Detta protokoll presenterar en robust, detaljerad metod för att erhålla mycket rena synaptosomer, synaptiska vesiklar och andra synaptiska fraktioner från mushjärnan. Denna metod möjliggör utvärdering av synaptiska processer, inklusive biokemisk analys av proteinlokalisering och funktion med fackupplösning.
Synaptiska terminaler är de primära platserna för neuronal kommunikation. Synaptisk dysfunktion är ett kännetecken för många neuropsykiatriska och neurologiska störningar. Karakteriseringen av synaptiska delfack genom biokemisk isolering är därför en kraftfull metod för att belysa de molekylära baserna för synaptiska processer, både i hälsa och sjukdom. Detta protokoll beskriver isoleringen av synaptiska terminaler och synaptiska underfack från mushjärnor genom subcellulär fraktionering. Först isoleras förseglade synaptiska terminalstrukturer, kända som synaptosomer, efter hjärnvävnadshomogenisering. Synaptosomer är neuronala pre- och postsynaptiska fack med klämda och förseglade membran. Dessa strukturer behåller ett metaboliskt aktivt tillstånd och är värdefulla för att studera synaptisk struktur och funktion. Synaptosomerna utsätts sedan för hypotonisk lys och ultracentrifugering för att erhålla synaptiska underfack berikade för synaptiska vesiklar, synaptisk cytosol och synaptiskt plasmamembran. Fraktionsrenhet bekräftas genom elektronmikroskopi och biokemisk anrikningsanalys för proteiner som är specifika för subsynaptiska fack. Den presenterade metoden är ett enkelt och värdefullt verktyg för att studera synapsens strukturella och funktionella egenskaper och molekylär etiologi hos olika hjärnsjukdomar.
Synapser är de grundläggande beräkningsenheterna i hjärnan genom vilka neuroner kommunicerar och utövar olika och utsökt komplexa funktioner. Synapser är således grundläggande för hjärnans hälsa1; Synaptisk dysfunktion är inblandad som en källa eller ett resultat av många störningar2. Synapser utgörs av pre- och postsynaptiska terminaler, förlängningar av två olika neuroner som är nära apposed och separerade av en synaptisk klyfta som passeras av synaptiska vidhäftningsmolekyler. Information flödar från det pre- till postsynaptiska facket i form av kemiska budbärare som kallas neurotransmittorer1. De molekylära processer som är involverade i neurotransmission är aktiva forskningsområden 3,4,5. Att förstå de patogena processerna inom synaptiska terminaler och synapsernas svar på patologi i andra neuronala underfack är avgörande steg för att ta itu med störningar i hjärnan 1,2. Flera metodologiska framsteg, främst tillämpade på murina modeller, har avancerat denna strävan6. Isoleringen av synaptiska fraktioner genom differentiell centrifugering är en sådan paradigmskiftande metod som har möjliggjort detaljerad utvärdering av synaptiska processer inom hälsa och sjukdom.
Den vuxna mänskliga hjärnan består av 80-90 miljarder neuroner 7,8. Bland murina arter innehåller råtthjärnan cirka ~ 200 miljoner neuroner, medan möss har ~ 70 miljoner 9,10. Varje neuron bildar tusentals specifika synaptiska förbindelser med ett nätverk av mycket polariserade neuroner blandade med gliaceller och tät vaskulatur. I sådan komplex och heterogen vävnad var det en gång otänkbart att isolera och studera synapser som ett oberoende system. På 1960-talet gjorde Victor Whittaker, Catherine Hebb och andra detta möjligt genom att isolera intakta synaptiska terminaler med subcellulär fraktionering11,12,13,14. I ett försök att isolera synaptiska vesiklar (SVs) homogeniserade de hjärnor genom flytande skjuvkraft i iso-osmotisk (0,32 M) sackaros följt av ultracentrifugering. De erhöll avklämda, plasmamembranslutna, intakta nervterminaler eller varicositeter, som de kallade nervändande partiklar (NEPs)11,13. Eftersom synapsens strukturella och funktionella egenskaper bevarades i dessa strukturer kallades NEP senare “synaptosomer” för kongruens med andra subcellulära organeller13,15. Det är värt att notera att arbetet med Eduardo de Robertis och kollegor, som myntade termen “synaptisk vesikel”, överlappade med Whittakers och kollegors och bidrog till valideringen av “synaptosom” isolering och karakterisering16,17,18.
Synaptosomer är fysiologiskt aktiva strukturer som innehåller alla cellulära och molekylära egenskaper som krävs för lagring, frisättning och återupptag av neurotransmittorer13,18. Bevarandet av viktiga synaptiska egenskaper in vitro och frihet från icke-synaptiska komponenter bidrar också till nyttan av denna isoleringsmetod. Synaptosomer har bidragit oerhört till förståelsen av de kemiska och fysiologiska egenskaperna hos neurotransmission och används nu för att studera synaptiska molekylära processer och deras förändringar i sjukdom 19,20,21,22,23. Synaptosomer är också det ursprungliga källmaterialet för isolering av synaptiska komponenter såsom SVs, clathrinbelagda vesiklar (CCV), synaptisk cytosol, synaptiskt plasmamembran, synaptiska mitokondrier, synaptiska vidhäftningsmolekyler och andra komponenter av intresse, vilket kan underlätta förståelsen av de molekylära mekanismerna för synaptisk funktion 18,19,20,24,25,26, 27,28. Dessa subsynaptiska komponenter kan erhållas genom osmotisk lys av synaptosomer och sackarosdensitetsgradient ultracentrifugering15,29. Även om den ursprungliga subcellulära fraktioneringsmetoden av Whittakers forskargrupp är känd för att vara effektiv för att isolera kvalitetssynaptosomer och SVs 13,30, förbättrar de senaste optimeringarna renheten hos de subcellulära fraktionerna 22,23,31,32. Den här artikeln innehåller en mycket detaljerad och tillgänglig version av ett klassiskt protokoll för subcellulär fraktionering av murin hjärnvävnad för att isolera synaptosomer, SVs och andra subsynaptiska komponenter.
I sina banbrytande studier använde Whittaker och kollegor fyra morfologiska kriterier för att identifiera synaptosomer: (1) strukturerna har ett förseglat plasmamembran; (2) strukturerna innehåller SVs som liknar dem i nervterminaler och varicosities in situ i storlek och antal; (3) strukturerna har en eller flera små mitokondrier; och (4) det presynaptiska membranet ofta fästs vid en postsynaptisk komponent11,12,13. Även om de två första kriterierna i allmänhet gäller för varje isoleringsmetod, i de senaste protokollen som beskrivs i den här artikeln, kommer inte alla resulterande synaptosomer att ha mitokondrier och bifogade postsynaptiska terminaler. Cirka 60% av synaptosomerna kommer att ha mitokondrier, och endast upp till 15% beräknas ha bifogade postsynaptiska terminaler37. Om postsynaptiska komponenter är av särskilt intresse är användningen av en isotonisk Krebs-liknande homogeniseringsbuffert och tryckfiltrering för anrikning kända för att ge höga koncentrationer av synaptosomer med postsynaptiska terminaler (även kallade synaptoneurosomer)22,38.
Metoden att offra djuret kan påverka kvaliteten på synaptosomer och synaptiska delfraktioner. Vuxna djur som offras med en eutanasimetod som inte kräver anestesi kommer att resultera i bästa fraktionskvalitet. Vidare bör hjärnorna nyligen dissekeras, inte frysas och homogeniseras med hjälp av ett homogeniseringsbuffert på 1:10 (vikt / volym) för de mest livskraftiga synaptiska fraktionerna22. Hjärnan har en heterogen population av synapser som kan differentieras av vilken typ av neurotransmittorer de bär. Synaptosombildning påverkas i allmänhet inte av synapstyp eller neurotransmittorinnehåll13. Ett undantag är mossiga fibrer i lillhjärnan, som är kända för att störas under optimala förhållanden för att erhålla synaptosomer från resten av hjärnan39,40. Således rekommenderas avlägsnande av cerebellum före hjärnhomogenisering om uteslutningen av denna region inte påverkar det experimentella målet. Om du är intresserad av att isolera synaptosomer av en viss neurotransmittorkaraktär, kan områden i hjärnan som är berikade för neuroner som innehåller neurotransmittorn av intresse först isoleras. Detta tillvägagångssätt kommer emellertid att medföra begränsningar för det slutliga fraktionsutbytet, beroende på storleken på intresseområdet (djurens ålder är därför också en övervägande). Det finns immunokemiska metoder för isolering av neurotransmittorspecifika synaptosomer, men livskraften och utbytet kommer att äventyras avsevärt22. Om det är viktigt att bedöma synaptosomens metaboliska livskraft kan mätningen av neurotransmittorfrisättning 41,42 eller vissa enzymatiska analyser43 användas.
Vanliga föroreningar i synaptosompreparat inkluderar mikrosomer, fria mitokondrier, SVs och neuronala och glialmembran. Kontaminering kan minskas genom att öka antalet tvättar vid P1- och P2-fraktionerna22 och undvika återsuspension av den röda mitokondriella pelleten i efterföljande steg. I experiment där metabolisk livskraft och tid är avgörande kommer det att vara till hjälpatt minska antalet tvättar och använda Ficoll- eller Percoll-gradienter över sackarosgradienter 44,45,46. Dessa metoder minskar också kontamineringen avsevärt. Whittakers ursprungliga protokoll gav högkvalitativa SVs. Ytterligare optimering av Nagy et al.23, som ingår i denna metod, producerar SVs med anmärkningsvärd homogenitet och renhet utan att kompromissa avsevärt med avkastning36. Om specifika SV-subtyper är av intresse, såsom glutamaterga (VGLUT-1-innehållande) eller GABAerga (VGAT-1-innehållande) SVs, kan immunisolering med specifika antikroppar utföras47,48. Alternativa metoder finns också tillgängliga för att isolera CCV från synaptosomer, som på grund av differentiell densitet kanske inte finns i samma gränssnitt som SV erhållna med denna metod20,49,50.
Sammantaget kan det nuvarande protokollet för att isolera synaptiska komponenter optimeras ytterligare för att erhålla fraktioner med förbättrad homogenitet och livskraft baserat på kvaliteten och kvantiteten av källhjärnvävnaden och de experimentella målen. För ytterligare felsökningsdetaljer bör man hänvisa till bokkapitel av Dunkley och Robinson22 och Ganzella et al.36.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka P. Colosi för EM-bildförberedelser. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01 NS064963, SSC; R01 NS110354, SSC; R01 NS083846, SSC; R21 NS094971, SSC; T32 NS007224, SMT; T32 NS041228, SMT), Förenta staternas försvarsdepartement (W81XWH-17-1-0564, SSC; W81XWH-19-1-0264, VDJ), Aligning Science Across Parkinson’s (ASAP) Collaborative Research Network (SSC) och Michael J. Fox Foundation Target Advancement Program (MJFF-020160, SSC & VDJ). Vi skapade grafiska illustrationer med BioRender.com.
1 mL TB Syringe | BD | 309649 | |
1.5 mL Eppendorf Tubes | USA Scientific | 1415-2500 | |
14 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube | Beckman Coulter | 344060 | Compatible with SW 40 Ti |
23 Gauge Precision Glide Hypodermic Needle | BD | 305145 | |
26.3 mL, Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | Compatible with Ti70 |
3.5 mL, Open-Top Thickwall Polypropylene Tube | Beckman Coulter | 349623 | Compatible with TLA-100.3 |
50 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC901024 | |
Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | 1 mg/mL in diH2O |
Avanti J-26 XP Centrifuge | Beckman Coulter | B22984 | <26,000 rpm |
Benchtop HDPE Dewar Flask | Thermo Scientific | 5028U19 | |
C57BL/6J Mice | The Jackson Labs | 000664 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | EP022628168 | <14,000 rpm |
complete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 11873580001 | Add 1 tablet per 50 mL of solution |
Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | |
Fine Surgical Scissors | Fine Science Tools | 8r | |
Glas-Col Tissue Homogenizing System | Cole-Parmer | UX-04369-15 | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11650-10 | |
High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 3117-0500 | Compatible with JA20 |
Isofluorane | Henry Schein Animal Health | NDC 11695-6776-2 | |
JA-20 Rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
Leupeptin | American Bio | AB01108 | 1 mg/mL in diH2O |
N-[2-Hydroxyethyl] piperazine-N’-[2-ethanesulfonic acid] (HEPES) | American Bio | AB00892 | |
Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <100,000 rpm | |
Optima TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | <120,000 rpm | |
Pepstatin A | Thermo Scientific | 78436 | 1 mg/mL in DMSO |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | American Bio | AB01620 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23335 | For determination of protein concentration |
Pipette Tips | |||
Serological Pipettes | |||
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
SW 40 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
Teflon-Coated Pestle and Mortar Tissue Grinder | Thomas Scientific | 3431D94 | |
Ti70 Rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
TLA-100.3 Rotor | Beckman Coulter | 349490 | |
Tube Revolver | Dot Scientific | DTR-02VS |