Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Erytrocytt sedimenteringshastighet: En fysikkdrevet karakterisering i en medisinsk sammenheng

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64502
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3
1Experimental Physics, Saarland University, 2Department of Physics and Materials Science, University of Luxembourg, 3Theoretical Medicine and Biosciences, Saarland University

Summary

Senkningsreaksjon (SR) er en fysisk parameter, ofte brukt i rutinemessige helsekontroller og medisinsk diagnose. En teoretisk modell som gjør det mulig å trekke ut fysisk meningsfulle parametere fra hele sedimentasjonskurven, basert på moderne kolloidal kunnskap, er nylig utviklet. Her presenterer vi en protokoll for automatisk å samle inn ESR over tid, og trekke ut parametrene til denne siste modellen fra denne automatiserte datainnsamlingen. Disse raffinerte parametrene vil sannsynligvis også forbedre det medisinske vitnesbyrdet.

Abstract

Erytrocytt (eller røde blodlegemer) sedimenteringshastighet (ESR) er en fysisk avledet parameter av blod som ofte brukes i rutinemessige helsekontroller og medisinsk diagnose. For eksempel, i tilfelle betennelse, observeres en høyere ESR på grunn av den tilknyttede økningen i fibrinogen og andre plasmaproteiner. Det ble antatt at denne økningen skyldtes dannelsen av større aggregater av røde blodlegemer (RBC) forårsaket av økningen i fibrinogen. Faktisk er fibrinogen en agentfremmende aggregering av RBC og i Stokes-regimet antas å bli observert i blodstørre aggregater sediment raskere. Imidlertid krever alle modeller av ESR-målinger basert på denne hypotesen ytterligere spesifikke fysiske forutsetninger, som ikke kreves i noe annet system. Dessuten har moderne studier innen kolloidale suspensjoner fastslått at attraktive partikler danner perkolerende aggregater (dvs. aggregater så brede som beholderen). Sedimenteringen av disse kolloidene følger da en såkalt "kolloidal gelkollaps". Nylig har det vist seg at RBC faktisk følger samme oppførsel. Denne hypotesen gjør det også mulig å effektivt og analytisk modellere sedimentasjonskurven til RBC, hvorfra robuste og fysisk meningsfulle beskrivelser kan trekkes ut. Dette manuskriptet beskriver hvordan man utfører en slik analyse, og diskuterer fordelene med denne tilnærmingen.

Introduction

Erytrocytt sedimenteringshastigheten (ESR) er et medisinsk in vitro klinisk verktøy, formelt introdusert i bevisbasert medisin i løpet av det tjuende århundre 1,2,3,4. Det brukes for tiden over hele verden som en ikke-spesifikk inflammatorisk test, eller for å overvåke utviklingen av noen spesifikke forhold 5,6,7,8. Dette skyldes hovedsakelig en økning i fibrinogenkonsentrasjonen, men også i andre plasmakomponenter som IgM 1,9,10,11. I henhold til gjeldende Westergren-standardprotokoll rapporteres ESR-verdier som måling av det cellefrie plasmalaget på et gitt tidspunkt (30 min eller 1 time) etter å ha forlatt et vertikalt rør med en typisk størrelse på 20 cm vertikalt i hvile12. Denne målemetoden har imidlertid blitt kritisert siden kvalitativt forskjellige stadier i sedimenteringsprosessen er rapportert, inkludert en forsinkelse før maksimal sedimenteringshastighet13 er nådd. Denne forsinkelsen varer mer enn 1 time i omtrent halvparten av friske prøver14. Hastigheten i denne fasen adlyder en annen skalering enn i den andre, raskere fasen av sedimentasjonen15. Ved å begrense avlesningen til gjennomsnittlig sedimenteringshastighet i løpet av den første timen, sammenlignes deretter en annen blanding av forskjellige blodegenskaper mellom forskjellige individer.

Videre er det nylig påvist at de vanlige teoretiske betraktningene bak denne protokollen var feilaktige16,17,18. Ved fysiologisk hematokrit (over ca. 25%) sedimenterer ikke røde blodlegemer (RBC) som separate aggregater, men snarere som et kontinuerlig, såkalt perkolerende, nettverk av RBC 17,18, som adlyder et annet sett med fysiske ligninger enn den vanligvis nevnte Stokes sedimentasjon 16,17. Det er vist at det å vurdere en fysisk beskrivelse basert på tidsoppløste målinger av sedimentasjonen (helkurven) var mer robust i noen nye medisinske sammenhenger19,20. Videre kan disse målingene brukes til å kaste lys over de fysiske mekanismene som endrer ESR i patologier der celleformer endres19,20. I tillegg kan en langsom ESR ha en nyttig medisinsk tolkning, som angitt i målingene av en kohort av nevroacanthocytose syndrom pasienter19,20. Denne artikkelen gjennomgår hvordan du praktisk implementerer måling av fysisk meningsfulle parametere, basert på hele ESR-kinetikken. Mer nøyaktig trekker metoden som presenteres her maksimal sedimenteringshastighet Um, hvis verdi kan korrigeres for å vurdere effekten av hematokriten til giveren16,17. Denne parameteren er mer nøyaktig og dermed mer pålitelig enn den tradisjonelle målingen16,17,19,20.

