Summary
본 프로토콜은 소뇌 발달의 초기 단계를 조사하기 위해 유도 만능 줄기 세포로부터 소뇌 세포의 2D 단층 생성을 설명합니다.
Abstract
소뇌의 정확하고시기 적절한 발달은 정확한 운동 조정과 균형뿐만 아니라인지에도 중요합니다. 또한 소뇌 발달의 혼란은 자폐증, 주의력 결핍 과잉 행동 장애 (ADHD) 및 정신 분열증을 포함한 많은 신경 발달 장애와 관련이 있습니다. 인간의 소뇌 발달에 대한 조사는 이전에 사후 연구 또는 신경 영상을 통해서만 가능했지만 이러한 방법은 많은 신경 발달 장애가 발생하는 초기 발달 동안 생체 내에서 발생하는 분자 및 세포 변화를 이해하기에 충분하지 않습니다. 체세포에서 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생성하는 기술의 출현과 iPSC를 뉴런으로 재 분화시키는 능력은 초기 뇌 발달의 시험관 내 모델링을위한 길을 열었습니다. 본 연구는 2차원(2D) 단층 구조가 필요한 응용 분야를 위해 소뇌 세포를 생성하기 위한 단순화된 단계를 제공합니다. 초기 발달 단계를 나타내는 소뇌 세포는 다음 단계를 통해 인간 iPSC에서 파생됩니다 : 먼저 배아체를 3 차원 (3D) 배양으로 만든 다음 FGF2 및 인슐린으로 처리하여 소뇌 운명 사양을 촉진하고 마지막으로 폴리 -l- 오르니 틴 (PLO) / 라미닌 코팅 기판에서 단층으로 말단으로 분화됩니다. 분화 35일째에 iPSC 유래 소뇌 세포 배양은 ATOH1, PTF1α, PAX6 및 KIRREL2를 포함한 소뇌 마커를 발현하며, 이는 이 프로토콜이 글루타메이트성 및 GABAergic 소뇌 뉴런 전구체와 푸르킨제 세포 전구체를 생성함을 시사합니다. 또한, 분화 된 세포는 뚜렷한 뉴런 형태를 나타내며 TUBB3와 같은 뉴런 정체성의 면역 형광 마커에 양성입니다. 이 세포는 세마포린 -4C, 플렉신 -B2 및 뉴로 필린 -1을 포함한 축삭 유도 분자를 발현하며 신경 돌기 성장 및 시냅스 연결성의 분자 메커니즘을 조사하기위한 모델이 될 수 있습니다. 이 방법은 2D 단층 형식이 필요한 유전자 발현, 생리학 및 형태학적 연구를 포함한 다운스트림 응용 분야에 유용한 인간 소뇌 뉴런을 생성합니다.
Introduction
인간의 소뇌 발달과이 과정의 중요한 시간 창을 이해하는 것은 신경 발달 장애의 가능한 원인을 해독 할뿐만 아니라 치료 적 개입을위한 새로운 표적을 식별하는 데에도 중요합니다. 시험관 내에서 인간 소뇌 발달을 모델링하는 것은 어려운 일이었지만 시간이 지남에 따라 소뇌 혈통 운명을 가진 인간 배아 줄기 세포(hESC) 또는 iPSC를 분화하는 많은 프로토콜이 등장했습니다.1,2,3,4,5,6,7,8 . 또한 재현 가능한 결과를 생성하고 비교적 간단하며(오류를 줄이기 위해) 금전적 비용이 많이 들지 않는 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다.
소뇌 분화를 위한 첫 번째 프로토콜은 도금된 배아체(EB)의 2D 배양에서 생성되어 WNT, BMP 및 FGF 1,9를 포함하여 생체 내 발달과 유사한 다양한 성장 인자로 소뇌 운명을 유도했습니다. 보다 최근에 발표된 프로토콜은 주로 FGF2 및 인슐린을 사용한 3D 오가노이드 배양에서 분화를 유도하고, 이어서 마름모꼴 립형 구조3,4에 대해 FGF19 및 SDF1을 유도하거나, FGF2, FGF4 및 FGF85의 조합을사용했습니다. 두 소뇌 오가노이드 유도 방법 모두 동일한 시점에서 유사한 소뇌 마커 발현을 보고했기 때문에 유사한 3D 소뇌 오가노이드를 생성했습니다. Holmes와 Heine은 3D 프로토콜5를 확장하여 2D 소뇌 세포가 3D 응집체로 시작하는 hESC 및 iPSC에서 생성될 수 있음을 보여주었습니다. 또한 Silva et al.7은 3D에서 2D로 전환하고 성장 및 성숙 시간을 연장하는 다른 시점을 사용하여 Holmes와 Heine과 유사한 접근 방식으로 2D에서 성숙한 소뇌 뉴런을 나타내는 세포를 생성 할 수 있음을 입증했습니다.
