Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Erytrocytenbezinkingssnelheid: een door fysica aangedreven karakterisering in een medische context

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64502
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3
1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

Summary

Erytrocytenbezinkingssnelheid (ESR) is een fysieke parameter, vaak gebruikt bij routinematige gezondheidscontroles en medische diagnose. Een theoretisch model dat het mogelijk maakt om fysisch zinvolle parameters uit de hele sedimentatiecurve te extraheren, gebaseerd op moderne colloïdale kennis, is onlangs ontwikkeld. Hier presenteren we een protocol om de ESR in de loop van de tijd automatisch te verzamelen en de parameters van dit recente model uit deze geautomatiseerde gegevensverzameling te halen. Deze verfijnde parameters zullen waarschijnlijk ook de medische getuigenis verbeteren.

Abstract

Erytrocyt (of rode bloedcel) sedimentatiesnelheid (ESR) is een fysiek afgeleide parameter van bloed die vaak wordt gebruikt bij routinematige gezondheidscontroles en medische diagnose. In het geval van ontsteking wordt bijvoorbeeld een hogere ESR waargenomen als gevolg van de bijbehorende toename van fibrinogeen en andere plasma-eiwitten. Er werd aangenomen dat deze toename te wijten was aan de vorming van grotere aggregaten van rode bloedcellen (RBC's) veroorzaakt door de toename van fibrinogeen. Inderdaad, fibrinogeen is een agent-bevorderende aggregatie van RBC's en in het Stokes-regime - verondersteld te worden waargenomen in bloed-grotere aggregaten sediment sneller. Alle modellen van ESR-metingen op basis van deze hypothese vereisen echter verdere specifieke fysische aannames, die in geen enkel ander systeem vereist zijn. Bovendien hebben moderne studies op het gebied van colloïdale suspensies aangetoond dat aantrekkelijke deeltjes percolerende aggregaten vormen (d.w.z. aggregaten zo breed als de container). De sedimentatie van deze colloïden volgt dan op een zogenaamde "colloïdale gel collapse". Onlangs is aangetoond dat RBC's eigenlijk hetzelfde gedrag volgen. Deze hypothese maakt het ook mogelijk om de sedimentatiecurve van RBC's efficiënt en analytisch te modelleren, waaruit robuuste en fysisch betekenisvolle descriptoren kunnen worden geëxtraheerd. Dit manuscript beschrijft hoe een dergelijke analyse moet worden uitgevoerd en bespreekt de voordelen van deze aanpak.

Introduction

De erytrocytenbezinkingssnelheid (ESR) is een medisch in vitro klinisch hulpmiddel, formeel geïntroduceerd in evidenced-based medicine in de twintigste eeuw 1,2,3,4. Het wordt momenteel wereldwijd gebruikt als een niet-specifieke ontstekingstest, of om de evolutie van sommige specifieke aandoeningen te volgen 5,6,7,8. Dit komt voornamelijk door een toename van de fibrinogeenconcentratie, maar ook in andere plasmacomponenten zoals IgM 1,9,10,11. Volgens het huidige Westergren-standaardprotocol worden ESR-waarden gerapporteerd als de meting van de celvrije plasmalaag op een bepaald tijdstip (30 min of 1 h) na het verlaten van een verticale buis van een typische grootte van 20 cm verticaal in rust12. Deze meetmethode is echter bekritiseerd omdat kwalitatief verschillende stadia in het sedimentatieproces zijn gemeld, waaronder een vertraging voordat de maximale bezinkingssnelheid13 is bereikt. Deze vertraging duurt meer dan 1 uur bij ongeveer de helft van de gezonde monsters14. De snelheid tijdens deze fase gehoorzaamt aan een andere schaalvergroting dan tijdens de tweede, snellere fase van de sedimentatie15. Door de uitlezing te beperken tot de gemiddelde bezinkingssnelheid gedurende het eerste uur, wordt vervolgens een verschillende mix van verschillende bloedeigenschappen tussen verschillende individuen vergeleken.

Bovendien is onlangs aangetoond dat de gebruikelijke theoretische overwegingen achter dit protocol onjuist waren16,17,18. Bij fysiologische hematocriet (boven ongeveer 25%) sedimenteren rode bloedcellen (RBC's) niet als afzonderlijke aggregaten, maar eerder als een continu, zogenaamd doorsijpelend, netwerk van RBC's 17,18, gehoorzamend aan een andere set fysische vergelijkingen dan de gewoonlijk genoemde Stokes-sedimentatie 16,17. Het is aangetoond dat het overwegen van een fysische beschrijving op basis van de tijd-opgeloste metingen van de sedimentatie (hele curve) robuuster was in sommige nieuwe medische contexten19,20. Bovendien kunnen deze metingen worden gebruikt om licht te werpen op de fysieke mechanismen die de ESR veranderen in pathologieën waarin celvormen worden veranderd19,20. Bovendien kan een langzame ESR een nuttige medische interpretatie hebben, zoals aangegeven in de metingen van een cohort van patiënten met neuroacanthocytosesyndroom19,20. Dit artikel bespreekt hoe de meting van fysiek betekenisvolle parameters praktisch kan worden geïmplementeerd, op basis van de hele ESR-kinetiek. Nauwkeuriger gezegd, de hier gepresenteerde methode extraheert de maximale sedimentatiesnelheid Um, waarvan de waarde kan worden gecorrigeerd om rekening te houden met het effect van de hematocriet van de donor16,17. Deze parameter is nauwkeuriger en dus betrouwbaarder dan de traditionele meting16,17,19,20.

