Summary
Denne protokol beskriver en metode til vurdering af funktionen af mekanisk aktiverede ionkanaler i native urothelceller ved hjælp af den fluorescerende Ca2+ sensor GCaMP5G.
Abstract
Mekanisk aktiverede ionkanaler er biologiske transducere, der konverterer mekaniske stimuli såsom stræk- eller forskydningskræfter til elektriske og biokemiske signaler. Hos pattedyr er mekanisk aktiverede kanaler afgørende for påvisning af eksterne og interne stimuli i processer så forskellige som berøringsfornemmelse, hørelse, regulering af røde blodlegemer, regulering af basalt blodtryk og følelsen af urinblærens fylde. Mens funktionen af mekanisk aktiverede ionkanaler er blevet grundigt undersøgt in vitro-indstillingen ved hjælp af patch-clamp-teknikken, er det stadig en vanskelig opgave at vurdere deres funktion i deres oprindelige miljø, ofte på grund af begrænset adgang til disse kanalers ekspressionssteder (f.eks. afferente terminaler, Merkelceller, baroreceptorer og nyretubuli) eller vanskeligheder med at anvende patch-clamp-teknikken (f.eks. de apikale overflader af urotheliale paraplyceller). Denne protokol beskriver en procedure til vurdering af mekanisk fremkaldteCa2 +-transienter ved hjælp af fluorescerende sensor GCaMP5G i et ex vivo urothelialt præparat, en teknik, der let kan tilpasses til undersøgelse af mekanisk fremkaldte Ca2+ -hændelser i andre native vævspræparater.
Introduction
Epitelceller i urinvejene udsættes for mekaniske kræfter, når urinfiltratet bevæger sig gennem nefronerne, og urinen pumpes ud af nyrebækkenet og bevæger sig gennem urinlederne, der skal opbevares i urinblæren. Det har længe været anerkendt, at mekaniske kræfter (fx forskydningsspænding og strækning), der udøves af væsker på epitelcellerne, der styrer urinvejen, regulerer reabsorptionen af protein i det proksimale rør og af opløste stoffer i den distale nefron: 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, samt opbevaring af urin i urinblæren og mikturering14,15,16,17.
Omdannelsen af mekaniske stimuli til elektriske og biokemiske signaler, en proces kaldet mekanotransduktion, medieres af proteiner, der reagerer på deformation af cellulære strukturer eller den tilhørende ekstracellulære matrix 18,19,20,21. Mekanisk aktiverede ionkanaler er unikke i den forstand, at de overgår fra en lukket tilstand til en åben permeabel tilstand som reaktion på ændringer i membranspænding, tryk eller forskydningsspænding 18,19,20,21,22. Derudover kan Ca 2+ transienter initieres ved integrinmedieret mekanotransduktion eller ved aktivering af mekanoresponsive adhæsionssystemer ved celle-celle-krydsninger23,24,25,26. Ionkanalfunktionen vurderes normalt med patch-clamp-teknikken, som involverer dannelsen af en gigaohm forsegling mellem cellemembranen og plasterpipetten27. Imidlertid er celler placeret i dybe vævslag med en tæt ekstracellulær matrix (f.eks. Nyretubuli) eller omgivet af en fysisk barriere (f.eks. Glycocalyx) vanskelige at få adgang til med en glasmikropipette. På samme måde kan celler, der er indlejret, eller som er integrerede dele af væv med dårlig mekanisk stabilitet (f.eks. Urothelium), ikke let studeres med patch-clamp-teknikken. Fordi mange mekanisk aktiverede ionkanaler er gennemtrængelige for Ca 2+, er en alternativ tilgang at vurdere deres aktivitet ved fluorescerende mikroskopi ved hjælp af et Ca2+-følsomt farvestof eller genetisk kodede calciumindikatorer (GECI'er) såsom GCaMP. Nylige bestræbelser inden for proteinteknik har signifikant øget det dynamiske område, følsomhed og respons af GECI'er28,29,30, og fremskridt inden for genetik har tilladt deres ekspression i specifikke cellepopulationer, hvilket gør dem ideelle til at studere mekanotransduktion.
