Summary
Dieses Protokoll beschreibt die detaillierte Methode der digitalen Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zur präzisen Quantifizierung von zirkulären RNA (circRNA)-Spiegeln in Zellen unter Verwendung divergenter Primer.
Abstract
Die digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (dd-PCR) ist eine der empfindlichsten Quantifizierungsmethoden; Es fraktioniert die Reaktion in fast 20.000 Wasser-in-Öl-Tröpfchen, und die PCR tritt in den einzelnen Tröpfchen auf. Die dd-PCR hat mehrere Vorteile gegenüber der herkömmlichen real-time qPCR, einschließlich einer erhöhten Genauigkeit bei der Erkennung von Zielen mit geringer Abundanz, dem Weglassen von Referenzgenen für die Quantifizierung, der Eliminierung technischer Replikate für Proben und der hohen Widerstandsfähigkeit gegenüber Inhibitoren in den Proben. In jüngster Zeit hat sich die dd-PCR zu einer der beliebtesten Methoden zur genauen Quantifizierung von Ziel-DNA oder RNA für die Genexpressionsanalyse und -diagnostik entwickelt. Zirkuläre RNAs (circRNAs) sind eine große Familie von kürzlich entdeckten kovalent geschlossenen RNA-Molekülen ohne 5' und 3' Enden. Es wurde gezeigt, dass sie die Genexpression regulieren, indem sie als Schwämme für RNA-bindende Proteine und microRNAs fungieren. Darüber hinaus werden circRNAs in Körperflüssigkeiten sezerniert, und ihre Resistenz gegen Exonukleasen macht sie zu Biomarkern für die Krankheitsdiagnose. Dieser Artikel soll zeigen, wie divergentes Primer-Design, RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und dd-PCR-Analyse durchgeführt werden können, um spezifische zirkuläre RNA (circRNA) -Spiegel in Zellen genau zu quantifizieren. Abschließend demonstrieren wir die genaue Quantifizierung von circRNAs mittels dd-PCR.
Introduction
Jüngste Fortschritte bei RNA-Sequenzierungstechnologien und neuartigen Computeralgorithmen haben ein neues Mitglied der wachsenden Familie nicht-kodierender RNAs entdeckt, die als zirkuläre RNA (circRNA)1 bezeichnet wird. Wie der Name schon sagt, sind circRNAs eine Familie von einzelsträngigen RNA-Molekülen ohne freie Enden. Sie werden durch nicht-kanonisches Kopf-zu-Schwanz-Spleißen gebildet, das als Back-Splicing bezeichnet wird, bei dem sich die vorgeschaltete Spleißakzeptorstelle kovalent mit der nachgeschalteten Spleißspenderstelle verbindet, um einen stabilen RNA-Kreis 1,2 zu bilden. Dieser Prozess könnte durch mehrere Faktoren vermittelt werden, einschließlich invertierter Alu-Repetitionselemente, die im Upstream und Downstream von zirkularisierten Exons vorhanden sind, oder kann durch einige Spleißfaktoren oder RNA-bindende Proteine (RBPs) vermittelt werden2,3. Zirkuläre RNAs, die ausschließlich aus der exonischen oder intronischen Sequenz erzeugt werden, werden als exonische circRNA und zirkuläre intronische RNAs oder ci-RNAs klassifiziert, während einige exonische circRNAs das Intron behalten und als Exon-Intron-circRNAs (EIcircRNAs) bezeichnet werden3,4. Die Funktionen von circRNAs sind vielfältig, einschließlich der Schwammbildung von miRNA und/oder RBP, der Regulierung der Transkription und der Regulierung der zellulären Funktion durch Übersetzung in Peptide 3,5,6,7. Mehrere Berichte haben die Bedeutung von circRNAs bei verschiedenen Krankheiten und physiologischen Prozessen hervorgehoben8. Darüber hinaus machen gewebespezifische Expressionsmuster und Resistenz gegen Exonuklease-Verdauung es zu einem funktionellen Biomarker für die Krankheitsdiagnostik und kann auch als geeignetes therapeutisches Ziel verwendet werden8. In Anbetracht seiner Bedeutung für die Regulierung von Gesundheit und Krankheiten ist die genaue Quantifizierung der circRNA-Expression das Gebot der Stunde.