Bovendien is het in sommige fundamentele onderzoeken, in plaats van de ontstekingstoestand van een bepaalde patiënt te monitoren, interessant om het effect van hematocriet op de ESR 21,22,23 uit te sluiten, of om de rol van RBC's in een gemodificeerde ESR 19,20,24,25 te onderzoeken tussen verschillende donoren. Het kan nuttig zijn om monsters te vergelijken die niet direct volbloedmonsters van patiënten zijn. Daarom kan het resuspendiëren van RBC's met een gecontroleerde hematocriet in het autologe plasma of in een plasmasubstituent worden gebruikt als de eerste stap van ESR-meting. Oplossingen van Dextran 70 kDa met een concentratie van 55 mg/ml in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) produceren bijvoorbeeld een sedimentatiebereik binnen het controlebereik voor gezonde cellen19. Dit manuscript laat ook zien hoe dergelijke stappen moeten worden uitgevoerd en dat de gepresenteerde analyse ook in deze gevallen relevant is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bloedafname en experimenten werden goedgekeurd door de "Ärztekammer des Saarlandes", ethiek votum 51/18, en uitgevoerd na geïnformeerde toestemming was verkregen volgens de Verklaring van Helsinki. Standaardmetingen moeten worden uitgevoerd met ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-antistollingsbloed (standaard EDTA-concentratie van 1,6 mg/ml bloed, Europese norm NF EN ISO 6710), in Westergren-buizen. Het volume dat nodig is om de Westergren-buis te vullen, is afhankelijk van de fabrikant (omdat lagere delen soms een breder reservoir bevatten); Het volume moet ongeveer 1 ml volbloed zijn en 800 μl voor de buizen die in de materiaaltabel zijn aangegeven. De hieronder beschreven methode is echter geldig, ongeacht de specifieke suspensie en de vorm van de container, zolang de hematocriet van de onderzochte monsters hoger is dan 25%16. Volumes, recipiënten, suspensiemedium en additieven moeten daarom worden geselecteerd op basis van de specifieke doelstellingen van het uitgevoerde onderzoek.

1. Experimenten en metingen

OPMERKING: Noteer elke minuut de sedimentatiesnelheid van het monster.

