med 10% (v / v) dimetylsulfoxid (DMSO).
- Förbered PSC-upptiningsmedium.
- Komplettera PSC-medium med 50 nM chroman, 1,5 μM emricasan, 1x polyamintillskott och 0,7 μM trans-ISRIB (CEPT cocktail11) (se Materialförteckning).
- Filtrera sterilisera med ett 0,20 μm filter och förvara vid 4 °C i upp till 4 veckor.
- Förbered dragna glaspipetter.
- Dra 22,9 cm (9 tum) glas Pasteur-pipetter i två delar ovanför en Bunsen-brännare, ~ 2 cm under halsen, vilket skapar två pipetter, med den tunnare sidan ~ 4 cm kortare än den andra.
- Med hjälp av lågan böjer du spetsarna på den dragna sidan för att skapa ett smidigt "r".
- Placera de dragna pipetterna i autoklavhylsor och autoklav för sterilisering.
- Förbered cerebellär differentieringsmedium (CDM).
- Blanda IMDM och Hams F12-näringsblandning i förhållandet 1: 1. Komplettera blandningen med 1x L-alanin-L-glutamintillskott, 1% (v/v) kemiskt definierat lipidkoncentrat, 0,45 mM 1-tio-glycerol, 15 μL/ml apo-transferrin, 5 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) och 7 μg/ml insulin (se materialförteckning).
- Filtrera med ett 0,20 μm filter, förvara vid 4 °C och använd inom 1 månad.
- Förbered cerebellärt mognadsmedium (CMM).
- Komplettera neurobasal medium med 1x L-alanin-L-glutamin tillägg och 1x N-2 tillägg (se Tabell över material).
- Filtrera med ett 0,20 μm filter, förvara vid 4 °C och använd inom 2 veckor.
2. Matarfri iPSC-kultur
- Tina cellerna enligt stegen nedan.
- Placera en BMM-platta (steg 1.1) i 37 °C-inkubatorn för att gela i minst 1 timme eller över natten innan cellerna tinas.
- Förvärm 10 ml PSC-upptiningsmedium (steg 1.5) vid 37 °C.
- Överför kryovialen med celler från flytande kväve till ett vattenbad vid 37 °C.
OBS: För att undvika att generera en föroreningskälla i cellodlingsutrymmet rekommenderas inte att använda ett vanligt vattenbad. Istället kan färskvatten värmas upp i en liten bägare till 37 °C för att generera ett engångsvattenbad. - När det finns en liten isbit kvar i röret, ta bort den från vattenbadet, torka röret och spraya med 70% etanol. Överför röret till huven och använd en 2 ml eller 5 ml serologisk pipett (se materialtabell) för att försiktigt överföra cellerna till ett 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 8 ml PSC-upptiningsmedium till cellerna droppvis medan du virvlar det koniska röret. Centrifugera vid 200 x g i 5 min vid rtr.
- Aspirera försiktigt supernatanten med en vakuumsugare utan att störa cellpelleten. Återsuspendera cellerna i 2 ml PSC-upptiningsmedium.
- Aspirera BMM från plattan och tillsätt de återsuspenderade cellerna droppvis över hela plattan för jämn fördelning.
- Placera plattan i inkubatorn vid 37 °C, 5 %CO2. Uppdatera mediet nästa dag med PSC-medium. Därefter byter du mediet dagligen.
- Behåll cellerna genom att följa stegen nedan.
- Förvärm den nödvändiga volymen PSC-medium vid 37 °C (t.ex. 1 ml medium per 35 mm platta).
- Undersök plattorna för differentierade celler eller kolonier och ta bort de differentierade cellerna med en dragen glaspipett (steg 1.6).
OBS: iPSC-kolonier har släta kanter med morfologiskt identiska celler. - Ändra det spenderade mediet dagligen och passera var 3-4: e dag eller när 70% sammanflöde uppnås.
- Passera cellerna.
- Placera den nödvändiga mängden BMM-plattor i inkubatorn i minst 1 timme eller över natten innan du passerar. Förvärm den nödvändiga mängden PSC-medium (steg 1.3) vid 37 °C.
- Rengör alla differentierade celler eller kolonier med en dragen glaspipett.
- Aspirera det förbrukade mediet med en vakuumsugare och tillsätt PSC-dissociationsmedium, 1 ml per 35 mm skål. Inkubera vid 37 °C i 1–3 min.
OBS: Om kolonier lyfter i PSC-passeringslösningen innan PSC-medium tillsätts kan inkubationstiden minskas. - Aspirera PSC-passeringslösningen och tillsätt förvärmt PSC-medium.
- Använd en steril pipettspets på 200 μL och repa linjer parallellt med varandra i en riktning, vrid plattan 90 ° och gör en andra uppsättning replinjer vinkelrätt mot de föregående (gör ett korskläckt mönster över plattan).
- Aspirera BMM-lösningen från de inställda plattorna. Samla kolonierna med en serologisk pipett och distribuera dem till nya BMM-plattor.
- Inkubera vid 37 °C, 5 %CO2. Byt medium dagligen.
- Frys cellerna.
- Förbered kryovialer genom att märka innehållet och sterilisera under ultraviolett (UV) ljus i huven (se materialtabell) i 30 minuter.
- Förbered PSC-frysmediet genom att komplettera PSC-mediet med 10% (v / v) DMSO. Följ steg 2.3.2-2.3.5.
- Överför cellerna till ett 15 ml koniskt rör med en 5 ml serologisk pipett och centrifugera vid 200 x g i 5 minuter vid RT.
- Aspirera försiktigt mediet och återsuspendera cellpelleten i PSC-frysmediet.
- Distribuera i kryovialer. Placera injektionsflaskorna i en frysbehållare och placera behållaren i en −80 °C frys.
- Följande dag, överför kryovialerna till flytande kväve för långvarig lagring.
3. Cerebellär differentiering
OBS: Innan differentieringen påbörjas passeras iPSC till sex 35 mm diskar och är redo för differentiering när de har 70% sammanflöde. Varje 35 mm platta kommer att överföras till en brunn på 6-brunnsplattan.
- På dag 0, lyft de friska iPSC-kolonierna för EB-bildning.
- Tillsätt 1 ml CDM (steg 1.7) kompletterat med 10 μM Y-27632 och 10 μM SB431542 (se materialtabell) till varje brunn i en 6-brunns ultralåg fästplatta (ULA) och placera i inkubatorn tills de lyfta kolonierna är redo att läggas till brunnarna.
- Rengör de differentierade cellerna med en dragen glaspipett. Aspirera mediet och tillsätt 1 ml PSC-passeringslösning för varje 35 mm skål. Inkubera i 3 minuter vid 37 °C, aspirat, och tillsätt 2 ml CDM kompletterat med 10 μM Y-27632 och 10 μM SB431542.
OBS: Om kolonier lyfter i PSC-passeringslösningen innan CDM tillsätts kan inkubationstiden minskas. - Under ett inverterat mikroskop med överfört ljus, lyft försiktigt kolonierna med den böjda kanten på den dragna glaspipetten med 4x förstoring. När varje koloni har lyfts, överför försiktigt allt till en brunn på 6-brunns ULA-plattan med en 10 ml serologisk pipett. Upprepa denna process för varje iPSC-platta. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 %CO2.
OBS: Om kolonierna är för stora eller slås samman kan de skivas med spetsen på den dragna glaspipetten för att skapa mindre EBs.
- På dag 2, tillsätt FGF2 till varje brunn till en slutlig koncentration på 50 ng / ml.
OBS: FGF2 som används för cerebellär differentiering är inte värmestabil. Detta protokoll har inte testats med värmestabil FGF2. - På dag 7, gör en 1/3 medium förändring. För 3 ml totalt medium i en brunn, med en 1 000 μL pipettor, sug försiktigt 1 ml använt medium och ersätt det med 1 ml färsk CDM. Inkubera EBs i 7 dagar.
- På dag 14, aspirera försiktigt nästan allt använt medium med en 1,000 μL pipettor. För att säkerställa minimal skada på EB: erna, virvla plattan för att samla alla EB: er i mitten av plattan och luta sedan plattan och aspirera långsamt från kanten.
- När medelmängden minskar, lägg långsamt plattan platt och fortsätt att aspirera. Lämna tillräckligt med medium för att undvika att torka ut EB: erna. Tillsätt sedan 3 ml färsk CDM kompletterad med 10 μM Y-27632. Överför EBs med en 10 ml serologisk pipett till en PLO / lamininbelagd skål (steg 1.2).
OBS: Beroende på nedströmsapplikationen kan EBs överföras till en 6-brunns PLO / lamininplatta eller enstaka EBs kan överföras till en enda brunn av en PLO / lamininbelagd 24-brunnsplatta eller täckglas.
- När medelmängden minskar, lägg långsamt plattan platt och fortsätt att aspirera. Lämna tillräckligt med medium för att undvika att torka ut EB: erna. Tillsätt sedan 3 ml färsk CDM kompletterad med 10 μM Y-27632. Överför EBs med en 10 ml serologisk pipett till en PLO / lamininbelagd skål (steg 1.2).
- På dag 15, aspirera mediet och ersätt det med färsk CDM.
OBS: Det är viktigt att tillsätta tillräckligt med medium till brunnarna för att säkerställa tillräckligt med medium mellan matningarna eftersom det med tiden kommer att finnas avdunstning (t.ex. för en brunn i en 6-brunnsplatta, tillsätt 3 ml medium). Om mediet har börjat surgöra (bli klart och gult), uppdatera mediet även om det inte finns på matningsschemat förrän i slutet av protokollet. - På dag 21, aspirera det förbrukade mediet och ersätt det med CMM. På dag 28, byt medium med färsk CMM. På dag 35, skörda cellerna för ytterligare applikationer.
4. Provberedning för RNA-isolering
- Aspirera mediet och tillsätt 500 μL celldissociationsreagens (se materialtabell) till varje brunn på 6-brunnsplattan. Låt den vara på i ett par sekunder och aspirera.
- Inkubera plattan, med locket på, vid rumstemperatur i 2 min. Tryck på sidorna på plattan för att ta bort cellerna.
- Tillsätt 1 ml koordinatmätmaskin (steg 1.8) och samla cellerna i ett rör på 1,5 ml.
- Pellera cellerna genom centrifugering med hjälp av en minicentrifug på bänkskivan (se materialtabell) i 30 s vid RT (maxhastighet 2000 x g), kassera mediet och tillsätt 1 ml 1x PBS pH 7,4 för att tvätta cellpelleten.
- Pellet cellerna igen med en bänkskiva mini centrifug i 30 s vid RT och tvätta med PBS en gång till.
- Pellet cellerna och kassera PBS. Lysera cellerna i fenol och guanidinisotiocyanat som innehåller reagens (se materialförteckning).
OBS: Celler som lyseras i fenol och guanidinisotiocyanat som innehåller reagens kan förvaras vid −80 °C i upp till 1 år. Celler kan lyseras direkt i skålen beroende på RNA-isoleringsmetoden och reagenser som används. På grund av det låga antalet celler i en skål kommer isolering av RNA med hjälp av kiseldioxidspinnkolumner (se materialförteckning) att resultera i högre utbyten av RNA.
5. Förbereda celler för immunofluorescerande färgning
OBS: För en 24-brunnsplatta räcker det med en EB per brunn.
- På dag 35, aspirera det förbrukade mediet och tvätta cellerna genom att tillsätta 1 ml DPBS +/+ per brunn (för en brunn på en 24-brunnsplatta).
- Aspirera DPBS+/+ och tillsätt 500 μL kall 4% paraformaldehyd (PFA, se materialtabell) framställd i DPBS+/+ per brunn. Inkubera i 20 minuter vid RT.
- Ta bort 4% PFA och tvätta cellerna två gånger med DPBS +/+, som i steg 5.1. Tillsätt 1 ml DPBS+/+ och förvara cellerna vid 4 °C tills färgningen är klar.
OBS: Det rekommenderas att göra den immunofluorescerande färgningen inom 1 vecka efter fixering för att undvika cellavskiljning och förlust av antigener. Beroende på antikroppen och målets cellulära placering kan färgning göras vid senare tillfällen upp till 4 veckor efter fixering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Översikt över 3D till 2D cerebellär differentiering
Cerebellära celler genereras från iPSC. Figur 1A visar det övergripande arbetsflödet och tillägget av huvudkomponenter för differentiering. På dag 0 tillverkas EBs genom att försiktigt lyfta iPSC-kolonierna (figur 1B) med hjälp av en dragen glaspipett i CDM innehållande SB431542 och Y-27632 och placeras i ultralåga fästplattor. FGF2 läggs till dag 2. På dag 7 ändras en tredjedel av mediet och EB-bildning observeras (Figur 1C). På dag 14 pläteras förstorade EBs (figur 1D) på PLO / lamininbelagda rätter i CDM kompletterat med Y-27632. På dag 15 ersätts mediet med CDM utan Y-27632. Cellerna börjar migrera utåt från EBs (figur 1E) längs den belagda ytan. På dag 21 utförs en fullständig mediumförändring och mediet byts till CMM. Därefter byts mediet en gång i veckan (eller oftare om mediet surgör snabbt). Vid dag 35 finns det ett monolager av celler med neuronalliknande morfologi och komplexitet (Figur 1F,G).
2D-celler uttrycker cerebellära cellmarkörer
Celler skördas på dag 35 för RNA-isolering och immunofluorescerande märkning. Uttrycket av gener som är kända för att vara närvarande under cerebellär utveckling mäts med RT-qPCR (figur 2). Cellerna uttrycker tidiga cerebellära stamfadermarkörer såsom ATOH1 12,13 (rombläpp, glutamaterga stamfäder) och PTF1α14 (ventrikulär zon, GABAergiska förfäder), liksom Purkinje stamcellsmarkörer KIRREL2 15 ochSKOR2 15. Förutom de tidiga utvecklingsmarkörerna för cerebellära celler observeras också uttrycket av utvecklingsgener i senare skede, OTX2 och SIX3. Den immunofluorescerande märkningen av celler visar positiv färgning för de cerebellära markörerna EN2 och PTF1α (figur 3A,D), neuronmarkören TUBB3 (figur 3G), liksom för proliferationsmarkören Ki67 (figur 3J). Kärnfärgning med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) visar cellkärnor (figur 3B,E,H,K). För att ytterligare validera detta protokoll användes iPSC härledda från patienter med en neuropsykiatrisk störning för att generera cerebellära celler och analysera cerebellärt cellmarköruttryck vid dag 35. RT-qPCR-data indikerar en liknande uttrycksprofil som kontroll-iPSC:erna (kompletterande figur 1). Dessutom är uttrycket av axonala styrmolekyler som är relevanta för cerebellär utveckling närvarande både i kontroll- och patient-härledda cerebellära celler (kompletterande figur 2).
Bild 1: Översikt över protokollets tidslinje och representativa bilder. (A) En schematisk kontur av det cerebellära differentieringsprotokollet som visar typen av odlingsmedium, de tillskott som läggs till odlingsmediet, de dagar då en mediumförändring krävs (indikerad med vertikala linjer) och ytbeläggningen på odlingsskålen. (B) Representativa ljusfältsbilder av iPSC på dag 0 och differentierade celler som kommer att rengöras innan EBs görs (visas i röd cirkel), (C) EBs på dag 7 och (D) dag 14, (E) dagen efter plätering av EBs och (F,G) mognande celler på dag 35. Skalstång (B-D): 1 mm; (E-G): 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Uttryck av cerebellära cellmarkörer i 2D-cerebellära celler vid dag 35. RT-qPCR-genuttrycksresultat vid dag 35 för utvalda gener som representerar olika cerebellära utvecklingsmarkörer och celltyper, normaliserade till GAPDH. -ΔCt-värdena representerar GAPDH-Ct-värden subtraherade från mål-Ct-värden; värden närmare noll indikerar högre uttryck. Alla värden under den markerade linjen representerar uttryck under den detekterbara gränsen. N = 2 iPSC-linjer, data presenteras som medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Immunofluorescerande märkning av 2D-cerebellära celler vid dag 35. Cellerna fixeras med 4% PFA vid dag 35 och är kärnfärgade med DAPI och immunmärkta för (A) EN2 (grön), (B) DAPI (blå), (C) EN2-DAPI sammanslagna; (D) PTF1α (röd), (E) DAPI (blå), (F) PTF1α-DAPI sammanslagen; (G) TUBB3 (grön), (H) DAPI (blå), (I) TUBB3-DAPI sammanslagen; och (J) Ki67 (röd), (K) DAPI (blå), (L) Ki67-DAPI slogs samman. Skalstreck: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Representativa bilder av cerebellär differentiering med hjälp av iPSC härledda från patienter som diagnostiserats med schizofreni. (A) iPSC-kolonier, (B) EBs på dag 7, (C) dag 14, (D) celler som växer ut från pläterade EBs på PLO / laminin-belagd skål på dag 15 och (E) cerebellära celler på dag 35. (F) RT-qPCR-resultat för genuttryck vid dag 35 för cerebellära cellmarkörer, normaliserade till GAPDH. -ΔCt-värdena representerar GAPDH-Ct-värden subtraherade från mål-Ct-värden; värden närmare noll indikerar högre uttryck. Alla värden under den markerade linjen representerar uttryck under den detekterbara gränsen. N = 2 iPSC-linjer, data presenteras som medelvärde ± SD. Skalstreck (A-C): 1 mm; (D,E): 500 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Genuttryck av axonala styrmolekyler av 2D-cerebellära celler vid dag 35. RT-qPCR-genuttrycksresultat vid dag 35 för utvalda molekyler som är involverade i axonstyrningssignalering, normaliserade till GAPDH. Alla gener som visas är kända för att uttryckas i lillhjärnan förutom PlxnB3, som har lågt uttryck i lillhjärnan över utveckling. -ΔCt-värdena representerar GAPDH-Ct-värden subtraherade från mål-Ct-värden; värden närmare noll indikerar högre uttryck. Alla värden under den markerade linjen representerar uttryck under den detekterbara gränsen. N (kontroll) = 1, N (SCZ) = 1, och medelvärdet av experiment som körs i tre exemplar visas. Förkortning: SCZ = schizofreni. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att modellera human cerebellär utveckling in vitro är viktig för sjukdomsmodellering samt för att främja förståelsen för normal hjärnutveckling. Mindre komplicerade och kostnadseffektiva protokoll skapar fler möjligheter för replikerbar datagenerering och bred implementering över flera vetenskapliga laboratorier. Ett cerebellärt differentieringsprotokoll beskrivs här med hjälp av en modifierad metod för att generera EBs som inte kräver enzymer eller dissociationsmedel, med hjälp av tillväxtfaktorer som rapporterats av Muguruma et al. 4 och ett modifierat 2D-monolagercelltillväxtprotokoll som liknar metoden från Holmes et al. 5.
Det övergripande protokollet börjar med att generera EBs från iPSCs, följt av induktion av cerebellär differentiering och slutligen plätering för 2D-monolagerkultur. Under denna process observerades en betydande mängd celldöd mellan dag 7-14. På grund av denna cellförlust rekommenderas det att börja med ett stort antal EBs; för en 6-brunnsplatta med 2D-celler rekommenderas att börja med minst sex plattor (antingen 35 mm eller 60 mm plattor) av iPSC. Dessutom ökar tillsatsen av Y-27632 vid tidpunkten för plätering av EBs på PLO / laminin signifikant bindningen av EBs till substratet. Det är viktigt att kontrollera mediet i kulturerna intermittent visuellt. Om mediet blir gult (surgörande) rekommenderas det att byta medium även om det inte finns i matningssystemet. Det totala antalet celler som fäster kommer att variera från experiment till experiment, vilket kräver mer frekvent eller mindre frekvent uppfriskning av näringsämnen i mediet.
RT-qPCR-resultaten avslöjade att iPSC: erna differentierades till celler som representerar de tidiga stadierna av det utvecklande lillhjärnan. Nuvarande data tyder på att det vid dag 35 av differentieringen finns celler som uttrycker neuronala cellödemarkören (TUBB3 16,17), glutamaterga och GABAergiska stamfadermarkörer (ATOH1 12,13 respektive PTF1α14), gränsmarkörer mellan hjärna och bakhjärna (EN1 18, EN2 18, GBX2 19), isthmiska arrangörsmarkörer (WNT1 18, FGF8 19), rhombisk läppderivatcellmarkör (PAX6 18 ) och Purkinje-cellstamfadermarkörer (KIRREL215, SKOR220). Uttryck av den rombiska läppmarkören OTX221 observerades också. Tidigare cerebellära organoidprotokoll med hESC har observerat att FGF2-induktion resulterar i GBX2-uttryckande celler men mycket få OTX2-positiva celler, medan ett liknande protokoll med iPSC visade identiskt mRNA-uttryck av GBX2 och OTX2 i cerebellära organoider8. Musembryonala stamceller (mESC)-härledda cerebellära neuroner innehåller emellertid separata OTX2- och GBX2-positiva cellkluster4, och det har visats att OTX2 uttrycks genom mus 22 ochhuman 21,23 cerebellär utveckling. Differentiell uttrycksprofil för OTX2 mellan protokoll som använder samma ödesspecifikationsfaktorer kan bero på andra skillnader mellan protokollen eller individuella skillnader mellan hESC och iPSC; Detta förtjänar ytterligare utredning. SIX3-uttryck observerades också i kulturen på dag 35. SIX3 uttrycks i det främre neuralröret under utveckling, och dess uttryck i den mänskliga lillhjärnan förblir lågt under hela utvecklingen och vuxenlivet23,24; Det uttrycks emellertid i neonatal och vuxen mus cerebellum25. Detta tyder på att det kan finnas en delpopulation av celler som skiljer sig mot ett främre öde, eller de kan representera en subpopulation av cerebellära celler som uttrycker SIX3 under utveckling. Dessa celler skulle kunna utforskas ytterligare.
Differentieringsprotokoll utvecklas ofta med hjälp av hESC eller iPSC från friska försökspersoner, men det är viktigt att bekräfta att dessa protokoll kan tillämpas på patient-härledda iPSC för att dissekera molekylära och cellulära förändringar i sjukdom. För att ytterligare testa vårt protokoll, tillsammans med våra iPSC-kontrolllinjer, differentierade vi iPSC-linjer som omprogrammerades från fibroblaster erhållna från patienter som diagnostiserats med schizofreni. Den tidigare litteraturen har visat att patienter som diagnostiserats med schizofreni har funktionella och anatomiska cerebellära abnormiteter26,27,28. Dessa förändringar observeras hos vuxna patienter men kan börja under utvecklingen och kräva ytterligare undersökning. Sammantaget observerades att cerebellära celler från schizofrenipatienter uttryckte de cerebellära markörerna som testades på dag 35 och morfologiskt inte skilde sig från de cerebellära cellerna härledda från kontroll-iPSC (kompletterande figur 1). Detta tyder på att detta protokoll kan undersöka mänsklig cerebellär utveckling i sjukdomssammanhang. Dessutom undersöktes också uttrycket av axonala vägledningsmarkörer vid dag 35, både i kontroll- och schizofrenicellinjer, eftersom en av de viktigaste komponenterna i utvecklingen är axonal pathfinding och neuronal anslutning 29,30,31,32. Faktum är att på dag 35 verifierades axonala vägledningsmolekyler som indikeras i cerebellär utveckling, inklusive semaphorin-4C, plexin-B2 och neuropilin-1 (kompletterande figur 2). Under utvecklingen är plexin-B3-uttrycket lågt i det mänskliga lillhjärnan23, och ett lägre uttryck av plexin-B3 observerades också jämfört med de andra axonala styrmolekylerna för differentieringarna. Tillsammans med uttrycket av cerebellära markörer är detta en stark indikation på att detta differentieringsprotokoll genererar cerebellära celler som uttrycker de korrekta ledtrådarna för neuronal anslutning i den strukturen.
Det är viktigt att notera att celltyperna som genereras med hjälp av detta FGF2 och insulininducerade cerebellära differentieringsprotokoll inte identifierades via encellsanalys. Nayler et al.8 publicerade nyligen en dataset av encellsprofilering av cerebellära organoider som genereras med hjälp av ett liknande induktionsprotokoll, och det förväntas att framtida forskning i allt högre grad kommer att använda encellsmetoder för att ta itu med dessa frågor. Cellerna bortom dag 35 testades inte heller för uttryck eller morfologi. Uttrycket av cerebellära markörer vid senare tidpunkter och hur de förändras över tid kommer att ge mer insikt i cellernas mognad. Samodling av stamcellsderiverade cerebellära celler med musens cerebellära granulatcellsprekursorer4 eller humana fostercerebellära skivor33 har visat sig generera mogna cerebellära celler, särskilt Purkinje-neuroner, som ofta saknas i cerebellära organoider. I synnerhet visade en nyligen genomförd studie att cerebellära organoider dissocierade på differentieringsdag 35 och pläterade för 2D-tillväxt också ger upphov till mogna cerebellära neuroner utan att behöva samodla7. Dessa applikationer syftar till att undersöka de senare stadierna av cerebellär utveckling och neural mognad i jämförelse med detta protokoll, som kan användas för att undersöka de tidigare utvecklingsstadierna. En annan intressant jämförelse kan uppstå genom att jämföra odlade embryonala mus cerebellära neuroner34 med iPSC-härledda mänskliga cerebellära neuroner, vilket potentiellt belyser skillnader i utveckling och ödesspecifikation mellan de två arterna.
Sammanfattningsvis kan detta protokoll användas för applikationer som kräver in vitro 2D-cerebellära celler genererade från iPSC. Detta protokoll inkluderar inte komplexa steg eller material, är kostnadseffektivt och kan användas som en modell för tidig cerebellär utveckling för att undersöka genuttryck, cellmorfologi och fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Jenny Gringer Richards för hennes grundliga arbete med att validera våra kontrollpersoner, från vilka vi genererade kontroll-iPSC: erna. Detta arbete stöddes av NIH T32 MH019113 (till D.A.M. och K.A.K.), Nellie Ball Trust (till T.H.W. och A.J.W.), NIH R01 MH111578 (till V.A.M. och J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (till A.J.W.) och Roy J. Carver Charitable Trust (till V.A.M., J.A.W. och A.J.W.). Figurerna skapades med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90x250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
- Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
- Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
- Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
- Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
- Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
- Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
- Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
- Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
- Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
- Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
- Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
- Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
- Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
- Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
- Akbarian, S., et al.
- Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
- Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
- Andreasen, N. C., Pierson, R.
- Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
- Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
- Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
- Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
- Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
- Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
- Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).