현재 프로토콜은 인슐린과 FGF2를 사용하여 자유 부동 배아체(EB)를 생성한 다음 2D 성장 및 분화를 위해 14일째에 PLO/라미닌 코팅 접시에 EB를 플레이팅하여 피더가 없는 iPSC에서 소뇌 운명을 유도합니다. 35 일째에 소뇌 정체성을 가진 세포가 얻어진다. 특히 2D 환경에서 소뇌 발달의 초기 단계를 요약하는 기능을 통해 연구원은 단층 구조 실험이 필요한 특정 질문에 답할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 원하는 세포 집단을 풍부하게하기 위해 마이크로 패턴 표면, 축삭 성장 분석 및 세포 분류와 같은 추가 수정이 가능합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
인간 피험자 연구는 아이오와 대학교 기관 검토위원회 승인 번호 201805995 및 아이오와 대학교 인간 다 능성 줄기 세포위원회 승인 번호 2017-02에 따라 승인되었습니다. 피부 생검은 서면 사전 동의를 얻은 후 피험자로부터 얻었습니다. 섬유아세포를 37°C 및 5%CO2에서 15% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% MEM-비필수 아미노산 용액으로 DMEM에서 배양하였다. 섬유아세포는 전기천공을 위해 뉴클레오펙터를 사용하는 제조자의 프로토콜( 재료 표 참조)에 따라 에피솜 재프로그래밍 키트를 사용하여 재프로그래밍되었습니다. 모든 절차는 클래스 II 유형 A2 생물 안전 캐비닛 (줄여서 "후드")에서 수행되었습니다. 모든 세포 배양 배지는 항생제가 없었습니다. 따라서 후드에 들어간 모든 구성 요소는 70 % 에탄올로 세척되었습니다. 모든 세포 배양 배지 및 성분은 멸균 여과되거나 후드에서 개봉되어 이들의 멸균성을 유지하였다.
1. 실험 준비
- 기저막 매트릭스(BMM) 코팅 플레이트를 준비합니다.
알림: BMM은 따뜻한 온도에서 더 빨리 응고됩니다. 플레이트는 보관을 위해 신속하고 즉시 4 ° C에 배치해야합니다.- BMM( 재료 표 참조)을 얼음 위에서 4°C에서 최소 2시간 동안 또는 밤새 해동합니다.
- DMEM/F12와 BMM을 최종 농도 80μg/mL로 혼합합니다. BMM 용액을 조직 배양 접시(35mm의 경우 1mL, 60mm 접시의 경우 2mL)에 분배하고 세포를 플레이팅하기 전에 최소 1시간 또는 밤새 37°C에서 배양합니다.
알림: 사용하지 않은 접시는 4 ° C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다.
- 폴리 -L- 오르니 틴 / 라미닌 (PLO / 라미닌) 코팅 플레이트를 준비하십시오.
- 멸균 DPBS+/+에서 20μg/mL PLO( 재료 표 참조)를 준비하고 1웰 플레이트의 각 웰에 6mL를 추가합니다. 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양한다.
- 다음날 진공 흡인기로 PLO를 흡입하고 DPBS+/+로 두 번 세척합니다. 후드에서 자연 건조하십시오.
알림: 공기 건조 플레이트는 향후 사용을 위해 알루미늄 호일로 싸서 최대 4 ° C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다. - DPBS+/+에서 10μg/mL 라미닌( 재료 표 참조)을 준비하고 1웰 플레이트의 각 웰에 6mL를 추가합니다. 인큐베이터에서 3 시간 이상 또는 37 ° C에서 밤새 배양하십시오.
- 진공 흡인기로 라미닌을 흡인하고 1mL의 중간 또는 멸균 DPBS+/+를 추가합니다.
알림: 라미닌 코팅이 마르지 않아야합니다. 이를 방지하기 위해 PBS 또는 적절한 배양 배지를 즉시 추가해야 합니다. 코팅된 플레이트는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
- PSC 통과 솔루션을 준비합니다.
알림: 삼투압계( 재료 표 참조)는 PSC 통과 솔루션10을 만드는 데 필요합니다.- 11.49g의 염화칼륨(KCl)과 0.147g의 시트르산나트륨 이수화물(HOC(COONa)(CH2COONa)2*2H2O)을 400mL의멸균 세포 배양 등급수에 녹입니다(재료 표 참조).
- 용액의 부피를 측정하고 초기 부피 (Vi)로 기록하십시오.
- 오스몰 농도를 측정하고 공식 Vi × Oi = Vf × 570mOsm을 사용하여 멸균 세포 배양 등급 물을 추가하여 570mOsm으로 조정합니다.
- 0.20μm 필터로 용액을 필터 멸균하고 10mL 분취량을 만듭니다. 분취량을 실온(RT)에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.
- 만능줄기세포(PSC) 배지를 준비합니다.
알림: iPSC는 열에 안정적인 FGF2( 재료 표 참조)가 포함된 배지에서 유지되어 주말에 없는 수유 일정을 제공합니다. 상업적으로 이용 가능한 다른 PSC 미디어는 이 프로토콜에 대해 시도되지 않았습니다.- PSC 배지 보충제를 4°C에서 밤새 해동합니다.
- 기본 PSC 배지 10mL에 500mL의 PSC 배지 보충제를 추가합니다. 25mL 분취량을 만들어 -20°C에서 보관합니다.
알림: 냉동 분취량은 -20°C에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 해동된 분취량은 4°C에서 보관하고 2주 이내에 사용해야 합니다. 세포는 10%(v/v) 디메틸설폭사이드(DMSO)가 있는 PSC 배지에서 장기 보관을 위해 냉동될 수 있습니다.
- PSC 해동 매체를 준비하십시오.
- 50 nM 크로만, 1.5 μM 엠리카산, 1x 폴리아민 보충제 및 0.7 μM 트랜스-ISRIB(CEPT 칵테일11)로 PSC 배지를 보충합니다( 재료 표 참조).
- 0.20μm 필터로 필터 멸균하고 4°C에서 최대 4주 동안 보관합니다.
- 뽑은 유리 피펫을 준비하십시오.
- 22.9cm(9인치) 유리 파스퇴르 피펫을 분젠 버너 위의 목 아래 ~2cm 두 조각으로 당겨 두 개의 피펫을 만들고 더 얇은 면이 다른 쪽보다 ~4cm 짧습니다.
- 화염의 도움으로 당겨진면의 끝을 구부려 부드러운 "r"을 만듭니다.
- 추출한 피펫을 멸균을 위해 오토클레이브 슬리브와 오토클레이브에 넣습니다.
- 소뇌 분화 배지 (CDM)를 준비하십시오.
- IMDM과 Ham의 F12 영양소 혼합물을 1:1 비율로 혼합합니다. 1x L- 알라닌 -L- 글루타민 보충제, 1 % (v / v) 화학적으로 정의 된 지질 농축액, 0.45mM 1- 티오 - 글리세롤, 15 μL / mL 아포 - 트랜스페린, 5 mg / mL 소 혈청 알부민 (BSA) 및 7 μg / mL 인슐린으로 혼합물을 보충하십시오 ( 재료 표 참조).
- 0.20μm 필터로 필터 멸균하고 4°C에서 보관한 후 1개월 이내에 사용합니다.
- 소뇌 성숙 배지 (CMM)를 준비하십시오.
- 1x L- 알라닌 -L- 글루타민 보충제와 1x N-2 보충제로 신경 기저 배지를 보충하십시오 ( 재료 표 참조).
- 0.20μm 필터로 필터 멸균하고 4°C에서 보관한 후 2주 이내에 사용하십시오.
2. 피더가 필요 없는 iPSC 배양
- 아래 단계에 따라 세포를 해동하십시오.
- BMM 플레이트(단계 1.1)를 37°C 인큐베이터 내로 넣고 세포를 해동하기 전에 적어도 1시간 또는 밤새 겔화시킨다.
- 37°C에서 PSC 해동 배지 10mL(단계 1.5)를 예열합니다.
- 세포를 액체 질소로부터 37°C의 수조로 극저온으로 옮긴다.
참고: 세포 배양 공간에서 오염원이 발생하지 않도록 하려면 표준 수조를 사용하지 않는 것이 좋습니다. 대신, 담수를 작은 비커에서 37 ° C로 가열하여 일회용 수조를 생성 할 수 있습니다. - 튜브에 작은 얼음 조각이 남아 있으면 수조에서 꺼내 튜브를 말린 다음 70 % 에탄올을 뿌립니다. 튜브를 후드로 옮기고 2mL 또는 5mL 혈청학적 피펫( 재료 표 참조)을 사용하여 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 부드럽게 옮깁니다.
- 원뿔형 튜브를 소용돌이치면서 8mL의 PSC 해동 배지를 세포에 적가합니다. RT에서 5분 동안 200 x g 로 원심분리합니다.
- 세포 펠릿을 방해하지 않고 진공 흡인기로 상청액을 조심스럽게 흡인하십시오. 세포를 2mL의 PSC 해동 배지에 재현탁시킨다.
- 플레이트에서 BMM을 흡인하고 균일한 분포를 위해 플레이트 전체에 재현탁 셀을 적가합니다.
- 플레이트를 37°C, 5%CO2의 인큐베이터에 넣는다. 다음 날 PSC 미디어로 미디어를 새로 고칩니다. 그런 다음 매일 매체를 변경하십시오.
- 아래 단계에 따라 셀을 유지 관리합니다.
- 필요한 부피의 PSC 배지를 37°C에서 예열합니다(예: 35mm 플레이트당 배지 1mL).
- 플레이트에서 분화된 세포 또는 콜로니를 조사하고 당겨진 유리 피펫으로 분화된 세포를 제거합니다(단계 1.6).
참고: iPSC 콜로니는 형태학적으로 동일한 세포가 있는 매끄러운 가장자리를 가지고 있습니다. - 소비 된 매체를 매일 변경하고 3-4 일마다 또는 70 % 컨플루언스에 도달하면 통과하십시오.
- 세포를 통과시킵니다.
- 통과하기 전에 필요한 양의 BMM 플레이트를 최소 1 시간 또는 밤새 인큐베이터에 넣으십시오. 필요한 양의 PSC 배지를 37°C에서 예열합니다(단계 1.3).
- 뽑은 유리 피펫을 사용하여 분화된 세포나 콜로니를 제거합니다.
- 진공 흡인기로 사용한 배지를 흡인하고 35mm 접시당 1mL의 PSC 해리 배지를 추가합니다. 37°C에서 1-3분 동안 배양합니다.
알림: 콜로니가 PSC 배지를 추가하기 전에 PSC 계대 숙성 용액에서 리프팅되는 경우 배양 시간을 줄일 수 있습니다. - PSC 통과 용액을 흡인하고 예열된 PSC 매체를 추가합니다.
- 멸균 200μL 피펫 팁을 사용하여 한 방향으로 서로 평행한 스크래치 라인을 긁고 플레이트를 90° 돌리고 이전 스크래치 라인에 수직인 두 번째 스크래치 라인 세트를 만듭니다(플레이트를 가로질러 크로스해칭 패턴 만들기).
- 세트 플레이트에서 BMM 용액을 흡인합니다. 혈청 피펫을 사용하여 콜로니를 수집하고 새로운 BMM 플레이트에 분배합니다.
- 37°C, 5%CO2에서 배양한다. 매일 매체를 교체하십시오.
- 세포를 동결하십시오.
- 내용물에 라벨을 부착하여 냉동 바이알을 준비하고 후드의 자외선(UV) 아래에서 30분 동안 살균합니다( 재료 표 참조).
- PSC 배지에 10%(v/v) DMSO를 보충하여 PSC 동결 배지를 준비합니다. 2.3.2-2.3.5 단계를 따르십시오.
- 세포를 5mL 혈청학적 피펫이 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 RT에서 5분 동안 200 x g 로 원심분리합니다.
- 배지를 조심스럽게 흡인하고 PSC 동결 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 냉동 비알에 배포하십시오. 바이알을 냉동 용기에 넣고 -80 ° C 냉동고에 보관하십시오.
- 다음날, 장기 보관을 위해 냉동 비알을 액체 질소로 옮깁니다.
3. 소뇌 분화
알림: 차별화를 시작하기 전에 iPSC는 6개의 35mm 접시로 통과되며 70% 컨플루언스에 있을 때 차별화할 준비가 됩니다. 각 35mm 플레이트는 6웰 플레이트의 한 웰로 옮겨집니다.
- 0일째에 EB 형성을 위해 건강한 iPSC 콜로니를 들어 올립니다.
- 10μM Y-27632 및 10μM SB431542( 재료 표 참조)가 보충된 1mL의 CDM(단계 1.7)을 6웰 초저 부착(ULA) 플레이트의 각 웰에 추가하고 들어 올린 콜로니를 웰에 추가할 준비가 될 때까지 인큐베이터에 넣습니다.
- 뽑은 유리 피펫을 사용하여 분화된 세포를 세척합니다. 배지를 흡인하고 각 35mm 접시에 1mL의 PSC 계대 숙성 용액을 추가합니다. 37°C에서 3분 동안 배양하고, 흡인하고, 10 μM Y-27632 및 10 μM SB431542가 보충된 CDM 2 mL를 첨가한다.
알림: CDM을 추가하기 전에 PSC 계대 배양 용액에서 콜로니가 이륙하는 경우 배양 시간을 줄일 수 있습니다. - 투과광 도립 현미경에서 4배 배율을 사용하여 당겨진 유리 피펫의 구부러진 가장자리를 사용하여 콜로니를 부드럽게 들어 올립니다. 모든 콜로니가 들어 올려지면 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 6웰 ULA 플레이트의 한 웰로 모든 것을 부드럽게 옮깁니다. 각 iPSC 플레이트에 대해 이 과정을 반복합니다. 세포를 37°C에서 5%CO2로 배양한다.
알림: 콜로니가 너무 크거나 병합된 경우 당겨진 유리 피펫의 끝으로 슬라이스하여 더 작은 EB를 만들 수 있습니다.
- 2일째에 FGF2를 각 웰에 최종 농도 50ng/mL로 추가합니다.
참고: 소뇌 분화에 사용되는 FGF2는 열에 안정적이지 않습니다. 이 프로토콜은 열 안정성 FGF2로 테스트되지 않았습니다. - 7 일째에 1/3 중간 변경을하십시오. 웰에서 총 배지 3mL의 경우 1,000μL 피펫터를 사용하여 사용한 배지 1mL를 부드럽게 흡입하고 1mL의 새 CDM으로 교체합니다. EB를 7 일 동안 배양하십시오.
- 14일째에 1,000μL 피펫터를 사용하여 거의 모든 사용한 배지를 부드럽게 흡입합니다. EB의 손상을 최소화하려면 플레이트를 소용돌이 치면서 플레이트 중앙에 모든 EB를 모은 다음 플레이트를 기울여 가장자리에서 천천히 흡인합니다.
- 중간 양이 감소하면 천천히 판을 평평하게 놓고 계속 흡인하십시오. EB가 마르지 않도록 충분한 매체를 남겨 두십시오. 그런 다음 10μM Y-27632가 보충된 신선한 CDM 3mL를 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 EB를 PLO/라미닌 코팅 접시에 옮깁니다(단계 1.2).
알림: 다운스트림 응용 분야에 따라 EB를 6웰 PLO/라미닌 플레이트로 옮기거나 단일 EB를 PLO/라미닌 코팅 24웰 플레이트 또는 커버슬립의 단일 웰로 옮길 수 있습니다.
- 중간 양이 감소하면 천천히 판을 평평하게 놓고 계속 흡인하십시오. EB가 마르지 않도록 충분한 매체를 남겨 두십시오. 그런 다음 10μM Y-27632가 보충된 신선한 CDM 3mL를 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 EB를 PLO/라미닌 코팅 접시에 옮깁니다(단계 1.2).
- 15 일째에 배지를 흡인하고 신선한 CDM으로 교체하십시오.
알림: 시간이 지남에 따라 증발이 발생하므로 공급 사이에 충분한 배지를 확보하기 위해 웰에 충분한 배지를 추가하는 것이 중요합니다(예: 6웰 플레이트의 웰의 경우 배지 3mL 추가). 배지가 산성화되기 시작한 경우 (투명하고 노란색으로 변함) 프로토콜이 끝날 때까지 공급 일정에 있지 않더라도 배지를 새로 고칩니다. - 21 일에 사용한 배지를 흡인하고 CMM으로 교체하십시오. 28일째에 새 CMM으로 배지를 교체합니다. 35일째에, 추가 적용을 위해 세포를 수확한다.
4. RNA 분리를 위한 샘플 준비
- 배지를 흡인하고 500μL의 세포 해리 시약( 재료 표 참조)을 6웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 몇 초 동안 그대로두고 흡인하십시오.
- 뚜껑을 덮은 상태에서 접시를 실온에서 2분 동안 배양합니다. 플레이트의 측면을 탭하여 셀을 분리합니다.
- 1mL의 CMM을 추가하고(단계 1.8) 세포를 1.5mL 튜브에 수집합니다.
- RT(최대 속도 2000 x g)에서 30초 동안 벤치탑 미니 원심분리기(재료 표 참조)를 사용하여 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 배지를 버리고, 1 mL의 1 mL PBS pH 7.4를 첨가하여 세포 펠릿을 세척한다.
- RT에서 30초 동안 벤치탑 미니 원심분리기를 사용하여 셀을 다시 펠릿하고 PBS로 한 번 더 세척합니다.
- 세포를 펠릿하고 PBS를 버립니다. 시약을 함유하는 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트에서 세포를 용해시킨다( 재료 표 참조).
참고: 시약을 함유한 페놀 및 구아니딘 이소티오시아네이트에서 용해된 세포는 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 세포는 RNA 분리 방법 및 사용되는 시약에 따라 접시에서 직접 용해될 수 있습니다. 접시에 있는 세포 수가 적기 때문에 실리카 스핀 컬럼( 재료 표 참조)을 사용하여 RNA를 분리하면 RNA 수율이 높아집니다.
5. 면역형광염색을 위한 세포 준비
참고: 24웰 플레이트의 경우 웰당 1EB이면 충분합니다.
- 35일째에 사용한 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 DPBS+/+를 추가하여 세포를 세척합니다(24웰 플레이트의 한 웰에 대해).
- DPBS+/+를 흡인하고 DPBS+/+로 웰당 준비된 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA, 재료 표 참조) 500μL를 추가합니다. RT에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 4% PFA를 제거하고 5.1단계에서와 같이 DPBS+/+로 세포를 두 번 세척합니다. 1mL의 DPBS+/+를 추가하고 염색이 완료될 때까지 세포를 4°C에서 보관합니다.
참고: 세포 분리 및 항원 손실을 피하기 위해 고정 후 1주일 이내에 면역형광 염색을 수행하는 것이 좋습니다. 그러나, 항체 및 표적의 세포 위치에 따라, 염색은 고정 후 최대 4 주까지 나중에 수행 될 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D에서 2D로의 소뇌 분화 개요
소뇌 세포는 iPSC에서 시작하여 생성됩니다. 그림 1A 는 전체 워크플로와 차별화를 위한 주요 구성 요소의 추가를 보여줍니다. 0일째에 EB는 SB431542 및 Y-27632가 포함된 CDM의 당겨진 유리 피펫을 사용하여 iPSC 콜로니(그림 1B)를 부드럽게 들어 올리고 초저 부착 플레이트에 배치하여 만듭니다. FGF2는 2일째에 추가됩니다. 7 일째에 배지의 1/3이 변경되고 EB 형성이 관찰됩니다 (그림 1C). 14일째에 확대된 EB(그림 1D)를 Y-27632가 보충된 CDM의 PLO/라미닌 코팅 접시에 도금합니다. 15일째에, 배지는 Y-27632가 없는 CDM으로 대체된다. 세포는 코팅된 표면을 따라 EB(그림 1E)에서 바깥쪽으로 이동하기 시작합니다. 21 일에 완전한 배지 변경이 수행되고 배지가 CMM으로 전환됩니다. 그 후, 배지는 일주일에 한 번 (또는 매체가 빨리 산성화되는 경우 더 자주) 변경됩니다. 35 일째에는 뉴런과 같은 형태와 복잡성을 가진 세포의 단층이 있습니다 (그림 1F, G).
2D 세포는 소뇌 세포 마커를 발현합니다.
세포는 RNA 분리 및 면역형광 표지를 위해 35일째에 수확된다. 소뇌 발달 중에 존재하는 것으로 알려진 유전자의 발현은 RT-qPCR로 측정됩니다(그림 2). 세포는 ATOH1 12,13 (마름모꼴 립, 글루타메이트 전구 세포) 및 PTF1α14 (심실 영역, GABA 성 전구 세포)와 같은 초기 소뇌 전구 마커뿐만 아니라 푸르 킨제 전구 세포 마커 KIRREL2 15 및 SKOR2 15를 발현합니다. 초기 발달 소뇌 세포 마커 외에도 후기 발달 유전자 인 OTX2 및 SIX3의 발현도 관찰됩니다. 세포의 면역 형광 표지는 소뇌 마커 EN2 및 PTF1α (그림 3A, D), 신경 마커 TUBB3 (그림 3G) 및 증식 마커 Ki67 (그림 3J)에 대해 양성 염색을 보여줍니다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용한 핵 염색은 세포핵을 보여줍니다(그림 3B,E,H,K). 이 프로토콜을 추가로 검증하기 위해 신경 정신 장애 환자로부터 유래 한 iPSC를 사용하여 소뇌 세포를 생성하고 35 일째에 소뇌 세포 마커 발현을 분석했습니다. RT-qPCR 데이터는 대조군 iPSC와 유사한 발현 프로필을 나타낸다(보충 그림 1). 또한, 소뇌 발달과 관련된 축삭 유도 분자의 발현은 대조군 세포와 환자 유래 소뇌 세포 모두에 존재합니다 (보충 그림 2).
그림 1: 프로토콜 타임라인 및 대표 이미지의 개요. (A) 배양 배지의 유형, 배양 배지에 첨가 된 보충제, 배지 변경이 필요한 일 (수직선으로 표시) 및 배양 접시의 표면 코팅을 묘사하는 소뇌 분화 프로토콜의 개략적 개요. (B) 0일째의 iPSC와 EB를 만들기 전에 세척될 분화된 세포의 대표적인 명시야 이미지(빨간색 원으로 표시), (C) 7일째 및 (D) 14일째의 EB, (E) EB를 플레이팅한 다음 날, (F,G) 35일째의 성숙 세포. 스케일 바 (흑백): 1 밀리미터; (예: 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 35일째에 2D 소뇌 세포에서 소뇌 세포 마커의 발현. GAPDH로 정규화된 상이한 소뇌 발달 마커 및 세포 유형을 나타내는 선택된 유전자에 대한 RT-qPCR 유전자 발현 결과는 35일째에 이루어진다. -ΔCt 값은 타겟-Ct 값에서 뺀 GAPDH-Ct 값을 나타냅니다. 값이 0에 가까울수록 표현식이 더 높음을 나타냅니다. 선택한 선 아래의 모든 값은 감지 가능한 한계 아래의 표현식을 나타냅니다. N = 2 iPSC 라인, 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 35일째에 2D 소뇌 세포의 면역형광 표지. 세포는 35일째에 4% PFA로 고정되고, DAPI로 핵 염색되고, (A) EN2 (녹색), (B) DAPI(청색), (C) EN2-DAPI 병합에 대해 면역표지되고; (D) PTF1α (적색), (E) DAPI (청색), (F) PTF1α-DAPI 병합; (G) TUBB3 (녹색), (H) DAPI (파란색), (I) TUBB3-DAPI 병합; 및 (J) Ki67 (빨간색), (K) DAPI (파란색), (L) Ki67-DAPI가 병합되었습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 정신분열증 진단을 받은 환자로부터 유래한 iPSC를 사용한 소뇌 분화의 대표 이미지. (A) iPSC 콜로니, (B) 7일째의 EB, (C) 14일째의 EB, (D) 15일째의 PLO/라미닌 코팅 접시의 도금된 EB에서 자라는 세포, (E) 35일째의 소뇌 세포. (f) GAPDH로 정규화된 소뇌 세포 마커에 대한 35일째의 유전자 발현에 대한 RT-qPCR 결과. -ΔCt 값은 타겟-Ct 값에서 뺀 GAPDH-Ct 값을 나타냅니다. 값이 0에 가까울수록 표현식이 더 높음을 나타냅니다. 선택한 선 아래의 모든 값은 감지 가능한 한계 아래의 표현식을 나타냅니다. N = 2 iPSC 라인, 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 스케일 바 (A-C) : 1 mm; (D, E) : 500 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 35일째에 2D 소뇌 세포의 축삭 유도 분자의 유전자 발현. RT-qPCR 유전자 발현 결과는 축삭 유도 신호전달에 관여하는 선택된 분자에 대해 35일째에 GAPDH로 정규화된다. 표시된 모든 유전자는 발달 전반에 걸쳐 소뇌에서 낮은 발현을 보이는 PlxnB3를 제외하고 소뇌에서 발현되는 것으로 알려져 있습니다. -ΔCt 값은 타겟-Ct 값에서 뺀 GAPDH-Ct 값을 나타냅니다. 값이 0에 가까울수록 표현식이 더 높음을 나타냅니다. 선택한 선 아래의 모든 값은 감지 가능한 한계 아래의 표현식을 나타냅니다. N(대조군)=1, N(SCZ)=1이고, 삼중으로 실행된 실험의 평균이 도시되어 있다. 약어 : SCZ = 정신 분열증. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
시험관 내에서 인간 소뇌 발달을 모델링하는 능력은 질병 모델링뿐만 아니라 정상적인 뇌 발달에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. 덜 복잡하고 비용 효율적인 프로토콜은 복제 가능한 데이터 생성 및 여러 과학 실험실에서 광범위한 구현을 위한 더 많은 기회를 만듭니다. 소뇌 분화 프로토콜은 Muguruma et al.에 의해보고 된 성장 인자를 사용하여 효소 또는 해리 제를 필요로하지 않는 EB를 생성하는 수정 된 방법을 사용하여 여기에 설명되어 있습니다. 도 4는 Holmes et al.으로부터의 방법과 유사한 변형된 2D 단분자층 세포 성장 프로토콜을 포함한다. 5.
전체 프로토콜은 iPSC에서 EB를 생성하는 것으로 시작하여 소뇌 분화를 유도하고 마지막으로 2D 단층 배양을 위한 도금으로 이어집니다. 이 과정에서 7-14 일 사이에 상당한 양의 세포 사멸이 관찰되었습니다. 이 세포 손실로 인해 많은 수의 EB로 시작하는 것이 좋습니다. 2D 셀의 6웰 플레이트의 경우 최소 6개의 플레이트(35mm 또는 60mm 플레이트)의 iPSC로 시작하는 것이 좋습니다. 또한, PLO/라미닌에 EB를 도금할 때 Y-27632를 첨가하면 기판에 대한 EB의 부착이 크게 증가합니다. 간헐적으로 배양 물의 배지를 시각적으로 확인하는 것이 중요합니다. 배지가 노란색으로 변하는 경우 (산성화) 급식 계획에 없더라도 배지를 변경하는 것이 좋습니다. 부착되는 세포의 총 수는 실험마다 다르므로 배지에서 영양소를 더 자주 또는 덜 자주 새로 고쳐야합니다.
RT-qPCR 결과는 iPSC가 발달 중인 소뇌의 초기 단계를 나타내는 세포로 분화되었음을 밝혀냈습니다. 본 데이터는 분화 35일째에 뉴런 세포 운명 마커(TUBB3 16,17), 글루타메이트성 및 GABAergic 전구 마커(각각 ATOH1 12,13 및 PTF1α14), 중뇌-후뇌 경계 마커(EN1 18, EN2 18, GBX2 19), 협부 조직자 마커(WNT1 18, FGF8 19), 마름모꼴 립 유도체 세포 마커(PAX6 18 ), 및 푸르킨제 세포 전구 마커 (KIRREL215, SKOR220)를 포함한다. 마름모꼴 립 마커인 OTX221의 발현도 관찰되었다. hESC를 사용한 이전의 소뇌 오가노이드 프로토콜은 FGF2 유도가 GBX2 발현 세포에서 결과를 낳지만 OTX2 양성 세포는 거의 없는 반면, iPSC를 사용하는 유사한 프로토콜은 소뇌 오가노이드8에서 GBX2 및 OTX2의 동일한 mRNA 발현을 나타냈다는 것을 관찰했습니다. 그러나 마우스 배아 줄기 세포 (mESC) 유래 소뇌 뉴런은 별도의 OTX2 및 GBX2 양성 세포 클러스터4를 포함하고 있으며, OTX2는 마우스 22 및 인간21,23 소뇌 발달 전반에 걸쳐 발현되는 것으로 나타났습니다. 동일한 운명 사양 인자를 사용하는 프로토콜 간의 OTX2의 차등 발현 프로필은 프로토콜 간의 다른 차이 또는 hESC와 iPSC 간의 개인차 때문일 수 있습니다. 이것은 추가 조사가 필요합니다. SIX3 발현은 또한 배양 35일째에 관찰되었다. SIX3는 발달 중에 전방 신경관에서 발현되며 인간 소뇌에서의 발현은 발달과 성인기에 걸쳐 낮게 유지됩니다23,24; 그러나, 그것은 신생아 및 성인 마우스 소뇌25에서 발현된다. 이것은 전방 운명으로 분화하는 세포의 하위 집단이 있거나 발달 중에 SIX3를 발현하는 소뇌 세포의 하위 집단을 나타낼 수 있음을 시사합니다. 이 세포들은 더 탐구 될 수 있습니다.
분화 프로토콜은 종종 건강한 피험자의 hESC 또는 iPSC를 사용하여 개발되지만 이러한 프로토콜이 질병의 분자 및 세포 변화를 해부하기 위해 환자 유래 iPSC에 적용될 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 우리의 프로토콜을 추가로 테스트하기 위해 대조군 iPSC 라인과 함께 정신 분열증 진단을받은 환자로부터 얻은 섬유 아세포에서 재 프로그래밍 된 iPSC 라인을 차별화했습니다. 이전 문헌에 따르면 정신 분열증으로 진단받은 환자는 기능적 및 해부학 적 소뇌 이상26,27,28이 있습니다. 이러한 변화는 성인 환자에서 관찰되지만 발달 중에 시작될 수 있으며 추가 조사가 필요할 수 있습니다. 전반적으로, 정신 분열증 환자의 소뇌 세포는 35 일에 테스트 된 소뇌 마커를 발현하고 형태 학적으로 대조군 iPSC에서 유래 한 소뇌 세포와 다르지 않은 것으로 관찰되었습니다 (보충 그림 1). 이것은이 프로토콜이 질병 맥락에서 인간의 소뇌 발달을 조사 할 수 있음을 시사합니다. 또한, 발달의 주요 구성 요소 중 하나가 축삭 경로 찾기 및 신경 연결성 29,30,31,32이기 때문에 대조군 및 정신 분열증 세포주 모두에서 35 일째에 축삭 유도 마커의 발현도 조사되었습니다. 실제로, 35 일째에, 세마포린 -4C, 플렉신 -B2 및 뉴로 필린 -1을 포함하여 소뇌 발달에 나타나는 축삭 유도 분자가 확인되었습니다 (보충 그림 2). 발달 동안, 플렉신-B3 발현은 인간 소뇌 23에서 낮고, 분화를 위한 다른 축삭 유도 분자에 비해 플렉신-B3의 낮은 발현도 관찰되었다. 소뇌 마커의 발현과 함께 이것은 이 분화 프로토콜이 해당 구조에서 신경 세포 연결에 대한 올바른 신호를 발현하는 소뇌 세포를 생성한다는 강력한 표시입니다.
이 FGF2 및 인슐린 유도 소뇌 분화 프로토콜을 사용하여 생성 된 세포 유형은 단일 세포 분석을 통해 확인되지 않았다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. Nayler et al.8 은 최근 유사한 유도 프로토콜을 사용하여 생성된 소뇌 오가노이드의 단일 세포 프로파일링 데이터 세트를 발표했으며 향후 연구는 이러한 질문을 해결하기 위해 단일 세포 방법을 점점 더 많이 사용할 것으로 예상됩니다. 35일 이후의 세포는 또한 발현 또는 형태에 대해 시험되지 않았다. 나중 시점에서 소뇌 마커의 발현과 시간이 지남에 따라 어떻게 변하는 지 세포의 성숙도에 대한 더 많은 통찰력을 제공합니다. 줄기 세포 유래 소뇌 세포를 마우스 소뇌 과립 세포 전구체4 또는 인간 태아 소뇌 슬라이스33 과 공동 배양하면 성숙한 소뇌 세포, 특히 소뇌 오가노이드에 종종 존재하지 않는 푸르킨제 뉴런을 생성하는 것으로 나타났습니다. 특히, 최근 연구에 따르면 분화 35일에 해리되고 2D 성장을 위해 도금된 소뇌 오가노이드는 공동 배양 없이도 성숙한 소뇌 뉴런을생성합니다7. 이러한 응용 프로그램은 발달의 초기 단계를 조사하는 데 활용할 수 있는 이 프로토콜과 비교하여 소뇌 발달 및 신경 성숙의 후기 단계를 조사하는 것을 목표로 합니다. 또 다른 흥미로운 비교는 배양된 배아 마우스 소뇌 뉴런(34 )을 iPSC-유래된 인간 소뇌 뉴런과 비교함으로써 발생할 수 있으며, 잠재적으로 두 종 사이의 발달 및 운명 사양의 차이를 강조할 수 있다.
요약하면, 본 프로토콜은 iPSC로부터 생성된 시험관내 2D 소뇌 세포를 필요로 하는 애플리케이션에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 복잡한 단계나 재료를 포함하지 않고 비용 효율적이며 유전자 발현, 세포 형태 및 생리학을 조사하기 위한 초기 소뇌 발달 모델로 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Jenny Gringer Richards가 통제 대상을 검증하는 데 철저한 노력을 기울인 것에 대해 감사 드리며, 그로부터 통제 iPSC를 생성했습니다. 이 작업은 NIH T32 MH019113 (D.A.M. 및 K.A.K.), Nellie Ball Trust (T.H.W. 및 AJW), NIH R01 MH111578 (V.A.M. 및 J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (A.J.W.), 및 Roy J. Carver Charitable Trust (V.A.M., J.A.W. 및 AJW). 수치는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-thio-glycerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Filter Unit, 0.2 µm aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Easy Grip Tissue Cluture Dish | Falcon | 353001 | |
| 4D Nucleofector core unit | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Serological pipette | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Easy Grip Tissue Culture Dish | Falcon | 353004 | |
| 6-well ultra-low attachment plates | Corning | 3471 | |
| 9" Disposable Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrin | Sigma | T1147 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Cell culture grade water | Cytiva | SH30529.02 | |
| Chemically defined lipid concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Class II, Type A2, Biological safety Cabinet | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Hood, UV light |
| Costar 24-well plate, TC treated | Corning | 3526 | |
| Costar 6-well plate, TC treated | Corning | 3516 | |
| DAPI solution | Thermo Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimethly sulfoxide) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 episomal iPSC reprogramming kit | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | PSC medium with heat-stable FGF2 |
| EVOS XL Core Imaging system | Life Technologies | AMEX1000 | |
| Fetal bovine serum - Premium Select | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| GlutaMAX supplement | Gibco | 35050061 | L-alanine-L-glutamine supplement |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Human Anti-EN2, mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Human anti-Ki67/MKI67, rabbit | R&D Systems | MAB7617 | |
| Human anti-PTF1a, rabbit | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Human anti-TUBB3, mouse | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulin | Gibco | 12585 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini Centrifuge | Labnet International | C1310 | Benchtop mini centrifuge |
| Monarch RNA Cleanup Kit (50 µg) | New England BioLabs | T2040 | Silica spin columns |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | New England BioLabs | T2010 | Silica spin columns |
| N-2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyamine supplement | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Potassium chloride | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| See through self-sealable pouches | Steriking | SS-T2 (90x250) | Autoclave pouches |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Syringe filters, sterile, PES 0.22 µm, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | Phenol and guanidine isothiocyanate |
| TrypLE Express Enzyme (1x) | Gibco | 12604039 | Cell dissociation reagent |
| Vapor pressure osmometer | Wescor, Inc. | Model 5520 | Osmometer |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
References
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
- Erceg, S., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells. Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).
- Muguruma, K. 3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer. Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888 (2017).
- Holmes, D. B., Heine, V. M. Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium. Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).
- Silva, T. P., et al. Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70 (2020).
- Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids. Scientific Reports. 11, 12959 (2021).
- Salero, E., Hatten, M. E. Differentiation of ES cells into cerebellar neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).
- Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells. PLoS One. 9 (1), 88012 (2014).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).
- Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).
- Mizuhara, E., et al. Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin. Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).
- Ferreira, A., Caceres, A. Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture. Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).
- Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).
- Joyner, A. L. Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).
- Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer. Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).
- Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker. Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).
- Aldinger, K. A., et al. Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development. Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).
- Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development. Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).
- Akbarian, S., et al.
- Aijaz, S., et al. Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18. Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).
- Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain. Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).
- Andreasen, N. C., Pierson, R.
- Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept. Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).
- Jacobsen, L. K., et al. Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia. American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).
- Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation. The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).
- Kim, D., Ackerman, S. L. The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons. Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).
- Maier, V., et al. Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development. Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).
- Telley, L., et al. Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum. Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).
- Wang, S., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons. Scientific Reports. 5, 9232 (2015).
- Shabanipour, S., et al. Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (152), e60168 (2019).