Urothelium, det stratificerede epitel, der dækker det indre af urinblæren, fungerer som en barriere, der forhindrer diffusion af urinopløste stoffer i blæreinterstitium, men fungerer også som en transducer, der registrerer blærefylde og kommunikerer disse begivenheder til de underliggende nerver og muskulatur16. Tidligere undersøgelser har vist, at kommunikationen mellem urothelium og underliggende væv kræver de mekanisk aktiverede ionkanaler Piezo1 og Piezo231. For at vurdere mekanisk inducerede Ca 2+ transienter i urothelceller blev der udviklet en ny teknik, der bruger adenoviral genoverførsel til at udtrykke Ca2+ sensoren GCaMP5G i urothelceller . Denne teknik anvender et slimhindearkpræparat, der giver nem adgang til det yderste paraplycellelag og et computerassisteret system til samtidig mekanisk stimulering af individuelle celler med en lukket glasmikropipette og registrering af ændringer i fluorescens over tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pasning og håndtering af dyrene blev udført i overensstemmelse med University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Hunmus, 2-4 måneder gamle C57Bl/6J-mus blev anvendt til denne undersøgelse. Musene blev anskaffet kommercielt (se materialetabel).
1. Montering og opsætning af udstyr
- Udfør Ca2+ -billeddannelse med et opretstående mikroskop udstyret med et kamera med høj opløsning og en stabil lyskilde (se materialetabellen).
- Hent billederne med en mikroskopkompatibel software, der tillader direkte styring af kameraet, lyskilden og piezoaktuatoren via en digital USB-enhed (se materialetabellen).
BEMÆRK: Figur 1 repræsenterer et skema over opsætningen. GCaMP5G har en maksimal excitationsbølgelængde på 470 nm og en maksimal emissionsbølgelængde på 497 nm28. Brug en filterkube, der er egnet til GCaMP5G-billeddannelse.
- Hent billederne med en mikroskopkompatibel software, der tillader direkte styring af kameraet, lyskilden og piezoaktuatoren via en digital USB-enhed (se materialetabellen).
- Til stimulering af individuelle urothelceller i blæreslimhindepræparatet (se trin 2) skal du bruge en piezoelektrisk aktuator, der styres af en piezoregulator med åben sløjfe med en enkelt kanal (se materialetabellen). Monter den piezoelektriske aktuator i en mikromanipulator.
- Glasmikropipetterne monteres i en pipetteholder, der er fastgjort til den piezoelektriske aktuator (figur 1). Fjernbetjent piezo-controlleren ved hjælp af en analog/digital konverter, der styres af et program til indsamling og analyse af elektrofysiologiske data (se materialetabel).
BEMÆRK: En ekstern udløser i form af et transistor-transistorlogik (TTL) signal initieret af billedbehandlingssoftwaren bruges til at udløse stimuleringsprotokollen i elektrofysiologidataindsamlings- og analysesoftwaren, der bevæger den piezoelektriske aktuator (figur 1).
- Glasmikropipetterne monteres i en pipetteholder, der er fastgjort til den piezoelektriske aktuator (figur 1). Fjernbetjent piezo-controlleren ved hjælp af en analog/digital konverter, der styres af et program til indsamling og analyse af elektrofysiologiske data (se materialetabel).
- Sørg for, at billedbehandlingssoftwaren (se materialetabellen) har grænseflader med den digitale I/O-enhed. Konfigurer en digital udgangskanal i den digitale USB-I/O-enhed til at levere TTL-signalet til den analoge/digitale konverter, som starter protokollen i elektrofysiologisoftwaren, der bevæger den piezoelektriske aktuator.
- Brug et kabel til at forbinde Start BNC-porten i den analoge/digitale konverter til jorden (GND) og en skrueterminal i den digitale USB-I/O-enhed.
- Konfigurer optagelsesprotokollen i billedbehandlingssoftwaren.
BEMÆRK: Følgende trin beskriver, hvordan du genererer en protokol, der sender et TTL-signal og begynder at indsamle billeder med bestemte tidsintervaller.- Konfigurer anskaffelsesprotokollen i billedbehandlingssoftwaren ved at klikke på Experiment Manager og vælge Nyt eksperiment. Et nyt vindue åbnes.
- Vælg ikonet Time Lapse Loop og træk det til det nyåbnede vindue; Indstil antallet af cyklusser til 2 og intervallet til den hurtigste indstilling, der er tilladt i opsætningen.
- Fra ikonet Transmitteret lukker / manuel lukker skal du vælge ikonet NI USB-6501 og trække det ind i vinduet Time Lapse Loop og derefter indstille NI USB-6501 som lukket. Træk en ekstra NI USB-6501 fra den transmitterede lukker/manuelle lukker ind i vinduet Time Lapse Loop, og indstil den som åben. For at forbinde de to NI USB-6501-ikoner skal du trække pilehovedet på siden af det lukkede NI USB-6501-ikon og trække, indtil det rører NI USB-6501 åbent ikon. En linje, der forbinder begge ikoner, vises.
- Træk endnu en tidsforløbsløjfe til vinduet Experiment Manager , og slut den til den første ved at trække i pilespidsen. Indstil parametrene til optagelse. Indstil antallet af cyklusser i den nye Time Lapse Loop til 2400.
- Fra ikonet Image Acquisition skal du trække GFP-filteret ind i den nyligt åbnede Time Lapse Loop og indstille eksponeringstiden til 100 ms.
- Indstil kameraets billedtype til 8-bit, opløsning til 576 x 576 (Binning 4 x 4), pixelur til 480 MHz og Hot pixelkorrektion til standard.
BEMÆRK: Parametrene kan justeres afhængigt af lysstofrørssensorens udtryksniveau, kameraets følsomhed og opsætningskonfiguration.
- Opsæt laboratoriebænken i elektrofysiologisoftwaren (se materialetabel).
BEMÆRK: Dette definerer udgangssignalet i mV for den analoge / digitale konverter.- Gå til menuen Konfigurer i elektrofysiologisoftwaren, og vælg Labbænk. I det resulterende Output Signals vindue, vælg Analog Out #1, tryk på Tilføj signal, og navngiv det (f.eks. "Piezo"). Indstil signalenheden til mV og skalafaktoren (mV/V) til 1.
- Generer en stimuleringsprotokol i elektrofysiologisoftwaren ved at følge nedenstående trin.
- For at generere en ny stimuleringsprotokol i elektrofysiologisoftwaren skal du gå til menupunktet Hent og vælge Ny protokol.
- Indstil tilstand/hastighed til episodisk stimulering, kør/forsøg til 1, fej/kør til 1 og fejevarighed (er) til 150.
- I menuen Udgange skal du vælge kanal #1 Piezo som analog udgang.
- I menuen Trigger skal du indstille udløseren til Digitizer Start Input og Internal Timer.
- I menuen Bølgeform skal du vælge kanal #1 og Analog bølgeform med epoker. Indstil Trin A til Trin, Første niveau til 0, Delta-niveau til 0, Første varighed til 10000 og Delta-varighed til 0.
- Indstil Trin B til Trin, Første niveau til 10, Deltaniveau til 0, Første varighed til 1000 og Deltavarighed til 0. Indstil Trin C til Trin, Første niveau til 0, Deltaniveau til 0, Første varighed til 130000 og Deltavarighed til 0.
- Gem protokollen, og navngiv den Stimuleringsprotokol.
- Brug et BNC-kabel til at forbinde analog udgang #1 i den analoge/digitale konverter til EXT INPUT foran på piezo-controlleren med åben sløjfe med én kanal (se materialetabellen).
- Fremstille glasmikropipetter til mekanisk stimulering af paraplyceller fra kapillærglasrør ved at følge nedenstående trin.
- Anbring kapillærglasset i en aftrækker (se materialetabellen), og juster det med kapillærholdeknapperne.
- Placer varmeenheden i sin fulde højde. Juster skyderen for den første trækafslutningsposition på aftrækkeren til 5.
- Indstil den første varmeknap til 76,7 og den anden knap til 52,7.
- Træk glaskapillæret i to trin ved at trykke på startknappen.
- Luk spidsen af mikropipetten med en mikrosmedje (se materialetabellen) med varmejusteringsknappen indstillet til 60.
BEMÆRK: For denne protokol er den endelige diameter af mikropipettespidsen, der bruges til at stikke individuelle celler, ~ 1-3 μm.
- Kontroller, at den stimulerende mikropipette bevæger den afstand, der er angivet i stimuleringsprotokollen.
BEMÆRK: Følgende trin er at sikre, at der 12,5 s efter initiering af stimuleringsprotokollen i elektrofysiologisoftwaren genereres en spændingspuls med en varighed på 1 s, hvilket får den piezoelektriske aktuator til at bevæge sig 20 μm.- Monter en mikropipette i holderen, og fastgør den til den piezoelektriske aktuator.
- Den piezoelektriske aktuator og den vedhæftede mikropipette anbringes parallelt med midten af mikroskoptrinnet og inden for synsfeltet.
- Fokuser på pipettens spids og immobiliser den piezoelektriske monteringsstang (se materialetabel) med tape. Under skarp feltbelysning skal du justere kameraparametrene for at opnå et klart billede af pipettespidsen.
- Åbn stimuleringsprotokollen i elektrofysiologisoftwaren, og indstil den til at spille.
BEMÆRK: Elektrofysiologiprotokollen starter ikke, før TTL-signalet, der sendes fra billedbehandlingssoftwaren, modtages. - Fra Experiment Manager i billedbehandlingssoftwaren skal du trykke på Start for at starte dataindsamling.
BEMÆRK: Dette vil udløse protokollen i elektrofysiologisoftwaren, som driver den piezoelektriske aktuator. Protokollen i billedbehandlingssoftwaren genererer en fil med billederne af eksperimentet.
- Kontroller den afstand, pipetten har tilbagelagt, ved at følge nedenstående trin.
- Hvis du vil måle den afstand, pipetten tilbagelægger under stimuleringsprotokollen, skal du vælge elementet Tæl og mål i billedbehandlingssoftwaren.
- Fra menuen Måling skal du vælge indstillingen Måling og ROI, og et nyt vindue vises under filmvinduet.
- I menuen Måling skal du vælge den vilkårlige linje.
- I filmvinduet skal du tegne en vilkårlig linje, der starter ved pipettens spids. Bemærk, at slutningen af den vilkårlige linje justeres senere.
- Højreklik på den vilkårlige linje for at konvertere linjen til et interesseområde (ROI), som vil være synligt i alle filmrammer.
- Undersøg filmen, og juster enden af den vilkårlige linje (ROI) til den endelige position, pipetten har rejst som reaktion på stimulus.
BEMÆRK: Den afstand, pipetten har tilbagelagt i μm, vises i vinduet Måling og ROI . Stimuleringsprotokollen kan ændres efter brugerens behov.
2. In situ transduktion og isolering af blæreslimhinden
- Transducer kvindelige museblærer in situ med et adenovirus, der koder cDNA'et for CGaMP5G i henhold til proceduren beskrevet i virustransduktionsprotokol31.
- Ved transducering af urothelceller til Ca2+ billeddannelseseksperimenter indsprøjtes blærerne med 50 μL af opløsningen indeholdende 2 x 107 infektiøse virale partikler (IVP).
BEMÆRK: Denne teknik har tendens til at begrænse ekspressionen af CGaMP5G til paraplycellelaget. Alternativt kan eksperimenter udføres med urinblærer høstet fra transgene mus, der udtrykker CGaMP5G i urothelceller (dvs. GCaMP5G-ekspression drevet af en uroplakin-2-promotor) eller enhver anden celletype af interesse.
- Ved transducering af urothelceller til Ca2+ billeddannelseseksperimenter indsprøjtes blærerne med 50 μL af opløsningen indeholdende 2 x 107 infektiøse virale partikler (IVP).
- 24-72 timer efter transduktion aflives musene ved CO2 -kvælning og udfører en thoracotomi ved at åbne brysthulen med en saks for at få lungerne til at kollapse.
- Knuder urinrøret med et 24 G kateter. Udsæt blæren ved et abdominalt snit på ~ 1,5 cm gennem huden og musklen, og brug en 6,0 sutur (se materialetabel) for at fastgøre kateteret til urinrøret.
- Høst blæren og urinrøret32 og fastgør den til en silikonegummiholderpude (se materialetabel) badet i optageopløsning indeholdende (i mM): 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl 2,2,5 CaCl2, 10 glucose, 10 HEPES, pH 7,4 og boblet op med 100%O2 (figur 2A).
- Adskil blæreslimhinden fra det underliggende muskellag med fine pincet efter tidligere offentliggjorte rapporter32 (figur 2B).
- Blæreslimhinden skæres op, og fastgør den med urothelet opad til en silikoneelastomerindsats i bunden af en vævskulturskål med en diameter på 35 mm (figur 2C).
3. Mekanisk stimulering af individuelle urothelceller og Ca2+ billeddannelse
- Monter den vævsdyrkede skål med den fastgjorte blæreslimhinde i mikroskoptrinnet udstyret med en kulturskålinkubator med resistive varmeelementer (figur 2E). Perfuse (efter producentens anvisninger, se materialetabellen) cellekulturskålen kontinuerligt med en hastighed på 1,7 ml / min med optageopløsning opvarmet til ~ 37 ° C med en in-line varmelegeme.
- Temperaturen på vævsskålens inkubator og opløsninger holdes på ~37 °C med en dobbeltkanals bipolær temperaturregulatormodel (se materialetabel). Ligevægt vævet i kammeret med kontinuerlig perfusion i mindst 15 minutter, før der udføres yderligere eksperimentelle procedurer.
- For at registrere mekanisk inducerede Ca2+ transienter nedsænkes mikropipetten i opløsningen, der bader den fastgjorte blæreslimhinde i vævsskålen. Flyt mikropipetten til midten af feltet ved hjælp af et scanningsmål med lav forstørrelse (4x) ved hjælp af lys feltbelysning.
- Flyt mikropipetten nær overfladen af urothelialvævet ved at koordinere mikromanipulatoren i lodret plan og justere fokus.
- Skift målet til et med en højere forstørrelse (20x), der er egnet til immunfluorescens med en høj numerisk blænde (NA).
- Indstil mikromanipulatoren til Fin , og flyt mikropipetten nær toppen af målcellen.
- Skift synsfeltet til kameraet, og tryk på Live i billedbehandlingssoftwaren.
BEMÆRK: Dette skal tænde for den reflekterede lukker og tillade observation af det fluorescerende signal, der udsendes fra vævet i computeren. - Juster fokus for at visualisere toppen af cellen, og juster pipettens position, hvis det er nødvendigt.
- Åbn stimuleringsprotokollen i elektrofysiologisoftwaren, og indstil den til at spille.
BEMÆRK: Protokollen i elektrofysiologisoftwaren starter ikke, før TTL-signalet, der sendes fra billedbehandlingssoftwaren, modtages. - Fra Experiment Manager i billedbehandlingssoftwaren skal du trykke på Start for at starte dataindsamling. Dette vil udløse protokollen i elektrofysiologisoftwaren, som vil drive den piezoelektriske aktuator og generere en fil med billederne af eksperimentet. Stimuleringsprotokollen kan ændres efter brugerens behov.
4. Analyse af data
- Kvantificer fluorescensintensiteten over tid ved at følge nedenstående trin.
- Åbn billedfilen i billedbehandlingssoftwaren, og vælg vinduet Tæl og mål . Vælg polygonværktøjet , og tegn et investeringsafkast på grænserne for den celle, der blev stukket.
- Gå til vinduet Måling, vælg Intensitetsprofil, indstil målingen til Over tid, Resultater til gennemsnit, Baggrundssubtraktion til ingen, og tryk derefter på Udfør. Den gennemsnitlige fluorescensintensitet beregnes over tid (figur 3).
- For at eksportere intensitetsprofildataene skal du klikke på Excel-ikonet i vinduet Intensitetsprofilresultater . Dette giver brugeren mulighed for at vælge destinationsmappen og filnavnet og gemme dataene i et .xlsx format.
- Udfør dataanalyse ved hjælp af videnskabelig graftegning og dataanalysesoftware (se materialetabel).
BEMÆRK: Amplituden af Ca2+ toppen fremkaldt ved stikning udtrykkes som ændringen i fluorescensintensitet (ΔF / F), hvor F er fluorescensintensiteten af GCaMP5G på tidspunktet 0, og ΔF er forskellen mellem fluorescensintensitetsmaksima og basalen på tidspunktet 0. Forfaldet af Ca2+ responsen kan også beregnes (ikke vist).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver en teknik til vurdering af mekanisk fremkaldte Ca 2+ transienter i paraplyceller ved hjælp af den fluorescerende Ca2+ sensor GCaMP5G. Adenoviral transduktion blev anvendt til at udtrykke GCaMP5G i urothelceller på grund af dets høje effektivitet, og fordi det producerer et forhøjet ekspressionsniveau. Fluorescerende billeder af farvede kryosektioner fra en transduceret blære er vist i figur 2D. For disse eksperimenter er GCaMP5G-ekspression højest i paraplycellelaget. En sekvens af repræsentative billeder taget under et eksperiment, hvor en paraplycelle blev stukket, er vist i figur 3A. Det første billede i figur 3A viser et fluorescerende billede af den stimulerende pipette placeret på toppen af en paraplycelle i en blæreslimhinde, der udtrykker GCaMP5G. Mekanisk stimulering af paraplycellen, der udtrykker GCaMP5G, forårsager en deformation (se billede figur 3A ved 12,5 s) efterfulgt af en hurtig stigning i fluorescensemissionen (se billede figur 3A ved 13,5 s). Ændringen i fluorescens blev afbildet som en funktion af tiden (figur 3B). Som tidligere rapporteret31 fremkalder stikkeri et Ca2+-respons i de fleste paraplyceller, der testes i blærer fra kontrol- og vildtypemus transduceret med GCaMP5G. Sletning af Piezo1 og Piezo2 fra paraplyceller reducerede topamplituden af Ca2+ respons31. Når man sammenligner effekten af forskellige behandlinger eller genetiske baggrunde på mekanisk fremkaldte Ca2+-responser, er det vigtigt at standardisere de eksperimentelle betingelser, herunder transduktion af blæren, montering af vævet, størrelsen på pipettens spids, der anvendes til fordybning, mekanisk stimulusvarighed og amplitude og billeddannelsesbetingelser.
Figur 1: Eksperimentel opsætning til registrering af mekanoaktiverede Ca2+ transienter i urothelcceller. Riggen består af et opretstående mikroskop, fluorescerende lyskilde, excitations- og emissionsfiltre og et CMOS-kamera. Billedbehandlingssoftwaren styrer systemet. En piezoelektrisk aktuator, der styres af en enkeltkanals piezo-controller med åben sløjfe, bruges til at flytte den stikkende mikropipette. Glasmikropipetter monteres i en pipetteholder, der er fastgjort til den piezoelektriske aktuator. Den piezoelektriske aktuator og tilhørende mikropipette er monteret på en mikromanipulator (ikke vist). Piezo open-loop controlleren fjernbetjenes af en analog / digital konverter og elektrofysiologi software. En optagelsesprotokol i billedbehandlingssoftwaren leverer et TTL-signal via en digital I/O-enhed, og dette starter stimuleringsprotokollen i elektrofysiologisoftwaren, der styrer den piezoelektriske og efterfølgende billedoptagelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Isolering og montering af blæreslimhinden til billeddannelse af Ca2+ . A) Forberedelse af slimhindeplader med et påsat kateter. Blæreslimhinden blev fjernet fra det underliggende muskulære lag med fine pincet. (B) Forstørret billede af den strippede blæreslimhinde vist i panel (A). (C) Slimhinden blev fastgjort med urothelet opad med 0,15 mm insektstifter fastgjort til en silikone elastomerindsats. (D) Konfokale immunfluorescenstværsnitsbilleder af slimhindearkpræparatet farvet med et antistof mod GFP og et sekundært æselantikaninkonjugeret antistof (grønt), rhodamin-phalloidin (rødt) og DAPI (blåt). Blæreslimhindepræparatet indbefatter en del af lamina propria (LP). Pile angiver placeringen af paraplycellelaget (Ub). Skalastænger = 50 μm. (E) Fotografi af forsøgsopstillingen. a, in-line varmelegeme; b, piezoelektrisk aktuator; c, varmelegemer og controller; d, pipetteholder og mikropipette; e, slimhindeark fastgjort til silikoneindsatsen i en vævsdyrket skål og skålinkubator. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. Registrering og analyse af mekanoaktiverede Ca2+ transienter i urothelialceller. (A) Sekvens af fluorescerende billeder taget på forskellige tidspunkter i løbet af et eksperiment. Bemærk, at mekanisk stimulering af paraplycellen forårsager en deformation efterfulgt af en hurtig stigning i emissionen af GCaMP5G (pil). Grænserne for den stimulerede celle (ROI) er markeret med rødt. (B) Ændring i fluorescensintensitet (ΔF/F) over tid for otte uafhængige mekanisk stimulerede celler i et blæreslimhindepræparat fra en kontrolmus. Indrykningstidspunktet (12, 5 s) er markeret med en blå pil. Dataene i (B) er blevet ændret fra Dalghi et al.31. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alle organismer, og tilsyneladende de fleste celletyper, udtrykker ionkanaler, der reagerer på mekaniske stimuli 20,33,34,35,36,37. Funktionen af disse mekanisk aktiverede kanaler er overvejende blevet vurderet med patch-clamp-teknikken. På grund af tilgængelighedsproblemer har patch-clamp-undersøgelser af mekanisk aktiverede ionkanaler imidlertid stort set været begrænset til dissocierede celler og cellelinjer. Da mange mekanisk aktiverede ionkanaler er gennemtrængelige for Ca2+, udnyttede vi de seneste fremskridt inden for mikroskopi, biosensing og mikromanipulation til at udvikle en billeddannelsesmetode til vurdering af funktionen af mekanisk aktiverede kanaler i et ex vivo urothelialt præparat. I denne protokol transduceres urothelceller med en adenoviruskodning for GCaMP5G. Adenoviale vektorer er ideelle til at studere Ca 2+ signalering i urothelium, da de giver en høj transduktionshastighed og høje ekspressionsniveauer af GCaMP5G i urothelceller (figur 2D). Under disse forhold er baggrundsfluorescens relativt lav. Hvis adenoviral transduktion bruges til at udtrykke en genetisk kodet Ca2+ sensor, skal der lægges særlig vægt på at optimere forholdene, så kun de relevante celler udtrykker sensoren. Som et alternativ kan ekspression af genetisk kodede Ca2+-indikatorer (GECI'er) opnås ved at krydse mus, der bærer et floxed transgen, der koder for det pågældende protein (f.eks. GCaMP5G), og mus, der udtrykker Cre-rekombinase, under kontrol af en passende promotor. Denne fremgangsmåde kræver ikke kirurgiske indgreb og har den fordel, at den giver målrettet ekspression og endda niveauer af ekspression af proteiner i celler, der udtrykker Cre-rekombinase.
Protokollen beskrevet her bruger et opretstående bredfeltmikroskop til at vurdere mekanisk aktiverede Ca2+ transienter i paraplyceller stimuleret med en lukket brandpoleret mikropipette. Metoden kunne tilpasses til at studere mekanotransduktion i dybere lag af urothelium eller endda celler i lamina propria med et opretstående konfokal eller to-fotonmikroskop. Brug af et konfokalmikroskop kan give den nødvendige opløsning til at definere subcellulære ændringer i intracellulær Ca2+ , der opstår som reaktion på mekanisk stimulering. Denne protokol anvender en lukket brandpoleret mikropipette til at stikke individuelle paraplyceller. Den største fordel ved at bruge en mikropipette til stimulering er, at den mekaniske forstyrrelse, der udøves på vævet, er forbigående og begrænset til den interessante celle og det omkringliggende område. Mens cellestrækningssystemer kan bruges til mekanisk at stimulere celler dyrket på PDMS-membraner, hindrer iboende begrænsninger brugen af sådanne anordninger til billeddannelsesforsøg med ex vivo-præparater . Disse begrænsninger omfatter udfordringer med montering og billeddannelse af en museblære og, i betragtning af blæreslimhindens foldede natur, vanskeligheder med at holde fokus på cellerne af interesse, mens vævet strækkes.
Protokollen til måling af mekanisk aktiveredeCa2+ transienter i urotheliale præparater har nogle begrænsninger. For det første indeholder riggen relativt dyre komponenter, og dens samling og opsætning kræver ekspertise med mikroskoper, mikromanipulatorer, analog-digitale konvertere og relativt specialiseret software. Ligesom patch-clamping kræver denne teknik, at efterforskeren lærer at bruge en mikromanipulator og fremstille glasmikropipetter til mekanisk stimulering. I modsætning til patch-clamp-teknikken, som involverer dannelsen af en tætning med høj modstand mellem pipetten og membranen, er den her beskrevne procedure til måling af mekanisk aktiverede Ca2+ -transienter imidlertid relativt enkel og kræver kun, at investigator placerer den stimulerende pipette tæt på overfladen af den celle, der skal stimuleres. Derfor kan en uddannet efterforsker potentielt vurdere responsen på stikning af 8-10 celler på 1 time, hvilket er utænkeligt med patch-clamp teknik.
I betragtning af den betydning, som mekanisk aktiverede ionkanaler har i normal kropsfunktion og sygdomstilstande, er der behov for nye metoder til at studere disse kanaler i deres oprindelige miljø. Som beskrevet i denne protokol kan billeddannelsesmetoder give unik indsigt i, hvordan disse kanaler registrerer ændringer i deres miljø og genererer fysiologiske reaktioner. I betragtning af tilgængeligheden af slimhindeoverfladen i de rør- eller sækformede organer kunne metoden beskrevet her tilpasses til at studere mekanotransduktion i andre indstillinger, herunder tarmen, urogenitale kanaler, blodkar osv. Således kan det være meget nyttigt at studere mekaniske reaktioner i kroppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud R01DK119183 (til G.A. og MDC) og S10OD028596 (til G.A.) og af Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores fra Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
- Kunau, R. T., Webb, H. L., Borman, S. C. Characteristics of the relationship between the flow rate of tubular fluid and potassium transport in the distal tubule of the rat. Journal of Clinical Investigation. 54 (6), 1488-1495 (1974).
- Engbretson, B. G., Stoner, L. C. Flow-dependent potassium secretion by rabbit cortical collecting tubule in vitro. American Journal of Physiology. 253 (5), 896-903 (1987).
- Satlin, L. M., Sheng, S., Woda, C. B., Kleyman, T. R. Epithelial Na(+) channels are regulated by flow. American Journal of Physiology Renal Physiology. 280 (6), 1010-1018 (2001).
- Woda, C. B., et al. Ontogeny of flow-stimulated potassium secretion in rabbit cortical collecting duct: functional and molecular aspects. American Journal of Physiology Renal Physiology. 285 (4), 629-639 (2003).
- Malnic, G., Berliner, R. W., Giebisch, G. Flow dependence of K+ secretion in cortical distal tubules of the rat. American Journal of Physiology. 256 (5), 932-941 (1989).
- Khuri, R. N., Strieder, W. N., Giebisch, G. Effects of flow rate and potassium intake on distal tubular potassium transfer. American Journal of Physiology. 228 (4), 1249-1261 (1975).
- Good, D. W., Wright, F. S. Luminal influences on potassium secretion: sodium concentration and fluid flow rate. American Journal of Physiology. 236 (2), 192-205 (1979).
- Wong, K. R., Berry, C. A., Cogan, M. G. Flow dependence of chloride transport in rat S1 proximal tubules. American Journal of Physiology. 269 (6), 870-875 (1995).
- Garvin, J. L. Glucose absorption by isolated perfused rat proximal straight tubules. American Journal of Physiology. 259 (4), 580-586 (1990).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of renal potassium excretion in the rat. American Journal of Physiology. 206 (4), 674-686 (1964).
- Malnic, G., Klose, R. M., Giebisch, G. Micropuncture study of distal tubular potassium and sodium transport in rat nephron. American Journal of Physiology. 211 (3), 529-547 (1966).
- Cabral, P. D., Garvin, J. L. Luminal flow regulates NO and O2(-) along the nephron. American Journal of Physiology. 300 (5), 1047-1053 (2011).
- Raghavan, V., Rbaibi, Y., Pastor-Soler, N. M., Carattino, M. D., Weisz, O. A. Shear stress-dependent regulation of apical endocytosis in renal proximal tubule cells mediated by primary cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8506-8511 (2014).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. Apical membrane area of rabbit urinary bladder increases by fusion of intracellular vesicles: an electrophysiological study. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 123-136 (1984).
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C.
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Khandelwal, P., Abraham, S. N., Apodaca, G. Cell biology and physiology of the uroepithelium. American Journal of Physiology Renal Physiology. 297 (6), 1477-1501 (2009).
- Sachs, F. Stretch-activated ion channels: what are they. Physiology. 25 (1), 50-56 (2010).
- Martinac, B. Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction. Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).
- Ranade, S. S., Syeda, R., Patapoutian, A.
- Cox, C. D., Bavi, N., Martinac, B. Biophysical principles of ion-channel-mediated mechanosensory transduction. Cell Reports. 29 (1), 1-12 (2019).
- Carattino, M. D., Sheng, S., Kleyman, T. R. Epithelial Na+ channels are activated by laminar shear stress. Journal of Biological Chemistry. 279 (6), 4120-4126 (2004).
- Ross, T. D., et al.
- Dieterle, M. P., Husari, A., Rolauffs, B., Steinberg, T., Tomakidi, P. Integrins, cadherins and channels in cartilage mechanotransduction: perspectives for future regeneration strategies. Expert Reviews in Molecular Medicine. 23, 14 (2021).
- Huveneers, S., de Rooij, J.
- Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R.
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv. European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Sun, X. R., et al. Fast GCaMPs for improved tracking of neuronal activity. Nature Communications. 4, 2170 (2013).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Durnin, L., et al. An ex vivo bladder model with detrusor smooth muscle removed to analyse biologically active mediators released from the suburothelium. The Journal of Physiology. 597 (6), 1467-1485 (2019).
- Delmas, P., Coste, B. Mechano-gated ion channels in sensory systems. Cell. 155 (2), 278-284 (2013).
- Tavernarakis, N., Driscoll, M. Degenerins. At the core of the metazoan mechanotransducer. Annals of the New York Academy of Sciences. 940 (1), 28-41 (2001).
- Peyronnet, R., Tran, D., Girault, T., Frachisse, J. M. Mechanosensitive channels: feeling tension in a world under pressure. Frontiers in Plant Science. 5, 558 (2014).
- Blount, P., Iscla, I. Life with bacterial mechanosensitive channels, from discovery to physiology to pharmacological target. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (1), 00055 (2020).
- Booth, I. R., Miller, S., Müller, A., Lehtovirta-Morley, L. The evolution of bacterial mechanosensitive channels. Cell Calcium. 57 (3), 140-150 (2015).
