Summary
Bu protokol, fare beyninden son derece saf sinaptozomlar, sinaptik veziküller ve diğer sinaptik fraksiyonları elde etmek için sağlam ve ayrıntılı bir yöntem sunar. Bu yöntem, protein lokalizasyonunun ve fonksiyonunun kompartmanlı çözünürlükle biyokimyasal analizi de dahil olmak üzere sinaptik süreçlerin değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Sinaptik terminaller nöronal iletişimin birincil bölgeleridir. Sinaptik disfonksiyon, birçok nöropsikiyatrik ve nörolojik bozukluğun ayırt edici özelliğidir. Bu nedenle, sinaptik alt bölmelerin biyokimyasal izolasyon ile karakterizasyonu, hem sağlıkta hem de hastalıkta sinaptik süreçlerin moleküler temellerini aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir. Bu protokol, sinaptik terminallerin ve sinaptik alt bölmelerin hücre altı fraksiyonasyon ile fare beyinlerinden izole edilmesini açıklar. İlk olarak, sinaptozomlar olarak bilinen kapalı sinaptik terminal yapılar, beyin dokusu homojenizasyonunu takiben izole edilir. Sinaptozomlar, sıkışmış ve kapatılmış membranlara sahip nöronal sinaptik öncesi ve sonrası bölmelerdir. Bu yapılar metabolik olarak aktif bir durumu korur ve sinaptik yapı ve işlevi incelemek için değerlidir. Sinaptozomlar daha sonra sinaptik veziküller, sinaptik sitosol ve sinaptik plazma membranı için zenginleştirilmiş sinaptik alt bölmeler elde etmek için hipotonik lizise ve ultrasantrifüjlemeye tabi tutulur. Fraksiyon saflığı, elektron mikroskobu ve subsinaptik bölmelere özgü proteinler için biyokimyasal zenginleştirme analizi ile doğrulanır. Sunulan yöntem, sinapsın yapısal ve fonksiyonel özelliklerini ve çeşitli beyin bozukluklarının moleküler etiyolojisini incelemek için basit ve değerli bir araçtır.
Introduction
Sinapslar, nöronların çeşitli ve zarif bir şekilde karmaşık işlevleri yerine getirdiği ve uyguladığı beynin temel hesaplama birimleridir. Sinapslar, bu nedenle, beynin sağlığı için temeldir1; sinaptik disfonksiyon birçok bozukluğun kaynağı veya sonucu olarak rol oynar2. Sinapslar, sinaptik yapışma molekülleri tarafından geçilen sinaptik bir yarıkla yakından yerleştirilen ve ayrılan iki farklı nöronun uzantıları olan sinaptik öncesi ve sonrası terminallerden oluşur. Bilgi, sinaptik bölme öncesinden sonrasına kadar, nörotransmiterler1 adı verilen kimyasal haberciler şeklinde akar. Nörotransmisyonda yer alan moleküler süreçler aktif araştırma alanlarıdır 3,4,5. Sinaptik terminallerdeki patojenik süreçleri ve sinapsların diğer nöronal alt bölmelerdeki patolojiye tepkisini anlamak, beyin bozukluklarını ele almak için çok önemli adımlardır 1,2. Ağırlıklı olarak murin modellerine uygulanan çeşitli metodolojik ilerlemeler, bu arayışıilerletmiştir 6. Diferansiyel santrifüjleme ile sinaptik fraksiyonların izolasyonu, sağlık ve hastalıkta sinaptik süreçlerin ayrıntılı olarak değerlendirilmesini sağlayan paradigma değiştiren bir yöntemdir.
Yetişkin insan beyni 80-90 milyar nörondan oluşur 7,8. Murin türleri arasında, sıçan beyni yaklaşık ~ 200 milyon nöron içerirken, fareler ~ 70 milyon 9,10'a sahiptir. Her nöron, glial hücreler ve yoğun vaskülatür ile karışmış yüksek polarize nöronlardan oluşan bir ağ ile binlerce spesifik sinaptik bağlantı oluşturur. Böyle karmaşık ve heterojen dokularda, bir zamanlar sinapsları bağımsız bir sistem olarak izole etmek ve incelemek düşünülemezdi. 1960'larda, Victor Whittaker, Catherine Hebb ve diğerleri, hücre altı fraksiyonasyonu11,12,13,14 kullanarak bozulmamış sinaptik terminalleri izole ederek bunu mümkün kıldı. Sinaptik vezikülleri (SV'ler) izole etme girişiminde, beyinleri izo-ozmotik (0.32 M) sakarozda sıvı kesme kuvveti ve ardından ultrasantrifüjleme yoluyla homojenize ettiler. Sıkışmış, plazma zarı ile kaplı, sağlam sinir terminalleri veya varisler elde ettiler ve bunlara sinir sonu parçacıkları (NEP'ler) adını verdiler11,13. Sinapsın yapısal ve fonksiyonel özellikleri bu yapılarda korunduğundan, NEP'ler daha sonra diğer hücre altı organellerle uyum için "sinaptozomlar" olarak adlandırıldı13,15. "Sinaptik vezikül" terimini icat eden Eduardo de Robertis ve meslektaşlarının çalışmalarının, Whittaker ve meslektaşlarınınkiyle örtüştüğünü ve "sinaptozom" izolasyonunun ve karakterizasyonunun doğrulanmasına katkıda bulunduğunu belirtmek gerekir16,17,18.
Sinaptozomlar, nörotransmitterlerin depolanması, salınması ve geri alımı için gerekli tüm hücresel ve moleküler özellikleri içeren fizyolojik olarak aktif yapılardır13,18. Anahtar sinaptik özelliklerin in vitro olarak korunması ve sinaptik olmayan bileşenlerden özgürlük de bu izolasyon yönteminin yararlılığına katkıda bulunur. Sinaptozomlar, nörotransmisyonun kimyasal ve fizyolojik özelliklerinin anlaşılmasına büyük katkıda bulunmuştur ve şimdi sinaptik moleküler süreçleri ve bunların hastalıktaki değişikliklerini incelemek için kullanılmaktadır 19,20,21,22,23. Sinaptozomlar ayrıca SV'ler, klatrin kaplı veziküller (CCV'ler), sinaptik sitosol, sinaptik plazma zarı, sinaptik mitokondri, sinaptik adezyon molekülleri ve sinaptik fonksiyonun moleküler mekanizmalarının anlaşılmasını kolaylaştırabilecek diğer ilgili bileşenler gibi sinaptik bileşenleri izole etmek için ilk kaynak materyaldir 18,19,20,24,25,26, 27,28. Bu subsinaptik bileşenler, sinaptozomların ozmotik lizisi ve sakkaroz yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme15,29 ile elde edilebilir. Whittaker'ın araştırma grubu tarafından orijinal hücre altı fraksiyonasyon yönteminin kaliteli sinaptozomların ve SV'lerin 13,30'un izole edilmesinde etkili olduğu bilinmesine rağmen, son optimizasyonlar hücre altı fraksiyonların saflığını arttırmaktadır22,23,31,32. Bu makale, sinaptozomları, SV'leri ve diğer alt sinaptik bileşenleri izole etmek için murin beyin dokusunun hücre altı fraksiyonasyonu için klasik bir protokolün oldukça ayrıntılı ve erişilebilir bir versiyonunu sunmaktadır.
Protocol
Farelerle yapılan tüm deneyler, Yale Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı (Protokol 2021-11117) ve Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş bir tesiste gerçekleştirildi. Hayvan bakımı ve barınma, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu33 ile uyumlu olup, Yale Hayvan Kaynak Merkezi (YARC) tarafından sağlanmıştır. Hayvanlar, yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu. Aşağıdaki protokol için genotip veya koşul başına beş ila sekiz fare veya iki ila dört sıçan gereklidir. Daha büyük beyin hacimleri nedeniyle daha az sıçan gereklidir. Benzer şekilde, deney hayvanlarının yaşı fraksiyon verimini etkileyebilir; 2 aydan daha kısa yaşlar için ek fareler gerekebilir. Aksi takdirde, özetlenen prosedürler hem murin türleri hem de her yaştan sağlıklı yetişkin hayvanlar için geçerlidir. Bu çalışmada sunulan temsili veriler, ticari bir kaynaktan elde edilen vahşi tip (C57BL / 6J) fareleri (yaş = 2 ay; replikasyon başına dört erkek ve dört dişi) kullanmıştır (bkz.
1. Deneysel hazırlık
NOT: Bu protokol, tek bir araştırmacının tamamlaması için ~ 11 saat gerektirir. Masaüstü kurulumunun (Şekil 1), tampon hazırlamanın (Tablo 1), santrifüjlerin ve rotorların 4 °C'ye kadar ön soğutmasının ve gerekli malzeme ve ekipmanların toplanması ve etiketlenmesinin (bkz.
Resim 1: Masaüstü kurulum. Beyin diseksiyonlarından önce, (A) Sıçrama cam homojenizatörleri ve (B) tüm tamponlar buz üzerinde soğutuldu. (C) Proteaz inhibitörü stok çözeltileri buz üzerinde çözüldü. Santrifüj tüpleri için ikinci bir ıslak buz kabı, sıvı azot Dewar (gösterilmemiştir) ve (D) sıvı azotta flaş dondurulmuş numunelerin kısa süreli depolanması için bir kuru buz kabı elde edilmiştir. (E) Mikrosantrifüj tüpleri tüm numuneler için önceden etiketlenmiştir, çünkü bu prosedür sırasında genotip veya durum başına her bir hücre altı fraksiyon örneğinin dört alikotu toplanmıştır (zaman kazandıran ipucu: deney yapılmadan bir gün önce tüm tüpleri iyice etiketleyin). (F) Uygun bir biyolojik tehlike atık kabı, (G) %70 etanol, (H) cerrahi aletler ve (I) emici bir yüzey pedi. Gerekli santrifüj tüpleri ve tek kullanımlık malzemeler, protokol uygulaması sırasında verimli erişim için ayrılmıştır (gösterilmemiştir). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Masaüstü tezgahı ameliyat için hazırlayın ve beyin eksizyonu için gerekli makas ve forsepsleri toplayın (bkz. Fare kuyruğu biyopsileri için 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve toplanan fraksiyon başına dört tüp için ön etiket, Şekil 2'de belirtildiği gibi.
- İki kap ıslak buz, bir kap kuru buz ve bir tezgah üstü sıvı azot Dewar şişesi elde edin.
- Buz üzerinde fenilmetilsülfonil florür (PMSF), pepstatin A, aprotinin ve leupeptin stok çözeltilerini çözün (bkz. Gerekli tamponları hazırlayın (Tablo 1).
NOT: Sakkaroz çözeltileri önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir. Bununla birlikte, proteaz inhibitörleri (çözülmüş stoklar ve tabletler), bu reaktiflerin sulu çözeltilerdeki kararsızlığı nedeniyle deneyin başlangıcında tüm tamponlara taze olarak eklenmelidir. Ayrıca, bozulmamış sinaptozomların toplanmasını sağlamak için tüm tamponlar deterjansız cam eşyalar ve deterjansız su ile hazırlanmalıdır. - Tüm tamponları ve cam Sıçrama homojenizatörlerini (bakınız Malzeme Tablosu) buz üzerinde soğutun. Santrifüjleri 4 °C'ye ayarlayın ve rotorları 4 °C'ye soğutun.
- Buz üzerindeki bir Sıçrama homojenizatörüne 14 mL Tampon A (Tablo 1) ekleyin.
Tablo 1: Hücre altı fraksiyonasyon tamponlarının bileşimi. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Hücre altı fraksiyonasyon protokolüne genel bakış. Hücre altı fraksiyonasyon adımlarının ve toplanan örneklerin özet şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Fare beyin eksizyonu
Şekil 3: Kraniofasiyal anatomi . (A) İlgili kranial yapıları belirtilmiş bir fare kafatasının dorsal görünümü. (B) İlgili kafatası yapıları ve anatomik yönleri belirtilmiş bir fare kafatası ve beyninin sol yanal görünümü. Kesikli çizgiler kesilerin yapılması gereken yerleri temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Açık damla yöntemi34 kullanarak her fareyi bir duman davlumbazında veya biyogüvenlik kabininde bulunan bir anestezi odasında% 100 izofloran ile derinlemesine anestezi altına alın. Her fareyi servikal omurga çıkığı ve ardından hızlı bir şekilde kafa kesme ile feda edin. Her kurban ve diseksiyon için genotipler veya deney grupları arasında geçişyapın 12. Ötenazi sonrası distal kuyruk ucunun 2 mm'sini ince makasla eksize ederek kuyruk biyopsileri alın. Genotipleme için dokuyu saklayın.
- Diseksiyon sırasında saçların dokuya ve cerrahi aletlere yapışmasını önlemek için kafası kesilmiş kafaya% 70 etanol püskürtün.
- Dekapitasyon insizyonunda derinin altına perikraniyal derinliğe kadar ince makas yerleştirin ve kafa derisini kafatasından geri çekmek için internazal dikişe kadar bir midsagital kesi yapın (Şekil 3A).
- Oksipital alandan her bir zamansal yöne doğru çalışarak, kafatasının dış yüzeyini her bir dış akustik meatusun ötesinde ortaya çıkarmak için fasyayı ve kası kesin (Şekil 3B).
- Kafatasının kafa derisini ve rostral yönünü baskın olmayan el ile sabitleyin. Diğeriyle, omuriliğin çıkışının görülebildiği foramen magnumunun kaudal tarafına 2 mm ince makas yerleştirin. Makas intraparietal kemiğin iç yüzeyine ulaşana kadar orta hat kesisi yapın (Şekil 3; kesikli çizgiler).
NOT: İlk kesi sırasında, beyin sapı ve beyincik hasarını önlemek için makas, kafatasının iç yüzeyine doğru uygulanan basınçla omuriliğe paralel olmalıdır. - Makasın açısını değiştirin, böylece bıçaklar kafatasının sırt yüzeyine paralel olarak çalışır. Sagital ve interfrontal sütürleri kılavuz olarak kullanarak midsagital insizyonu parietal ve frontal kemiklerden rostral olarak ilerletmeye devam edin. Korteksin zarar görmesini önlemek için sabit yukarı doğru basınç kullanın. İnsizyonu internazal sütürün hemen ötesinde sonlandırın (Şekil 3A).
- Makası kafatasına dik olarak yerleştirerek ve her bir bıçak nazal-premaksiller sütüre yerleştirilmiş olarak burun kemiğine küçük bir dik kesi (~3 mm), burun kemiğine rostral (~3 mm) yapın ve bir tanesini eşit şekilde kesinti yapın (Şekil 3; kesikli çizgiler).
NOT: Bu adım, kafatasını geri çekme kolaylığını artıracak ve bu alan ilgi çekiciyse, koku alma ampulünün toplanması için kritik öneme sahip olacaktır. - Rostral yönü güvence altına alırken, kafatasını beyinden nazikçe yukarı kaldırmak için bir çift dokulu forsepsin bir tarafını kullanın, daha sonra yanal ve ventral. Gerektiğinde orta hat boyunca, ardından tüm beyin yüzeyi açığa çıkana kadar diğer yarımküre için tekrarlayın.
- Kavisli forseps veya ince bir spatula kullanarak, beynin rostral tarafını yavaşça kaldırın. Kafatasından eksizyonu tamamlamak için optik ve kraniyal sinirleri kesin.
- Her koşul için, beş ila sekiz fare beynini 14 mL Tampon A içeren soğutulmuş cam Zıplama homojenizatöründe bir araya toplayın (Tablo 1).
3. Sinaptozom preparatı
NOT: Bu yordamın şemaları Şekil 4'te gösterilmiştir.
Şekil 4: Sinaptozom preparatı. Adım 3'ün şeması, sinaptozomların oluşumu (P2'). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- 500 rpm'de (toplam) 12 yukarı-aşağı geçişte bir cam Sıçrama homojenizatörü kullanarak beyinleri homojenize edin. Dokunun tam homojenizasyonunu sağlamak için her aşağı vuruşta kısa bir süre duraklayın. Isınmayı ve protein denatürasyonunu önlemek için tercihen bir buz banyosunda homojenize edin. Biskinkoninik asit testi ile protein konsantrasyonu tayini için 5 μL alikot alın (BCA, bakınız Malzeme Tablosu). Batı lekesi (WB) için 100 μL bütün beyin lizat alikotlarını alın. Bu ve sonraki tüm örnekler için (Şekil 2), BCA için iki alikot ve WB için iki alikot alın. Toplanan tüm alikotları sıvı azotta flaşla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
- Süpernatantı (S1) elde etmek için toplam beyin homojenatını 800 x g'de 800 x g'de yüksek hızlı yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpünde (14 mL) döndürün (Malzeme Tablosuna bakınız). S1'i yeni bir santrifüj tüpüne aktarın ve peleti sağlam hücreler ve çekirdekler içeren (P1) geride bırakın. Kabarık, beyaz, gevşek, yüzeysel peleti pipetlemekten kaçının. BCA için 2 x 5 μL S1 ve WB için 2 x 100 μL S1 alın.
- Sinaptozomal süpernatant (S2) ve ham sinaptozom peleti (P2) elde etmek için S1'i 9.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika boyunca döndürün. BCA için 2 x 10 μL S2 ve WB için 2 x 500 μL S2 alın. Alikotları elde ettikten sonra süpernatantı atın ve pelet ile bir sonraki adıma geçin.
- P2'yi 3 mL buz gibi soğuk Tampon A'da proteaz inhibitörleri ile yeniden askıya alın ve süpernatant (S2') ve yıkanmış sinaptozomları (P2') elde etmek için 4 ° C'de 15 dakika boyunca 9.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti saklayın.
- P2'yi 3 mL'lik Tampon A'da yeniden askıya alın Esas olarak mitokondri içeren peletin altındaki koyu kırmızı kısmı yeniden askıya almaktan kaçının. BCA için 2 x 20 μL P2' ve WB için 2 x 100 μL P2' alın.
NOT: Bu, beyaz yıkanmış sinaptozomları yeniden askıya almak için peletin kenarlarını ve yüzeyini hafifçe pipetle karıştırarak ve pipet ucunu peletin kırmızı merkezinden uzağa yönlendirerek elde edilebilir.
4. Hipotonik lizis
NOT: Bu yordamın şemaları Şekil 5'te gösterilmiştir.
Şekil 5: Hipotonik lizis. Adım 4'ün şeması, lizis süpernatantı (LS1) ve sinaptozomal membran fraksiyonlarını (LP1) üretmek için sinaptozomların hipotonik lizisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Yıkanmış sinaptozomların hipotonik lizisi için, yeniden askıya alınmış P2'ye (~ 27 mL) 9 hacim soğutulmuş Tampon B (Tablo 1) ekleyin. Bir cam Zıplama homojenizatöründe sinaptozomları homojenize edin (500 rpm'de üç yukarı-aşağı geçiş).
- Numuneleri 50 mL kapaklı konik santrifüj tüplerine aktarın. Bunları 4 °C soğuk odada 15 dakika boyunca bir tüp tabanca üzerinde döndürün.
- Lizis süpernatanı (LS1) ve sinaptozomal membranlar içeren lizis peletini (LP1) elde etmek için 4 °C'de 20 dakika boyunca 25.000 x g'de P2' lisine santrifüj yapın. BCA için 2 x 50 μL LS1 ve WB için 2 x 400 μL LS1 alın. LS1'i ultrasantrifüjleme için kapaklı bir santrifüj tüpüne aktarın (bkz.
5. Sinaptik vezikül izolasyonu
NOT: Bu yordamın şemaları Şekil 6'da gösterilmiştir.
Şekil 6: Sinaptik vezikül izolasyonu ve sinaptik plazma membran izolasyonu. (A) Adım 5'in şeması, sinaptik sitosol (LS2) ve sinaptik vezikül (LP2) fraksiyonlarının izolasyonu ve (B) adım 6, sakkaroz gradyanlarının ultrasantrifüjasyonunu takiben miyelin (MF), sinaptik plazma membranı (SPM) ve mitokondriyal (Mito.) fraksiyonların oluşumu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- LS1'i sabit açılı ultrasantrifüj rotorunda (bakınız Malzeme Tablosu) 100.000 x g'de 4 °C'de 60 dakika boyunca sinaptik sitozol süpernatant (LS2) ve sinaptik vezikül pelet (LP2) elde etmek için santrifüj yapın. LP2 küçük, yarı saydam olacak ve santrifüj tüpünün yanına kuvvetlice yapışacaktır.
- LP2'yi 500 μL Tampon A'da yeniden askıya alın 23 G'lik bir iğne ve 1 mL'lik bir şırınga kullanarak, LP2'yi nazik tritürasyonla kesin. BCA için 2 x 10 μL LP2 ve WB için 2 x 250 μL LP2 alın.
- LS2'yi (~30 mL) 10 kDa kesimli santrifüj filtre ünitelerine aktarın (bkz.
NOT: 10 kDa'dan küçük proteinler ilgi çekiciyse, 4 kDa kesme santrifüj filtre ünitesi mevcuttur, ancak daha uzun sıkma sürelerine neden olur. - LS2'yi 4 °C'de 1 saate kadar 5000 x g'de döndürerek yaklaşık 0,5 mL'ye konsantre edin. BCA için 2 x 10 μL konsantre LS2 ve WB için 2 x 250 μL konsantre LS2 alın. Döndürmeye başladıktan sonra, doğrudan adım 6.1'e geçin.
6. Sinaptik plazma membran izolasyonu
- LP1'i (adım 4.3) 1 mL Tampon B'de yeniden askıya alın (Tablo 1). BCA için 2 x 10 μL LP1 ve WB için 2 x 50 μL LP1 alın. Kalan LP1'i Tampon B ve Tampon C ile 7,5 mL'lik bir son hacme ve 1,1 M'lik bir son sakkaroz konsantrasyonuna ayarlayın (Tablo 1).
- 7,5 mL yeniden asılı LP1'i 14 mL'lik ultrasantrifüj tüpe aktarın (bkz. LP1'i 3,75 mL Tampon D (Tablo 1) ile dikkatlice kaplayın ve ardından 1,25 mL Tampon A (veya santrifüj tüpünün üst kısmının hemen altına doldurulacak daha büyük bir hacim) ile bindirin. Tüpün yan tarafını pipetlemekten kaçının, bu da sakkaroz gradyan arayüzlerini bozacaktır. Her sakkaroz fraksiyonunu üst üste koyduktan sonra, çözeltinin üstünü bir kalemle işaretleyin. Ultra santrifüjleme için tüpleri hacme göre değil, ağırlığa göre dengeleyin, Tampon A'nın damla damla 10 mg'a eklenmesiyle. Sallanan bir kova ultrasantrifüj rotorunda 4 °C'de 2,5 saat boyunca 48.000 x g'de santrifüj yapın (bkz.
- Her bir sakkaroz arayüzünün farklılığını ve fraksiyonasyonun başarısını belgelemek için ultrasantrifüjlemeyi takiben bozulmamış gradyanların görüntülerini elde edin.
- 320 mM sakkarozun yüzeysel tabakasını dikkatlice çıkarın (Tampon A). Miyelin fraksiyonunu (MF) 320 mM/855 mM sakkaroz arayüzünde 800 μL hacimde geri kazanın. Sinaptik plazma membranı (SPM) fraksiyonunu 855 mM/1.1 M sakkaroz arayüzünde 1.000 μL hacimde geri kazanın. Tam fraksiyonun toplanmasını sağlamak için her fraksiyonu tüpün duvarından dairesel bir şekilde yukarı doğru pipetleyin. Kalan sakarozu dikkatlice aspire edin ve 200 μL Tampon B'de yeniden askıya alarak mitokondriyal peleti (Mito.) geri kazanın. BCA için 2 x 100 μL MF ve 2 x 10 μL Mito alın. BCA için; MF ve Mito'nun geri kalanını bölün. WB için örnekler yarıya indirilmiştir.
- SPM fraksiyonunu 2 hacimli Tampon B (~2 mL) ile seyreltin ve ardından sabit açılı bir rotorda 3,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde ( bkz. Malzeme Tablosu) 25.000 x g'de 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve SPM peletini 250 μL'lik son bir hacim için Tampon A'da yeniden askıya alın. BCA için 2 x 5 μL SPM alın ve kalan SPM'yi WB için ikiye bölün.
- Her numunenin protein konsantrasyonunu belirlemek için değişken aliquot hacmini hesaba katan bir BCA gerçekleştirin.
NOT: WB analizi için, tüm hücre altı fraksiyonlar için önerilen çalışma proteini konsantrasyonu 2 μg / μL'dir (veya LS1 ve MF için elde edilebilecek kadar yüksek).
Representative Results
Sunulan yöntem, daha fazla saflaştırmaya ve çeşitli aşağı akış analizi biçimlerine maruz bırakılabilen 11 beyin hücre altı fraksiyonu ile sonuçlanır35,36. Sinaptozomların, SV'lerin23'ün ve diğer bileşenlerin kalitesini değerlendirmek için altın standart yöntem elektron mikroskobudur (EM) (Şekil 7). Spesifik hücre altı fraksiyonlarda bulunan proteinler için kantitatif immünoblotlama, fraksiyon saflığının belirteçlerini değerlendirmek için de yapılabilir (Şekil 8). Örneğin, fraksiyonların immünoblot analizi, sinaptik plazma membran fraksiyonunda (SPM) N-kadherinin (CDH2, UniProt adı), sinaptik sitozolde (LS2) α-sinükleinin (SYUA), sinaptik vezikül fraksiyonunda (LP2) sinaptik vezikül fraksiyonunda (LP2) siaptofizin (SYPH) ve miyelin fraksiyonundaki (MF) miyelin bazik proteininin (MBP) ilk tüm beyin homojenatındaki (Toplam) protein seviyeleriyle karşılaştırıldığında zenginleştiğini ortaya koymaktadır (Şekil 8 ). Fraksiyon saflığı belirlendikten sonra (örneğin, LS2 fraksiyonunda CDH2'nin yokluğuna veya LP2 fraksiyonunda SYPH'deki çok kat artışa dikkat edin), ilgilenilen proteinlerin lokalizasyonunu belirlemek veya genotipler veya tedaviler arasındaki protein dağılımındaki farklılıkları sorgulamak için kantitatif immünoblotlama kullanılabilir. Sinaptik proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu anlamak, daha önce tanımlanmamış protein fonksiyonlarının diseksiyonunu sağlayabilir. Ayrıca, bu yöntem, özellikle fonksiyonel tahlillerle eşleştirildiğinde, hastalık durumlarındaki kaçakçılık kusurlarını veya sinaptik işlev bozukluğunu açıklığa kavuşturabilir. Örneğin, ekibimiz bu yöntemi, sinaptik sitosol19'da zenginleştirilmiş enzimatik olarak aktif palmitoil proteini tiyoesteraz 1 havuzunu tanımlamak için kullandı.
Şekil 7: Sinaptozomların elektron mikroskobu (EM). (A) Sinaptik veziküller (ok) içeren bir sinaptozomun temsili EM görüntüsü. (B) Hem sinaptik öncesi (ok) hem de sonrası sinaptik bileşenlere (çift ok) sahip bir sinaptozomun temsili EM görüntüsü. (C) Sinaptik veziküller ve bir mitokondri (ok) içeren bir sinaptozomun temsili EM görüntüsü (ölçek çubukları = 100 nm). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Hücre altı fraksiyonların immünoblot analizi. (A) Hücre altı fraksiyon saflığının belirteçleri (UniProt terminolojisi ile belirtilir), tüm beyin homojenatına (toplam) kıyasla uygun şekilde lokalize edilir: Sinaptik plazma membran fraksiyonunda (SPM) N-kadherin (CDH2), sinaptik vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonda (LP2) sinaptik vezikülde (LP2) α sinaptojenin (SYUA) sinaptik sinükleinde (SYUA), sinaptik sitosolda (LS2) sinaptofil 1 (SYPH) ve sinaptojanin 1 (SYNJ1), ve miyelin fraksiyonunda (MF) miyelin bazik proteini (MBP). (B) İmmünoblot nicelleştirme analizi, fraksiyon saflık belirteçlerinin zenginleşmesini (toplamdan katlama değişimi) ortaya çıkarır. Veriler, log10 ölçeğinde ortalama ± standart sapma olarak gösterilir. Noktalı çizgi 1,5 kat değişimi gösterir (y = 0,176) (n = 3 8 vahşi tip fare ile deneyleri çoğaltır; yaş = 2 ay; SYPH, SYUA, MBP için n = 4-5 leke, daha önce Gorenberg ve ark.19 tarafından yayınlanan n = 3 çizilmiş değerle; SYNJ1 için n = 5; CDH2 için n = 1). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Seminal çalışmalarında, Whittaker ve meslektaşları sinaptozomları tanımlamak için dört morfolojik kriter kullandılar: (1) yapılar kapalı bir plazma zarına sahiptir; (2) yapılar, sinir terminallerindekilere benzeyen SV'ler ve boyut ve sayı olarak in situ varisler içerir; (3) Yapıların bir veya daha fazla küçük mitokondriye sahip olması; ve (4) presinaptik membran sıklıkla sinaptik bir post-sinaptik bileşene yapışır11,12,13. İlk iki kriter genellikle her izolasyon yöntemi için geçerli olsa da, bu makalede açıklanan en son protokollerde, ortaya çıkan tüm sinaptozomlarda mitokondri ve bağlı post-sinaptik terminaller olmayacaktır. Sinaptozomların yaklaşık% 60'ında mitokondri olacaktır ve sadece% 15'ine kadarının sinaptik sonrası terminallere bağlı olduğu tahmin edilmektedir37. Post-sinaptik bileşenler özellikle ilgi çekiciyse, zenginleştirme için izotonik Krebs benzeri homojenizasyon tamponunun ve basınç filtrasyonunun kullanılmasının, post-sinaptik terminallerle (sinaptonörozomlar olarak da adlandırılır) yüksek konsantrasyonlarda sinaptozomlar ürettiği bilinmektedir22,38.
Hayvanı kurban etme yöntemi, sinaptozomların ve sinaptik alt fraksiyonların kalitesini etkileyebilir. Anestezi gerektirmeyen bir ötenazi yöntemi kullanılarak kurban edilen yetişkin hayvanlar, en iyi fraksiyon kalitesi ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, beyinler taze olarak diseke edilmeli, dondurulmamalı ve en uygun sinaptik fraksiyonlar için 1:10 oranında homojenizasyon tamponu (ağırlık / hacim) kullanılarak homojenize edilmelidir22. Beyin, taşıdıkları nörotransmiterlerin türüne göre ayırt edilebilen heterojen bir sinaps popülasyonuna sahiptir. Sinaptozom oluşumu genellikle sinaps tipi veya nörotransmitter içeriğinden etkilenmez13. Bunun bir istisnası, beynin geri kalanından sinaptozomlar elde etmek için en uygun koşullarda bozulduğu bilinen beyincikteki yosunlu liflerdir39,40. Bu nedenle, beyin homojenizasyonundan önce beyinciğin çıkarılması, bu bölgenin dışlanması deneysel hedefi etkilemiyorsa önerilir. Belirli bir nörotransmitter karakterinin sinaptozomlarını izole etmekle ilgileniyorsanız, beynin ilgilenilen nörotransmitteri içeren nöronlar için zenginleştirilmiş alanları ilk önce izole edilebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, ilgilenilen bölgenin büyüklüğüne bağlı olarak nihai kesir verimine sınırlamalar getirecektir (bu nedenle hayvanların yaşı da dikkate alınmaktadır). Nörotransmittere özgü sinaptozomların izolasyonu için immünokimyasal yöntemler vardır, ancak canlılık ve verim önemli ölçüde tehlikeye girecektir22. Sinaptozomun metabolik canlılığını değerlendirmek önemliyse, nörotransmitter salınımının ölçümü 41,42 veya bazı enzimatik testler43 kullanılabilir.
Sinaptozom preparatlarındaki yaygın kirleticiler arasında mikrozomlar, serbest mitokondri, SV'ler ve nöronal ve glial membranlar bulunur. Kontaminasyon, P1 ve P2fraksiyonlarındaki yıkama sayısını artırarak ve sonraki adımlarda kırmızı mitokondriyal peletin yeniden süspansiyonundan kaçınarak azaltılabilir. Metabolik canlılığın ve zamanın çok önemli olduğu deneylerde, yıkama sayısının azaltılması ve sakkaroz gradyanları üzerinde Ficoll veya Percoll gradyanlarının kullanılması 44,45,46 yardımcı olacaktır. Bu yöntemler aynı zamanda kontaminasyonu önemli ölçüde azaltır. Whittaker'ın orijinal protokolü yüksek kaliteli SV'ler verdi. Bu yönteme dahil edilen Nagy ve ark.23 tarafından yapılan daha ileri optimizasyon, verim36'dan önemli ölçüde ödün vermeden olağanüstü homojenlik ve saflığa sahip SV'ler üretmektedir. Glutamaterjik (VGLUT-1-içeren) veya GABAerjik (VGAT-1-içeren) SV'ler gibi spesifik SV alt tipleri ilgi çekiciyse, spesifik antikorlar kullanılarak immünoizolasyonyapılabilir 47,48. CCV'leri, diferansiyel yoğunluk nedeniyle, bu yöntemle elde edilen SV'lerle aynı arayüzde bulunmayabilecek sinaptozomlardan izole etmek için alternatif yöntemler de mevcuttur20,49,50.
Genel olarak, sinaptik bileşenleri izole etmek için mevcut protokol, kaynak beyin dokusunun kalitesine ve miktarına ve deneysel hedeflere bağlı olarak geliştirilmiş homojenlik ve canlılığa sahip fraksiyonlar elde etmek için daha da optimize edilebilir. Daha fazla sorun giderme ayrıntısı için, Dunkley ve Robinson22 ve Ganzella ve ark.36'nın kitap bölümlerine başvurulmalıdır.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
EM görüntü hazırlığı için P. Colosi'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), Amerika Birleşik Devletleri Savunma Bakanlığı (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), Parkinson (ASAP) İşbirlikçi Araştırma Ağı (SSC) ve Michael J. Fox Vakfı Hedef İlerleme Programı (MJFF-020160, SSC ve VDJ) Genelinde Bilimi Hizalamak. BioRender.com kullanarak grafiksel illüstrasyonlar oluşturduk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309649 | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | |
| 14 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube | Beckman Coulter | 344060 | Compatible with SW 40 Ti |
| 23 Gauge Precision Glide Hypodermic Needle | BD | 305145 | |
| 26.3 mL, Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | Compatible with Ti70 |
| 3.5 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube | Beckman Coulter | 349623 | Compatible with TLA-100.3 |
| 50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901024 | |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | 1 mg/mL in diH2O |
| Avanti J-26 XP Centrifuge | Beckman Coulter | B22984 | <26,000 rpm |
| Benchtop HDPE Dewar Flask | Thermo Scientific | 5028U19 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Labs | 000664 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | EP022628168 | <14,000 rpm |
| complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11873580001 | Add 1 tablet per 50 mL of solution |
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
| Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 8r | |
| Glas-Col Tissue Homogenizing System | Cole-Parmer | UX-04369-15 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
| High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 3117-0500 | Compatible with JA20 |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
| JA-20 Rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Leupeptin | American Bio | AB01108 | 1 mg/mL in diH2O |
| N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | American Bio | AB00892 | |
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <100,000 rpm | |
| Optima TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <120,000 rpm | |
| Pepstatin A | Thermo Scientific | 78436 | 1 mg/mL in DMSO |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | American Bio | AB01620 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23335 | For determination of protein concentration |
| Pipette Tips | |||
| Serological Pipettes | |||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| SW 40 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
| Teflon-Coated Pestle and Mortar Tissue Grinder | Thomas Scientific | 3431D94 | |
| Ti70 Rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| TLA-100.3 Rotor | Beckman Coulter | 349490 | |
| Tube Revolver | Dot Scientific | DTR-02VS |
References
- Synaptic Transmission. Principles of Neural Science, Fifth Edition. Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M., Siegelbaum, S. A., Hudspeth, A. J., Education, A. J. , McGraw-Hill Education. New York, NY. (2014).
- Lepeta, K., et al. Synaptopathies: synaptic dysfunction in neurological disorders - A review from students to students. Journal of Neurochemistry. 138 (6), 785-805 (2016).
- Südhof, T. C., Malenka, R. C. Understanding synapses: Past, present, and future. Neuron. 60 (3), 469-476 (2008).
- Südhof, T. C. The molecular machinery of neurotransmitter release (Nobel lecture). Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12696-12717 (2014).
- Jahn, R., Boyken, J. Molecular Regulation of Synaptic Release. Neuroscience in the 21st Century: From Basic to Clinical. Pfaff, D. W. , Springer. New York. New York, NY. 351-401 (2013).
- Xiong, H., Gendelman, H. E. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York. New York, NY. (2014).
- Azevedo, F. A., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. Journal of Comparative Neurology. 513 (5), 532-541 (2009).
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 10661-10668 (2012).
- Herculano-Houzel, S., Lent, R. Isotropic fractionator: A simple, rapid method for the quantification of total cell and neuron numbers in the brain. Journal of Neuroscience. 25 (10), 2518-2521 (2005).
- Herculano-Houzel, S., Mota, B., Lent, R. Cellular scaling rules for rodent brains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (32), 12138-12143 (2006).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. Journal of Anatomy. 96, 79-88 (1962).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of synaptic vesicles from the central nervous system. Journal of Physiology. 153, 35-37 (1960).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. Journal of Neurocytology. 22 (9), 735-742 (1993).
- Jahn, R., Fasshauer, D. Molecular machines governing exocytosis of synaptic vesicles. Nature. 490, 201-207 (2012).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes). Biochemical Journal. 90 (2), 293-303 (1964).
- De Robertis, E., Rodriguez De Lores Arnaiz, G., Pellegrino De Iraldi, A. Isolation of synaptic vesicles from nerve endings of the rat brain. Nature. 194, 794-795 (1962).
- De Robertis, E., Pellegrino De Iraldi, A., Rodriguez, G., Gomez, C. J. On the isolation of nerve endings and synaptic vesicles. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (1), 229-235 (1961).
- Zimmermann, H., Whittaker, V. P. The Discovery of the Synaptosome and Its Implications. Synaptosomes. Murphy, K. M. , Springer. New York. New York, NY. 9-26 (2018).
- Gorenberg, E. L., et al. Identification of substrates of palmitoyl protein thioesterase 1 highlights roles of depalmitoylation in disulfide bond formation and synaptic function. PLoS Biology. 20 (3), 3001590 (2022).
- Vidyadhara, D. J., et al. Dopamine transporter and synaptic vesicle sorting defects initiate auxilin-linked Parkinson's disease. bioRxiv. , (2022).
- Schrimpf, S. P., et al. Proteomic analysis of synaptosomes using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry. Proteomics. 5 (10), 2531-2541 (2005).
- Dunkley, P. R., Robinson, P. J. Synaptosome Preparations: Which Procedure Should I Use. Synaptosomes. Murphy, K. M. , Springer. New York. New York, NY. 27-53 (2018).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Research. 109 (2), 285-309 (1976).
- Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
- Wagner, J. A., Kelly, R. B. Topological organization of proteins in an intracellular secretory organelle: the synaptic vesicle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (8), 4126-4130 (1979).
- Jahn, R., Schiebler, W., Ouimet, C., Greengard, P. A 38,000-dalton membrane protein (p38) present in synaptic vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (12), 4137-4141 (1985).
- Binotti, B., Jahn, R., Pérez-Lara, Á An overview of the synaptic vesicle lipid composition. Archives of Biochemistry and Biophysics. 709, 108966 (2021).
- Siegel, D. P., Ware, B. R. Electrokinetic properties of synaptic vesicles and synaptosomal membranes. Biophysical Journal. 30 (1), 159-172 (1980).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from disrupted nervending particles. Biochemical Pharmacology. 12 (3), 300-302 (1963).
- Clementi, F., Whittaker, V. P., Sheridan, M. N. The yield of synaptosomes from the cerebral cortex of guinea pigs estimated by a polystyrene bead "tagging" procedure. Zeitschrift für Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 72, 126-138 (1966).
- Carlson, S. S., Wagner, J. A., Kelly, R. B. Purification of synaptic vesicles from elasmobranch electric organ and the use of biophysical criteria to demonstrate purity. Biochemistry. 17 (7), 1188-1199 (1978).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. Journal of Cell Biology. 96 (5), 1374-1388 (1983).
- Hawkins, P., et al. A guide to defining and implementing protocols for the welfare assessment of laboratory animals: eleventh report of the BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW Joint Working Group on Refinement. Laboratory Animals. 45 (1), 1-13 (2011).
- Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. Open-drop anesthesia for small laboratory animals. Canadian Veterinary Journal. 53 (3), 299-302 (2012).
- Deutsch, C., Drown, C., Rafalowska, U., Silver, I. A. Synaptosomes from rat brain: Morphology, compartmentation, and transmembrane pH and electrical gradients. Journal of Neurochemistry. 36 (6), 2063-2072 (1981).
- Ganzella, M., Ninov, M., Riedel, D., Jahn, R. Isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Methods in Molecular Biology. 2417, 131-145 (2022).
- Dunkley, P. R., et al. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Research. 441 (1-2), 59-71 (1988).
- Schwartz, R. D., Skolnick, P., Hollingsworth, E. B., Paul, S. M. Barbiturate and picrotoxin-sensitive chloride efflux in rat cerebral cortical synaptoneurosomes. FEBS Letters. 175 (1), 193-196 (1984).
- Pittaluga, A., Thellung, S., Maura, G., Raiteri, M. Characterization of two central AMPA-preferring receptors having distinct location, function and pharmacology. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 349 (6), 555-558 (1994).
- Israël, M., Whittaker, V. P. The isolation of mossy fibre endings from the granular layer of the cerebellar cortex. Experientia. 21 (6), 325-326 (1965).
- Khvotchev, M., Lonart, G., Südhof, T. C. Role of calcium in neurotransmitter release evoked by alpha-latrotoxin or hypertonic sucrose. Neuroscience. 101 (3), 793-802 (2000).
- Lonart, G., Janz, R., Johnson, K. M., Südhof, T. C. Mechanism of action of rab3A in mossy fiber LTP. Neuron. 21 (5), 1141-1150 (1998).
- Nicholls, D. G., Sihra, T. S. Synaptosomes possess an exocytotic pool of glutamate. Nature. 321 (6072), 772-773 (1986).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nature Protocols. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Cotman, C. W., Matthews, D. A. Synaptic plasma membranes from rat brain synaptosomes: Isolation and partial characterization. Biochimica et Biophysica Acta. 249 (2), 380-394 (1971).
- Booth, R. F., Clark, J. B. A rapid method for the preparation of relatively pure metabolically competent synaptosomes from rat brain. Biochemical Journal. 176 (2), 365-370 (1978).
- Takamori, S., Riedel, D., Jahn, R. Immunoisolation of GABA-specific synaptic vesicles defines a functionally distinct subset of synaptic vesicles. Journal of Neuroscience. 20 (3), 4904-4911 (2000).
- Burger, P. M., et al. Synaptic vesicles immunoisolated from rat cerebral cortex contain high levels of glutamate. Neuron. 3 (6), 715-720 (1989).
- Blondeau, F., et al. Tandem MS analysis of brain clathrin-coated vesicles reveals their critical involvement in synaptic vesicle recycling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (11), 3833-3838 (2004).
- Maycox, P. R., Link, E., Reetz, A., Morris, S. A., Jahn, R. Clathrin-coated vesicles in nervous tissue are involved primarily in synaptic vesicle recycling. Journal of Cell Biology. 118 (6), 1379-1388 (1992).
