Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modellering af menneskelig cerebellær udvikling in vitro i 2D-struktur

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64462
Automatic Translation
1,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3, 1,2,3,4,5, 1,3,4,5, 1,3,4,5
1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

Summary

Den nuværende protokol forklarer dannelsen af et 2D-monolag af cerebellære celler fra inducerede pluripotente stamceller til undersøgelse af de tidlige stadier af cerebellær udvikling.

Abstract

Den præcise og rettidige udvikling af lillehjernen er afgørende ikke kun for nøjagtig motorkoordinering og balance, men også for kognition. Derudover har forstyrrelser i cerebellar udvikling været impliceret i mange neurodevelopmental lidelser, herunder autisme, opmærksomhedsunderskud-hyperaktivitetsforstyrrelse (ADHD) og skizofreni. Undersøgelser af cerebellær udvikling hos mennesker har tidligere kun været mulige gennem post mortem-undersøgelser eller neuroimaging, men disse metoder er ikke tilstrækkelige til at forstå de molekylære og cellulære ændringer, der forekommer in vivo under tidlig udvikling, hvilket er når mange neuroudviklingsforstyrrelser stammer fra. Fremkomsten af teknikker til at generere menneskeskabte pluripotente stamceller (iPSC'er) fra somatiske celler og evnen til yderligere at differentiere iPSC'er til neuroner har banet vejen for in vitro-modellering af tidlig hjerneudvikling. Denne undersøgelse giver forenklede trin i retning af at generere cerebellære celler til applikationer, der kræver en 2-dimensionel (2D) monolagsstruktur. Cerebellarceller, der repræsenterer tidlige udviklingsstadier, stammer fra humane iPSC'er via følgende trin: først fremstilles embryoidlegemer i 3-dimensionel (3D) kultur, derefter behandles de med FGF2 og insulin for at fremme cerebellar skæbnespecifikation, og endelig differentieres de terminalt som et monolag på poly-l-ornithin (PLO) / lamininbelagte substrater. Ved 35 dages differentiering udtrykker iPSC-afledte cerebellære cellekulturer cerebellære markører, herunder ATOH1, PTF1α, PAX6 og KIRREL2, hvilket tyder på, at denne protokol genererer glutamatergiske og GABAergiske cerebellære neuronale forstadier samt Purkinje-celleforfædre. Desuden viser de differentierede celler tydelig neuronal morfologi og er positive for immunfluorescensmarkører for neuronal identitet såsom TUBB3. Disse celler udtrykker aksonale vejledningsmolekyler, herunder semaphorin-4C, plexin-B2 og neuropilin-1, og kan tjene som en model til undersøgelse af de molekylære mekanismer for neuritudvækst og synaptisk forbindelse. Denne metode genererer humane cerebellære neuroner, der er nyttige til downstream-applikationer, herunder genekspression, fysiologiske og morfologiske undersøgelser, der kræver 2D-monolagsformater.

Introduction

At forstå menneskelig cerebellær udvikling og de kritiske tidsvinduer i denne proces er vigtig ikke kun for at afkode de mulige årsager til neuroudviklingsforstyrrelser, men også for at identificere nye mål for terapeutisk intervention. Modellering af menneskelig cerebellær udvikling in vitro har været udfordrende, men over tid er der opstået mange protokoller, der differentierer menneskelige embryonale stamceller (hESC'er) eller iPSC'er med cerebellære afstamningsskæbner 1,2,3,4,5,6,7,8 . Desuden er det vigtigt at udvikle protokoller, der genererer reproducerbare resultater, er relativt enkle (for at reducere fejl) og ikke er tunge på monetære omkostninger.

De første protokoller for cerebellær differentiering blev genereret fra 2D-kulturer fra belagte embryoidlegemer (EB'er), hvilket inducerede cerebellær skæbne med forskellige vækstfaktorer svarende til in vivo-udvikling, herunder WNT, BMP'er og FGF'er 1,9. Nyere offentliggjorte protokoller inducerede differentiering primært i 3D-organoidkultur med FGF2 og insulin, efterfulgt af FGF19 og SDF1 til rhombiske læbelignende strukturer 3,4 eller anvendte en kombination af FGF2, FGF4 og FGF85. Begge cerebellære organoide induktionsmetoder resulterede i lignende 3D cerebellar organoider, da begge protokoller rapporterede lignende cerebellære markørekspression på identiske tidspunkter. Holmes og Heine udvidede deres 3D-protokol5 for at vise, at 2D cerebellære celler kan genereres fra hESC'er og iPSC'er, der starter som 3D-aggregater. Derudover viste Silva et al.7, at celler, der repræsenterer modne cerebellære neuroner i 2D, kan genereres med en lignende tilgang til Holmes og Heine ved hjælp af et andet tidspunkt for at skifte fra 3D til 2D og forlænge vækst- og modningstiden.

Den nuværende protokol inducerer cerebellær skæbne i feederfrie iPSC'er ved at generere fritsvævende embryoidlegemer (EB'er) ved hjælp af insulin og FGF2 og derefter plettere EB'erne på PLO / lamininbelagte retter på dag 14 til 2D-vækst og differentiering. På dag 35 opnås celler med cerebellær identitet. Evnen til at rekapitulere de tidlige stadier af cerebellær udvikling, især i et 2D-miljø, gør det muligt for forskere at besvare specifikke spørgsmål, der kræver eksperimenter med en monolagsstruktur. Denne protokol er også modtagelig for yderligere modifikationer såsom mikropatternede overflader, aksonale udvækstassays og cellesortering for at berige de ønskede cellepopulationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Humanforsøgsforskningen blev godkendt under University of Iowa Institutional Review Board godkendelsesnummer 201805995 og University of Iowa Human Pluripotent Stem Cell Committee godkendelsesnummer 2017-02. Hudbiopsier blev indhentet fra forsøgspersonerne efter indhentning af skriftligt informeret samtykke. Fibroblasterne blev dyrket i DMEM med 15% føtalt bovint serum (FBS) og 1% MEM-ikke-essentiel aminosyreopløsning ved 37 °C og 5% CO2. Fibroblaster blev omprogrammeret ved hjælp af et episomalt omprogrammeringssæt efter producentens protokol (se Materialetabel) ved hjælp af en nukleofraktor til elektroporation. Alle procedurer blev udført i et biologisk sikkerhedsskab af type II type A2 ("hætte" for kort). Alle cellekulturmedier var antibiotikafrie; Derfor blev hver komponent, der kom ind i emhætten, rengjort med 70% ethanol. Alle cellekulturmedier og komponenter blev sterilt filtreret eller åbnet i emhætten for at opretholde deres sterilitet.

1. Eksperimentelt præparat

  1. Forbered kældermembranmatrix (BMM) -belagte plader.
    BEMÆRK: BMM størkner hurtigere ved varmere temperaturer. Pladerne skal tilberedes hurtigt og anbringes straks ved 4 °C med henblik på opbevaring.
    1. Optø BMM (se Materialetabel) på is, ved 4 °C i mindst 2 timer eller natten over.
    2. Dme/F12 og BMM blandes til en slutkoncentration på 80 μg/ml. Fordel BMM-opløsningen i servietter (1 ml til 35 mm og 2 ml til 60 mm skåle) og inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time eller natten over, før cellerne pletteres.
      BEMÆRK: De ubrugte retter kan opbevares ved 4 °C i 2 uger.
  2. Tilbered poly-L-ornithin / laminin (PLO / laminin) -overtrukne plader.
    1. Forbered 20 μg/ml PLO (se materialetabel) i steril DPBS+/+ og tilsæt 1 ml til hver brønd på en 6-brønds plade. Inkuberes natten over ved 37 °C i inkubatoren.
    2. Den følgende dag opsuges PLO med en vakuumaspirator og vaskes to gange med DPBS +/+. Lufttør i emhætten.
      BEMÆRK: Lufttørrede plader kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger, pakket ind i aluminiumsfolie, til fremtidig brug.
    3. Forbered 10 μg / ml laminin (se materialetabel) i DPBS +/+ og tilsæt 1 ml til hver brønd i en 6-brøndsplade. Inkuberes mindst i 3 timer eller natten over ved 37 °C i inkubatoren.
    4. Aspirer laminin med en vakuumaspirator og tilsæt enten 1 ml medium eller steril DPBS +/+.
      BEMÆRK: Lamininbelægningen må ikke tørre ud. PBS eller et egnet dyrkningsmedium skal straks tilsættes for at forhindre dette. Overtrukne plader kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
  3. Forbered PSC-passaging-løsning.
    BEMÆRK: Der kræves et osmometer (se Materialetabel) for at fremstille PSC-passeringsløsning10.
    1. 11,49 g kaliumchlorid (KCl) og 0,147 g natriumcitratdihydrat (HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O) opløses i 400 ml vand af steril cellekulturkvalitet (se Materialetabel).
    2. Mål opløsningens volumen, og registrer det som det oprindelige volumen (Vi).
    3. Mål osmolariteten og juster den til 570 mOsm ved at tilføje sterilt cellekulturkvalitetsvand ved hjælp af formlen Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. Filter-steriliser opløsningen med et 0,20 μm filter og lav 10 ml aliquots. Opbevares aliquoterne ved stuetemperatur (RT) i op til 6 måneder.
  4. Forbered pluripotent stamcelle (PSC) medium.
    BEMÆRK: iPSC'er vedligeholdes i et medium, der indeholder varmestabil FGF2 (se Materialetabel), hvilket giver en weekendfri fodringsplan. Andre kommercielt tilgængelige PSC-medier er ikke blevet forsøgt til denne protokol.
    1. Optø PSC medium supplement natten over ved 4 °C.
    2. Tilsæt 10 ml PSC-mediumtilskud til 500 ml basalt PSC-medium. Lav 25 ml alikvoter og opbevar ved -20 °C.
      BEMÆRK: Frosne aliquoter kan opbevares ved -20 °C i 6 måneder. Optøede alikvoter skal opbevares ved 4 °C og anvendes inden for 2 uger. Celler kan fryses til langtidsopbevaring i et PSC-medium med 10% (v / v) dimethylsulfoxid (DMSO).
  5. Forbered PSC optøningsmedium.
    1. Suppler PSC-medium med 50 nM kroman, 1,5 μM emricasan, 1x polyamintilskud og 0,7 μM trans-ISRIB (CEPT-cocktail11) (se materialetabel).
    2. Filtersteriliser med et filter på 0,20 μm og opbevares ved 4 °C i op til 4 uger.
  6. Forbered trukne glaspipetter.
    1. Træk 22,9 cm (9 tommer) glas Pasteur-pipetter i to stykker over en Bunsen-brænder, ~ 2 cm under halsen, hvilket skaber to pipetter, hvor den tyndere side er ~ 4 cm kortere end den anden.
    2. Ved hjælp af flammen skal du bøje spidserne på den trukne side for at skabe et glat "r".
    3. Anbring de trukne pipetter i autoklavemuffer og autoklave til sterilisering.
  7. Forbered cerebellar differentieringsmedium (CDM).
    1. Bland IMDM og skinkes F12 næringsstofblanding i forholdet 1:1. Suppler blandingen med 1x L-alanin-L-glutamintilskud, 1% (v / v) kemisk defineret lipidkoncentrat, 0,45 mM 1-thio-glycerol, 15 μL / ml apo-transferrin, 5 mg / ml bovin serumalbumin (BSA) og 7 μg / ml insulin (se materialetabel).
    2. Filtrer-steriliser med et 0,20 μm filter, opbevares ved 4 °C, og brug inden for 1 måned.
  8. Forbered cerebellar modningsmedium (CMM).
    1. Suppler neurobasalt medium med 1x L-alanin-L-glutamin supplement og 1x N-2 supplement (se Tabel over materialer).
    2. Filtrer-steriliser med et 0,20 μm filter, opbevares ved 4 °C, og brug inden for 2 uger.

