Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Bewertung der Funktion von mechanisch aktivierten Ionenkanälen in nativen Urothelzellen unter Verwendung des fluoreszierendenCa2+ -Sensors GCaMP5G.
Abstract
Mechanisch aktivierte Ionenkanäle sind biologische Wandler, die mechanische Reize wie Dehnungs- oder Scherkräfte in elektrische und biochemische Signale umwandeln. Bei Säugetieren sind mechanisch aktivierte Kanäle essentiell für die Erkennung äußerer und innerer Reize in so unterschiedlichen Prozessen wie Berührungsempfindung, Gehör, Regulierung des Volumens roter Blutkörperchen, Basalblutdruckregulierung und Suffizienzgefühl in der Harnblase. Während die Funktion von mechanisch aktivierten Ionenkanälen in der In-vitro-Umgebung mit der Patch-Clamp-Technik ausgiebig untersucht wurde, bleibt die Beurteilung ihrer Funktion in ihrer natürlichen Umgebung eine schwierige Aufgabe, oft aufgrund des begrenzten Zugangs zu den Expressionsstellen dieser Kanäle (z. B. afferente Terminals, Merkel-Zellen, Barorezeptoren und Nierentubuli) oder Schwierigkeiten bei der Anwendung der Patch-Clamp-Technik (z. B. die apikalen Oberflächen von Urothelschirmzellen). Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Bewertung mechanisch evozierter Ca 2+ Transienten unter Verwendung des Fluoreszenzsensors GCaMP5G in einer ex vivo urothelialen Präparation, einer Technik, die leicht für die Untersuchung von mechanisch evozierten Ca2+ -Ereignissen in anderen nativen Gewebepräparaten angepasst werden könnte.
Introduction
Epithelzellen in den Harnwegen sind mechanischen Kräften ausgesetzt, wenn das Harnfiltrat durch die Nephrone wandert, und der Urin wird aus dem Nierenbecken gepumpt und wandert durch die Harnleiter, um in der Harnblase gespeichert zu werden. Es ist seit langem bekannt, dass mechanische Kräfte (z. B. Scherspannung und Dehnung), die von Flüssigkeiten auf die Epithelzellen ausgeübt werden, die die Harnwege auskleiden, die Rückresorption von Protein im proximalen Tubulus und von gelösten Stoffen im distalen Nephronregulieren 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13, sowie die Speicherung von Urin in der Harnblase und Miktion14,15,16,17.
Die Umwandlung mechanischer Reize in elektrische und biochemische Signale, ein Prozess, der als Mechanotransduktion bezeichnet wird, wird durch Proteine vermittelt, die auf die Verformung zellulärer Strukturen oder der zugehörigen extrazellulären Matrix 18,19,20,21 reagieren. Mechanisch aktivierte Ionenkanäle sind einzigartig in dem Sinne, dass sie als Reaktion auf Änderungen der Membranspannung, des Drucks oder der Scherspannung von einem geschlossenen Zustand in einen offenen permeablen Zustand übergehen 18,19,20,21,22. Darüber hinaus könnenCa2+-Transienten durch Integrin-vermittelte Mechanotransduktion oder durch Aktivierung mechanoresponsiver Adhäsionssysteme an den Zell-Zell-Verbindungen23,24,25,26 initiiert werden. Die Funktion des Ionenkanals wird üblicherweise mit der Patch-Clamp-Technik beurteilt, bei der eine Gigaohm-Dichtung zwischen der Zellmembran und der Patchpipette27 gebildet wird. Zellen, die sich in tiefen Gewebeschichten mit einer dichten extrazellulären Matrix (z. B. Nierentubuli) befinden oder von einer physikalischen Barriere (z. B. Glykokalyx) umgeben sind, sind jedoch mit einer Glasmikropipette schwer zugänglich. Ebenso können Zellen, die eingebettete oder integrale Bestandteile von Geweben mit schlechter mechanischer Stabilität sind (z. B. das Urothel), mit der Patch-Clamp-Technik nicht ohne weiteres untersucht werden. Da viele mechanisch aktivierte Ionenkanäle für Ca2+ durchlässig sind, besteht ein alternativer Ansatz darin, ihre Aktivität durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung einesCa2+-sensitiven Farbstoffs oder genetisch kodierter Calciumindikatoren (GECIs) wie GCaMP zu bewerten. Jüngste Anstrengungen im Bereich des Protein-Engineerings haben den Dynamikbereich, die Empfindlichkeit und die Reaktion von GECIs28,29,30 signifikant erhöht, und Fortschritte in der Genetik haben ihre Expression in bestimmten Zellpopulationen ermöglicht, was sie ideal für die Untersuchung der Mechanotransduktion geeignet macht.
Das Urothel, das geschichtete Epithel, das das Innere der Harnblase bedeckt, fungiert als Barriere, die die Diffusion von gelösten Stoffen im Urin in das Blaseninterstitium verhindert, fungiert aber auch als Schallkopf, der die Fülle der Blase wahrnimmt und diese Ereignisse an die darunter liegenden Nerven und die Muskulatur weiterleitet16. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Kommunikation zwischen dem Urothel und dem darunter liegenden Gewebe die mechanisch aktivierten Ionenkanäle Piezo1 und Piezo231 erfordert. Um mechanisch induzierte Ca2+-Transienten in Urothelzellen zu bewerten, wurde eine neue Technik entwickelt, die den adenoviralen Gentransfer nutzt, um denCa2+-Sensor GCaMP5G in Urothelzellen zu exprimieren. Diese Technik verwendet eine Schleimhautblattpräparation, die einen einfachen Zugang zur äußersten Schirmzellschicht ermöglicht, und ein computergestütztes System zur gleichzeitigen mechanischen Stimulation einzelner Zellen mit einer geschlossenen Glasmikropipette und zur Aufzeichnung von Fluoreszenzänderungen im Laufe der Zeit.
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Protocol
Die Pflege und der Umgang mit den Tieren wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden weibliche, 2-4 Monate alte C57Bl/6J-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden kommerziell erworben (siehe Materialtabelle).
1. Montage und Einrichtung der Ausrüstung
- Führen Sie eine Ca2+ -Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop durch, das mit einer hochauflösenden Kamera und einer stabilen Lichtquelle ausgestattet ist (siehe Materialtabelle).
- Erfassen Sie die Bilder mit einer mikroskopkompatiblen Software, die eine direkte Steuerung der Kamera, der Lichtquelle und des Piezoaktors über ein USB-Digital-I/O-Gerät ermöglicht (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt ein Schema des Setups. GCaMP5G hat eine Peak-Anregungswellenlänge von 470 nm und eine Peak-Emissions-Wellenlänge von 497 nm28. Verwenden Sie einen Filterwürfel, der für die GCaMP5G-Bildgebung geeignet ist.
- Erfassen Sie die Bilder mit einer mikroskopkompatiblen Software, die eine direkte Steuerung der Kamera, der Lichtquelle und des Piezoaktors über ein USB-Digital-I/O-Gerät ermöglicht (siehe Materialtabelle).
- Für die Stimulation einzelner Urothelzellen in der Blasenschleimhautpräparation (siehe Schritt 2) wird ein piezoelektrischer Aktuator verwendet, der von einem einkanaligen Open-Loop-Piezo-Controller gesteuert wird (siehe Materialtabelle). Montieren Sie den piezoelektrischen Aktuator in einem Mikromanipulator.
- Montieren Sie die Mikropipetten aus Glas in einem Pipettenhalter, der am piezoelektrischen Aktuator befestigt ist (Abbildung 1). Fernsteuerung des Piezo-Controllers über einen Analog/Digital-Wandler, der von einem elektrophysiologischen Datenerfassungs- und Analyseprogramm gesteuert wird (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Ein externer Trigger in Form eines TTL-Signals (Transistor-Transistor-Logik), das von der Bildgebungssoftware initiiert wird, wird verwendet, um das Stimulationsprotokoll in der elektrophysiologischen Datenerfassungs- und Analysesoftware auszulösen, die den piezoelektrischen Aktuator bewegt (Abbildung 1).
- Montieren Sie die Mikropipetten aus Glas in einem Pipettenhalter, der am piezoelektrischen Aktuator befestigt ist (Abbildung 1). Fernsteuerung des Piezo-Controllers über einen Analog/Digital-Wandler, der von einem elektrophysiologischen Datenerfassungs- und Analyseprogramm gesteuert wird (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie sicher, dass die Imaging-Software (siehe Materialtabelle) mit dem digitalen E/A-Gerät verbunden ist. Konfigurieren Sie einen digitalen Ausgangskanal im USB-Digital-I/O-Gerät, um das TTL-Signal an den Analog/Digital-Wandler zu liefern, der das Protokoll in der Elektrophysiologie-Software initiiert, die den piezoelektrischen Aktuator bewegt.
- Verwenden Sie ein Kabel, um den Start BNC-Port im Analog/Digital-Wandler mit Masse (GND) und eine Schraubklemme im USB-Digital-I/O-Gerät zu verbinden.
- Richten Sie das Aufzeichnungsprotokoll in der Bildbearbeitungssoftware ein.
HINWEIS: In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie Sie ein Protokoll generieren, das ein TTL-Signal sendet und in bestimmten Zeitintervallen mit der Erfassung von Bildern beginnt.- Richten Sie das Erfassungsprotokoll in der Bildgebungssoftware ein, indem Sie auf den Experiment-Manager klicken und Neues Experiment auswählen. Es öffnet sich ein neues Fenster.
- Wählen Sie das Symbol Zeitrafferschleife und ziehen Sie es in das neu geöffnete Fenster. Stellen Sie die Anzahl der Zyklen auf 2 und das Intervall auf die schnellste Einstellung ein, die im Setup zulässig ist.
- Wählen Sie unter dem Symbol "Übertragener Verschluss/manueller Verschluss" das Symbol NI USB-6501 aus, ziehen Sie es in das Fenster "Time Lapse Loop" und stellen Sie das NI USB-6501 auf "geschlossen" ein. Ziehen Sie ein zusätzliches NI USB-6501 aus dem Transmission Shutter/Manual Shutter in das Fenster "Time Lapse Loop" und setzen Sie es auf "Geöffnet". Um die beiden Symbole des NI USB-6501 zu verbinden, ziehen Sie die Pfeilspitze an der Seite des geschlossenen Symbols des NI USB-6501 und ziehen Sie, bis das Symbol zum Öffnen des NI USB-6501 berührt wird. Eine Linie, die beide Symbole verbindet, wird angezeigt.
- Ziehen Sie eine weitere Zeitrafferschleife in das Fenster des Experiment-Managers und verbinden Sie sie mit der ersten, indem Sie an der Pfeilspitze ziehen. Stellen Sie die Parameter für die Aufnahme ein. Stellen Sie die Anzahl der Zyklen der neuen Zeitrafferschleife auf 2400 ein.
- Ziehen Sie über das Bildaufnahmesymbol den GFP-Filter in die kürzlich geöffnete Zeitrafferschleife und stellen Sie die Belichtungszeit auf 100 ms ein.
- Stellen Sie den Kamerabildtyp auf 8 Bit, die Auflösung auf 576 x 576 (Binning 4 x 4), den Pixeltakt auf 480 MHz und die Hotpixelkorrektur auf Standard ein.
HINWEIS: Die Parameter können je nach Ausstrahlungsgrad des Fluoreszenzsensors, Kameraempfindlichkeit und Setup-Konfiguration angepasst werden.
- Richten Sie den Labortisch in der Elektrophysiologie-Software ein (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Hiermit wird das Ausgangssignal des Analog/Digital-Wandlers in mV definiert.- Gehen Sie in der Elektrophysiologie-Software zum Menü Konfigurieren und wählen Sie Lab Bench aus. Wählen Sie im daraufhin angezeigten Fenster "Ausgangssignale" den Analogausgang #1 aus, drücken Sie auf "Signal hinzufügen" und benennen Sie es (z. B. "Piezo"). Stellen Sie die Signaleinheit auf mV und den Skalierungsfaktor (mV/V) auf 1 ein.
- Generieren Sie ein Stimulationsprotokoll in der Elektrophysiologie-Software, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Um ein neues Stimulationsprotokoll in der Elektrophysiologie-Software zu generieren, gehen Sie zum Menüpunkt Erwerben und wählen Sie Neues Protokoll.
- Stellen Sie den Modus/die Rate auf episodische Stimulation, den Lauf/Versuch auf 1, den Sweep/Lauf auf 1 und die Sweepdauer (en) auf 150 ein.
- Wählen Sie im Menü " Ausgänge" den Kanal #1 Piezo als Analogausgang aus.
- Stellen Sie im Menü "Trigger" den Trigger auf "Digitizer-Starteingang" und "Interner Timer" ein.
- Wählen Sie im Menü "Wellenform" Kanal #1 und "Analoge Wellenform mit Epochen" aus. Legen Sie Schritt A auf Schritt, Erste Stufe auf 0, Delta-Stufe auf 0, Erste Dauer auf 10000 und Deltadauer auf 0 fest.
- Legen Sie Schritt B auf Schritt, erste Stufe auf 10, Delta-Stufe auf 0, erste Dauer auf 1000 und Deltadauer auf 0 fest. Legen Sie Schritt C auf Schritt, erste Stufe auf 0, Delta-Stufe auf 0, erste Dauer auf 130000 und Deltadauer auf 0 fest.
- Speichern Sie das Protokoll und nennen Sie es Stimulationsprotokoll.
- Verwenden Sie ein BNC-Kabel, um den Analogausgang #1 im Analog/Digital-Wandler mit dem EXT INPUT an der Vorderseite des einkanaligen Open-Loop-Piezo-Controllers zu verbinden (siehe Materialtabelle).
- Stellen Sie Glasmikropipetten für die mechanische Stimulation von Regenschirmzellen aus Kapillarglasröhren her, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Legen Sie das Kapillarglas in einen Abzieher (siehe Materialtabelle) und stellen Sie es mit den Kapillarhalteknöpfen ein.
- Positionieren Sie die Heizeinheit in voller Höhe. Stellen Sie den Schieberegler für die erste Zugabschlussposition des Abziehers auf 5 ein.
- Stellen Sie den ersten Heizknopf auf 76,7 und den zweiten Knopf auf 52,7.
- Ziehen Sie die Glaskapillare in zwei Schritten, indem Sie den Startknopf drücken.
- Verschließen Sie die Spitze der Mikropipette mit einer Mikroschmiede (siehe Materialtabelle), wobei der Einstellknopf des Heizgeräts auf 60 eingestellt ist.
HINWEIS: Für das vorliegende Protokoll beträgt der Enddurchmesser der Mikropipettenspitze, die zum Stechen einzelner Zellen verwendet wird, ~1-3 μm.
- Stellen Sie sicher, dass sich die stimulierende Mikropipette um die im Stimulationsprotokoll angegebene Entfernung bewegt.
HINWEIS: Mit den folgenden Schritten soll sichergestellt werden, dass 12,5 s nach Initiierung des Stimulationsprotokolls in der Elektrophysiologie-Software ein Spannungsimpuls mit einer Dauer von 1 s erzeugt wird, wodurch sich der piezoelektrische Aktor um 20 μm bewegt.- Montieren Sie eine Mikropipette in der Halterung und befestigen Sie sie am piezoelektrischen Aktor.
- Platzieren Sie den piezoelektrischen Aktor und die angebrachte Mikropipette parallel zur Mitte des Mikroskoptisches und im Sichtbereich.
- Konzentrieren Sie sich auf die Spitze der Pipette und immobilisieren Sie die piezoelektrische Montagestange (siehe Materialtabelle) mit Klebeband. Passen Sie bei Hellfeldbeleuchtung die Kameraparameter an, um ein klares Bild der Pipettenspitze zu erhalten.
- Öffnen Sie das Stimulationsprotokoll in der Elektrophysiologie-Software und stellen Sie es auf Wiedergabe ein.
HINWEIS: Das elektrophysiologische Protokoll wird erst gestartet, wenn das von der Bildgebungssoftware gesendete TTL-Signal empfangen wird. - Drücken Sie im Experiment-Manager in der Bildgebungssoftware auf Start , um die Datenerfassung zu starten.
HINWEIS: Dadurch wird das Protokoll in der Elektrophysiologie-Software ausgelöst, das den piezoelektrischen Aktuator ansteuert. Das Protokoll in der Bildgebungssoftware generiert eine Datei mit den Bildern des Experiments.
- Überprüfen Sie die von der Pipette zurückgelegte Strecke, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Um die von der Pipette während des Stimulationsprotokolls zurückgelegte Strecke zu messen, wählen Sie in der Bildgebungssoftware das Element Zählen und Messen .
- Wählen Sie im Menü " Messen " die Option " Messung und ROI" aus, und unter dem Filmfenster wird ein neues Fenster angezeigt.
- Wählen Sie im Menü " Messen " die Option " Beliebige Linie" aus.
- Zeichnen Sie im Filmfenster eine beliebige Linie, die an der Spitze der Pipette beginnt. Beachten Sie, dass das Ende der beliebigen Zeile später angepasst wird.
- Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die beliebige Linie , um die Zeile in eine Region of Interest (ROI) umzuwandeln, die in allen Filmbildern sichtbar ist.
- Überprüfen Sie den Film und passen Sie das Ende der beliebigen Linie (ROI) an die endgültige Position an, die die Pipette als Reaktion auf den Stimulus bewegt.
HINWEIS: Die von der Pipette zurückgelegte Strecke in μm wird im Fenster Messung und ROI angezeigt. Das Stimulationsprotokoll kann je nach Bedarf des Benutzers geändert werden.
2. In-situ-Transduktion und Isolierung der Blasenschleimhaut
- Transduzieren Sie weibliche Mausblasen in situ mit einem Adenovirus, das für die cDNA von CGaMP5G kodiert, gemäß dem im Virustransduktionsprotokoll31 beschriebenen Verfahren.
- Bei der Transduktion von Urothelzellen für Ca2+ Bildgebungsexperimente werden die Blasen mit 50 μl der Lösung mit 2 x 107 infektiösen Viruspartikeln (IVP) in die Blasen geträufelt.
HINWEIS: Diese Technik neigt dazu, die Expression von CGaMP5G auf die Schirmzellschicht zu beschränken. Alternativ könnten Experimente mit Harnblasen durchgeführt werden, die von transgenen Mäusen entnommen wurden, die CGaMP5G in Urothelzellen exprimieren (d.h. GCaMP5G-Expression, die von einem Uroplakin-2-Promotor angetrieben wird) oder einem anderen Zelltyp von Interesse.
- Bei der Transduktion von Urothelzellen für Ca2+ Bildgebungsexperimente werden die Blasen mit 50 μl der Lösung mit 2 x 107 infektiösen Viruspartikeln (IVP) in die Blasen geträufelt.
- 24-72 h nach der Transduktion werden die Mäuse durch CO2 -Erstickung eingeschläfert und eine Thorakotomie durchgeführt, indem die Brusthöhle mit einer Schere geöffnet wird, um die Lunge zum Kollaps zu bringen.
- Canuieren Sie die Harnröhre mit einem 24-G-Katheter. Legen Sie die Blase durch einen Bauchschnitt von ~1,5 cm durch Haut und Muskel frei und verwenden Sie eine 6,0-Naht (siehe Materialtabelle), um den Katheter an der Harnröhre zu befestigen.
- Die Blase und die Harnröhre32 werden entnommen und auf ein Silikonkautschuk-Halterkissen (siehe Materialtabelle) geklebt, das in einer Aufzeichnungslösung gebadet ist, die (in mM) Folgendes enthält: 135 NaCl, 5,0 KCl, 1 MgCl 2, 2,5 CaCl 2, 10 Glucose, 10 HEPES, pH 7,4 und mit 100 % O2 aufgeblasen (Abbildung 2A).
- Trennen Sie die Blasenschleimhaut mit einer feinen Pinzette von der darunter liegenden Muskelschicht gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten32 (Abbildung 2B).
- Schneiden Sie die Blasenschleimhaut auf und fixieren Sie sie mit dem Urothel nach oben zu einem Silikonelastomereinsatz im Boden einer Gewebekulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm (Abbildung 2C).
3. Mechanische Stimulation einzelner Urothelzellen undCa2+ -Bildgebung
- Montieren Sie die Gewebekulturschale mit der festgesteckten Blasenschleimhaut im Mikroskoptisch, der mit einem Kulturinkubator mit Widerstandsheizelementen ausgestattet ist (Abbildung 2E). Perfusionieren (gemäß den Anweisungen des Herstellers, siehe Materialtabelle) der Zellkulturschale kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 1,7 ml/min mit einer auf ~37 °C erwärmten Aufzeichnungslösung mit einer Inline-Heizung.
- Halten Sie die Temperatur des Inkubators und der Lösungen für Gewebeschalen mit einem bipolaren Zweikanal-Temperaturregler bei ~37 °C (siehe Materialtabelle). Äquilibrieren Sie das Gewebe in der Kammer mindestens 15 Minuten lang mit kontinuierlicher Perfusion, bevor Sie weitere experimentelle Verfahren durchführen.
- Um mechanisch induzierteCa2+ -Transienten aufzuzeichnen, tauchen Sie die Mikropipette in die Lösung und baden Sie die festgesteckte Blasenschleimhaut in der Gewebeschale. Bewegen Sie die Mikropipette mit Hilfe eines Scanobjektivs mit geringer Vergrößerung (4x) unter Verwendung von Hellfeldbeleuchtung in die Mitte des Feldes.
- Bewegen Sie die Mikropipette in die Nähe der Oberfläche des Urothelgewebes, indem Sie den Mikromanipulator koordiniert in der vertikalen Ebene bewegen und den Fokus einstellen.
- Schalten Sie das Objektiv auf ein Objektiv mit einer höheren Vergrößerung (20x) um, das für Immunfluoreszenz mit hoher numerischer Apertur (NA) geeignet ist.
- Stellen Sie den Mikromanipulator auf Fein und bewegen Sie die Mikropipette in die Nähe der Oberseite der Zielzelle.
- Ändern Sie das Sichtfeld in Kamera und drücken Sie Live in der Bildbearbeitungssoftware.
HINWEIS: Dies muss den reflektierten Verschluss einschalten und die Beobachtung des Fluoreszenzsignals ermöglichen, das vom Gewebe im Computer ausgeht. - Passen Sie den Fokus an, um die Oberseite der Zelle zu visualisieren, und passen Sie bei Bedarf die Position der Pipette an.
- Öffnen Sie das Stimulationsprotokoll in der Elektrophysiologie-Software und stellen Sie es auf Wiedergabe ein.
HINWEIS: Das Protokoll in der Elektrophysiologie-Software wird erst gestartet, wenn das von der Bildgebungssoftware gesendete TTL-Signal empfangen wird. - Drücken Sie im Experiment-Manager in der Bildgebungssoftware auf Start , um die Datenerfassung zu starten. Dadurch wird das Protokoll in der Elektrophysiologie-Software ausgelöst, die den piezoelektrischen Aktuator ansteuert und eine Datei mit den Bildern des Experiments generiert. Das Stimulationsprotokoll kann an die Bedürfnisse des Benutzers angepasst werden.
4. Datenanalyse
- Quantifizieren Sie die Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Öffnen Sie die Bilddatei in der Bildbearbeitungssoftware und wählen Sie das Fenster Zählen und Messen . Wählen Sie das Polygonwerkzeug aus, und zeichnen Sie einen ROI für die Grenzen der Zelle, die gestochen wurde.
- Wechseln Sie zum Fenster "Messen", wählen Sie " Intensitätsprofil" aus, legen Sie die Messung auf " Über Zeit", " Ergebnisse " auf " Durchschnitt", " Hintergrundsubtraktion " auf " Keine" fest, und drücken Sie dann auf "Ausführen". Die mittlere Fluoreszenzintensität wird über die Zeit berechnet (Abbildung 3).
- Um die Daten des Intensitätsprofils zu exportieren, klicken Sie auf das Excel-Symbol im Fenster Ergebnisse des Intensitätsprofils. Auf diese Weise kann der Benutzer den Zielordner und den Dateinamen auswählen und die Daten in einem .xlsx Format speichern.
- Führen Sie eine Datenanalyse mit wissenschaftlicher Grafik- und Datenanalysesoftware durch (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die Amplitude des Ca2+ -Peaks, der durch Stochern hervorgerufen wird, wird als Änderung der Fluoreszenzintensität (ΔF/F) ausgedrückt, wobei F die Fluoreszenzintensität von GCaMP5G zum Zeitpunkt 0 und ΔF die Differenz zwischen den Fluoreszenzintensitätsmaxima und dem Basal zum Zeitpunkt 0 ist. Der Abfall derCa2+ -Antwort kann ebenfalls berechnet werden (nicht gezeigt).
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Representative Results
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur Bewertung mechanisch evozierter Ca2+-Transienten in Regenschirmzellen unter Verwendung des fluoreszierendenCa2+-Sensors GCaMP5G. Die adenovirale Transduktion wurde verwendet, um GCaMP5G in Urothelzellen zu exprimieren, da sie eine hohe Effizienz aufweist und ein erhöhtes Expressionsniveau erzeugt. Fluoreszenzbilder von gefärbten Kryoschnitten aus einer transduzierten Blase sind in Abbildung 2D dargestellt. Für diese Experimente ist die GCaMP5G-Expression in der Regenschirmzellschicht am höchsten. Eine Sequenz repräsentativer Bilder, die während eines Experiments aufgenommen wurden, bei dem eine Regenschirmzelle gestochen wurde, ist in Abbildung 3A dargestellt. Das erste Bild in Abbildung 3A zeigt eine fluoreszierende Ansicht der stimulierenden Pipette, die auf der Oberseite einer Regenschirmzelle einer Blasenschleimhaut positioniert ist, die GCaMP5G exprimiert. Die mechanische Stimulation der Schirmzelle, die GCaMP5G exprimiert, bewirkt eine Verformung (siehe Bild Abbildung 3A bei 12,5 s), gefolgt von einem schnellen Anstieg der Fluoreszenzemission (siehe Bild Abbildung 3A bei 13,5 s). Die Änderung der Fluoreszenz wurde als Funktion der Zeit aufgetragen (Abbildung 3B). Wie bereitsberichtet 31, ruft das Stochern eine Ca2+-Reaktion in den meisten Regenschirmzellen hervor, die in Blasen von Kontroll- und Wildtyp-Mäusen getestet wurden, die mit GCaMP5G transduziert wurden. Das Löschen von Piezo1 und Piezo2 aus Umbrella-Zellen reduzierte die Spitzenamplitude der Ca2+-Antwort31. Beim Vergleich der Wirkung verschiedener Behandlungen oder genetischer Hintergründe auf mechanisch evozierteCa2+-Reaktionen ist es wichtig, die experimentellen Bedingungen zu standardisieren, einschließlich der Transduktion der Blase, der Befestigung des Gewebes, der Größe der Spitze der Pipette, die für die Einkerbung verwendet wird, der Dauer und Amplitude des mechanischen Reizes sowie der Bildgebungsbedingungen.
Abbildung 1: Versuchsaufbau zur Erfassung mechanoaktivierterCa2+ -Transienten in Urothelzellen. Das Rig besteht aus einem aufrechten Mikroskop, einer fluoreszierenden Lichtquelle, Anregungs- und Emissionsfiltern sowie einer CMOS-Kamera. Die Imaging-Software steuert das System. Ein piezoelektrischer Aktuator, der von einem einkanaligen Open-Loop-Piezo-Controller gesteuert wird, wird verwendet, um die Stocher-Mikropipette zu bewegen. Mikropipetten aus Glas sind in einem Pipettenhalter montiert, der am piezoelektrischen Aktuator befestigt ist. Der piezoelektrische Aktuator und die zugehörige Mikropipette sind auf einem Mikromanipulator montiert (nicht abgebildet). Der Piezo-Open-Loop-Regler wird über einen Analog-Digital-Wandler und eine Elektrophysiologie-Software ferngesteuert. Ein Aufzeichnungsprotokoll in der Bildgebungssoftware liefert ein TTL-Signal über ein digitales I/O-Gerät, das das Stimulationsprotokoll in der Elektrophysiologie-Software initiiert, die die piezoelektrische und anschließend die Bildaufnahme steuert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Isolierung und Befestigung der Blasenschleimhaut für die Ca2+ Bildgebung. (A) Vorbereitung der Schleimhautblätter mit einem angebrachten Katheter. Die Blasenschleimhaut wurde mit einer feinen Pinzette von der darunterliegenden Muskelschicht abgestreift. (B) Vergrößertes Bild der abgestreiften Blasenschleimhaut in Tafel (A). (C) Die Schleimhaut wurde mit dem Urothel nach oben mit 0,15 mm Insektenstiften an einem Silikonelastomereinsatz festgenagelt. (D) Konfokale Immunfluoreszenz-Schnittbilder der Schleimhautblattpräparation, gefärbt mit einem Antikörper gegen GFP und einem sekundären Esel-Anti-Kaninchen-konjugierten Antikörper (grün), Rhodamin-Phalloidin (rot) und DAPI (blau). Das Blasenschleimhautpräparat enthält einen Teil der Lamina propria (LP). Pfeile zeigen die Position der Schirmzellschicht (Ub) an. Maßstabsbalken = 50 μm. (E) Foto des Versuchsaufbaus. a, Inline-Heizung; b, piezoelektrischer Aktuator; c, Heizelemente und Regler; d, Pipettenhalter und Mikropipette; e, Schleimhautfolie, die an der Silikoneinlage in einer gewebekultivierten Schale und einem Geschirrinkubator befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3. Erfassung und Analyse von mechanoaktivierten Ca2+ Transienten in Urothelzellen. (A) Sequenz von Fluoreszenzbildern, die zu verschiedenen Zeitpunkten während eines Experiments aufgenommen wurden. Beachten Sie, dass die mechanische Stimulation der Regenschirmzelle eine Verformung verursacht, gefolgt von einem schnellen Anstieg der Emission von GCaMP5G (Pfeil). Die Ränder der stimulierten Zelle (ROI) sind rot markiert. (B) Änderung der Fluoreszenzintensität (ΔF/F) über die Zeit für acht unabhängige mechanisch stimulierte Zellen in einem Blasenschleimhautpräparat aus einer Kontrollmaus. Die Einrückungszeit (12,5 s) ist mit einem blauen Pfeil markiert. Die Daten in (B) wurden von Dalghi et al.31 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Alle Organismen und scheinbar die meisten Zelltypen exprimieren Ionenkanäle, die auf mechanische Reize reagieren 20,33,34,35,36,37. Die Funktion dieser mechanisch aktivierten Kanäle wurde überwiegend mit der Patch-Clamp-Technik untersucht. Aufgrund von Zugänglichkeitsproblemen waren Patch-Clamp-Studien von mechanisch aktivierten Ionenkanälen jedoch weitgehend auf dissoziierte Zellen und Zelllinien beschränkt. Da viele mechanisch aktivierte Ionenkanäle fürCa2+ durchlässig sind, haben wir die jüngsten Fortschritte in der Mikroskopie, Biosensorik und Mikromanipulation genutzt, um eine bildgebende Methode zu entwickeln, mit der die Funktion mechanisch aktivierter Kanäle in einem ex vivo Urothelpräparat beurteilt werden kann. In diesem Protokoll werden Urothelzellen mit einem Adenovirus transduziert, das für GCaMP5G kodiert. Adenovirale Vektoren eignen sich ideal für die Untersuchung derCa2+-Signalübertragung im Urothel, da sie eine hohe Transduktionsrate und eine hohe Expression von GCaMP5G in Urothelzellen bieten (Abbildung 2D). Unter diesen Bedingungen ist die Hintergrundfluoreszenz relativ gering. Wenn die adenovirale Transduktion verwendet wird, um einen genetisch kodierten Ca2+ Sensor zu exprimieren, sollte besonderes Augenmerk auf die Optimierung der Bedingungen gelegt werden, so dass nur die interessierenden Zellen den Sensor exprimieren. Als Alternative könnte die Expression von genetisch kodierten Ca2+-Indikatoren (GECIs) erreicht werden, indem Mäuse, die ein floxiertes Transgen tragen, das für das interessierende Protein kodiert (z. B. GCaMP5G), und Mäuse, die Cre-Rekombinase exprimieren, unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors gekreuzt werden. Dieser Ansatz erfordert keine chirurgischen Eingriffe und hat den Vorteil, dass er eine gezielte Expression und gleichmäßige Expression von Proteinen in Zellen ermöglicht, die Cre-Rekombinase exprimieren.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet ein aufrechtes Weitfeldmikroskop, um mechanisch aktivierteCa2+ -Transienten in Regenschirmzellen zu bewerten, die mit einer geschlossenen, feuerpolierten Mikropipette stimuliert werden. Die Methode könnte angepasst werden, um die Mechanotransduktion in tieferen Schichten des Urothels oder sogar in Zellen in der Lamina propria mit einem aufrechten konfokalen oder Zwei-Photonen-Mikroskop zu untersuchen. Die Verwendung eines konfokalen Mikroskops kann die notwendige Auflösung liefern, um subzelluläre Veränderungen in intrazellulärem Ca2+ zu definieren, die als Reaktion auf mechanische Stimulation auftreten. Dieses Protokoll verwendet eine geschlossene, feuerpolierte Mikropipette, um einzelne Regenschirmzellen zu stechen. Der Hauptvorteil der Verwendung einer Mikropipette zur Stimulation besteht darin, dass die mechanische Störung, die auf das Gewebe ausgeübt wird, vorübergehend ist und auf die interessierende Zelle und die Umgebung beschränkt ist. Während Zelldehnungssysteme verwendet werden können, um Zellen, die auf PDMS-Membranen gezüchtet werden, mechanisch zu stimulieren, behindern inhärente Einschränkungen die Verwendung solcher Geräte für bildgebende Experimente mit Ex-vivo-Präparaten . Zu diesen Einschränkungen gehören Herausforderungen bei der Montage und Bildgebung einer Mausblase und, angesichts der gefalteten Natur der Blasenschleimhaut, Schwierigkeiten, den Fokus auf die interessierenden Zellen zu richten, während das Gewebe gedehnt wird.
Das Protokoll zur Messung mechanisch aktivierterCa2+ -Transienten in Urothelpräparaten weist einige Einschränkungen auf. Erstens enthält das Rig relativ teure Komponenten, und seine Montage und Einrichtung erfordert Fachwissen mit Mikroskopen, Mikromanipulatoren, Analog-Digital-Wandlern und relativ spezialisierter Software. Wie beim Klemmen von Pflastern muss der Forscher bei dieser Technik lernen, wie man einen Mikromanipulator verwendet und Glasmikropipetten zur mechanischen Stimulation herstellt. Im Gegensatz zur Patch-Clamp-Technik, bei der eine hochohmige Abdichtung zwischen der Pipette und der Membran gebildet wird, ist das hier beschriebene Verfahren zur Messung mechanisch aktivierterCa2+ -Transienten jedoch relativ einfach und erfordert nur, dass der Prüfer die stimulierende Pipette nahe an der Oberfläche der zu stimulierenden Zelle positioniert. Daher kann ein geschulter Ermittler möglicherweise die Reaktion auf das Stechen von 8-10 Zellen in 1 Stunde beurteilen, was mit der Patch-Clamp-Technik undenkbar ist.
Angesichts der Bedeutung, die mechanisch aktivierte Ionenkanäle für normale Körperfunktionen und Krankheitszustände haben, sind neue Methoden erforderlich, um diese Kanäle in ihrem natürlichen Milieu zu untersuchen. Wie in diesem Protokoll beschrieben, können bildgebende Verfahren einen einzigartigen Einblick geben, wie diese Kanäle Veränderungen in ihrer Umgebung wahrnehmen und physiologische Reaktionen erzeugen. Angesichts der Zugänglichkeit der Schleimhautoberfläche der röhren- oder sackförmigen Organe könnte die hier beschriebene Methode angepasst werden, um die Mechanotransduktion in anderen Umgebungen zu untersuchen, einschließlich des Darms, des Urogenitaltrakts, der Blutgefäße usw. Daher kann die Untersuchung mechanischer Reaktionen im Körper allgemein nützlich sein.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01DK119183 (an G.A. und M.D.C.) und S10OD028596 (an G.A.) sowie durch die Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores des Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
References
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