I tillegg, i noen grunnleggende undersøkelser, i stedet for å overvåke betennelsestilstanden til en gitt pasient, er det interessant å utelukke effekten av hematokrit på ESR 21,22,23, eller å undersøke RBCs rolle i en modifisert ESR 19,20,24,25 mellom ulike givere. Det kan være nyttig å sammenligne prøver som ikke er direkte fulle blodprøver fra pasienter. Derfor kan resuspendering av RBC med en kontrollert hematokrit i det autologe plasmaet, eller i en plasmasubstituent, brukes som det første trinnet i ESR-måling. For eksempel gir oppløsninger av Dextran 70 kDa med en konsentrasjon på 55 mg/ml i fosfatbufret saltvann (PBS) et sedimenteringsområde innenfor kontrollområdet for friske celler19. Dette manuskriptet viser også hvordan slike trinn bør gjennomføres, og at den presenterte analysen også er relevant i disse tilfellene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blodprøvetaking og eksperimenter ble godkjent av "Ärztekammer des Saarlandes", etikkvotum 51/18, og utført etter informert samtykke i henhold til Helsinkideklarasjonen. Standardmålinger bør utføres med etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)-antikoagulert blod (standard EDTA-konsentrasjon på 1,6 mg/ml blod, europeisk norm NF EN ISO 6710), i Westergren-rør. Volumet som kreves for å fylle Westergren-røret, avhenger av produsenten (da nedre deler noen ganger inneholder et bredere reservoar); Volumet skal være ca. 1 ml fullblod og 800 μL for rørene som er angitt i materialfortegnelsen. Metoden beskrevet nedenfor er imidlertid gyldig uansett den spesifikke suspensjonen og beholderformen, så lenge hematokriten til de undersøkte prøvene er høyere enn 25%16. Volumer, beholdere, suspenderingsmedium og tilsetningsstoffer bør derfor velges i henhold til de spesifikke målene for den utførte forskningen.

1. Eksperimenter og målinger

MERK: Registrer sedimentasjonshastigheten til prøven hvert minutt.

  1. Prøvepreparering (om nødvendig): Hvis det kreves en kontrollhematokrit eller suspenderende væske, start med å vaske cellene og forberede prøvene (som et eksempel viser vi hvordan du fremstiller prøver med forskjellige fibrinogennivåer ved å blande autologt serum og plasma). Serum kan faktisk tilnærmes som fibrinogenfritt plasma26,27, og kan brukes for å redusere aggregeringen av RBC, under ellers fysiologiske forhold. For å forberede flere prøver, samle blodet i standard EDTA-rør på 9 ml og serumet i standard serumrør (med silikaperler som koagulasjonsaktivatorer) på 9 ml.
    1. Sentrifuge blodprøvene (dvs. 9 ml standard EDTA og serumrør i det valgte eksemplet) ved 3000 x g i minst 7 minutter, for optimal komprimering av de pakkede erytrocytene. Erstatt supernatanten med PBS eller ønsket suspenderingsvæske hvis en tilstrekkelig mengde er tilgjengelig. Hvis det bare er nødvendig å kontrollere hematokriten i autologt plasma, fortsett direkte til trinn 1.1.3. Bland ellers forsiktig etter at supernatanten er tatt i bruk for vask.
    2. Gjenta tre ganger. Utfør den siste vasken med ønsket suspenderingsvæske i alle fall.
      1. I det valgte eksemplet fremstilles blandinger av autologt plasma og serum med bestemte proporsjoner (f.eks. 25 %/75 %, 50 %/50 % eller 75 %/25 % av plasma-serumvolumfraksjonen). For eksempel, når du tilbereder 2,5 ml av plasmaserumblandingen på 25 % / 75 %, tilsett 0,625 ml plasma til 1,875 ml serum.
    3. Trekk ut det nødvendige volumet av pakkede celler og suspender det i ønsket væske. Behandle de pakkede cellene som en høyviskøs væske (ved bruk av standard forpipettering og/eller reverspipettering eller en positiv fortrengningspipette28). I det valgte eksemplet, for en 4 ml prøve ved en hematokrit på 45%, suspendere 1,8 ml pakkede celler innen 2,2 ml av plasma-serumblandingen.
  2. Hvis prøvens hematokrit ikke er kontrollert, bestem den ved høyhastighets mikrosentrifugering (andre standardmetoder er også egnet).
    1. Trekk ut den nødvendige mengden prøve for hematokritbestemmelse: fyll mikrohematokritkapillærene ved å senke den nedre spissen i væsken. Stopp det ved å dekke toppåpningen når den nødvendige mengden prøve stiger i røret ved kapillærsug.
    2. Forsegl kapillærene med tetningsvoks. Plasser dem i mikrohematokritsentrifugen og kjør den ved 15 000 x g (12 000 o / min) i 5 minutter, eller i henhold til produsentens instruksjoner.
    3. Les hematokritnivået på kapillæren og skriv det ned for referanse.
  3. Sett opp et kamera for opptak av prøvenes sedimentering. For å unngå å overbelaste minnet eller tømme batteriet, koble enheten til strøm fra strømnettet og lagre bildene direkte på en datamaskin eller ekstern harddisk.
    1. Sett opp et stødig kamera foran holderen der ESR-rørene blir stående i ro. Bruk en hvit, opplyst bakgrunn (hvite ark i bakgrunnen fungerer perfekt).
    2. Bruk tomme Westergren-rør, helst uten markeringer, still inn fokus og synsfelt på kameraet for å oppnå høyest mulig oppløsning der prøvene skal plasseres. Sørg helst for at kantene på bildene er justert i vertikal og horisontal retning.
    3. Ta et bilde av et skalert rør for å trekke ut pikseloppløsningen. Bruk av RGB-bilder anbefales.
    4. Still inn lyset og eksponeringstiden til kameraet til å ha hvit bakgrunn, men ingen metning. Eksemplet i figur 1 er oppnådd ved hjelp av et Canon EOS M50, med en eksponeringstid på 1/15s, en blenderåpning på F8.0, wolfram hvitbalanse, i enkeltbildemodus med manuell fokus og en ISO-hastighet på 1,000.
  4. Forbered og plasser ESR-rørene.
    1. Fyll bunnbeholderen på Westergren-røret med volumet som tilsvarer produsentens instruksjoner. Sett inn Westergren-røret i bunnbeholderen som angitt av produsenten.
    2. Så snart det første røret er klart, plasser det i holderen og start kameraopptaket. Opptak av ett bilde hvert minutt gir vanligvis en god oppløsning på ESR-kinetisk kurve.
    3. Forbered og plasser de neste prøvene. Pass på at du ikke står foran noen prøve når et bilde er tatt.
    4. La målingene gå i minst 2 timer, for å sammenligne med standardmålinger ved 30 minutter, 1 time og 2 timer. Det er imidlertid også bedre å se metning og arrestering av sedimenteringen. For sunne prøver, eller i tilfelle betennelse, er det mer enn tilstrekkelig å registrere prøvene over natten, mellom 12 timer og 24 timer, siden krumningen av de raskeste prøvene er synlig innen 3 timer13,19. Imidlertid, hvis en tilstand reduserer sedimentasjonshastigheten, som en reduksjon i fibrinogenkonsentrasjonen gjør (dvs. i det valgte eksemplet høy serumvolumfraksjon), kan det være nødvendig med opptak på 50 timer eller mer for å få den mest nøyaktige informasjonen16,19.

2. Bildeanalyse

MERK: Når bildene er spilt inn, trekker du ut ESR-kurven. Et eksempel på Matlab-kode er gitt som tilleggsfil 1 (MatlabCodeImageAnalysisSampled.m).

  1. Velg eller identifiser et interesseområde (ROI) der bare ett rør er synlig, den nedre grensen ligger under den laveste posisjonen til det erytrocytcellefrie plasmagrensesnittet, men innenfor prøven (se figur 1A, B). Hvis det er nødvendig, roterer du bildet slik at den loddrette retningen justeres langs den første komponenten i bildet.
  2. Konverter avkastningen på RGB-bildet til et gråtonebilde eller matrise Gr. Vanligvis er det svært effektivt å kombinere de trefargede kanalene (rød [R], grønn [G] og blå [B]) som Gr = 2 * R - B - G med en klar bakgrunn (se figur 1C og MatlabCodeImageAnalysisSampled.m linje 121-128).
  3. Binarize bildet. For en sunn prøve gir bruk av Otsu-terskelen29 vanligvis et konsistent resultat (se figur 1D og linje 133 i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). For prøver med høy hematokrit eller med litt hemolyse, kan det være bedre å justere det manuelt eller bruke en annen automatisk metode (som gjort i linjene 129-131 i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m), avhengig av den nøyaktige kontrasten oppnådd mellom de forskjellige fasene inne i røret.
  4. Hent gjennomsnittet av pikselverdiene (eller elementene) til Gr langs den horisontale retningen. Dette trinnet minimerer støyen og beregner effektivt de mulige uregelmessighetene i grensesnittet (se figur 1E og MatlabCodeImageAnalysisSampled.m linje 137).
  5. Før du beregner variasjonene, glatt kurven med et glidende gjennomsnitt, spesielt hvis rørene inneholder noen horisontale markeringer (se figur 1F). For de oppgitte eksemplene ble et bevegelig vindu på ~ 2,5 mm (50 piksler) brukt til denne prosessen (se linje 138 i MatlabCodeImageAnalysisSampled.m). Identifiser deretter grensesnittposisjonen som punktet med høyest intensitetsvariasjon (se figur 1G).
  6. Gjenta for hvert bilde og hver prøve. For hver prøve, lagre posisjonene til grensesnittet langs tid i et passende format for å passe den fysiske modellen med en hvilken som helst passende programvare.

3. Montering av den fysiske modellen

  1. Bruk hvilken som helst passende programvare, å kjenne hematokriten og den opprinnelige høyden på blodkolonnen h 0, finn verdiene for forsinkelsestiden t0, den dimensjonsløse tiden γ og den endelige pakkede volumfraksjonen Φmav erytrocytene som minimerer summen av kvadrerte restavvik for den fysiske modellen17. En Matlab-kode (ShapeAnalyzerIntegrated.m) er gitt som tilleggsfil 2 som et eksempel på hvordan du utfører en slik tilpasning. Se tilleggsfil 2 for ytterligere instruksjoner. Som beskrevet andre steder16,17, erytrocytter ved fysiologisk hematokritsediment som en myk partikkelgel, hvor de viktige fysiske parametrene er forskjellen i tetthet mellom plasma og RBC av donoren Δρ, RBC-karakteristisk diameter rRBC, plasmaviskositeten ved romtemperatur η og donorens hematokrit Φ . Ved å bruke disse parametrene, og forutsatt at gravitasjonsspenningen er den viktigste drivprosessen for at plasmaet skal strømme oppover gjennom det porøse nettverket dannet av erytrocyttene etter en forsinkelsestid t0, oppnår man den tidsmessige utviklingen16,17:
    Equation 1
    med Equation 2, Equation 3, og Equation 4 er den gjennomsnittlige diskradiusen til en erytrocyt. Et eksempel på en Matlab-kode som utfører dette, er gitt som et vedlegg (ShapeAnalyzerIntegrated.m passer til funksjonen definert i SedimFit.m [tilleggsfil 3]). Alternativt kan G/γ også brukes direkte som tilpasningsparameter med enheter på 1/t.
  2. Når den kvantitative kurven er trukket ut fra bildet, lagrer du de fysiske parametrene til prøven. Tradisjonelle ESR-verdier ved 30 minutter, 1 time eller 2 timer kan fremdeles trekkes ut fra kurven for referanse (se ShapeAnalyzerIntegrated.m linje 123-132).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Et eksempel på en korrekt innhentet bildesekvens er gitt som tilleggsfilm 1 (MovieS1.avi). En rekke karakteristiske tilpasninger av modellen er vist for ulike forhold i figur 2. Fibrinogenkonsentrasjonen ble bestemt ut fra fibrinogenkonsentrasjonen i plasma Fib0, forutsatt at serumet ikke har noe fibrinogen i det hele tatt. Derfor Fib = C Fib0, hvor C er plasmavolumfraksjonen i plasma-serumblandingen. I tidligere studier16 ble Fib0 bestemt ved standardmetoder i klinisk kjemilaboratorium ved Saarland universitetssykehus (Homburg, Tyskland). Hvis det er nødvendig å måle en slik mengde uavhengig, inkluderer en praktisk metode for å bestemme fibrinogenkonsentrasjonen (semi-) automatiserte kulekoagulometre, som også kan kreve å oppnå en citrat-antikoagulert prøve av blod fra giveren30. ESR-kurvene fra studiene som genererte disse kurvene kunne utstyres med en Pearson-koeffisient R 2 [0,974, 0,9996], med et gjennomsnitt på 0,996 og et standardavvik på 0,004 (bare en kurve av 35 ga en R2Equation 11 < 0,99). Parametrene som til slutt ekstraheres er den endelige hematokriten i RBC-fasen Φm, forsinkelsestiden t0-nødvendig for at gelen skal sprekke og begynne å kollapse - og maksimal øyeblikkelig hastighet Equation 6, nådd ved starten av kollapsen. Den dimensjonsløse parameteren γ er assosiert med det inverse av poreområdet i komprimeringsnettverket av RBC (uttrykt i multipler av partikkelradius), Δρ er forskjellen i tetthet mellom donorens plasma og RBC, a er RBC-karakteristikkdiameteren, η er plasmaviskositeten ved romtemperatur, og Φ er donorens hematokrit. Tilpasningen utføres faktisk ved å fikse Δρ,a,η og Φ og deretter bestemme de beste γ, Φm og t0. Hematokriten skal bestemmes uavhengig via en annen standardmetode, mens den andre kan fikseres ved standardverdier (ΔρEquation 10080kg/m3 31,32, ηEquation 100 1,5 mPa s 33 og aEquation 1004 μm). Ethvert avvik fra de andre parametrene vil ganske enkelt endre den bestemte verdien av γ med en tilsvarende faktor, men vil ikke endre den endelige bestemmelsen av Um, som da er en robust parameter i den forbindelse.

Samlinger av parameterverdier samlet i tidligere grunnleggende studier, som viser trendene til parametrene som en funksjon av hematokrit- og fibrinogennivåene, er vist i figur 3 og figur 4.

Figure 1
Figur 1: Bildebehandling . (A) Ideell visning av flere prøver, med relevante avkastninger, uthevet for ett utvalg. (B) Zoom på valgt avkastning. (C) Konvertering av den fargede avkastningen til grånivå. (D) Binarisert bilde oppnådd med Otsu-terskelen. (E) Den horisontalt gjennomsnittlige intensiteten til det binære bildet som en funksjon av høyden (i henhold til den vanlige konvensjonen i bildebehandling, anses opprinnelsen å være på toppen av bildet, se også trinn 2.4 i protokollen.) (F) Jevnet intensitet ved å utføre et glidende gjennomsnitt på et 50 pikslers vertikalt nabolag (se også trinn 2.5 i protokollen). (G) Variasjoner av glatt intensitet langs vertikal retning. Posisjonen til den absolutte maksimumsverdien er tatt som grensesnittets posisjon (se også trinn 2.5 i protokollen). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Karakteristiske anfall. (A) Kurver og anfall oppnådd for en frisk donor, med ulike justerte hematokriter. Kurvene er tilpasset fra en tidligere studie17. (B) Kurver og anfall oppnådd for en frisk donor, med forskjellige fibrinogenkonsentrasjoner. Ulike fibrinogenkonsentrasjoner ble oppnådd ved å blande autologt plasma og serum i forskjellige proporsjoner. Kurvene og dataene er fra en tidligere studie16. Feilfelt (hentet fra pikseloppløsning eller tilpasningsstatistikk) er mindre enn symbolstørrelsen. Figurene er gjengitt med tillatelse fra Dasanna et al.16 (18 prøver fra fire uavhengige blodtegninger) og Darras et al.17 (16 prøver fra syv uavhengige blodtegninger). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Karakteristiske verdier for de ekstraherte parametrene for forskjellige hematokriter . (A) Variasjon av den ekstraherte maksimale sedimentasjonshastigheten Umsom en funksjon av prøvehematokriten Φ. Sirkler er individuelle målinger; Ulike farger er relatert til forskjellige sunne givere. Den kontinuerlige røde linjen er trenden spådd av modellen, oppnådd med gjennomsnittsverdiene på Φm og γ. Den korrigerte verdien av Umfor en hematokrit av Φ = 0, 45 vises også, både som trekanter for individuelle verdier og som en rett linje for den forutsagte konstanten til modellen. Denne korrigerte verdien er beregnet i henhold til modellen som Equation 10. (B) Verdier oppnådd for parameteren γ. (C) Verdier oppnådd for parameteren Φm. (D) Verdier oppnådd for parameteren t0. Feilfelt for individuelle data hentet fra tilpasningsstatistikk er mindre enn symbolstørrelsen. Denne figuren er tilpasset med tillatelse fra Darras et al.17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Karakteristiske verdier for de ekstraherte parametrene for forskjellige fibrinogenkonsentrasjoner. (A) Variasjon av den ekstraherte maksimale sedimentasjonshastigheten Umsom funksjon av prøvens fibrinogenkonsentrasjon. Ulike farger er relatert til forskjellige friske givere. (B) Verdier oppnådd for parameteren γ. (C) Verdier oppnådd for parameteren Φm. (D) Verdier oppnådd for parameteren t0. Feilfelt for individuelle data hentet fra tilpasningsstatistikk er mindre enn symbolstørrelsen. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Dasanna et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfilm 1: Eksempel på en riktig ervervet bildesekvens. Ulike prøvetyper er vist på disse bildene fra to forskjellige givere (samme blodgruppe). Fra venstre til høyre, alle prøver med duplikater: fullt blod fra donor 1, suspensjon av RBC fra donor 1 i Dextran 70 kDa (55 mg / ml PBS) med kontrollert hematokrit på 45%, fullt blod fra donor 2, suspensjon av RBC fra donor 2 i Dextran (45% hematokrit), suspensjon av RBC fra donor 1 i plasma av donor 2 (45% hematokrit), og suspensjon av RBC fra donor 2 i plasma av donor 1 (45% hematokrit). Prøvene har et bredt spekter av senkningshastigheter, og suspensjonene i Dextran viser også noe hemolyse. Den medfølgende koden MatlabCodeImageAnalysisSampled.m analyserer imidlertid dem alle effektivt. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Tilleggsfil 1: MatlabCodeImageAnalysisSampled.m. Hovedkoden som brukes til bildeanalysen (trinn 2 i protokollen). For å kjøre koden på en bestemt enhet, bør linje 8 endres. Den skal inneholde banen til mappen som inneholder bildene av Westergren-rørene som skal analyseres, og slutter med prefikset til bildene, hvis noen. Et sett med komprimerte bilder er tilgjengelig for åpen nedlasting på Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Koden, og spesielt egenskapene til hver prøve (definert i linjene 14-61), er allerede tilpasset for å analysere disse bildene. For dette bildesettet var prefikset som ble brukt 'IMG_'. Derfor bør strenglinjen 8 slutte med '\IMG_' (eller '/IMG_' på Linux-systemer). Den siste delen av koden (linje 166-179) plotter også automatisk de ekstraherte sedimentasjonskurvene for hver prøve. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: ShapeAnalyzerIntegrated.m. Hovedkoden som brukes til å passe den fysiske modellen (trinn 3 i protokollen). For å kjøre denne koden, bare kopier og lim den inn i mappen som inneholder utdatatekstfilene fra MatlabCodeImageAnalysisSampled.m, sammen med SedimFit.m. Navnene på filene som skal analyseres (uten .txt-utvidelsen) skal være oppført i linje 9. Den første hematokriten og høyden på røret bør også være inneholdt i henholdsvis linje 12 og 15. Denne koden er allerede forberedt på å analysere kurvene hentet fra open access-bildene på Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7290177). Når de nevnte linjekodene er endret, klikker du bare på 'Kjør'-knappen i Matlab Editor-verktøylinjen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: SedimFit.m. Fysisk modell justert av ShapeAnalyzerIntegrated.m. Denne filen er en Matlab-funksjon, som definerer funksjonene som er montert på eksperimentelle kurver for å trekke ut de fysiske parametrene. Den skal være i samme mappe som ShapeAnalyzerIntegrated.m når analysen kjøres. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For at den automatiserte protokollen skal fungere effektivt, er det viktig å ha en klar bakgrunn og riktig belysning. En mørk bakgrunn kan forhindre eksistensen av en effektiv binariseringsterskel. For prøver med noe hemolyse, som vanligvis oppstår (øker) over tid, er det viktig å først verifisere at den valgte binariseringsterskelen er relevant for både det første og endelige bildet.

Når det gjelder binariseringsprosessen av bildet, er valget av avkastning og binariseringsterskel det mest følsomme trinnet. Det kan være nyttig å manuelt teste forskjellige terskelverdier på tre forskjellige bilder (i begynnelsen, midten og slutten av sedimenteringsprosessen) for å sikre at valget av terskelen faktisk gir relevant binarisering for hele prosessen. Hvis prøven opplever sterk hemolyse, kan det være nødvendig å begrense analysen av prøven til begynnelsen av prosessen, når et klart grensesnitt fortsatt kan observeres. Som for enhver ESR-måling, er det også viktig å unngå tilstedeværelse av bobler i røret. Men hvis noen små bobler observeres på toppen av røret, kan en avkastning som starter under boblene og rett på toppen av det opprinnelige grensesnittet, fortsatt gi den relevante målingen. I dette tilfellet er det imidlertid viktig å inkludere litt bakgrunnsplass til høyre og venstre for røret, slik at Otsu-terskelen kan bestemmes mens du alltid vurderer en betydelig mengde piksler med det grå nivået på bakgrunnen.

Metoden, som med alle ESR-målinger, er avhengig av antagelsen om at et klart grensesnitt mellom pakkede erytrocytter og cellefritt plasma kan sees. Hvis prøven opplever en betydelig mengde hemolyse, eller hvis hematokriten av prøven er for fortynnet (under 25%17), vil et slikt grensesnitt ikke bli observert lenger. En ESR-måling under disse forholdene er da umulig å utføre.

Som nevnt tidligere, sikrer denne metoden å gi den relevante hastigheten til gelkollapsen Um, som kan korrigeres i henhold til pasientens første hematokrit17. Figur 3A, sammen med råmålingene av Um, viser også de korrigerte verdiene for en normalisert hematokrit på Φ 0 = 0, 45. Det kan sees at korreksjonen fjerner den generelle avhengigheten av Φ0, så vel som det meste av dataspredningen. Å bestemme Umbasert direkte på den relevante fysiske modellen innebærer også at teknikken er mer objektiv enn en vilkårlig kurveutjevning, med vilkårlige valg av glattingsparametere. Blant annet har denne metoden vist seg å være mer robust i medisinske sammenhenger der unormalt lave ESR-verdier observeres19,20.

En annen iboende interesse for denne målingen er at den gir mer robuste og fysisk tolkbare data. For eksempel, i tilfelle av en senket ESR, tillater det å skille om forsinkelsestiden t0 av sammenbruddet er forlenget, hvis nettverket av RBC er uvanlig forstyrret gjennom γ, eller hvis den endelige komprimeringen Φm av cellene på en eller annen måte hindres16,19,20.

Interessant nok er målingen av maksimal sedimentasjonshastighet også mer robust og følsom for fibrinogennivåer, som allerede fremhevet i tidligere studier13,14,15. Dette er en viktig funksjon, da ESR ofte brukes til å overvåke betennelse, som er forbundet med forhøyede nivåer av fibrinogen. Denne følsomheten oppstår i hovedsak fra frakobling av Um fra tidspunktet for gelkollaps, som er kjent for å ha en viktig tilfeldig komponent34,35,36. Mer nøyaktig, som fremhevet i figur 4D16, for høyere konsentrasjoner av fibrinogen, har den iboende tilfeldige variasjonen av forsinkelsestiden (hvor målinger over 150 mg / ml er mellom 12 minutter og 30 minutter, selv blant en enkelt donor) samme størrelsesorden som dens underliggende avhengighet av denne parameteren (mellom 150 mg / dL og 300 mg / dL; den gjennomsnittlige trenden for målingene reduseres bare fra 0,45 h til 0,4 timer [ dvs. 27 min til 24 min]). Siden denne forsinkelsestiden faktisk er inkludert i den tradisjonelle høydemålingen ved 30 min eller 1 time (varigheter som denne forsinkelsestiden noen ganger kan nå eller overskride), gir ekstrahering av maksimal hastighet Um (presenterer en systematisk og signifikant trend for hver donor) en mer robust og meningsfull parameter 13,14,15,34,35, 36.

Videre kan parameteren Um effektivt korrigeres for den første hematokriten, i henhold til det praktiske resultatet Equation 11 beskrevet tidligere17. Ved sammenslåing av data for alle friske donorer i en tidligere studie17, oppnås verdier på γ = 0,50 ± 0,06 og Φ m = 0,86 ± 0,04, som fint gjengir trenden til Um som en funksjon av donorhematokriten Φ , som vist i figur 3. I praktiske tilfeller kan det imidlertid være strengere å korrigere ESR med γ- og Φm-verdieneoppnådd for en bestemt donor, siden fibrinogennivåene også kan endres betydelig mellom donorer og ha betydelig innflytelse på disse parametrene (figur 4).

Tatt i betraktning punktene som diskuteres og inkluderer dem i rutinemessige medisinske prosedyrer, vil nøyaktigheten og allsidigheten til ESR som et in vitro klinisk verktøy ytterligere forbedres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære relevant for innholdet i denne artikkelen.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av forskningsenheten FOR 2688 - Wa1336/12 fra den tyske forskningsstiftelsen og av Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen nr. 860436-EVIDENCE. TJ og CW anerkjenner finansiering fra fransk tysk universitet (DFH / UFA). AD anerkjenner finansiering av Young Investigator Grant av Saarland University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anticoagulant (EDTA or Heparin) tube (for blood sample) SARSTEDT 267001 or 265 Anticoagulated blood sample to characterize
Camera EOS M50 Canon Kit EF-M18-150 IS STM Any camera should work, provided that sector alimentation, connection to computer for automated shooting and adapted objective are available
Centrifuge HERMLE 302.00 V03 - Z 36 HK Requirements: at least 3000 x g ofr 7 min.
Micro-centrifuge MLW TH21 or any other way to determine the hematocrit
Micro-hematocrit capilaries Fisher scientific 11884040 or other capillaries/containers for hematocrit determination
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023 1x PBS, pH 7.4, 298 Osm
Pipettes (e.g. positive displacement pipette) Gilson FD10006 Pipette required to manipulate blood and/or packed cells.Other models are of course suitable, but be careful to treat blood and pakced cells as highly viscous fluids.
Wax sealing plate Hirschmann 9120101 Sealing wax for the micro-hematocrit capillaries
Westergren tubes Praxindo A9244560 Any other standard Wetsergren tube should work too
White background with illumination / / White sheet(s) of paper behind the samples, with usual room light is perfcetly sufficient.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bedell, S. E., Bush, B. T. Erythrocyte sedimentation rate. From folklore to facts. The American Journal of Medicine. 78, 1001-1009 (1985).
  2. Grzybowski, A., Sak, J. Edmund Biernacki (1866-1911): Discoverer of the erythrocyte sedimentation rate. On the 100th anniversary of his death. Clinics in Dermatology. 29 (6), 697-703 (2011).
  3. Kushner, I., Mackiewicz, A. The Acute Phase Response: An Overview. Acute Phase Proteins. , CRC Press. (1993).
  4. Tishkowski, K., Gupta, V. Erythrocyte Sedimentation Rate. StatPearls Publishing. , Treasure Island, FL. (2022).
  5. Menees, S. B., Powell, C., Kurlander, J., Goel, A., Chey, W. D. A meta-analysis of the utility of C-reactive protein, erythrocyte sedimentation rate, fecal calprotectin, and fecal lactoferrin to exclude inflammatory bowel disease in adults with IBS. The Americal Journal of Gastroenterology. 110 (3), 444-454 (2015).
  6. Brigden, M. L. Clinical utility of the erythrocyte sedimentation rate. Americal Family Physician. 60 (5), 1443-1450 (1999).
  7. Liu, S., et al. Preliminary case-control study to evaluate diagnostic values of C-reactive protein and erythrocyte sedimentation rate in differentiating active Crohn's disease from intestinal lymphoma, intestinal tuberculosis and Behcet's syndrome. The American Journal of the Medical Sciences. 346 (6), 467-472 (2013).
  8. Greidanus, N. V., et al. Use of erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein level to diagnose infection before revision total knee arthroplasty: A prospective evaluation. The Journal of Bone and Joint Surgery. 89 (7), 1409-1416 (2007).
  9. Flormann, D., Kuder, E., Lipp, P., Wagner, C., Kaestner, L. Is there a role of C-reactive protein in red blood cell aggregation. International Journal of Laboratory Hematology. 37 (4), 474-482 (2015).
  10. Brust, M., et al. The plasma protein fibrinogen stabilizes clusters of red blood cells in microcapillary flows. Scientific Reports. 4, 4348 (2014).
  11. Gray, S. J., Mitchell, E. B., Dick, G. F. Effect of purified protein fractions on sedimentation rate of erythrocytes. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 51 (3), 403-404 (1942).
  12. Kratz, A., et al. ICSH recommendations for modified and alternate methods measuring the erythrocyte sedimentation rate. International Journal of Laboratory Hematology. 39 (5), 448-457 (2017).
  13. Hung, W. T., Collings, A. F., Low, J. Erythrocyte sedimentation rate studies in whole human blood. Physics in Medicine and Biology. 39 (11), 1855-1873 (1994).
  14. Woodland, N. B., Cordatos, K., Hung, W. T., Reuben, A., Holley, L. Erythrocyte sedimentation in columns and the significance of ESR. Biorheology. 33 (6), 477-488 (1996).
  15. Holley, L., Woodland, N., Hung, W. T., Cordatos, K., Reuben, A. Influence of fibrinogen and haematocrit on erythrocyte sedimentation kinetics. Biorheology. 36 (4), 287-297 (1999).
  16. Dasanna, A. K., et al. Erythrocyte sedimentation: Effect of aggregation energy on gel structure during collapse. Physical Review. E. 105 (2-1), 024610 (2022).
  17. Darras, A., et al. Erythrocyte sedimentation: collapse of a high-volume-fraction soft-particle gel. Physical Review Letters. 128 (8), 088101 (2022).
  18. Darras, A., et al. Imaging erythrocyte sedimentation in whole blood. Frontiers in Physiology. 12, 729191 (2022).
  19. Darras, A., et al. Acanthocyte sedimentation rate as a diagnostic biomarker for neuroacanthocytosis syndromes: Experimental evidence and physical justification. Cells. 10 (4), 788 (2021).
  20. Rabe, A., et al. The erythrocyte sedimentation rate and its relation to cell shape and rigidity of red blood cells from chorea-acanthocytosis patients in an off-label treatment with dasatinib. Biomolecules. 11 (5), 727 (2021).
  21. Giavarina, D., Capuzzo, S., Pizzolato, U., Soffiati, G. Length of erythrocyte sedimentation rate (ESR) adjusted for the hematocrit: reference values for the TEST 1 method. Clinical Laboratory. 52 (5-6), 241-245 (2006).
  22. Bull, B. S. Is a standard ESR possible. Laboratory Medicine. 6 (11), 31-39 (1975).
  23. Bull, B. S., Brecher, G. An evaluation of the relative merits of the Wintrobe and Westergren sedimentation methods, including hematocrit correction. American Journal of Clinical Pathology. 62 (4), 502-510 (1974).
  24. Reinhart, W. H., Singh, A., Straub, P. W. Red blood cell aggregation and sedimentation: the role of the cell shape. British Journal of Haematology. 73 (4), 551-556 (1989).
  25. Jan, K., Usami, S., Smith, J. A. Influence of oxygen tension and hematocrit reading on ESRs of sickle cells: Role of RBC aggregation. Archives of Internal Medicine. 141 (13), 1815-1818 (1981).
  26. Issaq, H. J., Xiao, Z., Veenstra, T. D. Serum and plasma proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3601-3620 (2007).
  27. Yu, Z., et al. Differences between human plasma and serum metabolite profiles. PLoS One. 6 (7), 21230 (2011).
  28. Proper Pipetting Techniques - DE. , Available from: https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/lab-plasticware-supplies/lab-plasticware-supplies-learning-center/lab-plasticware-supplies-resource-library/fundamentals-of-pipetting/proper-pipetting-techniques.html (2023).
  29. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Transaction on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).
  30. Solomon, C., et al. A comparison of fibrinogen measurement methods with fibrin clot elasticity assessed by thromboelastometry, before and after administration of fibrinogen concentrate in cardiac surgery patients. Transfusion. 51 (8), 1695-1706 (2011).
  31. Norouzi, N., Bhakta, H. C., Grover, W. H. Sorting cells by their density. PLoS One. 12 (7), 0180520 (2017).
  32. Trudnowski, R. J., Rico, R. C. Specific gravity of blood and plasma at 4 and 37 degrees C. Clinical Chemistry. 20 (5), 615-616 (1974).
  33. Késmárky, G., Kenyeres, P., Rábai, M., Tóth, K. Plasma viscosity: A forgotten variable. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 39 (1-4), 243-246 (2008).
  34. Teece, L. J., et al. Gels under stress: The origins of delayed collapse. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 458, 126-133 (2014).
  35. Lindström, S. B., Kodger, T. E., Sprakel, J., Weitz, D. A. Structures, stresses, and fluctuations in the delayed failure of colloidal gels. Soft Matter. 8 (13), 3657-3664 (2012).
  36. Bartlett, P., Teece, L. J., Faers, M. A. Sudden collapse of a colloidal gel. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 85, 021404 (2012).

Tags

Medisin utgave 193
Erytrocytt sedimenteringshastighet: En fysikkdrevet karakterisering i en medisinsk sammenheng
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Darras, A., John, T., Wagner, C.,… More

Darras, A., John, T., Wagner, C., Kaestner, L. Erythrocyte Sedimentation Rate: A Physics-Driven Characterization in a Medical Context. J. Vis. Exp. (193), e64502, doi:10.3791/64502 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter