Summary
本プロトコールは、小脳発生の初期段階を調査するための人工多能性幹細胞からの小脳細胞の2D単層の生成を説明する。
Abstract
小脳の正確でタイムリーな発達は、正確な運動協調とバランスだけでなく、認知にとっても重要です。さらに、小脳発達の混乱は、自閉症、注意欠陥多動性障害(ADHD)、統合失調症など、多くの神経発達障害に関与しています。ヒトの小脳発達の調査は、これまで死後研究やニューロイメージングによってのみ可能でしたが、これらの方法は、多くの神経発達障害が発生する初期発生中に 生体内で 起こる分子および細胞の変化を理解するのに十分ではありません。体細胞からヒト誘導多能性幹細胞(iPSC)を生成する技術の出現と、iPS細胞をニューロンにさらに再分化する能力は、初期の脳発達の in vitro モデリングへの道を開きました。本研究は、2次元(2D)単層構造を必要とするアプリケーションのための小脳細胞を生成するための簡単なステップを提供します。発生初期を表す小脳細胞は、ヒトiPS細胞から3次元(3D)培養で作製し、FGF2とインスリンで処理して小脳運命の仕様を促進し、最後にポリ-1-オルニチン(PLO)/ラミニンコート基質上で単層として最終分化させるというステップ を経て ヒトiPS細胞に由来します。分化35日目に、iPS細胞由来の小脳細胞培養物は、ATOH1、PTF1α、PAX6、およびKIRREL2などの小脳マーカーを発現し、このプロトコルがグルタミン酸作動性およびGABA作動性の小脳ニューロン前駆体、ならびにプルキンエ細胞前駆細胞を生成することを示唆しています。さらに、分化した細胞は明確な神経形態を示し、TUBB3などの神経同一性の免疫蛍光マーカーに対して陽性である。これらの細胞は、セマフォリン-4C、キキシン-B2、ニューロピリン-1などの軸索誘導分子を発現しており、神経突起伸長やシナプス結合の分子機構を調べるためのモデルとなる可能性があります。この方法は、2D単層フォーマットを必要とする遺伝子発現、生理学的および形態学的研究を含むダウンストリームアプリケーションに役立つヒト小脳ニューロンを生成します。
Introduction
ヒトの小脳の発達とこのプロセスの重要な時間枠を理解することは、神経発達障害の考えられる原因を解読するだけでなく、治療介入の新しい標的を特定するためにも重要です。ヒト小脳発生をin vitroでモデル化することは困難でしたが、時間の経過とともに、ヒト胚性幹細胞(hESC)または小脳系統の運命を持つiPS細胞を区別する多くのプロトコルが出現しました1,2,3,4,5,6,7,8 .さらに、再現性のある結果を生成し、比較的単純で(エラーを減らすため)、金銭的コストに重くないプロトコルを開発することが重要です。
小脳分化のための最初のプロトコルは、播種胚様体(EB)からの2D培養から生成され、WNT、BMP、およびFGFを含むin vivo発生と同様のさまざまな成長因子で小脳運命を誘導しました1,9。より最近発表されたプロトコールは、主にFGF2およびインスリンを用いた3Dオルガノイド培養において分化を誘導し、続いて菱形唇様構造に対してFGF19およびSDF1が続き3、4、またはFGF2、FGF4、およびFGF8の組み合わせを使用した5。両方の小脳オルガノイド誘導法は、両方のプロトコルが同じ時点で同様の小脳マーカー発現を報告したため、同様の3D小脳オルガノイドをもたらしました。ホームズとハイネは、3Dプロトコル5を拡張して、3D凝集体として開始されるhESCとiPS細胞から2D小脳細胞を生成できることを示しました。さらに、Silvaら7は、成熟小脳ニューロンを2Dで表す細胞が、3Dから2Dに切り替え、成長と成熟の時間を延長するための異なる時点を使用して、ホームズとハイネと同様のアプローチで生成できることを示しました。
現在のプロトコルは、インスリンとFGF2を使用して自由に浮遊する胚様体(EB)を生成し、14日目にPLO /ラミニンコーティングされた皿にEBをプレーティングして2D成長と分化を行うことにより、フィーダーフリーiPS細胞に小脳運命を誘導します。35日目までに、小脳同一性を有する細胞が得られる。特に2D環境で小脳発達の初期段階を再現する能力により、研究者は単層構造の実験を必要とする特定の質問に答えることができます。このプロトコルは、マイクロパターン化された表面、軸索伸長アッセイ、および所望の細胞集団を濃縮するための細胞選別などのさらなる改変にも適している。
