यह प्रोटोकॉल माउस मस्तिष्क से अत्यधिक शुद्ध सिनैप्टोसोम, सिनैप्टिक पुटिकाओं और अन्य सिनैप्टिक अंशों को प्राप्त करने के लिए एक मजबूत, विस्तृत विधि प्रस्तुत करता है। यह विधि सिनैप्टिक प्रक्रियाओं के मूल्यांकन को सक्षम बनाती है, जिसमें प्रोटीन स्थानीयकरण के जैव रासायनिक विश्लेषण और कंपार्टमेंटल रिज़ॉल्यूशन के साथ कार्य शामिल है।
सिनैप्टिक टर्मिनल न्यूरोनल संचार की प्राथमिक साइटें हैं। सिनैप्टिक डिसफंक्शन कई न्यूरोसाइकियाट्रिक और न्यूरोलॉजिकल विकारों की एक पहचान है। जैव रासायनिक अलगाव द्वारा सिनैप्टिक उप-डिब्बों का लक्षण वर्णन, इसलिए, स्वास्थ्य और रोग दोनों में सिनैप्टिक प्रक्रियाओं के आणविक आधारों को स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। यह प्रोटोकॉल उपकोशिकीय विभाजन द्वारा माउस दिमाग से सिनैप्टिक टर्मिनलों और सिनैप्टिक उप-डिब्बों के अलगाव का वर्णन करता है। सबसे पहले, सील सिनैप्टिक टर्मिनल संरचनाएं, जिन्हें सिनैप्टोसोम के रूप में जाना जाता है, मस्तिष्क के ऊतक होमोजेनाइजेशन के बाद अलग होते हैं। सिनैप्टोसोम न्यूरोनल प्री-और पोस्ट-सिनैप्टिक डिब्बे होते हैं जिनमें पिन-ऑफ और सील झिल्ली होती है। ये संरचनाएं चयापचय रूप से सक्रिय स्थिति बनाए रखती हैं और सिनैप्टिक संरचना और कार्य का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान हैं। सिनैप्टोसोम को तब सिनैप्टिक पुटिकाओं, सिनैप्टिक साइटोसोल और सिनैप्टिक प्लाज्मा झिल्ली के लिए समृद्ध सिनैप्टिक उप-डिब्बों को प्राप्त करने के लिए हाइपोटोनिक लाइसिस और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया जाता है। उप-सिनैप्टिक डिब्बों के लिए विशिष्ट प्रोटीन के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और जैव रासायनिक संवर्धन विश्लेषण द्वारा अंश शुद्धता की पुष्टि की जाती है। प्रस्तुत विधि सिनैप्स की संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं और विभिन्न मस्तिष्क विकारों के आणविक एटियलजि का अध्ययन करने के लिए एक सीधा और मूल्यवान उपकरण है।
सिनैप्स मस्तिष्क की बुनियादी कम्प्यूटेशनल इकाइयाँ हैं जिनके माध्यम से न्यूरॉन्स संचार करते हैं और विविध और उत्तम रूप से जटिल कार्य करते हैं। इस प्रकार, सिनैप्स मस्तिष्क के स्वास्थ्य के लिए मौलिक हैं1; सिनैप्टिक डिसफंक्शन को कई विकारों के स्रोत या परिणाम के रूप में फंसायाजाता है। सिनैप्स का गठन पूर्व और पोस्ट-सिनैप्टिक टर्मिनलों द्वारा किया जाता है, जो दो अलग-अलग न्यूरॉन्स के विस्तार होते हैं जो सिनैप्टिक आसंजन अणुओं द्वारा पार किए गए सिनैप्टिक फांक द्वारा बारीकी से जुड़े और अलग होते हैं। सूचना न्यूरोट्रांसमीटर1 नामक रासायनिक संदेशवाहकों के रूप में पूर्व से पोस्ट-सिनैप्टिक डिब्बे तक बहती है। न्यूरोट्रांसमिशन में शामिल आणविक प्रक्रियाएं अनुसंधान के सक्रिय क्षेत्र हैं 3,4,5. सिनैप्टिक टर्मिनलों के भीतर रोगजनक प्रक्रियाओं को समझना और अन्य न्यूरोनल उप-डिब्बों में पैथोलॉजी के लिए सिनैप्स की प्रतिक्रिया मस्तिष्क के विकारों को संबोधित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। कई पद्धतिगत प्रगति, मुख्य रूप से मुराइन मॉडल पर लागू, ने इस खोजको उन्नत किया है। अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा सिनैप्टिक अंशों का अलगाव एक ऐसी प्रतिमान-स्थानांतरण विधि है जिसने स्वास्थ्य और बीमारी में सिनैप्टिक प्रक्रियाओं के विस्तृत मूल्यांकन को सक्षम किया है।
वयस्क मानव मस्तिष्क में 80-90 बिलियन न्यूरॉन्स 7,8 होते हैं। मुराइन प्रजातियों में, चूहे के मस्तिष्क में लगभग ~ 200 मिलियन न्यूरॉन्स होते हैं, जबकि चूहों में ~ 70 मिलियन 9,10 होते हैं। प्रत्येक न्यूरॉन ग्लियल कोशिकाओं और घने वाहिका के साथ जुड़े अत्यधिक ध्रुवीकृत न्यूरॉन्स के नेटवर्क के साथ हजारों विशिष्ट सिनैप्टिक कनेक्शन बनाता है। इस तरह के जटिल और विषम ऊतक में, एक स्वतंत्र प्रणाली के रूप में सिनैप्स को अलग करना और अध्ययन करना एक बार अकल्पनीय था। 1960 के दशक में, विक्टर व्हिटकर, कैथरीन हेब और अन्य ने उपकोशिकीय विभाजन 11,12,13,14 का उपयोग करके बरकरार सिनैप्टिक टर्मिनलों को अलग करके इसे संभव बनाया। सिनैप्टिक पुटिकाओं (एसवी) को अलग करने के प्रयास में, उन्होंने आइसो-आसमाटिक (0.32 एम) सुक्रोज में तरल कतरनी बल के माध्यम से मस्तिष्क को समरूप किया, जिसके बाद अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन हुआ। उन्होंने पिन-ऑफ, प्लाज्मा झिल्ली-संलग्न, बरकरार तंत्रिका टर्मिनल या वैरिकोसिटी प्राप्त की, जिसे उन्होंने तंत्रिका-अंत कण (एनईपी) 11,13 कहा। चूंकि इन संरचनाओं में सिनैप्स की संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं को संरक्षित किया गया था, एनईपी को बाद में अन्य उपकोशिकीय जीवोंके अनुरूपता के लिए “सिनैप्टोसोम” कहा गया था। यह ध्यान देने योग्य है कि एडुआर्डो डी रॉबर्टिस और सहयोगियों का काम, जिन्होंने “सिनैप्टिक पुटिका” शब्द गढ़ा, व्हिटटेकर और सहयोगियों के साथ अतिव्यापी हो गया और “सिनैप्टोसोम” अलगाव और लक्षण वर्णन 16,17,18 के सत्यापन में योगदान दिया।
सिनैप्टोसोम शारीरिक रूप से सक्रिय संरचनाएं हैं जिनमें न्यूरोट्रांसमीटर13,18 के भंडारण, रिलीज और पुन: उत्थान के लिए आवश्यक सभी सेलुलर और आणविक गुण होते हैं। विट्रो में प्रमुख सिनैप्टिक विशेषताओं का संरक्षण और गैर-सिनैप्टिक घटकों से स्वतंत्रता भी इस अलगाव विधि की उपयोगिता में योगदान करती है। सिनैप्टोसोम ने न्यूरोट्रांसमिशन के रासायनिक और शारीरिक गुणों की समझ में बेहद योगदान दिया है और अब इसका उपयोग सिनैप्टिक आणविक प्रक्रियाओं और बीमारी19,20,21,22,23 में उनके परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए किया जा रहा है। सिनैप्टोसोम भी एसवी, क्लैथ्रिन-लेपित पुटिकाओं (सीसीवी), सिनैप्टिक साइटोसोल, सिनैप्टिक प्लाज्मा झिल्ली, सिनैप्टिक माइटोकॉन्ड्रिया, सिनैप्टिक आसंजन अणुओं और रुचि के अन्य घटकों जैसे सिनैप्टिक घटकों को अलग करने के लिए प्रारंभिक स्रोत सामग्री हैं, जो सिनैप्टिक फ़ंक्शन 18,19,20,24,25,26 के आणविक तंत्र की समझ की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। 27,28. इन उप-सिनैप्टिक घटकों को सिनैप्टोसोम के आसमाटिक लाइसिस और सुक्रोज घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन15,29 द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। यद्यपि व्हिटकर के शोध समूह द्वारा मूल उपकोशिकीय विभाजन विधि को गुणवत्ता सिनैप्टोसोम और एसवी13,30 को अलग करने में कुशल माना जाता है, हाल के अनुकूलन उपकोशिकीय अंशोंकी शुद्धता को बढ़ाते हैं 22,23,31,32। यह लेख सिनैप्टोसोम, एसवी और अन्य उप-सिनैप्टिक घटकों को अलग करने के लिए मुराइन मस्तिष्क ऊतक के उपकोशिकीय विभाजन के लिए एक क्लासिक प्रोटोकॉल का एक अत्यधिक विस्तृत और सुलभ संस्करण प्रदान करता है।
अपने मौलिक अध्ययनों में, व्हिटकर और सहयोगियों ने सिनैप्टोसोम की पहचान करने के लिए चार रूपात्मक मानदंडों का उपयोग किया: (1) संरचनाओं में एक सील प्लाज्मा झिल्ली होती है; (2) संरचनाओं में तंत्रिका टर्मिनलों के समान एसवी होते हैं और आकार और संख्या में सीटू में वैरिकासिटी होते हैं; (3) संरचनाओं में एक या अधिक छोटे माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं; और (4) प्रीसिनेप्टिक झिल्ली को अक्सर पोस्ट-सिनैप्टिक घटक 11,12,13 का पालन किया जाता है। हालांकि पहले दो मानदंड आम तौर पर हर अलगाव विधि पर लागू होते हैं, इस लेख में वर्णित सबसे हालिया प्रोटोकॉल में, सभी परिणामी सिनैप्टोसोम में माइटोकॉन्ड्रिया और संलग्न पोस्ट-सिनैप्टिक टर्मिनल नहीं होंगे। लगभग 60% सिनैप्टोसोम में माइटोकॉन्ड्रिया होंगे, और केवल 15% तक पोस्ट-सिनैप्टिक टर्मिनल37 से जुड़े होने का अनुमान है। यदि पोस्ट-सिनैप्टिक घटक विशेष रुचि रखते हैं, तो संवर्धन के लिए आइसोटोनिक क्रेब्स जैसे होमोजेनाइजेशन बफर और दबाव निस्पंदन का उपयोग पोस्ट-सिनैप्टिक टर्मिनलों (जिसे सिनैप्टोन्यूरोसोम भी कहा जाता है) के साथ सिनैप्टोसोम की उच्च सांद्रता उत्पन्न करने के लिए जाना जाता है।
जानवर की बलि देने की विधि सिनैप्टोसोम और सिनैप्टिक सबफ्रैक्शन की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकती है। इच्छामृत्यु विधि का उपयोग करके बलिदान किए गए वयस्क जानवरों को संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं होती है, जिसके परिणामस्वरूप सर्वोत्तम अंश गुणवत्ता होगी। इसके अलावा, दिमाग को ताजा विच्छेदित किया जाना चाहिए, जमे हुए नहीं, और सबसे व्यवहार्य सिनैप्टिक अंशों के लिए होमोजेनाइजेशन बफर (वजन / मात्रा) के 1: 10 अनुपात का उपयोग करके समरूपकिया जाना चाहिए। मस्तिष्क में सिनैप्स की एक विषम आबादी होती है जिसे उनके द्वारा ले जाने वाले न्यूरोट्रांसमीटर के प्रकार से विभेदित किया जा सकता है। सिनैप्टोसोम गठन आम तौर पर सिनैप्स प्रकार या न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री13 से अप्रभावित होता है। एक अपवाद सेरिबैलम में काई फाइबर है, जो मस्तिष्क के बाकी हिस्सों से सिनैप्टोसोम प्राप्त करने के लिए इष्टतम परिस्थितियों में बाधित होने के लिए जाना जाता है39,40। इस प्रकार, मस्तिष्क समरूपीकरण से पहले सेरिबैलम को हटाने की सिफारिश की जाती है यदि इस क्षेत्र का बहिष्करण प्रयोगात्मक लक्ष्य को प्रभावित नहीं करता है। यदि किसी विशेष न्यूरोट्रांसमीटर चरित्र के सिनैप्टोसोम को अलग करने में रुचि रखते हैं, तो मस्तिष्क के क्षेत्र जो रुचि के न्यूरोट्रांसमीटर वाले न्यूरॉन्स के लिए समृद्ध होते हैं, उन्हें पहले अलग किया जा सकता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण अंतिम अंश उपज पर सीमाएं लगाएगा, जो रुचि के क्षेत्र के आकार पर निर्भर करता है (जानवरों की उम्र भी एक विचार है)। न्यूरोट्रांसमीटर-विशिष्ट सिनैप्टोसोम के अलगाव के लिए इम्यूनोकेमिकल तरीके हैं, लेकिन व्यवहार्यता और उपज से काफीसमझौता किया जाएगा। यदि सिनैप्टोसोम चयापचय व्यवहार्यता का आकलन करना महत्वपूर्ण है, तो न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज41,42 या कुछ एंजाइमेटिक परख 43 का माप नियोजित किया जा सकता है।
सिनैप्टोसोम तैयारी में आम संदूषकों में माइक्रोसोम, मुक्त माइटोकॉन्ड्रिया, एसवी और न्यूरोनल और ग्लियल झिल्ली शामिल हैं। पी 1 और पी 2 अंश 22 पर धोने की संख्या में वृद्धि करके और बाद केचरणों में लाल माइटोकॉन्ड्रियल गोली के पुन: निलंबन से बचने से संदूषण को कम किया जा सकता है। उन प्रयोगों में जहां चयापचय व्यवहार्यता और समय महत्वपूर्ण हैं, धोने की संख्या को कम करना और सुक्रोज ग्रेडिएंट पर फिकोल या परकोल ग्रेडिएंट का उपयोगकरना 44,45,46 सहायक होगा। ये विधियां संदूषण को भी काफी कम करती हैं। व्हिटकर के मूल प्रोटोकॉल ने उच्च गुणवत्ता वाले एसवी का उत्पादन किया। इस विधि में शामिल नागी एट अल.23 द्वारा आगे अनुकूलन, उपज36 पर महत्वपूर्ण रूप से समझौता किए बिना उल्लेखनीय समरूपता और शुद्धता के साथ एसवी का उत्पादन करता है। यदि विशिष्ट एसवी उपप्रकार रुचि के हैं, जैसे कि ग्लूटामेटर्जिक (वीजीएलयूटी -1-युक्त) या जीबीएर्जिक (वीजीएटी -1-युक्त) एसवी, विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोआइसोलेशन47,48 किया जा सकता है। सिनैप्टोसोम से सीसीवी को अलग करने के लिए वैकल्पिक तरीके भी उपलब्ध हैं, जो अंतर घनत्व के कारण, इस विधि 20,49,50 के साथ प्राप्त एसवी के समान इंटरफ़ेस पर मौजूद नहीं हो सकते हैं।
कुल मिलाकर, सिनैप्टिक घटकों को अलग करने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल को स्रोत मस्तिष्क ऊतक और प्रयोगात्मक लक्ष्यों की गुणवत्ता और मात्रा के आधार पर बेहतर एकरूपता और व्यवहार्यता के साथ अंश प्राप्त करने के लिए और अनुकूलित किया जा सकता है। आगे के समस्या निवारण विवरण के लिए, डंकले और रॉबिन्सन22 और गैंजेला एट अल.36 द्वारा पुस्तक अध्यायों का उल्लेख करना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
हम ईएम छवि तैयारी के लिए पी कोलोसी को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर 01 एनएस 064963, एसएससी) द्वारा समर्थित किया गया था; आर01 एनएस110354, एसएससी; आर01 एनएस083846, एसएससी; आर 21 एनएस 094971, एसएससी; टी 32 एनएस 007224, एसएमटी; टी 32 एनएस 041228, एसएमटी), संयुक्त राज्य अमेरिका के रक्षा विभाग (डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच-17-1-0564, एसएससी; W81XWH-19-1-0264, VDJ, पार्किंसंस (ASAP) सहयोगी अनुसंधान नेटवर्क (SSC) और माइकल J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC और VDJ) के पार विज्ञान को संरेखित करना। हमने BioRender.com का उपयोग करके ग्राफिकल चित्र बनाए।
1 mL TB Syringe | BD | 309649 | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | |
14 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube | Beckman Coulter | 344060 | Compatible with SW 40 Ti |
23 Gauge Precision Glide Hypodermic Needle | BD | 305145 | |
26.3 mL, Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | Compatible with Ti70 |
3.5 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube | Beckman Coulter | 349623 | Compatible with TLA-100.3 |
50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | 1 mg/mL in diH2O |
Avanti J-26 XP Centrifuge | Beckman Coulter | B22984 | <26,000 rpm |
Benchtop HDPE Dewar Flask | Thermo Scientific | 5028U19 | |
C57BL/6J Mice | The Jackson Labs | 000664 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | EP022628168 | <14,000 rpm |
complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11873580001 | Add 1 tablet per 50 mL of solution |
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 8r | |
Glas-Col Tissue Homogenizing System | Cole-Parmer | UX-04369-15 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 3117-0500 | Compatible with JA20 |
Isofluorane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
JA-20 Rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
Leupeptin | American Bio | AB01108 | 1 mg/mL in diH2O |
N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | American Bio | AB00892 | |
Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <100,000 rpm | |
Optima TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <120,000 rpm | |
Pepstatin A | Thermo Scientific | 78436 | 1 mg/mL in DMSO |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | American Bio | AB01620 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23335 | For determination of protein concentration |
Pipette Tips | |||
Serological Pipettes | |||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
SW 40 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
Teflon-Coated Pestle and Mortar Tissue Grinder | Thomas Scientific | 3431D94 | |
Ti70 Rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
TLA-100.3 Rotor | Beckman Coulter | 349490 | |
Tube Revolver | Dot Scientific | DTR-02VS |