Mehrere biochemische Methoden wurden entwickelt, um circRNAs in biologischen Proben zu quantifizieren9. Eine der bequemsten und am weitesten verbreiteten Methoden zur circRNA-Quantifizierung ist die reverse Transkription gefolgt von einer quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) unter Verwendung divergenter Primerpaare10. Die Mehrheit der circRNAs ist jedoch im Vergleich zu linearen mRNAs in geringer Häufigkeit, was es schwierig macht, sie zu quantifizieren11. Um dieses Problem zu lösen, haben wir versucht, die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR) zu verwenden, um die Anzahl der circRNAs in einer bestimmten Probe genau zu quantifizieren. Die dd-PCR ist eine fortschrittliche PCR-Technologie, die dem Prinzip der Mikrofluidik folgt. es erzeugt mehrere wässrige Tröpfchen in Öl, und die PCR tritt in jedem Tröpfchen als individuelle Reaktion auf12. Die Reaktion erfolgt in einzelnen Tröpfchen und wird mit einem Tröpfchenleser analysiert, der die Anzahl der positiven oder negativen Tröpfchen für das interessierende Gen12 angibt. Es ist die empfindlichste Technik, um ein Gen von Interesse genau zu quantifizieren, auch wenn es nur eine einzige Kopie in einer bestimmten Probe gibt. Verminderte Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren, bessere Präzision und das Weglassen des Referenzgens für die Quantifizierung machen es vorteilhafter als herkömmliche qPCR13,14,15. Es wurde häufig als Forschungs- und Diagnosewerkzeug für die absolute Quantifizierung eines interessierenden Gensverwendet 16,17. Hier beschreiben wir das detaillierte dd-PCR-Protokoll für die circRNA-Quantifizierung bei der Differenzierung von C2C12-Myotuben der Maus und proliferierenden C2C12-Myoblasten der Maus unter Verwendung divergenter Primer.
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Protocol
RNA ist empfindlich gegenüber RNasen; Daher sollten alle Reagenzien, Instrumente und Arbeitsbereiche RNase-frei sein und mit Sorgfalt behandelt werden.
1. Divergentes Primerdesign für circRNA (siehe Abbildung 1)
- Rufen Sie die reife Sequenz aus circRNA-Annotationsdaten mit BEDTools oder aus dem UCSC-Genombrowser ab, indem Sie die Exon/Intron-Sequenz zwischen den Backspleißverbindungskoordinaten18,19 verbinden.
- Bereiten Sie eine PCR-Vorlagensequenz von 200 Nukleotiden Länge vor, indem Sie die letzten 100 Nukleotide der gesamten circRNA-Sequenzlänge mit den ersten 100 Nukleotiden der circRNA-Sequenz10 verbinden.
HINWEIS: Wenn die circRNA-Länge weniger als 200 Nukleotide beträgt, teilen Sie sie in zwei gleiche Hälften und verbinden Sie die Nukleotide von der letzten Hälfte bis zum Anfang der ersten Hälfte. - Verwenden Sie die obige Vorlagensequenz für das Primer-Design, indem Sie das Primer3-Webtool verwenden und eine PCR-Produktlänge von 120-180 Nukleotiden in der Länge20 einstellen.
- Verwenden Sie die Standardeinstellungen von Primer3 für andere Parameter wie Tm und Primerlänge. Die Primersequenzen für circBnc2 sind in Tabelle 1 aufgeführt.
- Bestellen Sie die divergenten Primersequenzen für die Synthese bei einem beliebigen oligosynthetisierenden Unternehmen.
2. RNA-Isolierung
HINWEIS: Isolieren Sie die Gesamt-RNA aus den C2C12-Zellen der Maus mit handelsüblichen Kits oder einer internen RNA-Isoliermethode. Die hier verwendete hauseigene RNA-Isolierungsmethode wurde bereits21 beschrieben. Die magnetischen Kieselsäurekügelchen werden im Labor unter Verwendung des zuvor veröffentlichten Protokolls22 hergestellt. Diese magnetischen Perlen können auch von verschiedenen Anbietern bezogen werden.
- Nehmen Sie eine 10-cm-Schale mit etwa 5 x 106 proliferierenden C2C12-Myoblastenzellen und einem 4-tägigen differenzierten C2C12-Myoröhrchen zur RNA-Isolierung.
- Waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 ml 1x PBS und entsorgen Sie das PBS mit einer Pipette.
- Die Zellen in 1 ml 1x PBS mit einem Zellschaber abkratzen, bei 4 °C für 5 min bei 750 x g zentrifugieren und PBS mit einer Pipette entsorgen.
- Fügen Sie 1 ml RNA-Isolierreagenz (RIR) hinzu und lysieren Sie die Zellen durch kräftiges Pipettieren21.
- Fügen Sie 200 μL (1/5 des Volumens von RIR) Chloroform und Wirbel für 15 s hinzu. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 4 °C für 10 min bei 12.000 x g.
- Nehmen Sie 400 μL der oberen wässrigen Schicht, laden Sie sie auf eine Kieselsäuresäule und zentrifugieren Sie für 1 min bei 12.000 x g bei Raumtemperatur. Nehmen Sie den Durchfluss in ein neues Röhrchen und fügen Sie 600 μL 100% Ethanol hinzu.
- Fügen Sie 20 μL magnetische Kieselsäurekügelchen hinzu und legen Sie das Röhrchen für 5 min auf einen Thermomixer, der auf 25 °C und 1.200 U/min eingestellt ist.
HINWEIS: Das Perlenvolumen kann je nach anfänglicher Zellzahl für die Lyse erhöht oder verringert werden. Magnetische Kieselsäureperlen können von kommerziellen Anbietern bezogen werden. - Legen Sie das Röhrchen für 30 s auf einen magnetischen Ständer oder bis die Lösung klar ist. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
- Resuspendieren Sie die magnetischen Kieselsäurekügelchen in einem 500 μL Waschpuffer mit 90% Ethanol. Legen Sie das Rohr für 30 s auf den Magnetständer. Drehen Sie das Rohr zweimal auf dem Magnetständer, um die Perlen zu waschen. Lassen Sie die Perlen sich in Richtung des Magneten absetzen und entsorgen Sie den Puffer mit einer Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 2.9 zweimal. Nach dem Waschen das Röhrchen kurz umdrehen und für 30 s wieder auf den Magnetstativ legen. Entsorgen Sie den restlichen Waschpuffer. Trocknen Sie das Röhrchen bei 50 °C für 3 min an der Luft auf einem Thermomixer und halten Sie den Deckel offen.
- Fügen Sie 20 μL nukleasefreies Wasser hinzu und resuspendieren Sie die Perlen.
HINWEIS: Das RNA-Elutionsvolumen kann auf 10 μL reduziert werden, um die RNA-Konzentration zu erhöhen. - Stellen Sie die Röhrchen für 2-3 min bei Raumtemperatur. Legen Sie das Rohr wieder auf den Magnetständer und lassen Sie es 30 s sitzen. Sammeln Sie die gelöste RNA in einem neuen Röhrchen zur Quantitäts- und Qualitätsbeurteilung mit einem Spektralphotometer.
HINWEIS: RNA kann bei −20 °C oder −80 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden. Um ein optimales Ergebnis zu erzielen, wird empfohlen, am nächsten Tag mit dem Schritt der cDNA-Synthese fortzufahren.
3. cDNA-Synthese
- Messen Sie die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer und nehmen Sie 1 μg RNA für die cDNA-Synthese.
- Mischen Sie 1 μg Gesamt-RNA mit 1 μL dNTP-Mix (jeweils 10 mM dATP, dTTP, dGTP und dCTP), 4 μL 5x Reverse-Transkriptase (RT)-Puffer, 2 μL 10x RT-Zufallsprimer, 0,25 μL reverses Transkriptase-Enzym (200 U/μL) und 0,5 μL RNase-Inhibitor (40 U/μL) und bilden das Volumen mit nukleasefreiem Wasser auf bis zu 20 μL.
HINWEIS: Das Enzymvolumen der reversen Transkriptase kann abhängig von der anfänglichen RNA-Konzentration für die cDNA-Synthese verändert werden. - Klopfen Sie auf das Röhrchen, um die Reaktion zu mischen und kurz zu drehen. Stellen Sie das Röhrchen 10 min bei 25 °C, gefolgt von 1 h bei 50 °C.
- Um das Enzym zu inaktivieren, stellen Sie das Röhrchen für 5 min bei 85 °C.
- Kühlen Sie das Röhrchen in Eis für 2 min und fügen Sie 480 μL nukleasefreies Wasser in das Röhrchen hinzu, um die cDNA-Konzentration auf 2 ng / μL zu erhöhen.
HINWEIS: cDNA kann bei -20 °C gelagert oder sofort für die dd-PCR-Analyse verwendet werden.
4. Workflow für die digitale Tröpfchen-PCR (dd-PCR)
HINWEIS: Der Workflow der dd-PCR umfasst mehrere Schritte, beginnend mit der Probenvorbereitung, gefolgt von der Tröpfchenerzeugung, PCR-Amplifikation, Tröpfchenzählung und Datenanalyse. Jeder Schritt ist entscheidend für die genaue Datengenerierung, da dd-PCR die absolute Quantifizierung von Produkten beinhaltet und keine Standardkurve benötigt. Daher wurde jeder der verschiedenen Schritte der dd-PCR im Folgenden beschrieben.
- Vorbereitung der dd-PCR-Reaktion.
- Richten Sie die PCR-Reaktion von 22 μL in 0,2 ml PCR-Röhrchen oder -Streifen zusammen mit einem Negativkontrollröhrchen und NTC-Röhrchen (Non-Template-Control) ein.
HINWEIS: Jedes unterschiedliche divergente Primerpaar für den Nachweis verschiedener circRNAs muss zusammen mit Testproben eine NTC-Reaktion aufweisen. - Fügen Sie 11 μL dd-PCR-Master-Mix (z. B. EvaGreen Supermix) und 11 μL nukleasefreies Wasser hinzu, um das Negativkontrollreaktionsröhrchen einzurichten.
HINWEIS: Tauen Sie den dd-PCR-Master-Mix bei Raumtemperatur auf, gefolgt von einem kurzen Wirbel, um eine homogene Mischung zu erhalten. Verwenden Sie das gleiche nukleasefreie Wasser, um das Negativkontrollreaktionsröhrchen und die NTC-Röhrchen einzurichten, die zum Verdünnen der cDNA verwendet wurden. - Fügen Sie 11 μL dd-PCR-Master-Mix, 5,5 μL circRNA-spezifische Forward- und Reverse-Primermischung mit 1 μM-Konzentration und 5,5 μL nukleasefreies Wasser hinzu, um die NTC-Reaktionsröhrchen einzurichten.
HINWEIS: Verdünnen Sie die vorwärts- und rückwärts zirkulären RNA-spezifischen divergenten Primer von 100 μM Stamm und mischen Sie, um eine Arbeitskonzentration von 1 μM vorwärts und umgekehrt circRNA-Primermischung herzustellen; Somit beträgt die endgültige Primerkonzentration 250 nM in der 22 μL-Reaktion. - Fügen Sie 11 μL dd-PCR-Mastermix, 5,5 μL circRNA-spezifische Forward- und Reverse-Primermischung mit 1 μM-Konzentration und 5,5 μL cDNA (2 ng/μL) hinzu, um die Testreaktionsröhrchen einzurichten.
- Anschließend werden alle Reaktionsröhrchen kurz zentrifugiert, um ein homogenes Reaktionsgemisch am Boden der Röhrchen zu erhalten.
- Richten Sie die PCR-Reaktion von 22 μL in 0,2 ml PCR-Röhrchen oder -Streifen zusammen mit einem Negativkontrollröhrchen und NTC-Röhrchen (Non-Template-Control) ein.
- Tröpfchenerzeugung.
- Das 20 μL PCR-Gemisch aus 0,2 mL PCR-Röhrchen in die Probenvertiefungen der Tröpfchengeneratorkartusche überführt.
- Geben Sie 70 μL Tröpfchenerzeugungsöl vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette in die Ölquellen der Tröpfchengeneratorkartusche.
HINWEIS: Inkubieren Sie das Tröpfchenöl vor Gebrauch 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. - Decken Sie die Tröpfchengeneratorpatrone mit der Gummidichtung ab und legen Sie sie in die Tröpfchengeneratormaschine, um die Probenöl-Tröpfchenmischung zu erhalten, die in den Tröpfchenmulden der Patrone erzeugt wird.
- PCR-Amplifikation.
- 40 μL der Probenöl-Tröpfchenmischung aus den Tröpfchenmulden der Tröpfchengeneratorkartusche auf eine 96-Well-PCR-Platte mit einer Mehrkanalpipette übertragen.
HINWEIS: Übertragen Sie die Proben-Öl-Tröpfchenmischung vorsichtig, während Sie durch die Spitzen der Mehrkanalpipette einen Winkel zu den Vertiefungen bilden, um zu vermeiden, dass die Tröpfchen beim Übertragen auf die dd-PCR 96-Well-Platte gebrochen werden. - Verschließen Sie die 96-Well-PCR-Platte mit dem Aluminiumfolienversiegeler, legen Sie sie in den auf 80 °C vorgeheizten Maschinenblock der Plattenversiegelung und klicken Sie auf die Versiegelung der PCR-Platte.
- Legen Sie nun die Platte in den dd-PCR-Thermocycler und stellen Sie das Programm wie in Tabelle 2 beschrieben ein, wobei die Deckeltemperatur auf 105 °C und eine Rampenrate von 2 °C/s eingestellt ist.
- 40 μL der Probenöl-Tröpfchenmischung aus den Tröpfchenmulden der Tröpfchengeneratorkartusche auf eine 96-Well-PCR-Platte mit einer Mehrkanalpipette übertragen.
- Tröpfchenzählung.
- Sobald die PCR abgeschlossen ist, legen Sie die Platte auf das tt-PCR-Tröpfchenzählergerät mit dem Plattenhalter in der richtigen Position zum Zählen der Tröpfchen.
- Öffnen Sie die Tropfenanalysesoftware und richten Sie den Lauf ein, indem Sie Eingaben für die Probeninformationen geben.
- Klicken Sie auf die Setup-Option. Klicken Sie dann auf die Vorlagenoption , um eine neue Vorlage zu öffnen.
- Definieren Sie jede Vertiefung, indem Sie die Details des Experiments angeben, z. B. Probenname (verwendete cDNA oder Negativkontrolle oder NTC), Zielname (circRNA-Primername) und Typ (unbekannt) und Experimenttyp als ABS (absolute Quantifizierung) und Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) usw.
- Speichern Sie abschließend die Vorlage und starten Sie den Lauf, indem Sie auf die Ausführungsoption klicken und die Zählung nach Zeile oder Spalte auswählen. Lassen Sie die Maschine die Tröpfchenzählung abschließen, die etwa 1 Minute / Well dauert.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Analysieren , um die Daten nach Abschluss der Tröpfchenmessung zu analysieren.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche 1D-Amplitude , um die positiven und negativen Tröpfchen anzuzeigen
- Um die positiven Tröpfchen von den negativen Tröpfchen zu trennen, setzen Sie eine gemeinsame Schwellenwertlinie für alle Proben mit demselben Ziel.
HINWEIS: Die Gesamtzahl der Tröpfchen in jeder Probe sollte über 10.000 liegen, um für die absolute Quantifizierung berücksichtigt zu werden. Der NTC sollte keine positiven Tröpfchenzahlen aufweisen. Das Vorhandensein positiver Tröpfchen im NTC weist auf eine Kontamination der Reagenzien oder eine Amplifikation der Primer-Dimere hin. Es ist schwierig herauszufinden, ob die positiven Tröpfchen Primer-Dimere oder unspezifische Produkte in NTC enthalten. Es wird empfohlen, die Primer zu überprüfen und eine Kontamination der Reagenzien als allgemeine Praxis für jede PCR einschließlich dd-PCR zu vermeiden. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren , um die circRNA-Zähldaten als .csv Datei zu exportieren. Die exportierten Daten zeigen die Anzahl der in jeder Probe vorhandenen circRNAs.
- Berechnen Sie manuell die Anzahl der circRNAs in jeder Probe pro Nanogramm RNA, indem Sie die Gesamtmenge an cDNA berücksichtigen, die in jeder Reaktion verwendet wird.
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Representative Results
Die absolute Anzahl der circRNAs in jeder Probe kann aus den exportierten dd-PCR-Daten abgeleitet werden. Die quantitative PCR-Analyse in Echtzeit deutete auf eine differentielle Expression von circBnc2 in den differenzierten C2C12-Myotuben hin (Daten nicht gezeigt). Hier wollten wir die absolute Kopienzahl von circBnc2 in proliferierenden C2C12-Myoblasten und Myotuben überprüfen. Da die Expression von circBnc2 unter zwei Bedingungen verglichen wird, ist es sehr wichtig, alle Proben für RNA-Isolierung, cDNA-Synthese und PCR gleichzeitig mit den gleichen Reagenzien und Verfahren zu verarbeiten. Um die absolute Quantifizierung von circRNAs mit Hilfe der dd-PCR-Reaktion durchzuführen, sollte eine gleiche Menge der anfänglichen Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese verwendet werden, um die genaue Anzahl der Ziel-RNA-Moleküle pro Nanogramm Gesamt-RNA zu berechnen. Zum Beispiel wurde 1 μg Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese verwendet und unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser auf 500 μL verdünnt, um eine Endkonzentration von 2 ng/μL zu erhalten, bevor der dd-PCR-Assay durchgeführt wurde (Abbildung 1).
Wie in Abbildung 2A gezeigt, wurde cDNA aus 10 ng RNA aus proliferierenden C2C12-Myoblastenzellen (MB) und einem 4-tägigen differenzierten Myoröhrchen (MT) verwendet, um den Unterschied in der Expression von circBnc2 unter diesen beiden Bedingungen zu überprüfen. Die Proben wurden verarbeitet, um das Tröpfchen zu erzeugen und PCR durchzuführen, gefolgt von der Zählung der positiven und negativen Tröpfchen mit der Tröpfchenanalysesoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers (Abbildung 2B). Da Primer unspezifische Produkte verstärken und Primer-Dimere bilden können, sollte NTC für alle Primer-Sets verwendet werden. Idealerweise sollte NTC keine positiven Tröpfchenzahlen aufweisen.
Wie in Abbildung 3A gezeigt, zeigten alle Proben außer MT1 mehr als 12.000 Tröpfchenzahlen. Da die Gesamttropfenzahl in MT1 niedrig war, wurde diese Stichprobe nicht für die endgültige Datenanalyse berücksichtigt. Die niedrige Gesamttropfenzahl kann auf einen Fehler bei der Tröpfchenerzeugung, einen Bruch der Tröpfchen während der Übertragung auf die PCR-Platte oder Pipettierprobleme zurückzuführen sein. Interessanterweise gab es einen deutlichen Unterschied im Expressionsmuster von circBnc2 in der 4-tägigen differenzierten Myotube-Bedingung im Vergleich zu den Myoblastenzellen. Die Analyse der circBnc2-Häufigkeit in Bezug auf die Kopienzahl zeigte, dass die drei Replikate von C2C12-Myoblasten 76,8, 67 und 46 Kopien / ng RNA aufwiesen, während die beiden Myotube-Proben 558 und 610 Kopien / ng RNA aufwiesen (Abbildung 3B). Da eine Myotube-Probe nicht gut funktionierte, ist es besser, eine größere Anzahl biologischer Replikate zu haben, um die statistischen Unterschiede in ihren Expressionsmustern unter den beiden Bedingungen zu untersuchen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des divergenten Primerdesigns für die PCR-Amplifikation von circBnc2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Der dd-PCR-Workflow für die circRNA-Quantifizierung. Der komplette dd-PCR-Workflow umfasst viele Schritte: (A) RNA-Isolierung und cDNA-Präparation aus C2C12-Myoblasten und 4-tägigen differenzierten Myotube-Zellen, PCR-Mischungsvorbereitung, (B) Tröpfchenerzeugung, PCR-Amplifikation, Tröpfchenzählung und Datenanalyse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Datenanalyse mit QuantaSoft-Software. (A) Die Datenanalyse umfasst die Identifizierung von positiven und negativen Tröpfchen mit Hilfe der Quantifizierungssoftware. (B) Berechnung der Anzahl der circRNAs/ng RNA in C2C12-Myoblasten (MB) und Myotuben (MT). Die Daten im Balkendiagramm Panel B stellen den Mittelwert ± STDEV von zwei bis drei biologischen Replikaten dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Name der Grundierung | Reihenfolge |
| circBnc2 Vorwärtsgrundierung | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2 Reverse Primer | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
Tabelle 1: Divergente Primersequenzen zur Amplifikation von circBnc2.
| Schritt | Temperatur (°C) | Zeit | Anzahl der Zyklen | Rampenrate |
| Enzymaktivierung | 95 | 10 Minuten | 1 | ~ 2 °C/s |
| Denaturierung | 94 | 30 s | 40 | ~ 2 °C/s |
| Glühen/Ausdehnen | 60 | 1 min | 40 | ~ 2 °C/s |
| Signalstabilisierung | 4 | 5 Minuten | 1 | ~ 2 °C/s |
| Signalstabilisierung | 90 | 5 Minuten | 1 | ~ 2 °C/s |
Tabelle 2: Bedingungen für die PCR-Amplifikation von circBnc2 an einem Thermocycler.
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Discussion
Die CircRNA-Forschung ist in den letzten zehn Jahren mit der Entdeckung von Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologien gewachsen. Daher wurde es als potenzielles Molekül für zukünftige RNA-Therapeutika angesehen. Darüber hinaus ist bekannt, dass es als Biomarker bei mehreren Krankheiten wirkt, einschließlich Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 4,8. Die Identifizierung von circRNA ist jedoch aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwierig und sie hat nur eine spezifische Backspleißverbindungssequenz, die sie von der elterlichen mRNA9 unterscheidet. RT-PCR mit divergenten Primern ist seit seiner Entdeckung 9,10 die Goldstandardtechnik zur Validierung von circRNA. Obwohl mehrere molekulare Methoden zur circRNA-Quantifizierung entwickelt wurden, ist es aufgrund ihrer geringen Häufigkeit schwierig, circRNA-Expressionen genau zu messen. Da dd-PCR sehr wenig vorkommende RNA/DNA-Moleküle aus einer gegebenen Probe amplifizieren kann14, ist es eine der besten Methoden zur genauen Quantifizierung von circRNAs.
Die dd-PCR ist ein Endpunktassay, der eine absolute Quantifizierung des Zielgens15 ermöglicht. Im Gegensatz zur herkömmlichen qPCR ist sie zeitaufwendig, langwierig und teuer, so dass sie im Vergleich zur Real-Time-PCR auch ein Jahrzehnt nach ihrer Entdeckung weniger akzeptiertwird 15. Es bietet jedoch mehrere Vorteile gegenüber der weit verbreiteten qPCR zur Untersuchung von Genexpressionsänderungen13,23. Erstens kann dd-PCR die genaue Anzahl der DNA-Kopien in einer bestimmten Probe liefern. Zweitens verändert eine Änderung der Housekeeping-Genexpression die Berechnung der Zielgenpopulation in einer bestimmten Probe. Dies kann in der dd-PCR vermieden werden, die nicht von Standardkurven oder Housekeeping-Genen zur Quantifizierung der Ziel-DNA15 abhängt. Drittens, da die PCR-Reaktion in kleinen Kompartimenten stattfindet, bietet sie eine höhere Flexibilität gegenüber dem Vorhandensein von unspezifischen Inhibitoren oder Hintergrund-DNA, was sie zu einer genaueren Methode zur Quantifizierung von Zielgenenmacht 23,24.
Wir verwendeten die dd-PCR-Technologie, um die circBnc2-Expression in proliferierenden C2C12-Myoblasten zu quantifizieren und Myotuben mit divergenten Primern zu differenzieren. Die spezifische circRNA-Amplifikation mit divergenten Primerpaaren ohne Primer-Dimere muss jedoch vor der Durchführung der dd-PCR in regulärer PCR überprüft werden. Außerdem muss das dd-PCR-Protokoll sorgfältig befolgt werden, um die circRNA-Expression genau zu messen. Der hier vorgestellte Workflow kann leicht für die Quantifizierung jeder interessierenden circRNA angepasst werden. Neuere Studien haben die diagnostischen Werte von circRNAs in Geweben und Körperflüssigkeiten zum Nachweis von Krankheiten hervorgehoben8. Zusammen wird diese Methode ein wesentliches Werkzeug in der Forschungs- und Diagnostikindustrie sein und die circRNA-Forschung beschleunigen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch interne Mittel des Institute of Life Sciences, das DBT-Forschungsstipendium (BT / PR27622 / MED / 30 / 1961 / 2018) und das Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18 / 2 / 504017] unterstützt, das an Amaresh C. Panda vergeben wurde. Wir danken anderen Labormitgliedern für das Korrekturlesen des Artikels.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L.
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C.
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