2. Feederfri iPSC-kultur

  1. Optø cellerne ved at følge nedenstående trin.
    1. Anbring en BMM-plade (trin 1.1) i 37 °C-inkubatoren for at gelere i mindst 1 time eller natten over, før cellerne optøes.
    2. Forvarm 10 ml PSC-optøningsmedium (trin 1,5) ved 37 °C.
    3. Kryovial med celler overføres fra flydende nitrogen til et vandbad ved 37 °C.
      BEMÆRK: For at undgå at generere en forureningskilde i cellekulturrummet anbefales det ikke at bruge et standard vandbad. I stedet kan ferskvand opvarmes i et lille bægerglas til 37 °C for at generere et engangsvandbad.
    4. Når der er et lille stykke is tilbage i røret, skal du fjerne det fra vandbadet, tørre røret og sprøjte med 70% ethanol. Overfør røret til emhætten, og brug en 2 ml eller 5 ml serologisk pipette (se Materialetabel) til forsigtigt at overføre cellerne til et 15 ml konisk rør.
    5. Tilsæt 8 ml PSC-optøningsmedium til cellerne dråbevis, mens du hvirvler det koniske rør. Centrifuge ved 200 x g i 5 min ved RT.
    6. Opsug forsigtigt supernatanten med en vakuumaspirator uden at forstyrre cellepelleten. Resuspender cellerne i 2 ml PSC optøningsmedium.
    7. Aspirer BMM fra pladen og tilsæt de resuspenderede celler dråbevis over hele pladen for jævn fordeling.
    8. Pladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2. Opdater mediet næste dag med PSC medium. Derefter ændres mediet dagligt.
  2. Vedligehold cellerne ved at følge nedenstående trin.
    1. Forvarm det nødvendige volumen PSC-medium ved 37 °C (f.eks. 1 ml medium pr. 35 mm plade).
    2. Pladerne undersøges for differentierede celler eller kolonier, og de differentierede celler fjernes med en trukket glaspipette (trin 1.6).
      BEMÆRK: iPSC-kolonier har glatte kanter med morfologisk identiske celler.
    3. Skift det brugte medium dagligt og passage hver 3-4 dage, eller når 70% sammenløb er nået.
  3. Passage cellerne.
    1. Anbring den nødvendige mængde BMM-plader i inkubatoren i mindst 1 time eller natten over, før de passerer. Forvarm den nødvendige mængde PSC-medium (trin 1.3) ved 37 °C.
    2. Brug en trukket glaspipette til at rense eventuelle differentierede celler eller kolonier.
    3. Aspirer det brugte medium med en vakuumaspirator, og tilsæt PSC-dissociationsmedium, 1 ml pr. 35 mm skål. Inkuberes ved 37 °C i 1-3 min.
      BEMÆRK: Hvis kolonier løftes af i PSC-passaging-opløsningen, før der tilsættes PSC-medium, kan inkubationstiden reduceres.
    4. Aspirer PSC-passaging-løsningen, og tilføj forvarmet PSC-medium.
    5. Ved hjælp af en steril 200 μL pipettespids skal ridselinjer parallelt med hinanden i en retning, dreje pladen 90 ° og lave et andet sæt ridselinjer vinkelret på de foregående (hvilket gør et krydsklækket mønster på tværs af pladen).
    6. Aspirer BMM-opløsningen fra de indstillede plader. Saml kolonierne ved hjælp af en serologisk pipette og fordel dem til nye BMM-plader.
    7. Inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2. Skift mediet dagligt.
  4. Frys cellerne.
    1. Forbered kryovialer ved at mærke indholdet og steriliser under ultraviolet (UV) lys i emhætten (se Materialetabel) i 30 min.
    2. Forbered PSC-frysemedium ved at supplere PSC-medium med 10% (v / v) DMSO. Følg trin 2.3.2-2.3.5.
    3. Overfør cellerne til et 15 ml konisk rør med en 5 ml serologisk pipette og centrifuge ved 200 x g i 5 minutter ved RT.
    4. Opsug forsigtigt mediet, og resuspender cellepelleten i PSC-frysesubstans.
    5. Fordel i cryovials. Anbring hætteglassene i en frysebeholder, og anbring beholderen i en -80 °C fryser.
    6. Den følgende dag overføres kryovalerne til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.