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Protocol
ヒトを対象とした研究は、アイオワ大学治験審査委員会承認番号201805995およびアイオワ大学ヒト多能性幹細胞委員会承認番号2017-02の下で承認されました。皮膚生検は、書面によるインフォームドコンセントを得た後、被験者から取得されました。線維芽細胞を、15%ウシ胎児血清(FBS)および1%MEM非必須アミノ酸溶液を用いてDMEM中で37°Cおよび5%CO2で培養した。線維芽細胞は、エレクトロポレーション用のヌクレオフェクターを使用して、製造元のプロトコル( 材料の表を参照)に従ってエピソーム再プログラミングキットを使用して再プログラムされました。すべての手順は、クラスIIタイプA2生物学的安全キャビネット(略して「フード」)で実行されました。すべての細胞培養培地は抗生物質フリーでした。したがって、フードに入ったすべてのコンポーネントは70%エタノールで洗浄されました。すべての細胞培養培地および成分は、無菌性を維持するために滅菌濾過またはフード内で開封された。
1. 実験準備
- 基底膜マトリックス(BMM)コーティングプレートを準備します。
注意: BMMは、高温でより早く固化します。プレートは迅速に準備し、すぐに4°Cに置いて保管する必要があります。- BMM( 材料の表を参照)を氷上で、4°Cで少なくとも2時間、または一晩解凍します。
- DMEM/F12とBMMを最終濃度80 μg/mLまで混合します。BMM溶液を組織培養ディッシュ(35 mmディッシュの場合は1 mL、60 mmディッシュの場合は2 mL)に分配し、細胞をプレーティングする前に37°Cで少なくとも1時間または一晩インキュベートします。
注:未使用の食器は4°Cで2週間保存できます。
- ポリ-L-オルニチン/ラミニン(PLO/ラミニン)コーティングプレートを準備します。
- 滅菌DPBS+/+で20 μg/mL PLO( 材料表を参照)を調製し、6ウェルプレートの各ウェルに1 mLを加えます。インキュベーター内で37°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、真空吸引器でPLOを吸引し、DPBS+/+で2回洗浄します。フード内で風乾します。
注意: 風乾プレートは、将来の使用のために、アルミホイルで包まれて最大2週間4°Cで保存できます。 - DPBS+/+で10 μg/mLのラミニン( 材料表を参照)を調製し、6ウェルプレートの各ウェルに1 mLを加えます。インキュベーター内で少なくとも3時間または37°Cで一晩インキュベートします。
- 真空アスピレーターでラミニンを吸引し、1 mLの培地または滅菌DPBS+/+を追加します。
注意: ラミニンコーティングは乾燥してはなりません。これを防ぐために、PBSまたは適切な培地を直ちに添加する必要があります。コーティングされたプレートは、4°Cで最大2週間保存できます。
- PSC継代溶液を調製します。
注意: PSC継代溶液10を作成するには、浸透圧計(材料の表を参照)が必要です。- 11.49 gの塩化カリウム(KCl)と0.147 gのクエン酸ナトリウム二水和物(HOC(COONa)(CH 2 COONa)2* 2H2O)を400 mLの滅菌細胞培養グレードの水に溶解します(材料の表を参照)。
- 溶液の体積を測定し、初期体積(Vi)として記録します。
- 浸透圧を測定し、式Vi × Oi = Vf × 570 mOsmを使用して滅菌細胞培養グレードの水を加えて570 mOsmに調整します。
- 溶液を0.20 μmのフィルターでろ過滅菌し、10 mLのアリコートを作ります。アリコートを室温(RT)で最大6か月間保管します。
- 多能性幹細胞(PSC)培地を調製する。
注:iPS細胞は、熱安定性FGF2を含む培地で維持され( 材料の表を参照)、週末のない給餌スケジュールを提供します。他の市販のPSC培地は、このプロトコルでは試されていません。- PSC培地サプリメントを4°Cで一晩解凍します。
- 500 mLの基礎PSC培地に10 mLのPSC培地サプリメントを追加します。25 mLのアリコートを作り、-20°Cで保存します。
注:凍結アリコートは、-20°Cで6か月間保存できます。解凍したアリコートは4°Cで保存し、2週間以内に使用する必要があります。細胞は、10%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)を含むPSC培地で長期保存するために凍結することができます。
- PSC解凍培地を準備します。
- PSC培地に50 nMクロマン、1.5 μMエムリカサン、1 xポリアミンサプリメント、および0.7 μMトランスISRIB(CEPTカクテル11)を補充します( 材料の表を参照)。
- 0.20 μmのフィルターでフィルター滅菌し、4°Cで最大4週間保存します。
- プルドガラスピペットを準備します。
- 22.9 cm(9インチ)のガラス製パスツールピペットをブンゼンバーナーの上、ネックの下~2 cmの2つの部分に引き出し、薄い側がもう一方より~4 cm短い2つのピペットを作成します。
- 炎の助けを借りて、引っ張られた側の先端を曲げて滑らかな「r」を作成します。
- 引き抜いたピペットをオートクレーブスリーブに入れ、オートクレーブに入れて滅菌します。
- 小脳分化培地(CDM)を準備します。
- IMDMとハムのF12栄養素ミックスを1:1の比率で混ぜます。1x L-アラニン-L-グルタミンサプリメント、1%(v / v)化学的に定義された脂質濃縮物、0.45 mM 1-チオグリセロール、15 μL / mLアポトランスフェリン、5 mg / mLウシ血清アルブミン(BSA)、および7 μg / mLインスリンをミックスに追加します( 材料の表を参照)。
- 0.20μmのフィルターでろ過滅菌し、4°Cで保存し、1ヶ月以内にご使用ください。
- 小脳成熟培地(CMM)を準備します。
- 神経基礎培地に1x L-アラニン-L-グルタミンサプリメントと1x N-2サプリメントを補充します( 材料の表を参照)。
- 0.20 μmフィルターでフィルター滅菌し、4°Cで保存し、2週間以内にご使用ください。
2. フィーダーフリーiPS細胞培養
- 以下の手順に従って細胞を解凍します。
- BMMプレート(ステップ1.1)を37°Cのインキュベーターに入れ、細胞を解凍する前に少なくとも1時間または一晩ゲル化します。
- 10 mLのPSC解凍培地(ステップ1.5)を37°Cで予熱します。
- 細胞を含むクライオバイアルを液体窒素から37°Cの水浴に移します。
注:細胞培養スペースでの汚染源の発生を防ぐため、標準的なウォーターバスの使用はお勧めしません。代わりに、新鮮な水を小さなビーカーで37°Cに加熱して、使い捨ての水浴を生成することができます。 - チューブに氷の小片が残っている場合は、それを水浴から取り出し、チューブを乾燥させ、70%エタノールをスプレーします。チューブをフードに移し、2 mLまたは5 mLの血清学的ピペット( 材料表を参照)を使用して、細胞を15 mLのコニカルチューブに静かに移します。
- 8 mLのPSC解凍培地をコニカルチューブを旋回させながら細胞に滴下します。200 x g でRTで5分間遠心分離します。
- 細胞ペレットを乱すことなく、真空吸引器で上清を注意深く吸引します。細胞を2 mLのPSC解凍培地に再懸濁します。
- プレートからBMMを吸引し、再懸濁した細胞をプレート全体に滴下して均一に分配します。
- プレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに入れる。翌日、PSC培地で培地をリフレッシュします。その後、培地を毎日交換してください。
- 以下の手順に従ってセルを保守します。
- 必要量のPSC培地を37°Cで予熱します(例:35 mmプレートあたり1 mLの培地)。
- プレートに分化した細胞またはコロニーがないか調べ、プルドグラスピペットで分化した細胞を取り除きます(ステップ1.6)。
注:iPS細胞コロニーは、形態学的に同一の細胞を有する滑らかな縁を有する。 - 使用済みの培地を毎日交換し、3〜4日ごと、または70%のコンフルエントに達したときに通過します。
- 細胞を継代する。
- 継代前に、必要量のBMMプレートを少なくとも1時間または一晩インキュベーターに入れます。必要量のPSC培地を37°Cで予熱します(ステップ1.3)。
- プルドグラスピペットを使用して、分化した細胞またはコロニーを取り除きます。
- 使用済み培地を真空アスピレーターで吸引し、PSC解離培地(35 mmディッシュあたり1 mL)を加えます。37°Cで1〜3分間インキュベートします。
注:PSC培地を添加する前にPSC継代溶液中でコロニーが浮き上がっている場合は、インキュベーション時間を短縮できます。 - PSC継代液を吸引し、予熱したPSC培地を追加します。
- 滅菌済みの200 μLピペットチップを使用して、一方向に互いに平行なスクラッチラインを作成し、プレートを90°回転させ、前のスクラッチラインに垂直な2番目のスクラッチラインを作成します(プレート全体にクロスハッチングパターンを作成します)。
- セットプレートからBMM溶液を吸引します。血清学的ピペットを使用してコロニーを収集し、それらを新しいBMMプレートに分配します。
- 37°C、5%CO2でインキュベートします。培地を毎日交換してください。
- 細胞を凍結します。
- 内容物にラベルを付けてクライオバイアルを調製し、フード内の紫外線(UV)光( 材料の表を参照)で30分間滅菌します。
- PSC培地に10%(v/v)DMSOを添加して、PSC凍結培地を調製します。手順 2.3.2-2.3.5 に従います。
- 細胞を5 mLの血清学的ピペットと遠心分離機を備えた15 mLのコニカルチューブに移し、200 x g でRTで5分間遠心分離します。
- 培地を注意深く吸引し、細胞ペレットをPSC凍結培地に再懸濁します。
- クライオバイアルに配布します。バイアルを凍結容器に入れ、容器を-80°Cの冷凍庫に入れます。
- 翌日、クライオバイアルを液体窒素に移して長期保存します。
3.小脳分化
注:分化を開始する前に、iPS細胞は6つの35 mmディッシュに継代され、70%コンフルエントになったら分化の準備が整います。各35 mmプレートは、6ウェルプレートの1ウェルに移されます。
- 0日目に、EB形成のために健康なiPS細胞コロニーを持ち上げます。
- 10 μM Y-27632および10 μM SB431542( 材料の表を参照)を添加した1 mLのCDM(ステップ1.7)を6ウェル超低接着(ULA)プレートの各ウェルに加え、持ち上げたコロニーをウェルに追加する準備ができるまでインキュベーターに入れます。
- プルドグラスピペットを使用して分化した細胞を洗浄します。培地を吸引し、35 mmディッシュごとに1 mLのPSC継代溶液を追加します。37°Cで3分間インキュベートし、吸引し、10 μM Y-27632および10 μM SB431542を添加した2 mLのCDMを加えます。
注:CDMを添加する前にPSC継代溶液でコロニーが浮き上がっている場合は、インキュベーション時間を短縮できます。 - 透過光倒立顕微鏡下で、4倍の倍率で引き抜かれたガラスピペットの曲げた端を使用してコロニーを静かに持ち上げます。すべてのコロニーが持ち上げられたら、10 mL血清学的ピペットを使用して、すべてを6ウェルULAプレートの1ウェルに静かに移します。iPSCプレートごとにこのプロセスを繰り返します。細胞を5%CO2と共に37°Cでインキュベートする。
注:コロニーが大きすぎるか、マージされている場合は、プルドグラスピペットの先端でスライスして、より小さなEBを作成できます。
- 2日目に、FGF2を最終濃度50 ng/mLになるまで各ウェルに加えます。
注:小脳分化に使用されるFGF2は熱安定性がありません。このプロトコルは、熱安定性FGF2でテストされていません。 - 7日目に、1/3の培地交換を行います。ウェル内の総培地3 mLの場合、1,000 μLのピペッターを使用して、1 mLの使用済み培地を静かに吸引し、1 mLの新しいCDMと交換します。EBを7日間インキュベートします。
- 14日目に、1,000 μLのピペッターを使用して、ほぼすべての使用済み培地を穏やかに吸引します。EBへの損傷を最小限に抑えるには、プレートを回転させてすべてのEBをプレートの中央に集めてから、プレートを傾けて端からゆっくりと吸引します。
- 培地の量が減少したら、プレートをゆっくりと平らに置き、吸引を続けます。EBが乾燥しないように十分な培地を残します。その後、10 μM Y-27632を添加した3 mLの新しいCDMを追加します。10 mLの血清学的ピペットを使用してEBをPLO/ラミニンコーティングディッシュに移します(ステップ1.2)。
注:ダウンストリームアプリケーションに応じて、EBを6ウェルPLO/ラミニンプレートに移すか、単一のEBをPLO/ラミニンコーティングされた24ウェルプレートまたはカバーガラスの単一ウェルに移すことができます。
- 培地の量が減少したら、プレートをゆっくりと平らに置き、吸引を続けます。EBが乾燥しないように十分な培地を残します。その後、10 μM Y-27632を添加した3 mLの新しいCDMを追加します。10 mLの血清学的ピペットを使用してEBをPLO/ラミニンコーティングディッシュに移します(ステップ1.2)。
- 15日目に、培地を吸引し、新しいCDMと交換します。
注:時間の経過とともに蒸発するため、供給の間に十分な培地を確保するために、ウェルに十分な培地を追加することが重要です(たとえば、6ウェルプレートのウェルの場合、3 mLの培地を追加します)。培地が酸性化し始めた場合(透明で黄色に変わった場合)、プロトコルが終了するまで供給スケジュールに含まれていなくても、培地を更新します。 - 21日目に、使用済みの培地を吸引し、CMMと交換します。28日目に、新鮮なCMMで培地を交換します。35日目に、さらなる適用のために細胞を収穫します。
4. RNA単離のためのサンプル調製
- 培地を吸引し、500 μLの細胞解離試薬( 材料表を参照)を6ウェルプレートの各ウェルに加えます。数秒間そのままにして吸引します。
- 蓋をした状態でプレートを室温で2分間インキュベートします。プレートの側面をタップして、セルを切り離します。
- 1 mLのCMMを加え(ステップ1.8)、細胞を1.5 mLチューブに集めます。
- ベンチトップミニ遠心分離機( 材料の表を参照)を使用してRT(最高速度2000 x g)で30秒間遠心分離して細胞をペレット化し、培地を廃棄し、1 mLの1x PBS pH 7.4を加えて細胞ペレットを洗浄します。
- ベンチトップミニ遠心分離機を使用してRTで30秒間細胞を再度ペレット化し、もう一度PBSで洗浄します。
- 細胞をペレット化し、PBSを廃棄します。フェノールおよびグアニジンイソチオシアネート含有試薬で細胞を溶解します( 材料の表を参照)。
注:フェノールおよびグアニジンイソチオシアネート含有試薬で溶解した細胞は、-80°Cで最大1年間保存できます。細胞は、RNA単離方法や使用する試薬に応じて、ディッシュ内で直接溶解することができます。ディッシュ内の細胞数が少ないため、シリカスピンカラム( 材料表を参照)を使用してRNAを単離すると、RNAの収率が高くなります。
5. 免疫蛍光染色のための細胞の調製
注:24ウェルプレートの場合、ウェルあたり1EBで十分です。
- 35日目に、使用済み培地を吸引し、ウェルあたり1 mLのDPBS+/+を加えて細胞を洗浄します(24ウェルプレートの1ウェルの場合)。
- DPBS+/+を吸引し、ウェルあたりDPBS+/+で調製した500 μLの冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA、 材料表を参照)を加えます。RTで20分間インキュベートします。
- 4%PFAを除去し、手順5.1と同様に、DPBS+/+で細胞を2回洗浄します。1 mLのDPBS+/+を加え、染色が完了するまで細胞を4°Cで保存します。
注:細胞の剥離や抗原の損失を避けるために、固定後1週間以内に免疫蛍光染色を行うことをお勧めします。ただし、抗体と標的の細胞位置によっては、固定後4週間まで後で染色を行うことができます。
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Representative Results
3Dから2Dへの小脳分化の概要
小脳細胞はiPS細胞から発生します。 図1A は、全体的なワークフローと、差別化のための主要コンポーネントの追加を示しています。0日目に、SB431542およびY-27632を含むCDM中のプルドガラスピペットを使用してiPS細胞コロニーを穏やかに持ち上げ(図1B)、超低接着プレートに入れてEBを作成します。FGF2は2日目に追加されます。7日目に、培地の3分の1が交換され、EB形成が観察されます(図1C)。14日目に、拡大されたEB(図1D)を、Y-27632を添加したCDMのPLO /ラミニンコーティングディッシュにプレーティングします。15日目に、培地をY-27632を含まないCDMと交換します。細胞は、コーティングされた表面に沿ってEBから外側に移動し始めます(図1E)。21日目に、完全な培地交換が行われ、培地がCMMに切り替えられます。その後、培地は週に1回交換されます(または、培地が急速に酸性化する場合はより頻繁に)。35日目までに、ニューロン様の形態と複雑さを持つ細胞の単層があります(図1F、G)。
2D細胞は小脳細胞マーカーを発現する
細胞は、RNA単離および免疫蛍光標識のために35日目に回収される。小脳の発達中に存在することが知られている遺伝子の発現は、RT-qPCRによって測定されます(図2)。細胞は、ATOH112,13(菱形唇、グルタミン酸作動性前駆細胞)およびPTF1α 14(心室帯、GABA作動性前駆細胞)などの初期小脳前駆細胞マーカー、ならびにプルキンエ前駆細胞マーカーKIRREL2 15およびSKOR215を発現する。初期発生小脳細胞マーカーに加えて、後期発生遺伝子であるOTX2およびSIX3の発現も観察されます。細胞の免疫蛍光標識は、小脳マーカーEN2およびPTF1α(図3A、D)、ニューロンマーカーTUBB3(図3G)、ならびに増殖マーカーKi67(図3J)について陽性染色を示す。4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)による核染色は、細胞核を示す(図3B、E、H、K)。このプロトコルをさらに検証するために、精神神経疾患患者由来のiPS細胞を使用して、小脳細胞を生成し、35日目に小脳細胞マーカー発現を分析しました。RT-qPCRデータは、コントロールiPS細胞と同様の発現プロファイルを示しています(補足図1)。 さらに、小脳の発達に関連する軸索誘導分子の発現は、対照および患者由来の小脳細胞の両方に存在します(補足図2)。
図1:プロトコルのタイムラインと代表的な画像の概要。 (A)培地の種類、培地に添加するサプリメント、培地交換が必要な日(縦線で表示)、培養皿の表面コーティングを示す小脳分化プロトコルの概略。(B)0日目のiPS細胞とEBを作る前に除去する分化細胞の代表的な明視野画像(赤丸で表示)、(C)7日目と(D)14日目のEB、(E)EBをプレーティングした翌日、(F、G)35日目の成熟細胞。スケールバー (B-D): 1 ミリメートル;(E-G): 500 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:35日目の2D小脳細胞における小脳細胞マーカーの発現。 異なる小脳発達マーカーおよび細胞型を表す選択された遺伝子についての35日目のRT−qPCR遺伝子発現結果を、GAPDHに正規化した。-ΔCt 値は、ターゲット Ct 値から減算された GAPDH-Ct 値を表します。ゼロに近い値は、より高い式を示します。チェックマーク付きの線より下の値は、検出可能な限界を下回る式を表します。N=2 iPS細胞株、データはSD±平均値として表す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:35日目の2D小脳細胞の免疫蛍光標識。 細胞は35日目に4%PFAで固定され、DAPIで核染色され、(A)EN2(緑)、(B)DAPI(青)、(C)EN2-DAPIが融合した免疫標識されます。(D) PTF1α (赤), (E) DAPI (青), (F) PTF1α-DAPIがマージされました。(G) TUBB3 (緑), (H) DAPI (青), (I) TUBB3-DAPI がマージされました。(J)Ki67(赤)、(K)DAPI(青)、(L)Ki67-DAPIが統合されました。スケールバー:100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:統合失調症と診断された患者由来のiPS細胞を用いた小脳分化の代表的な画像。 (A)iPS細胞コロニー、(B)EBsは7日目、(C)14日目、(D)PLO/ラミニンコーティングディッシュに播種したEBから増殖する細胞は15日目、(E)小脳細胞は35日目に。(F)GAPDHに正規化された小脳細胞マーカーについての35日目の遺伝子発現に関するRT-qPCR結果。-ΔCt 値は、ターゲット Ct 値から減算された GAPDH-Ct 値を表します。ゼロに近い値は、より高い式を示します。チェックマーク付きの線より下の値は、検出可能な限界を下回る式を表します。N = 2 iPS細胞株、データはSD±平均値として表される。 スケールバー (A-C): 1 mm;(D,E): 500 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:35日目における2D小脳細胞の軸索誘導分子の遺伝子発現。 RT−qPCR遺伝子発現結果は、軸索誘導シグナル伝達に関与する選択された分子について35日目に、GAPDHに正規化した。示されているすべての遺伝子は、発生全体で小脳での発現が低いPlxnB3を除いて、小脳で発現することが知られています。-ΔCt 値は、ターゲット Ct 値から減算された GAPDH-Ct 値を表します。ゼロに近い値は、より高い式を示します。チェックマーク付きの線より下の値は、検出可能な限界を下回る式を表します。N(対照)=1、N(SCZ)=1、および三連で実行された実験の平均が示されている。略称:SCZ =統合失調症。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒト小脳の発達 をin vitroで モデル化する能力は、疾患モデリングだけでなく、正常な脳の発達の理解を深めるためにも重要です。複雑で費用効果の低いプロトコルは、複製可能なデータ生成と複数の科学ラボにわたる広範な実装の機会を増やします。小脳分化プロトコルは、Mugurumaらによって報告された成長因子を使用して、酵素または解離剤を必要としないEBを生成する修正方法を使用してここに説明されています。図4 およびHolmesらからの方法と同様の修正された2D単層細胞増殖プロトコル。5.
全体的なプロトコルは、iPS細胞からEBを生成することから始まり、小脳分化の誘導、そして最後に2D単層培養のためのプレーティングが続きます。このプロセスの間、7〜14日目の間にかなりの量の細胞死が観察された。このセル損失のため、多数のEBから始めることをお勧めします。2D細胞の6ウェルプレートの場合、iPS細胞のプレートを最低6枚(35 mmまたは60 mmプレート)から始めることをお勧めします。さらに、PLO/ラミニンへのEBのめっき時にY-27632を添加すると、EBの基質への付着が著しく増加します。培養液中の培地を断続的に視覚的に確認することが重要です。培地が黄色に変わっている(酸性化している)場合は、供給方式に含まれていなくても培地を交換することをお勧めします。付着する細胞の総数は実験ごとに異なり、培地中の栄養素をより頻繁にまたはより少ない頻度でリフレッシュする必要があります。
RT-qPCRの結果、iPS細胞は小脳の発達の初期段階を表す細胞に分化することが明らかになりました。本データは、分化35日目に、神経細胞運命マーカー(TUBB3 16,17)、グルタミン酸作動性およびGABA作動性前駆細胞マーカー(それぞれATOH1 12,13およびPTF1α 14)、中脳-後脳境界マーカー(EN1 18、EN2 18、GBX2 19)、弦側組織マーカー(WNT1 18、FGF819)、菱形唇誘導体細胞マーカー(PAX6 18)、およびプルキンエ細胞前駆マーカー(KIRREL215、SKOR220)。菱形リップマーカーOTX221の発現も認められた。hESCを用いたこれまでの小脳オルガノイドプロトコルでは、FGF2誘導によりGBX2発現細胞は存在するがOTX2陽性細胞はほとんどないことが観察されていたのに対し、iPS細胞を用いた同様のプロトコルでは、小脳オルガノイドにおいてGBX2とOTX2のmRNA発現が同一であることが観察されていました8。しかし、マウス胚性幹細胞(mESC)由来の小脳ニューロンには、別々のOTX2とGBX2陽性の細胞クラスターが含まれており4、OTX2はマウス22とヒト21,23の小脳発生全体で発現していることが示されています。同じ運命仕様因子を使用するプロトコル間のOTX2の発現プロファイルの違いは、プロトコル間の他の違い、またはhESCとiPS細胞の個人差が原因である可能性があります。これはさらに調査する価値があります。SIX3発現は培養35日目においても認められた。SIX3は発生中に前神経管で発現し、ヒト小脳でのその発現は発生および成人期を通して低いままです23,24;しかし、新生児および成体マウスの小脳25に発現している。これは、前方の運命に向かって分化する細胞の亜集団が存在する可能性があること、または発生中にSIX3を発現する小脳細胞の亜集団を表している可能性があることを示唆しています。これらの細胞はさらに探索される可能性があります。
鑑別プロトコルは、健常者のhESCやiPS細胞を用いて開発されることが多いが、疾患の分子・細胞変化を解剖するための患者由来iPS細胞にも適用できることを確認することが重要である。プロトコルをさらにテストするために、コントロールiPS細胞株とともに、統合失調症と診断された患者から得られた線維芽細胞から再プログラムされたiPS細胞株を区別しました。以前の文献は、統合失調症と診断された患者が機能的および解剖学的小脳異常を有することを示した26,27,28。これらの変化は成人患者で観察されますが、発達中に始まる可能性があり、さらなる調査が必要です。.全体として、統合失調症患者の小脳細胞は、35日目にテストされた小脳マーカーを発現し、形態学的には対照iPS細胞由来の小脳細胞と異ならなかったことが観察されました(補足図1)。これは、このプロトコルが疾患の文脈でヒトの小脳発達を調査できることを示唆している。さらに、発生の主要な構成要素の1つは軸索経路発見とニューロン接続性であるため、35日目の軸索ガイダンスマーカーの発現も対照細胞株と統合失調症細胞株の両方で調べられました29,30,31,32。実際、35日目に、セマフォリン-4C、キキシン-B2、およびニューロピリン-1を含む、小脳の発達に適応される軸索ガイダンス分子が確認されました(補足図2)。発生中、ヒト小脳23ではキキシンB3の発現が低く、他の軸索誘導分子と比較してキキシンB3の発現も低下して分化が見られました。小脳マーカーの発現とともに、これは、この分化プロトコルが、その構造におけるニューロン接続の正しい手がかりを発現する小脳細胞を生成することを強く示しています。
このFGF2およびインスリン誘発小脳分化プロトコルを使用して生成された細胞型は、単一細胞分析 では 特定されなかったことに注意することが重要です。Naylerら8 は最近、同様の誘導プロトコルを使用して生成された小脳オルガノイドの単一細胞プロファイリングのデータセットを公開しており、将来の研究では、これらの問題に対処するために単一細胞法がますます採用されることが予想されます。35日目以降の細胞についても、発現または形態について試験しなかった。後の時点での小脳マーカーの発現と、それらが時間の経過とともにどのように変化するかは、細胞の成熟度に関するより多くの洞察を提供します。幹細胞由来の小脳細胞をマウス小脳顆粒細胞前駆体4 またはヒト胎児小脳切片33 と共培養すると、成熟小脳細胞、特に小脳オルガノイドにはしばしば存在しないプルキンエニューロンが生成されることが示されている。特に、最近の研究では、分化35日目に解離し、2D成長のために播種された小脳オルガノイドも、共培養を必要とせずに成熟した小脳ニューロンを生じさせることが示されました7。これらのアプリケーションは、このプロトコルと比較して、小脳の発達と神経成熟の後期段階を調査することを目的としており、発達の初期段階を調査するために利用できます。培養マウス胚小脳ニューロン34 とiPS細胞由来のヒト小脳ニューロンを比較することで、別の興味深い比較が起こり、2つの種間の発生と運命の仕様の違いが浮き彫りになる可能性があります。
要約すると、本プロトコルは、iPS細胞から生成された in vitro2D 小脳細胞を必要とするアプリケーションに使用することができる。このプロトコルは、複雑なステップや材料を含まず、費用対効果が高く、遺伝子発現、細胞形態、および生理学を調査するための初期の小脳発生のモデルとして使用できます。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反はありません。
Acknowledgments
Jenny Gringer Richards氏の、コントロールiPS細胞の生成元となった被験者の検証に徹底的に取り組んでくださったことに感謝します。この作業は、NIH T32 MH019113(D.A.M.およびK.A.K.)、NELLIE BALL Trust(T.H.W.およびA.J.W.)、NIH R01 MH111578(V.A.M.およびJ.A.W.)、NIH KL2 TR002536(A.J.W.)、およびRoy J. Carver Charitable Trust(V.A.M.、J.A.W.、A.J.W.)の支援を受けた。フィギュアは BioRender.com で作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90x250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
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