  1. Monstervoorbereiding (indien nodig): Als een controlehematocriet of suspensievloeistof nodig is, begin dan met het wassen van de cellen en het voorbereiden van de monsters (als voorbeeld laten we zien hoe monsters met verschillende fibrinogeenniveaus kunnen worden bereid, door autoloog serum en plasma te mengen). Serum kan inderdaad worden benaderd als fibrinogeenvrij plasma26,27 en kan worden gebruikt om de aggregatie van RBC's te verminderen, in anders fysiologische omstandigheden. Om verschillende monsters te bereiden, verzamelt u het bloed in standaard EDTA-buizen van 9 ml en het serum in standaard serumbuizen (met silicakorrels als stollingsactivatoren) van 9 ml.
    1. Centrifugeer de bloedmonsters (d.w.z. 9 ml standaard EDTA en serumbuizen in het gekozen voorbeeld) op 3.000 x g gedurende ten minste 7 minuten, voor een optimale verdichting van de verpakte erytrocyten. Vervang het supernatant door PBS of de gewenste suspensievloeistof, als er voldoende hoeveelheid beschikbaar is. Als het alleen nodig is om de hematocriet in autoloog plasma te regelen, ga dan direct verder met stap 1.1.3. Anders voorzichtig mengen na opname van het supernatant voor het wassen.
    2. Herhaal dit drie keer. Voer de laatste wasbeurt in ieder geval uit met de gewenste suspensievloeistof.
      1. Bereid in het gekozen voorbeeld mengsels van autoloog plasma en serum met bepaalde verhoudingen (bijv. 25%/75%, 50%/50% of 75%/25% plasma-serumvolumefractie). Voeg bijvoorbeeld bij het bereiden van 2,5 ml van het 25% / 75% plasma-serummengsel 0,625 ml plasma toe aan 1,875 ml serum.
    3. Extraheer het vereiste volume van verpakte cellen en suspensie het in de gewenste vloeistof. Verwerk de verpakte cellen als een zeer viskeuze vloeistof (met behulp van standaard pre-pipetteren en/of reverse-pipetteren of een verdringerpipet28). In het gekozen voorbeeld, voor een monster van 4 ml bij een hematocriet van 45%, suspensie 1, 8 ml verpakte cellen binnen 2, 2 ml van het plasma-serummengsel.
  2. Als de hematocriet van het monster niet wordt gecontroleerd, bepaal deze dan met behulp van microcentrifugatie met hoge snelheid (andere standaardmethoden zijn ook geschikt).
    1. Extraheer de benodigde hoeveelheid monster voor hematocrietbepaling: vul de micro-hematocrietcapillairen door de onderste punt in de vloeistof onder te dompelen. Stop het door de bovenste opening te bedekken wanneer de vereiste hoeveelheid monster in de buis stijgt door capillaire zuiging.
    2. Sluit de haarvaten af met afdichtingswas. Plaats ze in de micro-hematocrietcentrifuge en laat deze gedurende 5 minuten op 15.000 x g (12.000 tpm) draaien, of volgens de instructies van de fabrikant.
    3. Lees het hematocrietniveau op het capillair en schrijf het op ter referentie.
  3. Stel een camera in voor het opnemen van de sedimentatie van de monsters. Om te voorkomen dat het geheugen overbelast raakt of de batterij leegloopt, voedt u het apparaat van het lichtnet en slaat u de foto's rechtstreeks op een computer of externe harde schijf op.
    1. Plaats een stabiele camera voor de houder waar de ESR-buizen in rust worden gelaten. Gebruik een witte, verlichte achtergrond (witte vellen papier op de achtergrond werken perfect).
    2. Met behulp van lege Westergren-buizen, bij voorkeur zonder markeringen, stelt u de focus en het gezichtsveld van de camera in om de hoogste resolutie te verkrijgen waar de monsters worden geplaatst. Zorg er bij voorkeur voor dat de randen van de afbeeldingen in verticale en horizontale richting zijn uitgelijnd.
    3. Maak een foto van een geschaalde buis om de pixelresolutie te extraheren. Het gebruik van RGB-afbeeldingen wordt aanbevolen.
    4. Stel het licht en de belichtingstijd van de camera in op een witte achtergrond, maar geen verzadiging. Het voorbeeld in figuur 1 is verkregen met een Canon EOS M50, met een belichtingstijd van 1/15s, een diafragma van F8.0, wolfraam witbalans, in single shot modus met handmatige scherpstelling en een ISO snelheid van 1.000.
  4. Bereid de ESR-buizen voor en plaats ze.
    1. Vul de onderste container van de Westergren-buis met het volume dat overeenkomt met de instructies van de fabrikant. Plaats de Westergren-buis in de onderste container zoals aangegeven door de fabrikant.
    2. Zodra de eerste buis klaar is, plaatst u deze in de houder en start u de camera-opname. Het opnemen van één foto per minuut geeft meestal een goede resolutie van de ESR kinetische curve.
    3. Bereid de volgende monsters voor en plaats ze. Zorg ervoor dat u niet voor een monster gaat staan wanneer een foto wordt gemaakt.
    4. Laat de metingen minstens 2 uur lopen, om te vergelijken met standaardmetingen op 30 min, 1 h en 2 h. Het is echter ook beter om de verzadiging en stilstand van de sedimentatie te zien. Voor gezonde monsters, of in geval van ontsteking, is het registreren van de monsters 's nachts, tussen 12 uur en 24 uur, meer dan voldoende, omdat de kromming van de snelste monsters zichtbaar is binnen 3 uur13,19. Als een aandoening echter de sedimentatiesnelheid verlaagt, zoals een afname van de fibrinogeenconcentratie (d.w.z. in het gekozen voorbeeld, hoge serumvolumefractie), kunnen opnames van 50 uur of meer nodig zijn om de meest nauwkeurige informatie te verkrijgen16,19.

2. Beeldanalyse

OPMERKING: Zodra de beelden zijn opgenomen, extraheert u de ESR-curve. Een voorbeeld van Matlab-code wordt gegeven als Aanvullend bestand 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

  1. Selecteer of identificeer een interessant gebied (ROI) waar slechts één buis zichtbaar is, waarbij de ondergrens zich onder de laagste positie van de erytrocytencelvrije plasma-interface bevindt, maar binnen het monster (zie figuur 1A, B). Draai de afbeelding indien nodig zodat de verticale richting wordt uitgelijnd langs het eerste onderdeel van de afbeelding.
  2. Zet de ROI van de RGB-afbeelding om in een grijswaardenafbeelding of matrix Gr. Meestal is het combineren van de driekleurige kanalen (rood [R], groen [G] en blauw [B]) als Gr = 2 * R - B - G zeer efficiënt met een duidelijke achtergrond (zie Figuur 1C en MatlabCodeImageAnalysisSampled.m lijnen 121-128).
  3. Binarize de foto. Voor een gezonde steekproef geeft het gebruik van de Otsu-drempel29 meestal een consistent resultaat (zie figuur 1D en regel 133 van MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Voor monsters met een hoge hematocriet of met enige hemolyse, is het misschien beter om het handmatig aan te passen of een andere automatische methode te gebruiken (zoals gedaan in regels 129-131 van MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), afhankelijk van het exacte contrast dat wordt verkregen tussen de verschillende fasen in de buis.
  4. Verkrijg het gemiddelde van de pixelwaarden (of elementen) van Gr langs de horizontale richting. Deze stap minimaliseert de ruis en neemt efficiënt het gemiddelde van de mogelijke interface-onregelmatigheden (zie Figuur 1E en MatlabCodeImageAnalysisSampled.m regel 137).
  5. Voordat u de variaties berekent, moet u de curve gladstrijken met een voortschrijdend gemiddelde, vooral als de buizen enkele horizontale markeringen bevatten (zie figuur 1F). Voor de gegeven voorbeelden werd een bewegend venster van ~2,5 mm (50 pixels) gebruikt voor dit proces (zie regel 138 van MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Identificeer vervolgens de interfacepositie als het punt met de hoogste intensiteitsvariatie (zie figuur 1G).
  6. Herhaal dit voor elke afbeelding en elk voorbeeld. Sla voor elk voorbeeld de posities van de interface in de loop van de tijd op in een geschikt formaat om het fysieke model te passen bij elke geschikte software.

3. Aanpassing van het fysieke model

  1. Met behulp van een geschikte software, die de hematocriet en de beginhoogte van de bloedkolom h 0 kent, vindt u de waarden van de vertragingstijd t0, de dimensieloze tijd γ en de uiteindelijke verpakte volumefractie Φmvan de erytrocyten die de som van kwadratische restafwijkingen voor het fysieke model17 minimaliseert. Een Matlab-code (ShapeAnalyzerIntegrated.m) wordt geleverd als aanvullend bestand 2 als een voorbeeld van hoe een dergelijke fit moet worden uitgevoerd. Zie Aanvullend dossier 2 voor verdere instructies. Zoals elders beschreven16,17, erytrocyten bij fysiologisch hematocrietsediment als een zachte deeltjesgel, waarbij de belangrijke fysische parameters het verschil in dichtheid zijn tussen het plasma en RBC's van de donor Δρ, de RBC-karakteristieke diameter rRBC, de plasmaviscositeit bij kamertemperatuur η en de hematocriet Φ van de donor . Met behulp van deze parameters, en ervan uitgaande dat de zwaartekrachtspanning het belangrijkste drijvende proces is voor het plasma om omhoog te stromen door het poreuze netwerk gevormd door de erytrocyten na een vertragingstijd t0, verkrijgt men de temporele evolutie16,17:
    Equation 1
    met Equation 2, Equation 3en Equation 4 zijnde de gemiddelde schijfstraal van een erytrocyt. Een voorbeeld van een Matlab-code die dit uitvoert, wordt geleverd als bijlage (ShapeAnalyzerIntegrated.m past bij de functie die is gedefinieerd in SedimFit.m [Aanvullend bestand 3]). Als alternatief kan G/γ ook direct worden gebruikt als een fitparameter met eenheden van 1/t.
  2. Zodra de kwantitatieve curve uit de afbeelding is geëxtraheerd, slaat u de fysieke parameters van het monster op. Traditionele ESR-waarden op 30 min, 1 h of 2 h kunnen nog steeds uit de curve worden geëxtraheerd ter referentie (zie ShapeAnalyzerIntegrated.m lijnen 123-132).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een voorbeeld van een correct verkregen beeldreeks wordt gegeven als Aanvullende film 1 (MovieS1.avi). Een reeks karakteristieke pasvormen van het model is weergegeven voor verschillende omstandigheden in figuur 2. De fibrinogeenconcentratie werd bepaald aan de hand van de fibrinogeenconcentratie in het plasma Fib0, ervan uitgaande dat het serum helemaal geen fibrinogeen bevat. Vandaar dat Fib = C Fib0, waarbij C de plasmavolumefractie in het plasma-serummengsel is. In eerdere studies16 werd Fib0 bepaald met behulp van standaardmethoden in het laboratorium voor klinische chemie van het universitair ziekenhuis van Saarland (Homburg, Duitsland). Als het nodig is om een dergelijke hoeveelheid onafhankelijk te meten, omvat een handige methode om de fibrinogeenconcentratie te bepalen (semi-) geautomatiseerde kogelcoagulometers, waarvoor mogelijk ook een citraat-antistollingsmonster van bloed van de donor moet worden verkregen30. De ESR-curven uit de studies die deze curven hebben gegenereerd, konden worden uitgerust met een Pearson-coëfficiënt R 2 [0,974, 0,9996], met een gemiddelde van 0,996 en een standaarddeviatie van 0,004 (slechts één curve van 35 gaf een R2Equation 11 < 0,99). De parameters die uiteindelijk worden geëxtraheerd zijn de laatste hematocriet in de RBC-fase Φm, de vertragingstijd t0-die nodig is voor de gel om te breken en te beginnen in te storten- en de maximale momentane snelheid Equation 6, bereikt aan het begin van de ineenstorting. De dimensieloze parameter γ is geassocieerd met de inverse van het poriegebied in het verdichtingsnetwerk van RBC's (uitgedrukt in veelvouden van deeltjesradius), Δρ is het verschil in dichtheid tussen het plasma en RBC's van de donor, a is de RBC-karakteristieke diameter, η is de plasmaviscositeit bij kamertemperatuur en Φ is de hematocriet van de donor. De fit wordt eigenlijk uitgevoerd door Δρ,a,η en Φ te fixeren en vervolgens de beste γ, Φm en t0 te bepalen. De hematocriet moet onafhankelijk worden bepaald via een andere standaardmethode, terwijl de andere kan worden vastgesteld op standaardwaarden (ΔρEquation 10080 kg/m3 31,32, ηEquation 100 1,5 mPa s 33 en eenEquation 1004 μm). Elke afwijking van de andere parameters zou de vastgestelde waarde van γ eenvoudigweg wijzigen met een overeenkomstige factor, maar zou de uiteindelijke bepaling van Um, die dan in dat opzicht een robuuste parameter is, niet wijzigen.