3. Cerebellær differentiering

BEMÆRK: Før differentieringen påbegyndes, føres iPSC'er til seks 35 mm skåle og er klar til differentieringen, når de er ved 70% sammenløb. Hver 35 mm plade overføres til en brønd af 6-brøndspladen.

  1. På dag 0 løftes de sunde iPSC-kolonier til EB-dannelse.
    1. Der tilsættes 1 ml CDM (trin 1.7) suppleret med 10 μM Y-27632 og 10 μM SB431542 (se materialetabel) til hver brønd i en 6-brønds ultra-lav fastgørelsesplade (ULA), og anbring den i inkubatoren, indtil de løftede kolonier er klar til at blive føjet til brøndene.
    2. Rengør de differentierede celler ved hjælp af en trukket glaspipette. Aspirer mediet, og tilsæt 1 ml PSC-passaging-opløsning for hver 35 mm skål. Inkuberes i 3 minutter ved 37 °C, aspireres, og tilsæt 2 ml CDM suppleret med 10 μM Y-27632 og 10 μM SB431542.
      BEMÆRK: Hvis kolonier løftes af i PSC-passaging-opløsningen, før der tilføjes CDM, kan inkubationstiden reduceres.
    3. Under et omvendt mikroskop med transmitteret lys løftes kolonierne forsigtigt ved hjælp af den bøjede kant af den trukne glaspipette ved hjælp af 4x forstørrelse. Når hver koloni er løftet, overføres det forsigtigt til en brønd af 6-brønds ULA-pladen ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Gentag denne proces for hver iPSC-plade. Cellerne inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2.
      BEMÆRK: Hvis kolonierne er for store eller slås sammen, kan de skæres i skiver med spidsen af den trukne glaspipette for at skabe mindre EB'er.
  2. På dag 2 tilsættes FGF2 til hver brønd til en endelig koncentration på 50 ng/ml.
    BEMÆRK: FGF2, der bruges til cerebellar differentiering, er ikke varmestabil. Denne protokol er ikke testet med varmestabil FGF2.
  3. På dag 7 skal du foretage en 1/3 medium ændring. For 3 ml total medium i en brønd, med en 1.000 μL pipettor, forsigtigt opsuge 1 ml brugt medium og udskift det med 1 ml frisk CDM. Inkuber EB'erne i 7 dage.
  4. På dag 14 skal du forsigtigt opsuge næsten alt det brugte medium ved hjælp af en 1.000 μL pipettor. For at sikre minimal skade på EB'erne skal du hvirvle pladen for at samle alle EB'erne i midten af pladen og derefter vippe pladen og aspirere langsomt fra kanten.
    1. Når mellemmængden falder, skal du langsomt lægge pladen fladt og fortsætte med at aspirere. Efterlad nok medium til at undgå at tørre EB'erne ud. Derefter tilsættes 3 ml frisk CDM suppleret med 10 μM Y-27632. EB'erne overføres ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette til en PLO/lamininbelagt skål (trin 1.2).
      BEMÆRK: Afhængigt af downstream-applikationen kan EB'erne overføres til en 6-brønds PLO / lamininplade, eller enkelte EB'er kan overføres til en enkelt brønd i en PLO / lamininbelagt 24-brøndsplade eller dækslip.
  5. På dag 15 skal du opsuge mediet og erstatte det med frisk CDM.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at tilføje nok medium til brøndene for at sikre nok medium mellem fodringer, da der over tid vil være fordampning (f.eks. For en brønd i en 6-brøndsplade tilsættes 3 ml medium). Hvis mediet er begyndt at syrne (blive klart og gult), skal du opdatere mediet, selvom det ikke er på fodringsplanen før slutningen af protokollen.
  6. På dag 21 skal du aspirere det brugte medium og erstatte det med CMM. På dag 28 skal du skifte mediet med frisk CMM. På dag 35 høstes cellerne til yderligere anvendelser.

4. Prøveforberedelse til RNA-isolering

  1. Aspirer mediet og tilsæt 500 μL celledissociationsreagens (se Materialetabel) til hver brønd i 6-brøndspladen. Lad det være tændt i et par sekunder og aspirere.
  2. Inkuber pladen med låget på ved stuetemperatur i 2 min. Tryk på siderne af pladen for at løsne cellerne.
  3. Tilsæt 1 ml CMM (trin 1.8) og opsaml cellerne i et 1,5 ml rør.
  4. Pellet cellerne ved centrifugering ved hjælp af en benchtop minicentrifuge (se Materialetabel) i 30 s ved RT (maks. hastighed 2000 x g), kassér mediet, og tilsæt 1 ml 1x PBS pH 7,4 for at vaske cellepellet.
  5. Pellet cellerne igen ved hjælp af en benchtop minicentrifuge i 30 s på RT og vask med PBS igen.
  6. Pellet cellerne og kassér PBS. Lysér cellerne i phenol- og guanidinisothiocyanatholdige reagens (se Materialetabel).
    BEMÆRK: Celler lyset i phenol og guanidinisothiocyanat indeholdende reagens kan opbevares ved -80 °C i op til 1 år. Celler kan lyseres direkte i skålen afhængigt af RNA-isoleringsmetoden og reagenser, der anvendes. På grund af det lave antal celler i en skål vil isolering af RNA ved hjælp af silicaspinkolonner (se Materialetabel) resultere i højere udbytter af RNA.

5. Forberedelse af celler til immunfluorescerende farvning

BEMÆRK: For en 24-brønds plade er en EB pr. Brønd tilstrækkelig.

  1. På dag 35 skal du opsuge det brugte medium og vaske cellerne ved at tilføje 1 ml DPBS +/+ pr. Brønd (for en brønd af en 24-brøndsplade).
  2. Aspirer DPBS+/+ og tilsæt 500 μL koldt 4% paraformaldehyd (PFA, se Materialetabel) fremstillet i DPBS+/+ pr. brønd. Inkuberes i 20 minutter ved RT.
  3. Fjern 4% PFA og vask cellerne to gange med DPBS +/+, som i trin 5.1. Tilsæt 1 ml DPBS +/+ og opbevar cellerne ved 4 ° C, indtil farvning er færdig.
    BEMÆRK: Det tilrådes at foretage immunfluorescerende farvning inden for 1 uge efter fiksering for at undgå celleløsrivelse og tab af antigener. Afhængigt af antistoffet og målets cellulære placering kan farvning imidlertid udføres på senere tidspunkter op til 4 uger efter fiksering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Oversigt over 3D til 2D cerebellar differentiering
Cerebellar celler genereres startende fra iPSC'er. Figur 1A viser den overordnede arbejdsgang og tilføjelsen af hovedkomponenter til differentiering. På dag 0 fremstilles EB'er ved forsigtigt at løfte iPSC-kolonierne (figur 1B) ved hjælp af en trukket glaspipette i CDM indeholdende SB431542 og Y-27632 og placeres i plader med ultralav fastgørelse. FGF2 tilføjes på dag 2. På dag 7 ændres en tredjedel af mediet, og EB-dannelse observeres (figur 1C). På dag 14 er forstørrede EB'er (figur 1D) belagt på PLO / lamininbelagte retter i CDM suppleret med Y-27632. På dag 15 erstattes mediet med CDM uden Y-27632. Cellerne begynder at migrere udad fra EB'erne (figur 1E) langs den belagte overflade. På dag 21 udføres en komplet mellemændring, og mediet skiftes til CMM. Derefter skiftes mediet en gang om ugen (eller oftere, hvis mediet syrner hurtigt). På dag 35 er der et monolag af celler med neuronallignende morfologi og kompleksitet (figur 1F, G).

2D-celler udtrykker cerebellære cellemarkører
Celler høstes på dag 35 til RNA-isolering og immunfluorescerende mærkning. Ekspressionen af gener, der vides at være til stede under cerebellær udvikling, måles ved RT-qPCR (figur 2). Cellerne udtrykker tidlige cerebellar stamfadermarkører såsom ATOH1 12,13 (rhombisk læbe, glutamaterge forfædre) og PTF1α14 (ventrikulær zone, GABAergiske forfædre) samt Purkinje stamfadercellemarkører KIRREL2 15 og SKOR2 15. Ud over de tidlige udviklingsmæssige cerebellære cellemarkører observeres også ekspressionen af senere udviklingsgener, OTX2 og SIX3. Den immunfluorescerende mærkning af celler viser positiv farvning for cerebellære markører EN2 og PTF1α (figur 3A, D), neuronal markør TUBB3 (figur 3G) samt for spredningsmarkøren Ki67 (figur 3J). Nuklear farvning med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) viser cellekerner (figur 3B,E,H,K). For yderligere at validere denne protokol blev iPSC'er afledt af patienter med en neuropsykiatrisk lidelse brugt til at generere cerebellære celler og analysere cerebellar cellemarkørekspression på dag 35. RT-qPCR-dataene angiver en lignende udtryksprofil som kontrol-iPSC'erne (supplerende figur 1). Derudover er ekspressionen af aksonale vejledningsmolekyler, der er relevante for cerebellær udvikling, til stede både i kontrol- og patientafledte cerebellære celler (supplerende figur 2).

Figure 1
Figur 1: Oversigt over protokollens tidslinje og repræsentative billeder. (A) En skematisk oversigt over cerebellar differentieringsprotokollen, der viser typen af kulturmedium, de kosttilskud, der er tilføjet til kulturmediet, de dage, hvor en medium ændring er påkrævet (angivet med lodrette linjer) og overfladebelægningen af kulturskålen. (B) Repræsentative lyse feltbilleder af iPSC'er på dag 0 og differentierede celler, der vil blive renset af, før der laves EB'er (vist i rød cirkel), (C) EB'er på dag 7 og (D) dag 14, (E) dagen efter plettering af EB'erne og (F,G) modne celler på dag 35. Skala stang (B-D): 1 mm; (E-G): 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Ekspression af cerebellære cellemarkører i 2D cerebellære celler på dag 35. RT-qPCR-genekspressionsresultater på dag 35 for udvalgte gener, der repræsenterer forskellige cerebellære udviklingsmarkører og celletyper, normaliseret til GAPDH. -ΔCt-værdierne repræsenterer GAPDH-Ct-værdier trukket fra mål-Ct-værdier; værdier tættere på nul angiver højere udtryk. Enhver værdi under den afkrydsede linje repræsenterer udtryk under den detekterbare grænse. N = 2 iPSC-linjer, data præsenteres som middel ± SD. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Immunfluorescerende mærkning af 2D cerebellære celler på dag 35. Celler er fastgjort med 4% PFA på dag 35 og er nukleare farvet med DAPI og immunmærket for (A) EN2 (grøn), (B) DAPI (blå), (C) EN2-DAPI fusioneret; (D) PTF1α (rød), (E) DAPI (blå), (F) PTF1α-DAPI fusioneret (G) TUBB3 (grøn), (H) DAPI (blå), (I) TUBB3-DAPI fusioneret; og (J) Ki67 (rød), (K) DAPI (blå), (L) Ki67-DAPI fusioneret. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Repræsentative billeder af cerebellær differentiering ved hjælp af iPSC'er afledt af patienter diagnosticeret med skizofreni. (A) iPSC-kolonier, (B) EB'er på dag 7, (C) dag 14, (D) celler, der vokser ud fra belagte EB'er på den PLO/lamininbelagte skål på dag 15, og (E) cerebellære celler på dag 35. (F) RT-qPCR-resultater for genekspression på dag 35 for cerebellære cellemarkører, normaliseret til GAPDH. -ΔCt-værdierne repræsenterer GAPDH-Ct-værdier trukket fra mål-Ct-værdier; værdier tættere på nul angiver højere udtryk. Enhver værdi under den afkrydsede linje repræsenterer udtryk under den detekterbare grænse. N = 2 iPSC-linjer, data præsenteres som gennemsnit ± SD. Skalastang (A-C): 1 mm; (D,E): 500 μm. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: Genekspression af aksonale vejledningsmolekyler af 2D cerebellære celler på dag 35. RT-qPCR-genekspressionsresultater på dag 35 for udvalgte molekyler involveret i axon-vejledningssignalering, normaliseret til GAPDH. Alle viste gener er kendt for at blive udtrykt i lillehjernen bortset fra PlxnB3, som har lav ekspression i lillehjernen på tværs af udvikling. -ΔCt-værdierne repræsenterer GAPDH-Ct-værdier trukket fra mål-Ct-værdier; værdier tættere på nul angiver højere udtryk. Enhver værdi under den afkrydsede linje repræsenterer udtryk under den detekterbare grænse. N (kontrol) = 1, N (SCZ) = 1, og gennemsnittet af eksperimenter, der køres i tre eksemplarer, vises. Forkortelse: SCZ = skizofreni. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til at modellere menneskelig cerebellær udvikling in vitro er vigtig for sygdomsmodellering samt fremme forståelsen af normal hjerneudvikling. Mindre komplicerede og omkostningseffektive protokoller skaber flere muligheder for replikerbar datagenerering og bred implementering på tværs af flere videnskabelige laboratorier. En cerebellar differentieringsprotokol er beskrevet her ved hjælp af en modificeret metode til generering af EB'er, der ikke kræver enzymer eller dissociationsmidler, ved hjælp af vækstfaktorer rapporteret af Muguruma et al. 4 og en modificeret 2D monolagscellevækstprotokol svarende til metoden fra Holmes et al. 5.

Den overordnede protokol starter med at generere EB'er fra iPSC'er, efterfulgt af induktion af cerebellær differentiering og endelig plettering til 2D-monolagskultur. Under denne proces blev der observeret en betydelig mængde celledød mellem dag 7-14. På grund af dette celletab anbefales det at starte med et stort antal EB'er; for en 6-brønds plade af 2D-celler anbefales det at starte med mindst seks plader (enten 35 mm eller 60 mm plader) iPSC'er. Desuden øger tilføjelsen af Y-27632 på tidspunktet for plettering af EB'er på PLO / laminin signifikant fastgørelsen af EB'erne til substratet. Det er vigtigt at kontrollere mediet i kulturerne intermitterende visuelt. Hvis mediet bliver gult (forsurende), anbefales det at ændre mediet, selvom det ikke er i fodringsordningen. Det samlede antal celler, der binder sig, vil variere fra eksperiment til eksperiment, hvilket kræver hyppigere eller mindre hyppig opdatering af næringsstoffer i mediet.

RT-qPCR-resultaterne afslørede, at iPSC'erne differentierede sig til celler, der repræsenterer de tidlige stadier af den udviklende lillehjerne. De nuværende data tyder på, at der på dag 35 af differentiering er celler, der udtrykker neuronal celleskæbnemarkør (TUBB3 16,17), glutamatergiske og GABAergiske stammarkører (henholdsvis ATOH1 12,13 og PTF1α 14), mellemhjerne-baghjerne grænsemarkører (EN1 18, EN2 18, GBX2 19), isthmic organizer markører (WNT1 18, FGF819), rhombic læbeafledt cellemarkør (PAX6 18 ), og Purkinje-cellestamfadermarkører (KIRREL215, SKOR220). Ekspression af den rhombiske læbemarkør OTX221 blev også observeret. Tidligere cerebellære organoidprotokoller ved hjælp af hESC'er har observeret, at FGF2-induktion resulterer i GBX2-ekspressive celler, men meget få OTX2-positive celler, mens en lignende protokol ved hjælp af iPSC'er viste identisk mRNA-ekspression af GBX2 og OTX2 i cerebellære organoider8. Imidlertid indeholder museembryonale stamcelle (mESC) -afledte cerebellære neuroner separate OTX2- og GBX2-positive celleklynger4, og det har vist sig, at OTX2 udtrykkes gennem mus 22 og human21,23 cerebellær udvikling. OTX2's differentierede ekspressionsprofil mellem protokoller, der anvender de samme skæbnespecifikationsfaktorer, kan skyldes andre forskelle mellem protokollerne eller individuelle forskelle mellem hESC'er og iPSC'er; Dette fortjener yderligere undersøgelse. SIX3-udtryk blev også observeret i kulturen på dag 35. SIX3 udtrykkes i det forreste neurale rør under udvikling, og dets ekspression i det menneskelige lillehjernen forbliver lavt gennem hele udviklingen og voksenalderen23,24; det udtrykkes dog i neonatal og voksen mus cerebellum25. Dette tyder på, at der kan være en underpopulation af celler, der adskiller sig mod en forreste skæbne, eller de kan repræsentere en underpopulation af cerebellære celler, der udtrykker SIX3 under udvikling. Disse celler kunne udforskes yderligere.

Differentieringsprotokoller udvikles ofte ved hjælp af hESC'er eller iPSC'er fra raske forsøgspersoner, men det er vigtigt at bekræfte, at disse protokoller kan anvendes på patientafledte iPSC'er til dissekering af molekylære og cellulære ændringer i sygdom. For yderligere at teste vores protokol differentierede vi sammen med vores kontrol-iPSC-linjer iPSC-linjer, der blev omprogrammeret fra fibroblaster opnået fra patienter diagnosticeret med skizofreni. Den tidligere litteratur har vist, at patienter diagnosticeret med skizofreni har funktionelle og anatomiske cerebellar abnormiteter26,27,28. Disse ændringer observeres hos voksne patienter, men kan begynde under udviklingen og kræver yderligere undersøgelse. Samlet set blev det observeret, at cerebellære celler fra skizofrenipatienter udtrykte de cerebellære markører, der blev testet på dag 35, og morfologisk ikke var forskellige fra cerebellære celler afledt af kontrol-iPSC'er (supplerende figur 1). Dette tyder på, at denne protokol kan undersøge menneskets cerebellære udvikling i sygdomssammenhæng. Desuden blev ekspressionen af aksonale vejledningsmarkører på dag 35 også undersøgt, både i kontrol- og skizofrenicellelinjer, da en af hovedkomponenterne i udviklingen er aksonal pathfinding og neuronal forbindelse 29,30,31,32. Faktisk blev aksonale vejledningsmolekyler på dag 35 verificeret, der er indiceret i cerebellær udvikling, herunder semaphorin-4C, plexin-B2 og neuropilin-1 (supplerende figur 2). Under udviklingen er plexin-B3-ekspression lav i det humane lillehjernen23, og der blev også observeret et lavere udtryk for plexin-B3 sammenlignet med de andre aksonale vejledningsmolekyler for differentieringerne. Sammen med ekspressionen af cerebellar markører er dette en stærk indikation af, at denne differentieringsprotokol genererer cerebellære celler, der udtrykker de korrekte signaler for neuronal forbindelse i denne struktur.

Det er vigtigt at bemærke, at de celletyper, der genereres ved hjælp af denne FGF2 og insulininducerede cerebellære differentieringsprotokol, ikke blev identificeret via enkeltcelleanalyse. Nayler et al.8 offentliggjorde for nylig et datasæt af enkeltcelleprofilering af cerebellære organoider genereret ved hjælp af en lignende induktionsprotokol, og det forventes, at fremtidig forskning i stigende grad vil anvende enkeltcellemetoder til at løse disse spørgsmål. Cellerne efter dag 35 blev heller ikke testet for ekspression eller morfologi. Ekspressionen af cerebellar markører på senere tidspunkter, og hvordan de ændrer sig over tid, vil give mere indsigt i cellernes modenhed. Co-dyrkning af stamcelleafledte cerebellære celler med mus cerebellar granulat celle forstadier4 eller humane føtale cerebellar skiver33 har vist sig at generere modne cerebellære celler, især Purkinje neuroner, som ofte er fraværende i cerebellar organoider. Især viste en nylig undersøgelse, at cerebellære organoider dissocieret på differentieringsdag 35 og belagt til 2D-vækst også giver anledning til modne cerebellære neuroner uden behov for co-dyrkning7. Disse applikationer sigter mod at undersøge de senere stadier af cerebellær udvikling og neural modning i forhold til denne protokol, som kan bruges til at undersøge de tidligere udviklingsstadier. En anden interessant sammenligning kunne opstå ved at sammenligne dyrkede embryonale muse cerebellar neuroner34 med iPSC-afledte humane cerebellar neuroner, hvilket potentielt fremhæver forskelle i udvikling og skæbnespecifikation mellem de to arter.

Sammenfattende kan den nuværende protokol bruges til applikationer, der kræver in vitro 2D cerebellære celler genereret fra iPSC'er. Denne protokol inkluderer ikke komplekse trin eller materialer, er omkostningseffektiv og kan bruges som en model til tidlig cerebellær udvikling til at undersøge genekspression, cellemorfologi og fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Vi takker Jenny Gringer Richards for hendes grundige arbejde med at validere vores kontrolemner, hvorfra vi genererede kontrol-iPSC'erne. Dette arbejde blev støttet af NIH T32 MH019113 (til D.A.M. og K.A.K.), Nellie Ball Trust (til T.H.W. og A.J.W.), NIH R01 MH111578 (til V.A.M. og J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (til A.J.W.) og Roy J. Carver Charitable Trust (til V.A.M., J.A.W. og A.J.W.). Figurerne blev skabt med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26D
1-thio-glycerol Sigma M6145
2 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-26B
250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia Fisher Scientific FB12566502
35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish Falcon 353001
4D Nucleofector core unit Lonza 276885 Nucleofector
5 mL Serological pipette Fisher Scientific 13-678-25D
60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish Falcon 353004
6-well ultra-low attachment plates Corning 3471
9" Disposable Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Apo-transferrin Sigma T1147
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A9418
Cell culture grade water Cytiva SH30529.02
Chemically defined lipid concentrate Gibco 11905031
Chroman 1 Cayman 34681
Class II, Type A2, Biological safety Cabinet NuAire, Inc. NU-540-600 Hood, UV light
Costar 24-well plate, TC treated Corning 3526
Costar 6-well plate, TC treated Corning 3516
DAPI solution Thermo Scientific 62248
DMEM Gibco 11965092
DMEM/F12 Gibco 11320033
DMSO (Dimethly sulfoxide) Sigma D2438
DPBS+/+ Gibco 14040133
Emricasan Cayman 22204
Epi5 episomal iPSC reprogramming kit Life Technologies A15960
Essential 8-Flex Gibco A2858501 PSC medium with heat-stable FGF2
EVOS XL Core Imaging system Life Technologies AMEX1000
Fetal bovine serum - Premium Select Atlanta Biologicals S11150
FGF2 Peprotech 100-18B
GlutaMAX supplement Gibco 35050061 L-alanine-L-glutamine supplement
Ham's F12 Nutrient Mix Gibco 11765054
HERAcell VIOS 160i CO2 incubator Thermo Scientific 50144906
Human Anti-EN2, mouse Santa Cruz Biotechnology sc-293311
Human anti-Ki67/MKI67, rabbit R&D Systems MAB7617
Human anti-PTF1a, rabbit Novus Biologicals NBP2-98726
Human anti-TUBB3, mouse Biolegend 801213
IMDM Gibco 12440053
Insulin Gibco 12585
Laminin Mouse Protein Gibco 23017015
Matrigel Matrix Corning 354234 Basement membrane matrix
MEM-NEAA Gibco 11140050
Mini Centrifuge Labnet International C1310 Benchtop mini centrifuge
Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) New England BioLabs T2040 Silica spin columns
Monarch Total RNA Miniprep Kit New England BioLabs T2010 Silica spin columns
N-2 supplement Gibco 17502-048
Neurobasal medium Gibco 21103049
PBS, pH 7.4 Gibco 10010023
PFA 16% Electron Microscopy Sciences 15710
Polyamine supplement Sigma P8483
Poly-L-Ornithine (PLO) Sigma 3655
Potassium chloride Sigma 746436
SB431542 Sigma 54317
See through self-sealable pouches Steriking SS-T2 (90x250) Autoclave pouches
Sodium citrate dihydrate  Fisher Scientific S279-500
Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia Research Products International 256131
Trans-ISRIB Cayman 16258
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018 Phenol and guanidine isothiocyanate
TrypLE Express Enzyme (1x) Gibco 12604039 Cell dissociation reagent 
Vapor pressure osmometer Wescor, Inc. Model 5520 Osmometer
Y-27632 Biogems 1293823

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
  2. Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
  3. Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
  4. Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
  5. Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
  6. Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
  7. Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
  8. Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
  9. Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
  10. Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
  11. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  12. Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
  13. Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
  14. Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
  15. Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
  16. Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
  17. Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
  18. Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
  19. Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
  20. Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
  21. Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
  22. Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
  23. Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
  24. Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
  25. Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
  26. Andreasen, N. C., Pierson, R. The role of the cerebellum in schizophrenia. Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).
  27. Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
  28. Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
  29. Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
  30. Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
  31. Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
  32. Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
  33. Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
  34. Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).

Tags

Neurovidenskab udgave 187 Cerebellum udvikling 3D til 2D induceret pluripotent stamcelle differentiering sygdomsmodel
Modellering af menneskelig cerebellær udvikling <em>in vitro</em> i 2D-struktur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madencioglu, D. A., Kruth, K. A.,… More

Madencioglu, D. A., Kruth, K. A., Wassink, T. H., Magnotta, V. A., Wemmie, J. A., Williams, A. J. Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure. J. Vis. Exp. (187), e64462, doi:10.3791/64462 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter