Summary
यह प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट सीए 2 + सेंसर जीसीएएमपी 5 जी का उपयोग करके देशी यूरोथेलियल कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से सक्रिय आयनचैनलों के कार्य का आकलन करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करता है।
Abstract
यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनल जैविक ट्रांसड्यूसर हैं जो यांत्रिक उत्तेजनाओं जैसे खिंचाव या कतरनी बलों को विद्युत और जैव रासायनिक संकेतों में परिवर्तित करते हैं। स्तनधारियों में, स्पर्श संवेदना, श्रवण, लाल रक्त कोशिका की मात्रा विनियमन, बेसल रक्तचाप विनियमन और मूत्र मूत्राशय की परिपूर्णता की अनुभूति के रूप में विविध प्रक्रियाओं में बाहरी और आंतरिक उत्तेजनाओं का पता लगाने के लिए यांत्रिक रूप से सक्रिय चैनल आवश्यक हैं। जबकि पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग करके इन विट्रो सेटिंग में यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनलों के कार्य का बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, उनके मूल वातावरण में उनके कार्य का आकलन करना एक कठिन काम बना हुआ है, अक्सर इन चैनलों की अभिव्यक्ति की साइटों तक सीमित पहुंच के कारण (जैसे, अभिवाही टर्मिनल, मर्केल कोशिकाएं, बैरोसेप्टर्स, और गुर्दे की नलिकाएं) या पैच-क्लैंप तकनीक को लागू करने में कठिनाइयों (जैसे, यूरोथेलियल छाता कोशिकाओं की एपिकल सतहें)। यह प्रोटोकॉल एक पूर्व विवो यूरोथेलियल तैयारी में फ्लोरोसेंट सेंसर जीसीएएमपी 5 जी का उपयोग करके यांत्रिक रूप से उत्पन्न सीए2 + क्षणिकों का आकलन करने की प्रक्रिया का वर्णन करता है, एक तकनीक जिसे अन्य देशी ऊतक तैयारी में यांत्रिक रूप से उत्पन्न सीए2 + घटनाओं के अध्ययन के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
मूत्र पथ में उपकला कोशिकाओं को यांत्रिक बलों के अधीन किया जाता है क्योंकि मूत्र निस्पंदन नेफ्रॉन के माध्यम से यात्रा करता है, और मूत्र को गुर्दे की श्रोणि से बाहर पंप किया जाता है और मूत्र मूत्राशय में संग्रहीत होने के लिए मूत्रवाहिनी के माध्यम से यात्रा करता है। यह लंबे समय से मान्यता प्राप्त है कि मूत्र पथ को पंक्तिबद्ध करने वाली उपकला कोशिकाओं पर तरल पदार्थों द्वारा लगाए गए यांत्रिक बल (जैसे, कतरनी तनाव और खिंचाव) समीपस्थ नलिका में प्रोटीन के पुन: अवशोषण और डिस्टल नेफ्रॉन में विलेय 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, साथ ही मूत्राशय में मूत्र का भंडारण और मूत्राशय 14,15,16,17।
यांत्रिक उत्तेजनाओं का विद्युत और जैव रासायनिक संकेतों में रूपांतरण, एक प्रक्रिया जिसे मेकेनोट्रांसडक्शन कहा जाता है, प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता की जाती है जो सेलुलर संरचनाओं या संबंधित बाह्य मैट्रिक्स 18,19,20,21 के विरूपण का जवाब देती है। यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनल इस अर्थ में अद्वितीय हैं कि वे झिल्ली तनाव, दबाव, या कतरनी तनाव 18,19,20,21,22 में परिवर्तन के जवाब में एक बंद अवस्था से खुली पारगम्य अवस्था में संक्रमण करते हैं। इसके अलावा, सीए2 + ट्रांसिएंट्स को इंटीग्रिन-मध्यस्थता मेकानोट्रांसडक्शन या सेल-सेल जंक्शनों23,24,25,26 पर मेकेनोरिस्पॉन्सिव आसंजन सिस्टम के सक्रियण द्वारा शुरू किया जा सकता है। आयन चैनल फ़ंक्शन का मूल्यांकन आमतौर पर पैच-क्लैंप तकनीक के साथ किया जाता है, जिसमें कोशिका झिल्ली और पैच पिपेट 27 के बीच एक गीगाहोम सील का गठन शामिलहोता है। हालांकि, घने बाह्य मैट्रिक्स (जैसे, गुर्दे की नलिकाओं) के साथ गहरी ऊतक परतों में स्थित कोशिकाएं या एक भौतिक बाधा (जैसे, ग्लाइकोकैलिक्स) से घिरी कोशिकाओं को ग्लास माइक्रोपिपेट के साथ एक्सेस करना मुश्किल है। इसी तरह, एम्बेडेड कोशिकाएं या जो खराब यांत्रिक स्थिरता (जैसे, यूरोथेलियम) के साथ ऊतकों के अभिन्न अंग हैं, पैच-क्लैंप तकनीक के साथ आसानी से अध्ययन नहीं किया जा सकता है। क्योंकि कई यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनल सीए2 + के लिए पारगम्य हैं, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण सीए2 + संवेदनशील डाई या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) जैसे जीसीएएमपी का उपयोग करके फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा उनकी गतिविधि का आकलन करना है। प्रोटीन इंजीनियरिंग में हाल के प्रयासों ने जीईसीआई28,29,30 की गतिशील सीमा, संवेदनशीलता और प्रतिक्रिया में काफी वृद्धि की है, और आनुवंशिकी में प्रगति ने विशिष्ट सेल आबादी में उनकी अभिव्यक्ति की अनुमति दी है, जिससे उन्हें मेकेनोट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल बनाया गया है।
यूरोथेलियम, स्तरीकृत उपकला जो मूत्राशय के इंटीरियर को कवर करती है, एक बाधा के रूप में कार्य करती है, मूत्राशय इंटरस्टिटियम में मूत्र विलेय के प्रसार को रोकती है, लेकिन एक ट्रांसड्यूसर के रूप में भी कार्य करती है, मूत्राशय की परिपूर्णता को महसूस करती है और इन घटनाओं को अंतर्निहित नसों और मांसपेशियों में संचारितकरती है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि यूरोथेलियम और अंतर्निहित ऊतकों के बीच संचार के लिए यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनल पीज़ो 1 और पीज़ो 231 की आवश्यकता होती है। यूरोथेलियल कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से प्रेरित सीए2 + क्षणिकों का आकलन करने के लिए, एक नई तकनीक का वर्णन किया गया था जो यूरोथेलियल कोशिकाओं में सीए2 + सेंसर जीसीएएमपी 5 जी को व्यक्त करने के लिए एडेनोवायरल जीन ट्रांसफर का उपयोग करता है। यह तकनीक एक म्यूकोसल शीट तैयार करने का उपयोग करती है जो सबसे बाहरी छाता सेल परत तक आसान पहुंच प्रदान करती है और एक बंद ग्लास माइक्रोपिपेट के साथ व्यक्तिगत कोशिकाओं की एक साथ यांत्रिक उत्तेजना और समय के साथ प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की रिकॉर्डिंग के लिए एक कंप्यूटर-सहायता प्राप्त प्रणाली प्रदान करती है।
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Protocol
पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार जानवरों की देखभाल और हैंडलिंग की गई थी। वर्तमान अध्ययन के लिए मादा, 2-4 महीने के C57Bl / 6J चूहों का उपयोग किया गया था। चूहों को व्यावसायिक रूप से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
1. उपकरण असेंबली और सेटअप
- उच्च-रिज़ॉल्यूशन कैमरा और एक स्थिर प्रकाश स्रोत से लैस एक सीधा माइक्रोस्कोप के साथ सीए2 + इमेजिंग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- एक माइक्रोस्कोप संगत सॉफ़्टवेयर के साथ छवियों को प्राप्त करें जो यूएसबी डिजिटल आई / ओ डिवाइस के माध्यम से कैमरे, प्रकाश स्रोत और पीज़ो एक्ट्यूएटर के प्रत्यक्ष नियंत्रण की अनुमति देता है (सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: चित्रा 1 सेटअप के एक योजनाबद्ध का प्रतिनिधित्व करता है। जीसीएएमपी 5 जी में 470 एनएम की चरम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 497 एनएम28 की चरम उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है। GCaMP5G इमेजिंग के लिए उपयुक्त फ़िल्टर क्यूब का उपयोग करें।
- एक माइक्रोस्कोप संगत सॉफ़्टवेयर के साथ छवियों को प्राप्त करें जो यूएसबी डिजिटल आई / ओ डिवाइस के माध्यम से कैमरे, प्रकाश स्रोत और पीज़ो एक्ट्यूएटर के प्रत्यक्ष नियंत्रण की अनुमति देता है (सामग्री की तालिका देखें)।
- मूत्राशय म्यूकोसा तैयारी में व्यक्तिगत यूरोथेलियल कोशिकाओं की उत्तेजना के लिए (चरण 2 देखें), एकल चैनल ओपन-लूप पीजो नियंत्रक द्वारा नियंत्रित पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)। एक माइक्रोमैनिपुलेटर में पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर माउंट करें।
- पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर (चित्रा 1) से चिपके हुए पिपेट होल्डर में ग्लास माइक्रोपिपेट्स को माउंट करें। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण कार्यक्रम द्वारा नियंत्रित एनालॉग / डिजिटल कनवर्टर द्वारा पीजो नियंत्रक को दूरस्थ रूप से संचालित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा शुरू किए गए ट्रांजिस्टर-ट्रांजिस्टर लॉजिक (टीटीएल) सिग्नल के रूप में एक बाहरी ट्रिगर का उपयोग इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर में उत्तेजना प्रोटोकॉल को ट्रिगर करने के लिए किया जाता है जो पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर (चित्रा 1) को स्थानांतरित करता है।
- पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर (चित्रा 1) से चिपके हुए पिपेट होल्डर में ग्लास माइक्रोपिपेट्स को माउंट करें। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण कार्यक्रम द्वारा नियंत्रित एनालॉग / डिजिटल कनवर्टर द्वारा पीजो नियंत्रक को दूरस्थ रूप से संचालित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- सुनिश्चित करें कि इमेजिंग सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) डिजिटल आई / ओ डिवाइस के साथ इंटरफेस करता है। डिजिटल कनवर्टर को टीटीएल सिग्नल देने के लिए यूएसबी डिजिटल आई / ओ डिवाइस में एक डिजिटल आउटपुट चैनल कॉन्फ़िगर करें, जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में प्रोटोकॉल शुरू करेगा जो पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर को स्थानांतरित करता है।
- एनालॉग/डिजिटल कनवर्टर में स्टार्ट बीएनसी पोर्ट को ग्राउंड (जीएनडी) और यूएसबी डिजिटल आई/ओ डिवाइस में स्क्रू टर्मिनल से कनेक्ट करने के लिए केबल का उपयोग करें।
- इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल सेट करें।
नोट: निम्नलिखित चरण एक प्रोटोकॉल उत्पन्न करने के तरीके का वर्णन करते हैं जो टीटीएल सिग्नल भेजेगा और निर्दिष्ट समय अंतराल पर छवियों को एकत्र करना शुरू करेगा।- प्रयोग प्रबंधक पर क्लिक करके और नए प्रयोग का चयन करके इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में अधिग्रहण प्रोटोकॉल सेट करें। एक नई विंडो खुलेगी।
- आइकन टाइम लैप्स लूप का चयन करें और इसे नई खुली विंडो पर खींचें; चक्रों की संख्या को 2 पर सेट करें और अंतराल को सेटअप में अनुमत सबसे तेज़ सेटिंग पर सेट करें।
- मैन्युअल शटर आइकन से, आइकन एनआई यूएसबी -6501 का चयन करें और इसे टाइम लैप्स लूप विंडो में खींचें, और फिर एनआई यूएसबी -6501 को बंद के रूप में सेट करें। मैन्युअल शटर से एक अतिरिक्त एनआई यूएसबी -6501 को टाइम लैप्स लूप विंडो में खींचें और इसे खुले के रूप में सेट करें। दो एनआई यूएसबी -6501 आइकन को कनेक्ट करने के लिए, एनआई यूएसबी -6501 बंद आइकन के किनारे एरोहेड खींचें और एनआई यूएसबी -6501 ओपन आइकन को छूने तक खींचें। एक पंक्ति जो दोनों आइकन को जोड़ती है दिखाई देगी।
- प्रयोग प्रबंधक विंडो में एक और टाइम लैप्स लूप खींचें और तीर को खींचकर इसे पहले से कनेक्ट करें। रिकॉर्डिंग के लिए पैरामीटर सेट करें। नए टाइम लैप्स लूप के चक्रों की संख्या 2400 पर सेट करें।
- छवि अधिग्रहण आइकन से, जीएफपी फ़िल्टर को हाल ही में खोले गए टाइम लैप्स लूप में खींचें और एक्सपोजर समय को 100 एमएस पर सेट करें।
- कैमरा छवि प्रकार को 8-बिट पर सेट करें, रिज़ॉल्यूशन 576 x 576 (बिनिंग 4 x 4), पिक्सेल घड़ी को 480 मेगाहर्ट्ज पर, और हॉट पिक्सेल सुधार को मानक पर सेट करें।
नोट: फ्लोरोसेंट सेंसर, कैमरा संवेदनशीलता और सेटअप कॉन्फ़िगरेशन की अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर मापदंडों को समायोजित किया जा सकता है।
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में लैब बेंच स्थापित करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: यह एनालॉग / डिजिटल कनवर्टर के एमवी में आउटपुट सिग्नल को परिभाषित करेगा।- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में कॉन्फ़िगर मेनू पर जाएं और लैब बेंच का चयन करें। परिणामी आउटपुट सिग्नल विंडो में, एनालॉग आउट # 1 का चयन करें, जोड़ें सिग्नल दबाएं , और इसे नाम दें (उदाहरण के लिए, "पीज़ो")। सिग्नल यूनिट को एमवी और स्केल फैक्टर (एमवी /वी) को 1 पर सेट करें।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में एक उत्तेजना प्रोटोकॉल उत्पन्न करें।
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में एक नया उत्तेजना प्रोटोकॉल उत्पन्न करने के लिए, मेनू आइटम अधिग्रहण पर जाएं और नया प्रोटोकॉल चुनें।
- एपिसोडिक स्टिमुलेशन के लिए मोड/रेट सेट करें, 1 पर रन/ट्रायल, स्वीप/रन टू 1, और स्वीप ड्यूरेशन 150 तक सेट करें।
- आउटपुट मेनू में, एनालॉग आउट के रूप में चैनल # 1 पीज़ो का चयन करें।
- ट्रिगर मेनू में, ट्रिगर को डिजिटाइज़र स्टार्ट इनपुट और आंतरिक टाइमर पर सेट करें।
- वेवफॉर्म मेनू में, चैनल # 1 और एनालॉग वेवफॉर्म के साथ एपोक्स का चयन करें। चरण ए को चरण में, प्रथम स्तर को 0 पर, डेल्टा स्तर को 0 पर, पहली अवधि को 10000 तक और डेल्टा अवधि को 0 पर सेट करें।
- चरण बी को चरण में, पहले स्तर को 10 पर, डेल्टा स्तर को 0 पर, पहली अवधि को 1000 पर और डेल्टा अवधि को 0 पर सेट करें। चरण सी को चरण में, प्रथम स्तर को 0 पर, डेल्टा स्तर को 0 पर, पहली अवधि को 130000 पर और डेल्टा अवधि को 0 पर सेट करें।
- प्रोटोकॉल सहेजें और इसे स्टिमुलेशन प्रोटोकॉल नाम दें।
- डिजिटल कनवर्टर में एनालॉग आउटपुट # 1 को सिंगल-चैनल ओपन-लूप पीज़ो नियंत्रक के सामने एक्सटी इनपुट से कनेक्ट करने के लिए बीएनसी केबल का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- नीचे दिए गए चरणों के बाद केशिका ग्लास ट्यूबिंग से छाता कोशिकाओं की यांत्रिक उत्तेजना के लिए ग्लास माइक्रोपिपेट्स बनाएं।
- केशिका ग्लास को एक पुलर में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और इसे केशिका को बनाए रखने वाले नॉब्स के साथ समायोजित करें।
- हीटर इकाई को उसकी पूरी ऊंचाई पर रखें। पुलर के पहले पुल टर्मिनेटिंग स्थिति स्लाइडर को 5 में समायोजित करें।
- पहले हीटर नॉब को 76.7 और दूसरे नॉब को 52.7 पर सेट करें।
- स्टार्ट बटन दबाकर ग्लास केशिका को दो चरणों में खींचें।
- माइक्रोपाइपेट के सिरे को माइक्रोफोर्ज के साथ बंद करें ( सामग्री की तालिका देखें) जिसमें हीटर समायोजन नॉब 60 पर सेट है।
नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल के लिए, अलग-अलग कोशिकाओं को पोकिंग करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोपिपेट टिप का अंतिम व्यास ~ 1-3 μm है।
- सत्यापित करें कि उत्तेजक माइक्रोपिपेट उत्तेजना प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट दूरी को स्थानांतरित करता है।
नोट: निम्नलिखित कदम यह सुनिश्चित करने के लिए हैं कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में उत्तेजना प्रोटोकॉल शुरू करने के 12.5 सेकंड बाद, 1 एस की अवधि के साथ एक वोल्टेज पल्स उत्पन्न होता है, जिससे पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर 20 μm चलता है।- धारक में एक माइक्रोपिपेट माउंट करें और इसे पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर से संलग्न करें।
- पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर और संलग्न माइक्रोपिपेट को माइक्रोस्कोप चरण के केंद्र के समानांतर और दृश्य के क्षेत्र के भीतर रखें।
- पिपेट की नोक पर ध्यान केंद्रित करें और टेप के साथ पीजोइलेक्ट्रिक माउंटिंग रॉड ( सामग्री की तालिका देखें) को स्थिर करें। उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत, पिपेट टिप की स्पष्ट छवि प्राप्त करने के लिए कैमरा मापदंडों को समायोजित करें।
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में उत्तेजना प्रोटोकॉल खोलें और इसे खेलने के लिए सेट करें।
नोट: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रोटोकॉल तब तक शुरू नहीं होगा जब तक कि इमेजिंग सॉफ्टवेयर से भेजे गए टीटीएल सिग्नल प्राप्त नहीं हो जाते। - इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में प्रयोग प्रबंधक से, डेटा अधिग्रहण शुरू करने के लिए प्रारंभ दबाएँ .
नोट: यह इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में प्रोटोकॉल को ट्रिगर करेगा, जो पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर को चलाएगा। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में प्रोटोकॉल प्रयोग की छवियों के साथ एक फ़ाइल उत्पन्न करेगा।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए पिपेट द्वारा तय की गई दूरी की पुष्टि करें।
- उत्तेजना प्रोटोकॉल के दौरान पिपेट द्वारा तय की गई दूरी को मापने के लिए, इमेजिंग सॉफ्टवेयर में गिनती और माप आइटम का चयन करें।
- माप मेनू से, माप और ROI विकल्प का चयन करें, और मूवी विंडो के नीचे एक नई विंडो दिखाई देगी।
- माप मेनू से, मनमानी रेखा चुनें।
- फिल्म विंडो में, पिपेट की नोक से शुरू होने वाली एक मनमानी रेखा खींचें। ध्यान दें कि मनमानी लाइन का अंत बाद में समायोजित किया जाएगा।
- लाइन को रुचि के क्षेत्र (आरओआई) में बदलने के लिए मनमानी लाइन पर राइट क्लिक करें, जो सभी मूवी फ्रेम में दिखाई देगा।
- फिल्म का निरीक्षण करें और उत्तेजना के जवाब में पिपेट द्वारा यात्रा की गई अंतिम स्थिति में मनमानी लाइन (आरओआई) के अंत को समायोजित करें।
नोट: पिपेट द्वारा तय की गई दूरी माप और आरओआई विंडो में दिखाई देगी। उत्तेजना प्रोटोकॉल को उपयोगकर्ता की जरूरतों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।
2. मूत्राशय के श्लेष्म के सीटू पारगमन और अलगाव में
- वायरस ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल31 में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार सीजीएएमपी 5 जी के सीडीएनए को एन्कोडिंग करने वाले एडेनोवायरस के साथ सीटू में महिला माउस मूत्राशय को ट्रांसड्यूस करें।
- सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों के लिए यूरोथेलियल कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करते समय, मूत्राशय को 2 x 107 संक्रामक वायरल कणों (आईवीपी) वाले समाधान के 50 μL के साथ स्थापित करें।
नोट: यह तकनीक सीजीएएमपी 5 जी की अभिव्यक्ति को छाता सेल परत तक सीमित करती है। वैकल्पिक रूप से, ट्रांसजेनिक चूहों से काटे गए मूत्राशय के साथ प्रयोग किए जा सकते हैं जो यूरोथेलियल कोशिकाओं में सीजीएएमपी 5 जी को व्यक्त करते हैं (यानी, यूरोप्लाकिन -2 प्रोमोटर द्वारा संचालित जीसीएएमपी 5 जी अभिव्यक्ति) या किसी अन्य सेल प्रकार की रुचि।
- सीए2 + इमेजिंग प्रयोगों के लिए यूरोथेलियल कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करते समय, मूत्राशय को 2 x 107 संक्रामक वायरल कणों (आईवीपी) वाले समाधान के 50 μL के साथ स्थापित करें।
- ट्रांसडक्शन के 24-72 घंटे बाद, सीओ2 श्वासावरोध द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु दें और फेफड़ों को ध्वस्त करने के लिए कैंची के साथ छाती गुहा खोलकर थोराकोटॉमी करें।
- मूत्रमार्ग को 24 ग्राम कैथेटर के साथ कैनुलेट करें। त्वचा और मांसपेशियों के माध्यम से ~ 1.5 सेमी के पेट के चीरे द्वारा मूत्राशय को उजागर करें, और कैथेटर को मूत्रमार्ग में सुरक्षित करने के लिए 6.0 सीवन ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें।
- मूत्राशय और मूत्रमार्ग32 को काटें और एक सिलिकॉन रबर धारक पैड (सामग्री की तालिका देखें) से चिपकाएं जिसे रिकॉर्डिंग समाधान में स्नान किया गया है (एमएम में): 135 NaCl, 5.0 KCl, 1 MgCl2,2.5 CaCl 2, 10 ग्लूकोज, 10 HEPES, pH 7.4, और 100% O 2 (चित्रा 2A) के साथ बुलबुला।
- पहले प्रकाशित रिपोर्ट32 (चित्रा 2 बी) के बाद मूत्राशय के श्लेष्म को अंतर्निहित मांसपेशियों की परत से अलग करें।
- मूत्राशय के श्लेष्म को खोलें और इसे 35 मिमी व्यास के ऊतक सुसंस्कृत डिश (चित्रा 2 सी) के तल में सिलिकॉन इलास्टोमर डालने के लिए यूरोथेलियम के साथ पिन करें।
3. व्यक्तिगत यूरोथेलियल कोशिकाओं और सीए2 + इमेजिंग की यांत्रिक उत्तेजना
- प्रतिरोधक हीटिंग तत्वों के साथ कल्चर डिश इनक्यूबेटर से लैस माइक्रोस्कोप चरण में पिन किए गए मूत्राशय म्यूकोसा के साथ ऊतक सुसंस्कृत डिश को माउंट करें (चित्रा 2 ई)। परफ्यूज (निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, सामग्री की तालिका देखें) सेल कल्चर डिश लगातार 1.7 एमएल / मिनट की दर से रिकॉर्डिंग समाधान के साथ इन-लाइन हीटर के साथ ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म होता है।
- दोहरे चैनल द्विध्रुवी तापमान नियंत्रक मॉडल के साथ ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक डिश इनक्यूबेटर और समाधान के तापमान को बनाए रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। आगे की प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का संचालन करने से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए निरंतर छिड़काव के साथ कक्ष में ऊतक को बराबर करें।
- यांत्रिक रूप से प्रेरित सीए2 + ट्रांसिएंट्स को रिकॉर्ड करने के लिए, ऊतक डिश में पिन किए गए मूत्राशय के म्यूकोसा को स्नान करने वाले घोल में माइक्रोपिपेट को डुबोएं। उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी का उपयोग करके कम आवर्धन स्कैनिंग उद्देश्य (4x) की मदद से माइक्रोपिपेट को क्षेत्र के केंद्र में ले जाएं।
- ऊर्ध्वाधर तल में माइक्रोमैनिपुलेटर को समन्वित रूप से स्थानांतरित करके और फोकस को समायोजित करके यूरोथेलियल ऊतक की सतह के पास माइक्रोपिपेट को स्थानांतरित करें।
- उद्देश्य को उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयुक्त उच्च आवर्धन (20x) के साथ स्विच करें।
- माइक्रोमैनिपुलेटर को ठीक करने के लिए सेट करें और माइक्रोपिपेट को लक्ष्य सेल के शीर्ष के पास ले जाएं।
- कैमरे के लिए दृश्य क्षेत्र बदलें और इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में लाइव दबाएं।
नोट: इसे प्रतिबिंबित शटर को चालू करना चाहिए और कंप्यूटर में ऊतक से उत्सर्जित फ्लोरोसेंट सिग्नल के अवलोकन की अनुमति देनी चाहिए। - सेल के शीर्ष की कल्पना करने के लिए फ़ोकस समायोजित करें और यदि आवश्यक हो तो पिपेट की स्थिति को समायोजित करें।
- इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में उत्तेजना प्रोटोकॉल खोलें और इसे खेलने के लिए सेट करें।
नोट: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में प्रोटोकॉल तब तक शुरू नहीं होगा जब तक कि इमेजिंग सॉफ्टवेयर से भेजे गए टीटीएल सिग्नल प्राप्त नहीं हो जाते। - इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में प्रयोग प्रबंधक से, डेटा अधिग्रहण शुरू करने के लिए प्रारंभ दबाएँ . यह इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में प्रोटोकॉल को ट्रिगर करेगा, जो पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर को चलाएगा और प्रयोग की छवियों के साथ एक फ़ाइल उत्पन्न करेगा। उत्तेजना प्रोटोकॉल को उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं के अनुसार संशोधित किया जा सकता है।
4. डेटा विश्लेषण
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें।
- इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में छवि फ़ाइल खोलें और गिनती और माप विंडो का चयन करें। बहुभुज उपकरण का चयन करें और उस सेल की सीमाओं पर एक आरओआई खींचें जिसे पोक किया गया था।
- माप विंडो पर जाएं, तीव्रता प्रोफ़ाइल का चयन करें, माप को समय के साथ सेट करें, औसत के लिए परिणाम, पृष्ठभूमि घटाव को किसी पर नहीं, और फिर निष्पादित करें दबाएँ। औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना समय के साथ की जाएगी (चित्रा 3)।
- तीव्रता प्रोफ़ाइल डेटा निर्यात करने के लिए, तीव्रता प्रोफ़ाइल परिणाम विंडो में Excel चिह्न पर क्लिक करें। यह उपयोगकर्ता को गंतव्य फ़ोल्डर और फ़ाइल नाम चुनने और डेटा को .xlsx प्रारूप में सहेजने देगा।
- वैज्ञानिक ग्राफ़िंग और डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: पोकिंग द्वारा उत्पन्न सीए2 + शिखर के आयाम को प्रतिदीप्ति तीव्रता (एएफ / एफ) में परिवर्तन के रूप में व्यक्त किया जाता है, जहां एफ समय 0 पर जीसीएएमपी 5 जी की प्रतिदीप्ति तीव्रता है, और एएफ समय 0 पर प्रतिदीप्ति तीव्रता मैक्सिमा और बेसल के बीच का अंतर है। सीए2 + प्रतिक्रिया के क्षय की गणना भी की जा सकती है (नहीं दिखाया गया है)।
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Representative Results
वर्तमान प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट सीए2 + सेंसर जीसीएएमपी 5 जी का उपयोग करके छाता कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से उत्पन्न सीए2 + क्षणिकता का आकलन करने की तकनीक का वर्णन करता है। एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन को इसकी उच्च दक्षता के कारण यूरोथेलियल कोशिकाओं में जीसीएएमपी 5 जी को व्यक्त करने के लिए नियोजित किया गया था और क्योंकि यह अभिव्यक्ति के एक ऊंचे स्तर का उत्पादन करता है। ट्रांसड्यूस्ड मूत्राशय से सना हुआ क्रायोसेक्शन की फ्लोरोसेंट छवियां चित्रा 2 डी में दिखाई गई हैं। इन प्रयोगों के लिए, जीसीएएमपी 5 जी अभिव्यक्ति छाता सेल परत में सबसे अधिक है। एक प्रयोग के दौरान कैप्चर की गई प्रतिनिधि छवियों का एक अनुक्रम जहां एक छाता सेल को पोक किया गया था , चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। चित्रा 3 ए में पहली छवि जीसीएएमपी 5 जी को व्यक्त करने वाले मूत्राशय के म्यूकोसा के छाता सेल के शीर्ष पर स्थित उत्तेजक पिपेट का एक फ्लोरोसेंट दृश्य दिखाती है। जीसीएएमपी 5 जी को व्यक्त करने वाले छाता सेल की यांत्रिक उत्तेजना एक विकृति का कारण बनती है ( छवि चित्र 3 ए को 12.5 एस पर देखें), इसके बाद प्रतिदीप्ति उत्सर्जन में तेजी से वृद्धि होती है ( छवि चित्र 3 ए 13.5 एस पर देखें)। प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को समय के कार्य के रूप में प्लॉट किया गया था (चित्रा 3 बी)। जैसा कि पहले31 की रिपोर्ट की गई थी, पोकिंग मूत्राशय में नियंत्रण से परीक्षण की गई अधिकांश छाता कोशिकाओं में सीए2 + प्रतिक्रिया पैदा करता है और जंगली प्रकार के चूहों को जीसीएएमपी 5 जी के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है। छाता कोशिकाओं से पीज़ो 1 और पीज़ो 2 को हटाने से सीए2 + प्रतिक्रिया31 के चरम आयाम कम हो गए। यांत्रिक रूप से उत्पन्न सीए2 + प्रतिक्रियाओं पर विभिन्न उपचारों या आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रभाव की तुलना करते समय, प्रयोगात्मक स्थितियों को मानकीकृत करना आवश्यक है, जिसमें मूत्राशय का पारगमन, ऊतक का माउंटिंग, इंडेंटेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले पिपेट की नोक का आकार, यांत्रिक उत्तेजना अवधि और आयाम और इमेजिंग स्थितियां शामिल हैं।
चित्रा 1: यूरोथेलियल कोशिकाओं में मेचानो-सक्रिय सीए2 + क्षणिक रिकॉर्ड करने के लिए प्रायोगिक सेटअप। रिग में एक सीधा माइक्रोस्कोप, फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत, उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर और एक सीएमओएस कैमरा होता है। इमेजिंग सॉफ्टवेयर सिस्टम को नियंत्रित करता है। एकल चैनल ओपन-लूप पीजो नियंत्रक द्वारा नियंत्रित एक पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर का उपयोग पोकिंग माइक्रोपिपेट को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है। ग्लास माइक्रोपिपेट्स को पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर से चिपकाए गए पिपेट होल्डर में लगाया जाता है। पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर और संबंधित माइक्रोपिपेट को माइक्रोमैनिपुलेटर (नहीं दिखाया गया) पर लगाया जाता है। पीजो ओपन-लूप नियंत्रक को दूरस्थ रूप से एनालॉग / डिजिटल कनवर्टर और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर द्वारा संचालित किया जाता है। इमेजिंग सॉफ्टवेयर में एक रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल एक डिजिटल आई / ओ डिवाइस के माध्यम से एक टीटीएल सिग्नल प्रदान करता है, और यह इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर में उत्तेजना प्रोटोकॉल शुरू करता है जो पीजोइलेक्ट्रिक को नियंत्रित करता है और बाद में, छवि कैप्चर करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: सीए2 + इमेजिंग के लिए मूत्राशय म्यूकोसा का अलगाव और माउंटिंग। (ए) एक संलग्न कैथेटर के साथ म्यूकोसल शीट तैयार करना। मूत्राशय के म्यूकोसा को अंतर्निहित मांसपेशियों की परत से ठीक बल के साथ छीन लिया गया था। (बी) पैनल (ए) में दिखाए गए निर्वस्त्र मूत्राशय म्यूकोसा की बढ़ी हुई छवि। (सी) म्यूकोसा को यूरोथेलियम के साथ 0.15 मिमी कीट पिन के साथ सिलिकॉन इलास्टोमर इंसर्ट के साथ पिन किया गया था। (डी) जीएफपी और द्वितीयक गधे विरोधी खरगोश संयुग्मित एंटीबॉडी (हरा), रोडामाइन-फेलोइडिन (लाल), और डीएपीआई (नीला) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ सना हुआ म्यूकोसल शीट तैयारी की कॉन्फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस क्रॉस-सेक्शन छवियां। मूत्राशय म्यूकोसल तैयारी में लैमिना प्रोप्रिया (एलपी) का हिस्सा शामिल है। तीर छाता सेल परत (यूबी) के स्थान को इंगित करते हैं। स्केल बार = 50 μm. (E) प्रयोगात्मक सेटअप की तस्वीर। ए, इन-लाइन हीटर; बी, पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर; सी, हीटर तत्व और नियंत्रक; डी, पिपेट धारक और माइक्रोपिपेट; ई, सिलिकॉन से जुड़ी म्यूकोसल शीट एक ऊतक सुसंस्कृत डिश और डिश इनक्यूबेटर में डालें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3. यूरोथेलियल कोशिकाओं में मेकानो-सक्रिय सीए2 + क्षणिकों की रिकॉर्डिंग और विश्लेषण। (ए) एक प्रयोग के दौरान अलग-अलग समय बिंदुओं पर कैप्चर किए गए फ्लोरोसेंट छवियों का अनुक्रम। ध्यान दें कि छाता सेल की यांत्रिक उत्तेजना एक विकृति का कारण बनती है जिसके बाद जीसीएएमपी 5 जी (तीर) के उत्सर्जन में तेजी से वृद्धि होती है। उत्तेजित सेल (आरओआई) की सीमाओं को लाल रंग में चिह्नित किया गया है। (बी) एक नियंत्रण माउस से मूत्राशय म्यूकोसल तैयारी में आठ स्वतंत्र यांत्रिक रूप से उत्तेजित कोशिकाओं के लिए समय के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता (एएफ / एफ) में परिवर्तन। इंडेंटेशन का समय (12.5 सेकंड) एक नीले तीर के साथ चिह्नित किया गया है। (बी) में डेटा को दलघी एट अल.31 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
सभी जीव, और प्रतीत होता है कि अधिकांश सेल प्रकार, आयन चैनलों को व्यक्त करते हैं जो यांत्रिक उत्तेजनाओं का जवाब देते हैं 20,33,34,35,36,37। इन यांत्रिक रूप से सक्रिय चैनलों के कार्य का मूल्यांकन मुख्य रूप से पैच-क्लैंप तकनीक के साथ किया गया है। हालांकि, पहुंच के मुद्दों के कारण, यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनलों के पैच-क्लैंप अध्ययन काफी हद तक अलग-थलग कोशिकाओं और सेल लाइनों तक ही सीमित हैं। चूंकि कई यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनल सीए2 + के पारगम्य हैं, इसलिए हमने माइक्रोस्कोपी, बायोसेंसिंग और माइक्रोमैनिपुलेशन में हालिया प्रगति का लाभ उठाया ताकि एक पूर्व विवो यूरोथेलियल तैयारी में यांत्रिक रूप से सक्रिय चैनलों के कार्य का आकलन करने के लिए एक इमेजिंग विधि विकसित की जा सके। इस प्रोटोकॉल में, यूरोथेलियल कोशिकाओं को जीसीएएमपी 5 जी के लिए एडेनोवायरस एन्कोडिंग के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है। एडेनोवायरल वैक्टर यूरोथेलियम में सीए2 + सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल हैं क्योंकि वे यूरोथेलियल कोशिकाओं में जीसीएएमपी 5 जी की उच्च दर और अभिव्यक्ति के उच्च स्तर प्रदान करते हैं (चित्रा 2 डी)। इन स्थितियों के तहत, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति अपेक्षाकृत कम है। यदि एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + सेंसर को व्यक्त करने के लिए किया जाता है, तो स्थितियों को अनुकूलित करने पर विशेष जोर दिया जाना चाहिए, ताकि केवल रुचि की कोशिकाएं सेंसर को व्यक्त करें। एक विकल्प के रूप में, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + संकेतक (जीईसीआई) की अभिव्यक्ति को रुचि के प्रोटीन (जैसे, जीसीएएमपी 5 जी) के लिए फ्लोक्स्ड ट्रांसजीन एन्कोडिंग ले जाने वाले चूहों को पार करके प्राप्त किया जा सकता है और चूहों को एक उपयुक्त प्रोमोटर के नियंत्रण में क्रे रिकोम्बिनेस व्यक्त किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण को शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं की आवश्यकता नहीं है और इसमें लक्षित अभिव्यक्ति प्रदान करने और यहां तक कि क्रे रिकोम्बिनेस व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर भी प्रदान करने का लाभ है।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक बंद फायर-पॉलिश माइक्रोपिपेट के साथ उत्तेजित छाता कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से सक्रिय सीए2 + ट्रांसिएंट्स का आकलन करने के लिए एक सीधा वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करता है। विधि को यूरोथेलियम की गहरी परतों में मेकेनोट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है या यहां तक कि लैमिना प्रोप्रिया में कोशिकाओं को एक सीधा कॉन्फोकल या दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ। एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग इंट्रासेल्युलर सीए2 + में उपकोशिकीय परिवर्तनों को परिभाषित करने के लिए आवश्यक संकल्प प्रदान कर सकता है जो यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में होते हैं। यह प्रोटोकॉल अलग-अलग छाता कोशिकाओं को पोक करने के लिए एक बंद फायर-पॉलिश माइक्रोपिपेट को नियोजित करता है। उत्तेजना के लिए माइक्रोपिपेट का उपयोग करने का मुख्य लाभ यह है कि ऊतक पर लगाया गया यांत्रिक गड़बड़ी क्षणभंगुर है और रुचि की कोशिका और आसपास के क्षेत्र तक सीमित है। जबकि सेल स्ट्रेचिंग सिस्टम का उपयोग पीडीएमएस झिल्ली पर विकसित कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से उत्तेजित करने के लिए किया जा सकता है, अंतर्निहित सीमाएं पूर्व विवो तैयारी के साथ इमेजिंग प्रयोगों के लिए ऐसे उपकरणों के उपयोग में बाधा डालती हैं। इन सीमाओं में माउस मूत्राशय को बढ़ाने और इमेजिंग करने के साथ चुनौतियां शामिल हैं और मूत्राशय के श्लेष्म की मुड़ी हुई प्रकृति को देखते हुए, ऊतक को खींचते समय रुचि की कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने में कठिनाइयां शामिल हैं।
यूरोथेलियल तैयारी में यांत्रिक रूप से सक्रिय सीए2 + क्षणिकों को मापने के लिए प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, रिग में अपेक्षाकृत महंगे घटक शामिल हैं, और इसकी असेंबली और सेटअप को माइक्रोस्कोप, माइक्रोमैनिपुलेटर्स, एनालॉग-डिजिटल कन्वर्टर्स और अपेक्षाकृत विशेष सॉफ्टवेयर के साथ विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। पैच-क्लैंपिंग की तरह, इस तकनीक के लिए अन्वेषक को माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करने और यांत्रिक उत्तेजना के लिए ग्लास माइक्रोपिपेट्स बनाने का तरीका सीखने की आवश्यकता होती है। हालांकि, पैच-क्लैंप तकनीक के विपरीत, जिसमें पिपेट और झिल्ली के बीच एक उच्च प्रतिरोध सील का गठन शामिल है, यांत्रिक रूप से सक्रिय सीए2 + ट्रांसिएंट्स को मापने के लिए यहां वर्णित प्रक्रिया अपेक्षाकृत सरल है और केवल अन्वेषक को उत्तेजित होने के लिए सेल की सतह के करीब उत्तेजक पिपेट को रखने की आवश्यकता होती है। इसलिए, एक प्रशिक्षित अन्वेषक संभावित रूप से 1 घंटे में 8-10 कोशिकाओं के पोकिंग की प्रतिक्रिया का आकलन कर सकता है, जो पैच-क्लैंप तकनीक के साथ अकल्पनीय है।
यांत्रिक रूप से सक्रिय आयन चैनलों के सामान्य शरीर समारोह और रोग की स्थिति में महत्व को देखते हुए, इन चैनलों को उनके मूल वातावरण में अध्ययन करने के लिए नए तरीकों की आवश्यकता है। जैसा कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, इमेजिंग विधियां अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं कि ये चैनल अपने पर्यावरण में परिवर्तन को कैसे समझते हैं और शारीरिक प्रतिक्रियाएं उत्पन्न करते हैं। ट्यूब- या थैली के आकार के अंगों की श्लैष्मिक सतह की पहुंच को देखते हुए, यहां वर्णित विधि को आंत, मूत्रजननांगी पथ, रक्त वाहिकाओं आदि सहित अन्य सेटिंग्स में मेकेनोट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रकार, शरीर में यांत्रिक प्रतिक्रियाओं का अध्ययन व्यापक रूप से उपयोगी हो सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को एनआईएच अनुदान R01DK119183 (G.A. और M.D.C. को) और S10OD028596 (G.A.) और पिट्सबर्ग सेंटर फॉर किडनी रिसर्च (P30DK079307) के सेल फिजियोलॉजी और मॉडल ऑर्गेनिज्म किडनी इमेजिंग कोर द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
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