Verzamelingen van parameterwaarden verzameld in eerdere fundamentele studies, die de trends van de parameters laten zien als functie van de hematocriet- en fibrinogeenspiegels, zijn weergegeven in figuur 3 en figuur 4.

Figure 1
Figuur 1: Beeldverwerking . (A) Ideale weergave van verschillende voorbeelden, met relevante ROI's, gemarkeerd voor één steekproef. (B) Zoom in op de geselecteerde ROI. (C) Conversie van de gekleurde ROI naar grijsniveau. (D) Binarized beeld verkregen met de Otsu-drempel. (E) De horizontaal gemiddelde intensiteit van het binaire beeld als functie van de hoogte (volgens de gebruikelijke conventie in beeldverwerking wordt de oorsprong geacht zich aan de bovenkant van het beeld te bevinden; zie ook stap 2.4 van het protocol.) (F) Afgevlakte intensiteit door een voortschrijdend gemiddelde uit te voeren op een verticale buurt van 50 pixels (zie ook stap 2.5 van het protocol). (G) Variaties van de afgevlakte intensiteit langs de verticale richting. De positie van de absolute maximale waarde wordt genomen als de positie van de interface (zie ook stap 2.5 van het protocol). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Karakteristieke pasvormen. (A) Curven en pasvormen verkregen voor een gezonde donor, met verschillende aangepaste hematocrieten. De curves zijn aangepast van een eerdere studie17. (B) Curven en pasvormen verkregen voor een gezonde donor, met verschillende fibrinogeenconcentraties. Verschillende fibrinogeenconcentraties werden verkregen door autoloog plasma en serum in verschillende verhoudingen te mengen. De curven en gegevens zijn afkomstig uit een eerdere studie16. Foutbalken (verkregen uit pixelresolutie of pasvormstatistieken) zijn kleiner dan de symboolgrootte. De figuren zijn met toestemming herdrukt van Dasanna et al.16 (18 monsters van vier onafhankelijke bloedafnames) en Darras et al.17 (16 monsters van zeven onafhankelijke bloedafnames). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Karakteristieke waarden van de geëxtraheerde parameters voor verschillende hematocrieten . (A) Variatie van de geëxtraheerde maximale sedimentatiesnelheid Umals functie van het monster hematocriet Φ. Cirkels zijn individuele metingen; Verschillende kleuren zijn gerelateerd aan verschillende gezonde donoren. De doorlopende rode lijn is de door het model voorspelde trend, verkregen met de gemiddelde waarden van Φm en γ. De gecorrigeerde waarde van Umvoor een hematocriet van Φ = 0,45 wordt ook weergegeven, zowel als driehoeken voor individuele waarden als als een rechte lijn voor de voorspelde constante van het model. Deze gecorrigeerde waarde is volgens het model berekend als Equation 10. (B) Waarden verkregen voor de parameter γ. (C) Waarden verkregen voor de parameter Φm. (D) Waarden verkregen voor de parameter t0. Foutbalken voor individuele gegevens die zijn verkregen uit fitstatistieken zijn kleiner dan de symboolgrootte. Dit cijfer is met toestemming van Darras et al.17 aangepast. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Karakteristieke waarden van de geëxtraheerde parameters voor verschillende fibrinogeenconcentraties . (A) Variatie van de geëxtraheerde maximale sedimentatiesnelheid Umals functie van de fibrinogeenconcentratie van het monster. Verschillende kleuren zijn gerelateerd aan verschillende gezonde donoren. (B) Waarden verkregen voor de parameter γ. (C) Waarden verkregen voor de parameter Φm. (D) Waarden verkregen voor de parameter t0. Foutbalken voor individuele gegevens die zijn verkregen uit fitstatistieken zijn kleiner dan de symboolgrootte. Deze figuur is met toestemming overgenomen van Dasanna et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende film 1: Voorbeeld van een correct verkregen beeldreeks. Op deze foto's worden verschillende monstertypen getoond van twee verschillende donoren (dezelfde bloedgroep). Van links naar rechts, alle monsters met duplicaten: volbloed van donor 1, suspensie van RBC's van donor 1 in Dextran 70 kDa (55 mg/ml PBS) met gecontroleerde hematocriet bij 45%, volbloed van donor 2, suspensie van RBC's van donor 2 in Dextran (45% hematocriet), suspensie van RBC's van donor 1 in plasma van donor 2 (45% hematocriet), en suspensie van RBC's van donor 2 in plasma van donor 1 (45% hematocriet). De monsters hebben een breed scala aan sedimentatiesnelheden en de suspensies in Dextran vertonen ook enige hemolyse. De meegeleverde code MatlabCodeImageAnalysisSampled.m analyseert ze echter allemaal efficiënt. Klik hier om deze film te downloaden.

