Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Скорость оседания эритроцитов: характеристика, основанная на физике, в медицинском контексте

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64502
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3
1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

Summary

Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) — это физический параметр, часто используемый при рутинных медицинских осмотрах и медицинской диагностике. Недавно была разработана теоретическая модель, позволяющая извлекать физически значимые параметры из всей седиментационной кривой, основанная на современных коллоидных знаниях. Здесь мы представляем протокол для автоматического сбора ESR с течением времени и извлечения параметров этой недавней модели из этого автоматизированного сбора данных. Эти уточненные параметры также, вероятно, улучшат медицинские показания.

Abstract

Скорость оседания эритроцитов (или эритроцитов) (СОЭ) является физическим производным параметром крови, который часто используется при рутинных медицинских осмотрах и медицинской диагностике. Например, в случае воспаления наблюдается более высокая СОЭ из-за связанного с этим увеличения фибриногена и других белков плазмы. Считалось, что это увеличение было связано с образованием более крупных агрегатов эритроцитов (эритроцитов), вызванных увеличением фибриногена. Действительно, фибриноген является агентом, способствующим агрегации эритроцитов, и в режиме Стокса, который, как предполагается, наблюдается в крови, более крупные агрегаты откладываются быстрее. Однако все модели измерений ЭПР, основанные на этой гипотезе, требуют дополнительных специфических физических допущений, не требуемых ни в одной другой системе. Кроме того, современные исследования в области коллоидных суспензий установили, что притягивающие частицы образуют просачивающиеся агрегаты (т.е. агрегаты шириной с контейнер). Оседание этих коллоидов затем следует за так называемым «коллапсом коллоидного геля». Недавно было показано, что эритроциты на самом деле следуют тому же поведению. Эта гипотеза также позволяет эффективно и аналитически смоделировать кривую седиментации эритроцитов, из которой могут быть извлечены надежные и физически значимые дескрипторы. В этой рукописи описывается, как выполнить такой анализ, и обсуждаются преимущества этого подхода.

Introduction

Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) является медицинским клиническим инструментом in vitro, официально введенным в доказательную медицину в двадцатом веке 1,2,3,4. В настоящее время он используется во всем мире в качестве неспецифического воспалительного теста или для мониторинга развития некоторых специфических состояний 5,6,7,8. В основном это связано с увеличением концентрации фибриногена, а также других компонентов плазмы, таких как IgM 1,9,10,11. Согласно действующему стандартному протоколу Вестергрена, значения СОЭ сообщаются как измерение бесклеточного слоя плазмы в заданный момент времени (30 мин или 1 ч) после оставления вертикальной пробирки типичного размера 20 см по вертикали в состоянии покоя12. Однако этот метод измерения подвергся критике, поскольку сообщалось о качественно различных стадиях процесса осаждения, включая задержку перед достижением максимальной скорости осаждения13. Эта задержка длится более 1 ч примерно у половины здоровыхобразцов14. Скорость во время этой фазы подчиняется иному масштабированию, чем во время второй, более быстрой фазы осаждения15. Ограничение считывания средней скоростью осаждения в течение первого часа затем сравнивает различную смесь различных свойств крови у разных людей.

Более того, недавно было продемонстрировано, что обычные теоретические соображения, лежащие в основе этого протокола, были ошибочными16,17,18. При физиологическом гематокрите (выше примерно 25%) эритроциты (эритроциты) осаждаются не как отдельные агрегаты, а скорее как непрерывная, так называемая перколяционная сеть эритроцитов 17,18, подчиняющаяся другому набору физических уравнений, чем обычно упоминаемое седиментацияСтокса 16,17. Было показано, что рассмотрение физического описания, основанного на измерениях седиментации (всей кривой) с временным разрешением, было более надежным в некоторых новых медицинских контекстах19,20. Более того, эти измерения могут быть использованы, чтобы пролить свет на физические механизмы, изменяющие СОЭ при патологиях, при которых изменяются формы клеток19,20. Кроме того, медленная СОЭ может иметь полезную медицинскую интерпретацию, как указано в измерениях когорты пациентов с синдромом нейроакантоцитоза19,20. В данной статье рассматривается, как практически реализовать измерение физико-значимых параметров, основанных на кинетике всей СОЭ. Более точно, представленный здесь метод извлекает максимальную скорость седиментации Um, значение которой можно скорректировать, чтобы учесть влияние гематокрита донора16,17. Этот параметр является более точным и, следовательно, более надежным, чем традиционное измерение16,17,19,20.

Кроме того, в некоторых фундаментальных исследованиях вместо мониторинга воспалительного состояния данного пациента интересно исключить влияние гематокрита на СОЭ 21,22,23 или исследовать роль эритроцитов в модифицированной СОЭ 19,20,24,25 между разными донорами. Может быть полезно сравнить образцы, которые не являются непосредственно полными образцами крови пациентов. Таким образом, ресуспендирование эритроцитов контролируемым гематокритом в аутологичной плазме или в плазменном заместителе может быть использовано в качестве первого этапа измерения СОЭ. Например, растворы декстрана 70 кДа с концентрацией 55 мг/мл в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS) дают диапазон осаждения в пределах контрольного диапазона для здоровых клеток19. В этой рукописи также показано, как должны проводиться такие шаги, и что представленный анализ также актуален в этих случаях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Сбор образцов крови и эксперименты были одобрены «Ärztekammer des Saarlandes», ethics votum 51/18, и проводились после получения информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией. Стандартные измерения следует проводить с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) - антикоагулянтной кровью (стандартная концентрация ЭДТА 1,6 мг / мл крови, европейская норма NF EN ISO 6710) в пробирках Вестергрена. Объем, необходимый для заполнения трубки Вестергрена, зависит от производителя (так как нижние части иногда содержат более широкий резервуар); Объем должен составлять около 1 мл полной крови и 800 мкл для пробирок, указанных в Таблице материалов. Однако метод, описанный ниже, действителен независимо от конкретной суспензии и формы контейнера, если гематокрит исследуемых образцов превышает 25%16. Поэтому объемы, контейнеры, суспендирующая среда и добавки должны быть выбраны в соответствии с конкретными целями проводимого исследования.

1. Эксперименты и измерения

ПРИМЕЧАНИЕ: Записывайте скорость осаждения образца каждую минуту.

  1. Пробоподготовка (при необходимости): Если требуется контрольный гематокрит или суспендирующая жидкость, начните с промывки клеток и подготовки образцов (в качестве примера мы покажем, как подготовить образцы с различными уровнями фибриногена, смешивая аутологичную сыворотку и плазму). Сыворотка действительно может быть аппроксимирована как плазма без фибриногена26,27 и может быть использована для уменьшения агрегации эритроцитов в других физиологических условиях. Чтобы подготовить несколько образцов, собирают кровь в стандартные пробирки ЭДТА объемом 9 мл и сыворотку в стандартные пробирки сыворотки (с шариками кремнезема в качестве активаторов свертывания крови) объемом 9 мл.
    1. Центрифугируют образцы крови (т.е. 9 мл стандартной ЭДТА и сывороточных пробирок в выбранном примере) в концентрации 3000 x g в течение не менее 7 мин для оптимального уплотнения упакованных эритроцитов. Замените надосадочную жидкость PBS или желаемой суспендирующей жидкостью, если имеется достаточное количество. Если требуется просто контролировать гематокрит в аутологичной плазме, переходите непосредственно к шагу 1.1.3. В противном случае аккуратно перемешайте после включения надосадочной жидкости для стирки.
    2. Повторите три раза. Последнюю стирку в любом случае выполняйте с желаемой суспензионной жидкостью.
      1. В выбранном примере готовят смеси аутологичной плазмы и сыворотки с определенными пропорциями (например, 25%/75%, 50%/50% или 75%/25% объемной доли плазмы и сыворотки). Например, при приготовлении 2,5 мл смеси 25%/75% плазма и сыворотка добавляют 0,625 мл плазмы к 1,875 мл сыворотки.
    3. Извлеките необходимый объем упакованных клеток и суспендируйте его в нужной жидкости. Упакованные ячейки обрабатывают как высоковязкую жидкость (с использованием стандартной предварительной пипетки и/или обратной пипетки или пипетки28 с принудительным вытеснением). В выбранном примере для образца объемом 4 мл при гематокрите 45% суспендировать 1,8 мл упакованных клеток в пределах 2,2 мл смеси плазма и сыворотка.
  2. Если гематокрит образца не контролируется, определяют его с помощью высокоскоростного микроцентрифугирования (подойдут и другие стандартные методы).
    1. Извлеките необходимое количество образца для определения гематокрита: заполните микрогематокритные капилляры, погрузив его нижний кончик в жидкость. Остановите его, закрыв верхнее отверстие, когда необходимое количество образца поднимется в пробирке путем капиллярного всасывания.
    2. Запечатайте капилляры сургучом. Поместите их в центрифугу микрогематокрита и запустите ее при 15 000 x g (12 000 об/мин) в течение 5 минут или в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Прочтите уровень гематокрита на капилляре и запишите его для справки.
  3. Установите камеру для записи осаждения образцов. Чтобы избежать перегрузки памяти или разрядки аккумулятора, включите устройство от сети и сохраните снимки непосредственно на компьютер или внешний жесткий диск.
    1. Установите устойчивую камеру перед держателем, где трубки ESR будут оставлены в покое. Используйте белый, освещенный фон (белые листы бумаги на заднем плане отлично работают).
    2. Используя пустые трубки Вестергрена, желательно без маркировки, установите фокус и поле зрения камеры, чтобы получить максимальное разрешение, где будут размещены образцы. Желательно, чтобы границы рисунков были выровнены по вертикали и горизонтали.
    3. Сфотографируйте масштабированную трубку, чтобы извлечь разрешение в пикселях. Рекомендуется использовать изображения RGB.
    4. Установите свет и время экспозиции камеры так, чтобы фон был белым, но без насыщенности. Пример на рисунке 1 был получен с использованием Canon EOS M50 с выдержкой 1/15 с, диафрагмой F8.0, вольфрамовым балансом белого, в режиме одного кадра с ручной фокусировкой и чувствительностью ISO 1 000.
  4. Подготовьте и поместите трубки ESR.
    1. Наполните нижнюю емкость трубки Вестергрена объемом, соответствующим инструкциям производителя. Вставьте трубку Вестергрена в нижний контейнер, как указано производителем.
    2. Как только первая трубка будет готова, поместите ее в держатель и начните запись на камеру. Запись одного снимка каждую минуту обычно дает хорошее разрешение кинетической кривой ESR.
    3. Подготовьте и разместите следующие образцы. Убедитесь, что вы не стоите перед каким-либо образцом, когда делается снимок.
    4. Пусть измерения длятся не менее 2 часов, чтобы сравнить их со стандартными измерениями через 30 минут, 1 час и 2 часа. Тем не менее, также лучше увидеть насыщение и остановку седиментации. Для здоровых образцов или в случае воспаления более чем достаточно записи образцов в течение ночи, между 12 и 24 часами, поскольку кривизна самых быстрых образцов видна в течение 3 часов13,19. Однако, если какое-либо условие снижает скорость седиментации, как это происходит при снижении концентрации фибриногена (т.е. в выбранном примере, высокая объемная доля сыворотки), для получения наиболее точной информации может потребоваться регистрация в течение 50 ч или более 16,19.

2. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как изображения будут записаны, извлеките кривую ESR. Пример кода Matlab представлен в виде дополнительного файла 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

  1. Выберите или определите интересующую область (ROI), где видна только одна пробирка, нижняя граница которой расположена под самым нижним положением границы раздела бесклеточной плазмы эритроцитов, но внутри образца (см. рис. 1A, B). При необходимости поверните рисунок так, чтобы вертикальное направление было выровнено вдоль первого компонента рисунка.
  2. Преобразуйте ROI изображения RGB в изображение в оттенках серого или матрицу Gr. Обычно объединение трехцветных каналов (красный [R], зеленый [G] и синий [B]) как Gr = 2 * R - B - G очень эффективно с четким фоном (см. рис. 1C и MatlabCodeImageAnalysisSampled.m строки 121-128).
  3. Бинаризируйте картину. Для работоспособного образца использование порогаОцу 29 обычно дает согласованный результат (см. рисунок 1D и строку 133 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Для образцов с высоким гематокритом или с некоторым гемолизом может быть лучше настроить его вручную или использовать другой автоматический метод (как это сделано в строках 129-131 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), в зависимости от точного контраста, полученного между различными фазами внутри пробирки.
  4. Получите среднее значение значений пикселей (или элементов) Gr вдоль горизонтального направления. Этот шаг минимизирует шум и эффективно усредняет возможные неровности интерфейса (см. рис. 1E и строку 137 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).
  5. Прежде чем вычислять вариации, сгладьте кривую с помощью скользящей средней, особенно если трубки содержат некоторую горизонтальную разметку (см. рис. 1F). Для приведенных примеров для этого процесса использовалось движущееся окно размером ~2,5 мм (50 пикселей) (см. строку 138 MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Затем определите положение интерфейса как точку с наибольшим изменением интенсивности (см. рис. 1G).
  6. Повторите эти действия для каждого рисунка и каждого образца. Для каждого образца сохраняйте положения интерфейса во времени в соответствующем формате, чтобы соответствовать физической модели с любым подходящим программным обеспечением.

3. Подгонка физической модели

  1. Используя любое подходящее программное обеспечение, зная гематокрит и начальную высоту столбика крови h 0, найдите значения времени задержки t0, безразмерного времени γ и конечной упакованной объемной доли Φmэритроцитов, которая минимизирует сумму квадратов остаточных отклонений для физической модели17. Код Matlab (ShapeAnalyzerIntegrated.m) предоставляется в виде дополнительного файла 2 в качестве примера того, как выполнить такую подгонку. Дополнительные инструкции см. в Дополнительном файле 2. Как описано в другом месте16,17, эритроциты при физиологическом гематокрите осаждаются в виде мягких частиц геля, где важными физическими параметрами являются разница в плотности между плазмой и эритроцитами донора Δρ, характерный диаметр эритроцитов r эритроцитов, вязкость плазмы при комнатной температуре η и гематокрит донора Φ . Используя эти параметры и предполагая, что гравитационное напряжение является основным движущим процессом для потока плазмы вверх через пористую сеть, образованную эритроцитами после времени задержки t0, получаем временную эволюцию16,17:
    Equation 1
    где Equation 2, , Equation 3и Equation 4 средний радиус диска эритроцита. Пример кода Matlab, выполняющего это, приведен в виде вложения (ShapeAnalyzerIntegrated.m соответствует функции, определенной в SedimFit.m [Дополнительный файл 3]). В качестве альтернативы G/γ также можно использовать непосредственно в качестве параметра подгонки с единицами измерения 1/т.
  2. После того, как количественная кривая будет извлечена из изображения, сохраните физические параметры образца. Традиционные значения ESR через 30 мин, 1 ч или 2 ч все еще могут быть извлечены из кривой для справки (см. строки 123-132 ShapeAnalyzerIntegrated.m).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Пример правильно полученной последовательности изображений приведен в виде дополнительного фильма 1 (MovieS1.avi). Ряд характерных подгонок модели показан для различных условий на рисунке 2. Концентрацию фибриногена определяли по концентрации фибриногена в плазме Fib0, предполагая, что в сыворотке крови вообще нет фибриногена. Следовательно, Fib = C Fib0, где C - объемная доля плазмы в смеси плазмы и сыворотки. В предыдущих исследованиях16 Fib0 определяли стандартными методами в лаборатории клинической химии Университетской клиники Саара (Хомбург, Германия). Если необходимо измерить такое количество самостоятельно, удобный метод определения концентрации фибриногена включает (полу)автоматические шариковые коагулометры, которые также могут потребовать получения цитрат-антикоагулянтного образца крови от донора30. Кривые СОЭ из исследований, в результате которых были получены эти кривые, могут быть подогнаны коэффициентом Пирсона R 2 [0,974, 0,9996] со средним значением 0,996 и стандартным отклонением 0,004 (только одна кривая из 35 дала R2Equation 11 < 0,99). В конечном итоге извлекаются такие параметры, как конечный гематокрит в эритроцитной фазе Φm, время задержки t0, необходимое для разрушения геля и начала коллапса, и максимальная мгновенная скоростьEquation 6, достигаемая в начале коллапса. Безразмерный параметр γ связан с обратной площадью пор в уплотняющей сети эритроцитов (выражается кратно радиусу частицы), Δρ — разница в плотности между плазмой и эритроцитами донора, a — характерный диаметр эритроцитов, η — вязкость плазмы при комнатной температуре, а Φ — гематокрит донора. Подгонка фактически выполняется путем фиксации Δρ,a,η и Φ с последующим определением наилучшего γ, Φm и t0. Гематокрит следует определять самостоятельно другим стандартным методом, в то время как другой может быть зафиксирован на стандартных значениях (ΔρEquation 10080 кг/м3 31,32, ηEquation 100 1,5 мПа с 33 иEquation 1004 мкм). Любое отклонение других параметров просто изменит определенное значение γ на соответствующий коэффициент, но не изменит окончательное определение Um, которое в этом отношении является надежным параметром.

Коллекции значений параметров, собранные в предыдущих фундаментальных исследованиях, показывающие тенденции параметров в зависимости от уровней гематокрита и фибриногена, показаны на рисунках 3 и 4.

Figure 1
Рисунок 1: Обработка изображений . (A) Идеальный вид нескольких образцов с соответствующими показателями рентабельности инвестиций, выделенными для одного примера. (B) Увеличьте выбранную рентабельность инвестиций. (C) Преобразование цветного ROI в серый уровень. (D) Бинаризированное изображение, полученное с порогом Оцу. (E) Усредненная по горизонтали интенсивность двоичного изображения в зависимости от высоты (в соответствии с обычным соглашением при обработке изображений начало координат считается в верхней части изображения; см. также шаг 2.4 протокола). (F) Сглаживание интенсивности путем выполнения скользящей средней по 50-пиксельной вертикальной окрестности (см. также шаг 2.5 протокола). g) изменения сглаженной интенсивности вдоль вертикального направления. Позиция абсолютного максимального значения принимается за позицию интерфейса (см. также шаг 2.5 протокола). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Характерные посадки. (А) Кривые и посадки, полученные для здорового донора, с различными скорректированными гематокритическими показателями. Кривые адаптированы из предыдущего исследования17. (B) Кривые и посадки, полученные для здорового донора, с различными концентрациями фибриногена. Различные концентрации фибриногена были получены путем смешивания аутологичной плазмы и сыворотки в различных пропорциях. Кривые и данные взяты из предыдущего исследования16. Полосы погрешностей (полученные на основе пиксельного разрешения или статистики соответствия) меньше размера символа. Рисунки были перепечатаны с разрешения Dasanna et al.16 (18 образцов из четырех независимых анализов крови) и Darras et al.17 (16 образцов из семи независимых анализов крови). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Характерные значения выделенных параметров для различных гематокритов. (А) Изменение максимальной скорости осаждения экстрагированного Umв зависимости от гематокрита образца Φ. Круги - это индивидуальные измерения; Разные цвета связаны с разными здоровыми донорами. Непрерывная красная линия - это тренд, предсказанный моделью, полученный со средними значениями Φm и γ. Также показано скорректированное значение Umдля гематокрита Φ = 0,45, как в виде треугольников для отдельных значений, так и в виде прямой для предсказанной константы модели. Это скорректированное значение было вычислено в соответствии с моделью как Equation 10. (B) Значения, полученные для параметра γ. С) Значения, полученные для параметра Φm. D) Значения, полученные для параметра t0. Полосы погрешностей для отдельных данных, полученных из статистики подгонки, меньше размера символа. Эта цифра была адаптирована с разрешения Darras et al.17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Характерные значения экстрагированных параметров для различных концентраций фибриногена . (А) Изменение максимальной скорости осаждения экстрагированного Umв зависимости от концентрации фибриногена в образце. Разные цвета связаны с разными здоровыми донорами. (B) Значения, полученные для параметра γ. С) Значения, полученные для параметра Φm. D) Значения, полученные для параметра t0. Полосы погрешностей для отдельных данных, полученных из статистики подгонки, меньше размера символа. Этот рисунок был перепечатан с разрешения Dasanna et al.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный фильм 1: Пример правильно полученной последовательности изображений. На этих снимках показаны различные типы образцов от двух разных доноров (одна и та же группа крови). Слева направо все образцы, имеющие дубликаты: полная кровь от донора 1, суспензия эритроцитов от донора 1 в Декстрана 70 кДа (55 мг/мл PBS) с контролируемым гематокритом при 45%, полная кровь от донора 2, суспензия эритроцитов от донора 2 в Декстрана (гематокрит 45%), суспензия эритроцитов от донора 1 в плазме донора 2 (гематокрит 45%), и суспензия эритроцитов донора 2 в плазме донора 1 (гематокрит 45%). Образцы имеют широкий диапазон скоростей осаждения, а суспензии в декстрана также показывают некоторый гемолиз. Однако предоставленный код MatlabCodeImageAnalysisSampled.m эффективно анализирует их все. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Дополнительный файл 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. Основной код, используемый для анализа изображений (шаг 2 протокола). Для того, чтобы запустить код на конкретном устройстве, строка 8 должна быть изменена. В нем должен быть указан путь к папке, содержащей снимки анализируемых пробирок Вестергрена, оканчивающийся префиксом снимков, если таковые имеются. Набор сжатых изображений доступен для скачивания в открытом доступе на Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Код и, в частности, свойства каждого образца (определенные в строках 14-61) уже адаптированы для анализа этих изображений. Для этого набора изображений использовался префикс «IMG_». Поэтому строка 8 должна заканчиваться на '\IMG_' (или '/IMG_' в системах Linux). В последней части кода (строки 166-179) также автоматически строятся извлеченные кривые седиментации для каждого образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. Основной код, используемый для соответствия физической модели (шаг 3 протокола). Чтобы запустить этот код, просто скопируйте и вставьте его в папку, содержащую выходные текстовые файлы из MatlabCodeImageAnalysisSampled.m вместе с SedimFit.m. Имена анализируемых файлов (без расширения .txt) должны быть перечислены в строке 9. Исходный гематокрит и высота трубки также должны содержаться в строках 12 и 15 соответственно. Этот код уже подготовлен для анализа кривых, извлеченных из изображений в открытом доступе на Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). После того, как вышеупомянутые коды линий были изменены, просто нажмите кнопку «Выполнить» на панели инструментов редактора Matlab. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: SedimFit.m. Физическая модель, скорректированная с помощью ShapeAnalyzerIntegrated.m. Этот файл представляет собой функцию Matlab, определяющую функции, которые подходят к экспериментальным кривым для извлечения физических параметров. При выполнении анализа он должен находиться в той же папке, что и ShapeAnalyzerIntegrated.m. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для эффективной работы автоматизированного протокола важно иметь четкий фон и правильное освещение. Темный фон может препятствовать существованию эффективного порога бинаризации. Для образцов с некоторым гемолизом, который обычно происходит (увеличивается) с течением времени, важно сначала убедиться, что выбранный порог бинаризации актуален как для исходного, так и для конечного изображений.

Когда дело доходит до процесса бинаризации изображения, выбор порога ROI и бинаризации является наиболее чувствительным шагом. Возможно, было бы полезно вручную протестировать различные пороговые значения на трех разных изображениях (в начале, середине и конце процесса осаждения), чтобы убедиться, что выбор порога действительно обеспечивает соответствующую бинаризацию для всего процесса. Если образец испытывает сильный гемолиз, может потребоваться ограничить анализ образца началом процесса, когда еще можно наблюдать четкую границу раздела. Как и при любом измерении СОЭ, также важно избегать присутствия пузырьков в пробирке. Однако, если в верхней части трубы наблюдаются небольшие пузырьки, рентабельность инвестиций, начинающаяся под пузырьками и прямо над начальным интерфейсом, может по-прежнему обеспечивать соответствующее измерение. В этом случае, однако, важно включить некоторое фоновое пространство справа и слева от трубки, чтобы можно было определить порог Otsu, всегда учитывая значительное количество пикселей с уровнем серого фона.

Метод, как и все измерения СОЭ, основан на предположении, что можно увидеть четкую границу раздела между упакованными эритроцитами и бесклеточной плазмой. Если образец испытывает значительное количество гемолиза или если гематокрит образца слишком разбавлен (менее 25%17), такая граница раздела больше не будет наблюдаться. Измерение СОЭ в этих условиях невозможно выполнить.

Как указывалось ранее, данный способ обеспечивает соответствующую скорость коллапса геля Um, которая может быть скорректирована в соответствии с исходным гематокритом пациента17. На рисунке 3А, наряду с необработанными измерениями Um, также показаны скорректированные значения нормализованного гематокрита Φ 0 = 0,45. Видно, что поправка снимает общую зависимость от Φ0, а также большую часть дисперсии данных. Определение Umна основе непосредственно соответствующей физической модели также подразумевает, что этот метод является более объективным, чем произвольное сглаживание кривой с произвольным выбором параметров сглаживания. Среди прочего, было показано, что этот метод более надежен в медицинских контекстах, где наблюдаются аномально низкие значения СОЭ 19,20.

Еще один неотъемлемый интерес этого измерения заключается в том, что оно дает более надежные и физически интерпретируемые данные. Например, в случае пониженной СОЭ это позволяет определить, удлиняется ли время задержки t0 коллапса, необычно ли сеть эритроцитов необычно неупорядочена через γ или каким-то образом затруднено окончательное уплотнение Φm ячеек16,19,20.

Интересно, что измерение максимальной скорости седиментации также является более надежным и чувствительным к уровням фибриногена, как уже подчеркивалось в предыдущих исследованиях13,14,15. Это важная особенность, так как СОЭ часто используется для мониторинга воспаления, которое связано с повышенным уровнем фибриногена. Эта чувствительность по существу возникает из-за разъединения Um с момента коллапса геля, который, как известно, имеет важную случайную составляющую34,35,36. Более точно, как показано на рисунке 4D16, для более высоких концентраций фибриногена внутреннее случайное изменение времени задержки (при котором измерения выше 150 мг/мл составляют от 12 до 30 мин, даже среди одного донора) имеет тот же порядок величины, что и его базовая зависимость от этого параметра (от 150 мг/дл до 300 мг/дл; средний тренд измерений уменьшается только с 0,45 ч до 0,4 ч [ т.е. от 27 до 24 минут]). Поскольку это время задержки фактически включено в традиционное измерение высоты в 30 мин или 1 ч (продолжительность, которую это время задержки иногда может достигать или превышать), извлечение максимальной скорости Um (представляющей систематическую и значимую тенденцию для каждого донора) обеспечивает более надежный и значимый параметр 13,14,15,34,35, 36.

Более того, параметр Um может быть эффективно скорректирован для исходного гематокрита в соответствии с практическим результатомEquation 11, описанным ранее17. При объединении данных по всем здоровым донорам в предыдущем исследовании17 получены значения γ = 0,50 ± 0,06 и Φ m = 0,86 ± 0,04, которые хорошо воспроизводят тенденцию Um в зависимости от донорского гематокрита Φ , как показано на рисунке 3. Однако в практических случаях может быть более строгой коррекция СОЭ значениями γ и Φm, полученными для конкретного донора, поскольку уровни фибриногена также могут значительно изменяться между донорами и оказывать существенное влияние на эти параметры (рис. 4).

Учитывая обсуждаемые моменты и включая их в рутинные медицинские процедуры, точность и универсальность СОЭ как клинического инструмента in vitro еще больше улучшится.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, чтобы заявить о том, что это имеет отношение к содержанию этой статьи.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана исследовательским подразделением FOR 2688 - Wa1336/12 Немецкого научно-исследовательского общества и грантовым соглашением Марии Склодовской-Кюри No 860436-EVIDENCE. Т. Д. и К. В. признают финансирование со стороны Французско-немецкого университета (DFH/UFA). A. D. признает финансирование грантом для молодых исследователей Саарского университета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample) SARSTEDT 267001 or 265 Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50 Canon Kit EF-M18-150 IS STM Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge HERMLE 302.00 V03 - Z 36 HK Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge MLW TH21 or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries Fisher scientific 11884040 or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023 1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette) Gilson FD10006 Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate Hirschmann 9120101 Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes Praxindo A9244560 Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination / / White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bedell, S. E., Bush, B. T. Erythrocyte sedimentation rate. From folklore to facts. The American Journal of Medicine. 78, 1001-1009 (1985).
  2. Grzybowski, A., Sak, J. Edmund Biernacki (1866-1911): Discoverer of the erythrocyte sedimentation rate. On the 100th anniversary of his death. Clinics in Dermatology. 29 (6), 697-703 (2011).
  3. Kushner, I., Mackiewicz, A. The Acute Phase Response: An Overview. Acute Phase Proteins. , CRC Press. (1993).
  4. Tishkowski, K., Gupta, V. Erythrocyte Sedimentation Rate. StatPearls Publishing. , Treasure Island, FL. (2022).
  5. Menees, S. B., Powell, C., Kurlander, J., Goel, A., Chey, W. D. A meta-analysis of the utility of C-reactive protein, erythrocyte sedimentation rate, fecal calprotectin, and fecal lactoferrin to exclude inflammatory bowel disease in adults with IBS. The Americal Journal of Gastroenterology. 110 (3), 444-454 (2015).
  6. Brigden, M. L. Clinical utility of the erythrocyte sedimentation rate. Americal Family Physician. 60 (5), 1443-1450 (1999).
  7. Liu, S., et al. Preliminary case-control study to evaluate diagnostic values of C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate in differentiating active Crohn's disease from intestinal lymphoma, intestinal tuberculosis and Behcet's syndrome. The American Journal of the Medical Sciences. 346 (6), 467-472 (2013).
  8. Greidanus, N. V., et al. Use of erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein level to diagnose infection before revision total knee arthroplasty: A prospective evaluation. The Journal of Bone and Joint Surgery. 89 (7), 1409-1416 (2007).
  9. Flormann, D., Kuder, E., Lipp, P., Wagner, C., Kaestner, L. Is there a role of C-reactive protein in red blood cell aggregation. International Journal of Laboratory Hematology. 37 (4), 474-482 (2015).
  10. Brust, M., et al. The plasma protein fibrinogen stabilizes clusters of red blood cells in microcapillary flows. Scientific Reports. 4, 4348 (2014).
  11. Gray, S. J., Mitchell, E. B., Dick, G. F. Effect of purified protein fractions on sedimentation rate of erythrocytes. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 51 (3), 403-404 (1942).
  12. Kratz, A., et al. ICSH recommendations for modified and alternate methods measuring the erythrocyte sedimentation rate. International Journal of Laboratory Hematology. 39 (5), 448-457 (2017).
  13. Hung, W. T., Collings, A. F., Low, J. Erythrocyte sedimentation rate studies in whole human blood. Physics in Medicine and Biology. 39 (11), 1855-1873 (1994).
  14. Woodland, N. B., Cordatos, K., Hung, W. T., Reuben, A., Holley, L. Erythrocyte sedimentation in columns and the significance of ESR. Biorheology. 33 (6), 477-488 (1996).
  15. Holley, L., Woodland, N., Hung, W. T., Cordatos, K., Reuben, A. Influence of fibrinogen and haematocrit on erythrocyte sedimentation kinetics. Biorheology. 36 (4), 287-297 (1999).
  16. Dasanna, A. K., et al. Erythrocyte sedimentation: Effect of aggregation energy on gel structure during collapse. Physical Review. E. 105 (2-1), 024610 (2022).
  17. Darras, A., et al. Erythrocyte sedimentation: collapse of a high-volume-fraction soft-particle gel. Physical Review Letters. 128 (8), 088101 (2022).
  18. Darras, A., et al. Imaging erythrocyte sedimentation in whole blood. Frontiers in Physiology. 12, 729191 (2022).
  19. Darras, A., et al. Acanthocyte sedimentation rate as a diagnostic biomarker for neuroacanthocytosis syndromes: Experimental evidence and physical justification. Cells. 10 (4), 788 (2021).
  20. Rabe, A., et al. The erythrocyte sedimentation rate and its relation to cell shape and rigidity of red blood cells from chorea-acanthocytosis patients in an off-label treatment with dasatinib. Biomolecules. 11 (5), 727 (2021).
  21. Giavarina, D., Capuzzo, S., Pizzolato, U., Soffiati, G. Length of erythrocyte sedimentation rate (ESR) adjusted for the hematocrit: reference values for the TEST 1 method. Clinical Laboratory. 52 (5-6), 241-245 (2006).
  22. Bull, B. S. Is a standard ESR possible. Laboratory Medicine. 6 (11), 31-39 (1975).
  23. Bull, B. S., Brecher, G. An evaluation of the relative merits of the Wintrobe and Westergren sedimentation methods, including hematocrit correction. American Journal of Clinical Pathology. 62 (4), 502-510 (1974).
  24. Reinhart, W. H., Singh, A., Straub, P. W. Red blood cell aggregation and sedimentation: the role of the cell shape. British Journal of Haematology. 73 (4), 551-556 (1989).
  25. Jan, K., Usami, S., Smith, J. A. Influence of oxygen tension and hematocrit reading on ESRs of sickle cells: Role of RBC aggregation. Archives of Internal Medicine. 141 (13), 1815-1818 (1981).
  26. Issaq, H. J., Xiao, Z., Veenstra, T. D. Serum and plasma proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3601-3620 (2007).
  27. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), 21230 (2011).
  28. Proper Pipetting Techniques - DE. , Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/lab-plasticware-supplies/lab-plasticware-supplies-learning-center/lab-plasticware-supplies-resource-library/fundamentals-of-pipetting/proper-pipetting-techniques.html (2023).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transaction on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  30. Solomon, C., et al. A comparison of fibrinogen measurement methods with fibrin clot elasticity assessed by thromboelastometry, before and after administration of fibrinogen concentrate in cardiac surgery patients. Transfusion. 51 (8), 1695-1706 (2011).
  31. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLoS One. 12 (7), 0180520 (2017).
  32. Trudnowski, R. J., Rico, R. C. Specific gravity of blood and plasma at 4 and 37 degrees C. Clinical Chemistry. 20 (5), 615-616 (1974).
  33. Késmárky, G., Kenyeres, P., Rábai, M., Tóth, K. Plasma viscosity: A forgotten variable. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 39 (1-4), 243-246 (2008).
  34. Teece, L. J., et al. Gels under stress: The origins of delayed collapse. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 458, 126-133 (2014).
  35. Lindström, S. B., Kodger, T. E., Sprakel, J., Weitz, D. A. Structures, stresses, and fluctuations in the delayed failure of colloidal gels. Soft Matter. 8 (13), 3657-3664 (2012).
  36. Bartlett, P., Teece, L. J., Faers, M. A. Sudden collapse of a colloidal gel. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 85, 021404 (2012).

Tags

Медицина выпуск 193
Скорость оседания эритроцитов: характеристика, основанная на физике, в медицинском контексте
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Darras, A., John, T., Wagner, C.,… More

Darras, A., John, T., Wagner, C., Kaestner, L. Erythrocyte Sedimentation Rate: A Physics-Driven Characterization in a Medical Context. J. Vis. Exp. (193), e64502, doi:10.3791/64502 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter