该协议提供了一种强大,详细的方法,可以从小鼠大脑中获得高纯度的突触体,突触囊泡和其他突触部分。该方法能够评估突触过程,包括蛋白质定位和功能(具有区室分辨率)的生化分析。
突触末端是神经元通信的主要部位。突触功能障碍是许多神经精神和神经系统疾病的标志。因此,通过生化分离表征突触亚区室是阐明健康和疾病中突触过程分子基础的有力方法。该协议描述了通过亚细胞分离从小鼠大脑中分离突触末端和突触亚区室。首先,密封的突触末端结构,称为突触体,在脑组织匀浆后被分离出来。突触体是神经元突触前和突触后隔室,具有夹断和密封的膜。这些结构保持代谢活跃状态,对于研究突触结构和功能很有价值。然后将突触体进行低渗裂解和超速离心,以获得富集用于突触囊泡、突触细胞质和突触质膜的突触亚区室。通过电子显微镜和突触下区室特异性蛋白质的生化富集分析确认馏分纯度。所提出的方法是研究突触的结构和功能特征以及各种脑部疾病的分子病因的简单而有价值的工具。
突触是大脑的基本计算单元,神经元通过它进行交流并发挥多样化和精致复杂的功能。因此,突触对大脑健康至关重要1;突触功能障碍是许多疾病的来源或结果2.突触由突触前和突触后末端构成,两个不同神经元的延伸,它们被突触粘附分子穿过的突触裂缝紧密贴合和分离。信息以称为神经递质的化学信使的形式从突触前到突触后隔室流动1。参与神经传递的分子过程是研究的活跃领域3,4,5。了解突触末梢内的致病过程以及突触对其他神经元亚区室病理的反应是解决大脑疾病的关键步骤1,2。一些方法学的进步,主要应用于小鼠模型,推动了这一追求6。通过差速离心分离突触部分是一种范式转变方法,它能够详细评估健康和疾病中的突触过程。
成人大脑由80-900亿个神经元组成7,8。在小鼠物种中,大鼠大脑包含大约~2亿个神经元,而小鼠有~7000万个9,10。每个神经元与高度极化的神经元网络形成数千个特定的突触连接,这些神经元与神经胶质细胞和致密脉管系统混合在一起。在如此复杂和异质的组织中,将突触作为一个独立的系统进行分离和研究曾经是不可想象的。在1960年代,Victor Whittaker,Catherine Hebb和其他人通过使用亚细胞分离分离11,12,13,14分离完整的突触末端,使这成为可能。为了分离突触囊泡(SV),他们通过等渗透(0.32M)蔗糖中的液体剪切力使大脑匀浆,然后进行超速离心。他们获得了被捏断的、质膜封闭的、完整的神经末梢或静脉曲张,他们称之为神经末梢颗粒(NEP)11,13。由于突触的结构和功能特征保留在这些结构中,NEP后来被称为“突触体”,以与其他亚细胞器全等13,15。值得注意的是,爱德华多·德·罗伯蒂斯(Eduardo de Robertis)及其同事创造了“突触囊泡”一词,与惠特克及其同事的工作重叠,并有助于验证“突触体”分离和表征16,17,18。
突触体是生理活性结构,包含储存、释放和再摄取神经递质所需的所有细胞和分子特性13,18。在体外保留关键突触特征和不含非突触成分也有助于这种分离方法的实用性。突触体对理解神经传递的化学和生理特性做出了巨大贡献,现在正用于研究突触分子过程及其在疾病中的改变19,20,21,22,23。突触体也是分离突触成分的初始源材料,例如SVs,网格蛋白包被的囊泡(CCV),突触细胞质,突触质膜,突触线粒体,突触粘附分子和其他感兴趣的成分,可以促进理解突触功能的分子机制18,19,20,24,25,26,27,28.这些亚突触组分可以通过突触体的渗透裂解和蔗糖密度梯度超速离心15,29获得。尽管已知Whittaker研究小组的原始亚细胞分离方法可有效分离高质量的突触体和SVs13,30,但最近的优化提高了亚细胞组分22,23,31,32的纯度。本文提供了一个非常详细且易于访问的经典方案版本,用于小鼠脑组织的亚细胞分离以分离突触体、SV 和其他亚突触组件。
在他们的开创性研究中,惠特克及其同事使用四个形态学标准来鉴定突触体:(1)结构具有密封的质膜;(2)结构含有类似于神经末梢的SV和原位静脉曲张的大小和数量;(3)结构具有一个或多个小线粒体;(4)突触前膜经常粘附在突触后组件11,12,13上。虽然前两个标准通常适用于每种分离方法,但在本文描述的最新方案中,并非所有产生的突触体都会有线粒体和附着的突触后末端。大约60%的突触体将具有线粒体,估计只有高达15%的突触后末端附着37。如果对突触后成分特别感兴趣,已知使用等渗克雷布斯样匀浆和压力过滤进行富集会产生具有突触后末端的高浓度突触体(也称为突触神经体)22,38。
牺牲动物的方法会影响突触体和突触亚组分的质量。使用不需要麻醉的安乐死方法处死的成年动物将获得最佳的馏分质量。此外,大脑应新鲜解剖,而不是冷冻,并使用1:10比例的匀浆缓冲液(重量/体积)进行均质化,以获得最可行的突触部分22。大脑有一个异质的突触群体,可以通过它们携带的神经递质的类型来区分。突触体的形成通常不受突触类型或神经递质含量的影响13。一个例外是小脑中的苔藓纤维,已知在最佳条件下被破坏,以便从大脑的其余部分获得突触体39,40。因此,如果排除该区域不影响实验目标,则建议在脑均质化之前切除小脑。如果有兴趣分离特定神经递质特征的突触体,则可以首先分离富含含有目标神经递质的神经元的大脑区域。然而,这种方法将对最终馏分产量施加限制,具体取决于感兴趣区域的大小(因此,动物的年龄也是一个考虑因素)。有用于分离神经递质特异性突触体的免疫化学方法,但活力和产量将受到显着损害22。如果评估突触体代谢活力很重要,则可以采用神经递质释放41,42 或某些酶测定43 的测量。
突触体制剂中的常见污染物包括微粒体、游离线粒体、SV 以及神经元和神经胶质膜。通过增加P1和P2级分22的洗涤次数并避免在后续步骤中重悬红色线粒体沉淀,可以减少污染。在代谢活力和时间至关重要的实验中,减少洗涤次数并在蔗糖梯度上使用Ficoll或Percoll梯度将有助于44,45,46。这些方法还可以显着减少污染。惠特克的原始协议产生了高质量的SV。该方法中包含的Nagy等人23的进一步优化可生产出具有显着均匀性和纯度的SV,而不会显着影响产量36。如果感兴趣的特定 SV 亚型,例如谷氨酸能(含 VGLUT-1)或 GABA能(含 VGAT-1)SV,可以使用特异性抗体进行免疫分离47,48。还有替代方法可用于从突触体中分离CCV,由于密度差异,突触体可能与使用该方法获得的SV不在同一界面上20,49,50。
总体而言,根据源脑组织的质量和数量以及实验目标,可以进一步优化分离突触组分的当前方案,以获得具有改进的均匀性和活力的组分。有关进一步的故障排除细节,请参阅Dunkley和Robinson22 以及Ganzella et al.36的书籍章节。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢 P. Colosi 的 EM 图像准备。这项工作得到了美国国立卫生研究院(R01 NS064963,SSC;R01 NS110354, SSC;R01 NS083846, SSC;R21 NS094971, SSC;T32 NS007224, SMT;T32 NS041228,SMT),美国国防部(W81XWH-17-1-0564,SSC;W81XWH-19-1-0264,VDJ),在帕金森氏症(ASAP)合作研究网络(SSC)和Michael J. Fox基金会目标进步计划(MJFF-020160,SSC和VDJ)中调整科学。我们使用 BioRender.com 创建了图形插图。
1 mL TB Syringe | BD | 309649 | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | |
14 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube | Beckman Coulter | 344060 | Compatible with SW 40 Ti |
23 Gauge Precision Glide Hypodermic Needle | BD | 305145 | |
26.3 mL, Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | Compatible with Ti70 |
3.5 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube | Beckman Coulter | 349623 | Compatible with TLA-100.3 |
50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | 1 mg/mL in diH2O |
Avanti J-26 XP Centrifuge | Beckman Coulter | B22984 | <26,000 rpm |
Benchtop HDPE Dewar Flask | Thermo Scientific | 5028U19 | |
C57BL/6J Mice | The Jackson Labs | 000664 | |
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Glas-Col Tissue Homogenizing System | Cole-Parmer | UX-04369-15 | |
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Leupeptin | American Bio | AB01108 | 1 mg/mL in diH2O |
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Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | American Bio | AB01620 | |
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