Aanvullend dossier 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. Hoofdcode gebruikt voor de beeldanalyse (stap 2 van het protocol). Om de code op een specifiek apparaat uit te voeren, moet regel 8 worden gewijzigd. Het moet het pad bevatten naar de map met de foto's van de Westergren-buizen om te analyseren, eindigend met het voorvoegsel van de foto's, indien aanwezig. Een set gecomprimeerde foto's is beschikbaar voor open-access download op Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). De code, en in het bijzonder de eigenschappen van elk monster (gedefinieerd in de regels 14-61), is al aangepast om deze foto's te analyseren. Voor deze fotoset was het gebruikte voorvoegsel 'IMG_'. Daarom moet de tekenreeksregel 8 eindigen met '\IMG_' (of '/IMG_' op Linux-systemen). Het laatste deel van de code (regels 166-179) plot ook automatisch de geëxtraheerde sedimentatiecurven voor elk monster. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. Hoofdcode die wordt gebruikt om in het fysieke model te passen (stap 3 van het protocol). Om deze code uit te voeren, kopieert en plakt u deze eenvoudig in de map met de uitvoertekstbestanden van MatlabCodeImageAnalysisSampled.m, samen met SedimFit.m. De namen van de bestanden die moeten worden geanalyseerd (zonder de extensie .txt) moeten worden vermeld in regel 9. De initiële hematocriet en hoogte van de buis moeten ook worden opgenomen in respectievelijk regel 12 en 15. Deze code is al voorbereid om de curven te analyseren die zijn geëxtraheerd uit de open-access foto's op Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Zodra de bovengenoemde regelcodes zijn gewijzigd, klikt u eenvoudig op de knop 'Uitvoeren' in de Matlab Editor-werkbalk. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: SedimFit.m. Fysiek model aangepast door ShapeAnalyzerIntegrated.m. Dit bestand is een Matlab-functie, die de functies definieert die zijn aangepast aan de experimentele curven om de fysieke parameters te extraheren. Het moet zich in dezelfde map bevinden als ShapeAnalyzerIntegrated.m wanneer de analyse wordt uitgevoerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om het geautomatiseerde protocol efficiënt te laten werken, is het belangrijk om een duidelijke achtergrond en de juiste verlichting te hebben. Een donkere achtergrond kan het bestaan van een efficiënte binarisatiedrempel voorkomen. Voor monsters met enige hemolyse, die meestal optreedt (toeneemt) in de loop van de tijd, is het belangrijk om eerst te verifiëren of de gekozen binarisatiedrempel relevant is voor zowel de eerste als de uiteindelijke foto's.

Als het gaat om het binarisatieproces van de foto, is de keuze van de ROI en binarisatiedrempel de meest gevoelige stap. Het kan nuttig zijn om handmatig verschillende drempelwaarden te testen op drie verschillende foto's (aan het begin, midden en einde van het sedimentatieproces) om er zeker van te zijn dat de keuze van de drempel inderdaad de relevante binarisatie voor het hele proces oplevert. Als het monster een sterke hemolyse ervaart, kan het nodig zijn om de analyse van het monster te beperken tot het begin van het proces, wanneer nog steeds een duidelijke interface kan worden waargenomen. Zoals voor elke ESR-meting, is het ook essentieel om de aanwezigheid van bubbels in de buis te vermijden. Als er echter enkele kleine bubbels aan de bovenkant van de buis worden waargenomen, kan een ROI die begint onder de bellen en recht op de initiële interface nog steeds de relevante meting opleveren. In dit geval is het echter belangrijk om wat achtergrondruimte aan de rechter- en linkerkant van de buis op te nemen, zodat de Otsu-drempel kan worden bepaald, waarbij altijd rekening wordt gehouden met een aanzienlijk aantal pixels met het grijsniveau van de achtergrond.

De methode is, zoals bij alle ESR-metingen, gebaseerd op de veronderstelling dat een duidelijke interface tussen verpakte erytrocyten en celvrij plasma kan worden gezien. Als het monster een significante hoeveelheid hemolyse ervaart, of als de hematocriet van het monster te verdund is (minder dan 25%17), zal een dergelijk raakvlak niet meer worden waargenomen. Een ESR-meting in deze omstandigheden is dan onmogelijk uit te voeren.

Zoals eerder vermeld, zorgt deze methode ervoor dat de relevante snelheid van de gelinstorting Um wordt geleverd, die kan worden gecorrigeerd volgens de initiële hematocriet van de patiënt17. Figuur 3A, samen met de ruwe metingen van Um, toont ook de gecorrigeerde waarden voor een genormaliseerde hematocriet van Φ0 = 0,45. Het is duidelijk dat de correctie de algehele afhankelijkheid van Φ0 wegneemt, evenals het grootste deel van de gegevensspreiding. Het bepalen van Umop basis van het relevante fysische model impliceert ook dat de techniek objectiever is dan een willekeurige curve smoothing, met willekeurige keuzes van afvlakkende parameters. Deze methode is onder andere robuuster gebleken in medische contexten waar abnormaal lage ESR-waarden worden waargenomen19,20.

Een ander intrinsiek belang van deze meting is dat het robuustere en fysiek interpreteerbare gegevens oplevert. In het geval van een verlaagde ESR kan bijvoorbeeld worden onderscheiden of de vertragingstijd t0 van de instorting wordt verlengd, of het netwerk van RBC's ongewoon verstoord is door γ, of dat de uiteindelijke verdichting Φm van de cellen op de een of andere manier wordt belemmerd16,19,20.

Interessant is dat de meting van de maximale sedimentatiesnelheid ook robuuster en gevoeliger is voor fibrinogeenniveaus, zoals al benadrukt in eerdere studies13,14,15. Dit is een belangrijk kenmerk, omdat de ESR vaak wordt gebruikt om ontstekingen te controleren, die gepaard gaan met verhoogde niveaus van fibrinogeen. Deze gevoeligheid komt in wezen voort uit het loskoppelen van Um vanaf het moment van gelinstorting, waarvan bekend is dat het een belangrijke willekeurige component34,35,36 heeft. Nauwkeuriger, zoals aangegeven in figuur 4D16, heeft voor hogere concentraties fibrinogeen de intrinsieke willekeurige variatie van de vertragingstijd (waarbij metingen boven 150 mg/ml tussen 12 min en 30 min liggen, zelfs bij een enkele donor) dezelfde orde van grootte als de onderliggende afhankelijkheid van deze parameter (tussen 150 mg/dl en 300 mg/dl; de gemiddelde trend van de metingen neemt slechts af van 0,45 uur tot 0,4 uur [ d.w.z. 27 min tot 24 min]). Aangezien deze vertragingstijd eigenlijk is opgenomen in de traditionele hoogtemeting op 30 min of 1 h (duur die deze vertragingstijd soms kan bereiken of overschrijden), biedt het extraheren van de maximale snelheid Um (die een systematische en significante trend voor elke donor presenteert) vervolgens een robuustere en zinvollere parameter 13,14,15,34,35, 36.

Bovendien kan de parameter Um efficiënt worden gecorrigeerd voor de initiële hematocriet, volgens het eerder beschreven praktische resultaat Equation 1117. Bij het combineren van gegevens voor alle gezonde donoren in een eerdere studie17 worden waarden van γ = 0,50 ± 0,06 en Φ m = 0,86 ± 0,04 verkregen, die mooi de trend van Um als functie van de donorhematocriet Φ  weergeven, zoals weergegeven in figuur 3. In de praktijk kan het echter strenger zijn om de ESR te corrigeren met de γ- en Φm-waardendie voor een specifieke donor zijn verkregen, aangezien fibrinogeengehalten ook aanzienlijk kunnen veranderen tussen donoren en een aanzienlijke invloed kunnen hebben op deze parameters (figuur 4).

Gezien de besproken punten en het opnemen ervan in routinematige medische procedures, zal de nauwkeurigheid en veelzijdigheid van de ESR als een in vitro klinisch hulpmiddel verder verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren die relevant zijn voor de inhoud van dit artikel.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de onderzoekseenheid FOR 2688 - Wa1336/12 van de Duitse Onderzoeksstichting en door de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. 860436-EVIDENCE. T. J. en C. W. erkennen financiering van de Frans-Duitse Universiteit (DFH / UFA). A. D. erkent de financiering door de Young Investigator Grant van de Universiteit van Saarland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample) SARSTEDT 267001 or 265 Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50 Canon Kit EF-M18-150 IS STM Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge HERMLE 302.00 V03 - Z 36 HK Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge MLW TH21 or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries Fisher scientific 11884040 or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023 1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette) Gilson FD10006 Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate Hirschmann 9120101 Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes Praxindo A9244560 Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination / / White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bedell, S. E., Bush, B. T. Erythrocyte sedimentation rate. From folklore to facts. The American Journal of Medicine. 78, 1001-1009 (1985).
  2. Grzybowski, A., Sak, J. Edmund Biernacki (1866-1911): Discoverer of the erythrocyte sedimentation rate. On the 100th anniversary of his death. Clinics in Dermatology. 29 (6), 697-703 (2011).
  3. Kushner, I., Mackiewicz, A. The Acute Phase Response: An Overview. Acute Phase Proteins. , CRC Press. (1993).
  4. Tishkowski, K., Gupta, V. Erythrocyte Sedimentation Rate. StatPearls Publishing. , Treasure Island, FL. (2022).
  5. Menees, S. B., Powell, C., Kurlander, J., Goel, A., Chey, W. D. A meta-analysis of the utility of C-reactive protein, erythrocyte sedimentation rate, fecal calprotectin, and fecal lactoferrin to exclude inflammatory bowel disease in adults with IBS. The Americal Journal of Gastroenterology. 110 (3), 444-454 (2015).
  6. Brigden, M. L. Clinical utility of the erythrocyte sedimentation rate. Americal Family Physician. 60 (5), 1443-1450 (1999).
  7. Liu, S., et al. Preliminary case-control study to evaluate diagnostic values of C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate in differentiating active Crohn's disease from intestinal lymphoma, intestinal tuberculosis and Behcet's syndrome. The American Journal of the Medical Sciences. 346 (6), 467-472 (2013).
  8. Greidanus, N. V., et al. Use of erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein level to diagnose infection before revision total knee arthroplasty: A prospective evaluation. The Journal of Bone and Joint Surgery. 89 (7), 1409-1416 (2007).
  9. Flormann, D., Kuder, E., Lipp, P., Wagner, C., Kaestner, L. Is there a role of C-reactive protein in red blood cell aggregation. International Journal of Laboratory Hematology. 37 (4), 474-482 (2015).
  10. Brust, M., et al. The plasma protein fibrinogen stabilizes clusters of red blood cells in microcapillary flows. Scientific Reports. 4, 4348 (2014).
  11. Gray, S. J., Mitchell, E. B., Dick, G. F. Effect of purified protein fractions on sedimentation rate of erythrocytes. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 51 (3), 403-404 (1942).
  12. Kratz, A., et al. ICSH recommendations for modified and alternate methods measuring the erythrocyte sedimentation rate. International Journal of Laboratory Hematology. 39 (5), 448-457 (2017).
  13. Hung, W. T., Collings, A. F., Low, J. Erythrocyte sedimentation rate studies in whole human blood. Physics in Medicine and Biology. 39 (11), 1855-1873 (1994).
  14. Woodland, N. B., Cordatos, K., Hung, W. T., Reuben, A., Holley, L. Erythrocyte sedimentation in columns and the significance of ESR. Biorheology. 33 (6), 477-488 (1996).
  15. Holley, L., Woodland, N., Hung, W. T., Cordatos, K., Reuben, A. Influence of fibrinogen and haematocrit on erythrocyte sedimentation kinetics. Biorheology. 36 (4), 287-297 (1999).
  16. Dasanna, A. K., et al. Erythrocyte sedimentation: Effect of aggregation energy on gel structure during collapse. Physical Review. E. 105 (2-1), 024610 (2022).
  17. Darras, A., et al. Erythrocyte sedimentation: collapse of a high-volume-fraction soft-particle gel. Physical Review Letters. 128 (8), 088101 (2022).
  18. Darras, A., et al. Imaging erythrocyte sedimentation in whole blood. Frontiers in Physiology. 12, 729191 (2022).
  19. Darras, A., et al. Acanthocyte sedimentation rate as a diagnostic biomarker for neuroacanthocytosis syndromes: Experimental evidence and physical justification. Cells. 10 (4), 788 (2021).
  20. Rabe, A., et al. The erythrocyte sedimentation rate and its relation to cell shape and rigidity of red blood cells from chorea-acanthocytosis patients in an off-label treatment with dasatinib. Biomolecules. 11 (5), 727 (2021).
  21. Giavarina, D., Capuzzo, S., Pizzolato, U., Soffiati, G. Length of erythrocyte sedimentation rate (ESR) adjusted for the hematocrit: reference values for the TEST 1 method. Clinical Laboratory. 52 (5-6), 241-245 (2006).
  22. Bull, B. S. Is a standard ESR possible. Laboratory Medicine. 6 (11), 31-39 (1975).
  23. Bull, B. S., Brecher, G. An evaluation of the relative merits of the Wintrobe and Westergren sedimentation methods, including hematocrit correction. American Journal of Clinical Pathology. 62 (4), 502-510 (1974).
  24. Reinhart, W. H., Singh, A., Straub, P. W. Red blood cell aggregation and sedimentation: the role of the cell shape. British Journal of Haematology. 73 (4), 551-556 (1989).
  25. Jan, K., Usami, S., Smith, J. A. Influence of oxygen tension and hematocrit reading on ESRs of sickle cells: Role of RBC aggregation. Archives of Internal Medicine. 141 (13), 1815-1818 (1981).
  26. Issaq, H. J., Xiao, Z., Veenstra, T. D. Serum and plasma proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3601-3620 (2007).
  27. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), 21230 (2011).
  28. Proper Pipetting Techniques - DE. , Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/lab-plasticware-supplies/lab-plasticware-supplies-learning-center/lab-plasticware-supplies-resource-library/fundamentals-of-pipetting/proper-pipetting-techniques.html (2023).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transaction on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  30. Solomon, C., et al. A comparison of fibrinogen measurement methods with fibrin clot elasticity assessed by thromboelastometry, before and after administration of fibrinogen concentrate in cardiac surgery patients. Transfusion. 51 (8), 1695-1706 (2011).
  31. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLoS One. 12 (7), 0180520 (2017).
  32. Trudnowski, R. J., Rico, R. C. Specific gravity of blood and plasma at 4 and 37 degrees C. Clinical Chemistry. 20 (5), 615-616 (1974).
  33. Késmárky, G., Kenyeres, P., Rábai, M., Tóth, K. Plasma viscosity: A forgotten variable. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 39 (1-4), 243-246 (2008).
  34. Teece, L. J., et al. Gels under stress: The origins of delayed collapse. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 458, 126-133 (2014).
  35. Lindström, S. B., Kodger, T. E., Sprakel, J., Weitz, D. A. Structures, stresses, and fluctuations in the delayed failure of colloidal gels. Soft Matter. 8 (13), 3657-3664 (2012).
  36. Bartlett, P., Teece, L. J., Faers, M. A. Sudden collapse of a colloidal gel. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 85, 021404 (2012).

Tags

Geneeskunde Nummer 193
Erytrocytenbezinkingssnelheid: een door fysica aangedreven karakterisering in een medische context
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Darras, A., John, T., Wagner, C.,… More

Darras, A., John, T., Wagner, C., Kaestner, L. Erythrocyte Sedimentation Rate: A Physics-Driven Characterization in a Medical Context. J. Vis. Exp. (193), e64502, doi:10.3791/64502 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter