Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Test af kræftimmunotermiske lægemidler i en humaniseret musemodel, der bærer humane tumorer

Published: December 16, 2022 doi: 10.3791/64606
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, 2, 1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus, 3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L'Hospitalet)
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokol skitserer dannelsen af humane immunsystemmus (HIS) til immuno-onkologiske undersøgelser. Instruktioner og overvejelser i brugen af denne model til test af humane immunotermiske lægemidler på humane tumorer implanteret i denne model præsenteres med vægt på karakterisering af immunsystemets respons på tumoren.

Abstract

At vende den immunsuppressive karakter af tumormikromiljøet er afgørende for en vellykket behandling af kræft med immunterapilægemidler. Murine cancer modeller er ekstremt begrænsede i deres mangfoldighed og lider af dårlig oversættelse til klinikken. For at tjene som en mere fysiologisk præklinisk model for immunterapistudier er denne protokol udviklet til at evaluere behandlingen af humane tumorer i en mus rekonstitueret med et humant immunsystem. Denne unikke protokol demonstrerer udviklingen af humane immunsystem (HIS, "humaniserede") mus, efterfulgt af implantation af en human tumor, enten en cellelinjeafledt xenograft (CDX) eller en patientafledt xenograft (PDX). HIS-mus genereres ved at injicere CD34+ humane hæmatopoietiske stamceller isoleret fra navlesnorsblod i neonatal BRGS (BALB/c Rag2-/- IL2RγC-/- NOD SIRPα) stærkt immundefekte mus, der også er i stand til at acceptere en xenogenisk tumor. Betydningen af kinetikken og egenskaberne ved udvikling af det menneskelige immunsystem og tumorimplantation understreges. Endelig beskrives en dybdegående evaluering af tumormikromiljøet ved hjælp af flowcytometri. I talrige undersøgelser ved hjælp af denne protokol blev det konstateret, at tumormikromiljøet hos individuelle tumorer rekapituleres i HIS-PDX-mus; "Varme" tumorer udviser stor immuninfiltration, mens "kolde" tumorer ikke gør det. Denne model fungerer som testområde for kombinationsimmunterapier til en bred vifte af humane tumorer og repræsenterer et vigtigt redskab i søgen efter personlig medicin.

Introduction

Musekræftmodeller er vigtige for at etablere grundlæggende mekanismer for tumorvækst og immunflugt. Imidlertid har kræftbehandlingsstudier i musemodeller givet endelig oversættelse til klinikken på grund af begrænsede syngeneiske modeller og artsspecifikke forskelle 1,2. Fremkomsten af immunterapier som en dominerende tilgang til kontrol af tumorer har gentaget behovet for en in vivo-model med et funktionelt humant immunsystem. Fremskridt inden for humane immunsystemmus (HIS-mus) i løbet af det sidste årti har gjort det muligt at studere immuno-onkologi in vivo i en lang række kræfttyper og immunterapeutiske midler 3,4,5,6. Humane tumormodeller, herunder cellelinjeafledte og patientafledte xenotransplantater (henholdsvis CDX og PDX), vokser godt i HIS-mus og er i de fleste tilfælde næsten identiske med deres vækst i den immundeficiente vært, der mangler human hæmatopoietisk engraftment 7,8. Baseret på dette nøglefund har forskere brugt HIS-musemodellen til at studere humane immunterapier, herunder kombinationsterapier designet til at ændre tumormikromiljøet (TME) for at mindske immunsuppression og dermed forbedre immunrettet tumordrab. Disse prækliniske modeller hjælper med at løse problemerne med heterogenitet af humane kræftformer og kan også forudsige behandlingssucces samt overvåge immunrelaterede lægemiddeltoksiciteter 9,10.

Produktionen af en musemodel med et humant immunsystem gennem introduktion af humane hæmatopoietiske stamceller kræver en modtagende immundefekt mus, der ikke afviser xenotransplantatet. Nuværende HIS-musemodeller er afledt af immundefekte musestammer, der blev rapporteret for over 30 år siden. Den første immundeficiente musestamme, der blev beskrevet, var SCID-mus, der manglede T- og B-celler11, efterfulgt af en hybrid NOD-SCID med en SIRPα-polymorfi, der er ansvarlig for musemakrofagtolerance over for humane celler på grund af øget binding for NOD SIRPα-allelen til det humane CD47-molekyle12,13. I begyndelsen af 2000'erne var sletningen af den fælles gammakæde af IL-2-receptoren (IL-2Rγc) på både BALB / c og NOD immundeficiente stammer en game changer for forbedret menneskelig engraftment på grund af genetiske deletioner, der forbød værts NK-celleudvikling14,15,16,17. Alternative modeller, såsom BRG- og NRG-mus, opnår T- og B-cellemangel gennem deletion af Rag1- eller Rag2-genet, der kræves til T- og B-cellereceptorgenomlejringer og dermed modning og overlevelse af lymfocytter18,19. BRGS-musen (BALB/c -Rag2 nullIl2RγCnullSirpα NOD), der anvendes heri, kombinerer IL-2Rγ-kædemangel ogNOD SIRPα-allelen på Rag2-/- baggrunden, hvilket resulterer i en mus med høj immundefekt mus uden T-, B- eller NK-celler, men alligevel med tilstrækkelig kraft og sundhed til at muliggøre langvarig indkapsling på mere end 30 uger13.

HIS-mus kan genereres på flere måder, hvor human PBMC-injektion er den mest direkte metode15,18,20. Imidlertid har disse mus en markant udvidelse af aktiverede humane T-celler, der resulterer i graft versus host disease (GVHD) ved 12 ugers alderen, hvilket forhindrer langtidsundersøgelser. Alternativt kan humane hæmatopoietiske stamceller fra navlesnorsblod (CB), knoglemarv og føtal lever også bruges til engraftment og produktion af det menneskelige immunsystem de novo. I dette system producerer de hæmatopoietiske stamceller et humant immunsystem med flere afstamninger med generering af T, B og medfødte immunceller, der er vigtige tolerante over for museværten sammenlignet med PBMC-musene, der hovedsagelig udvikler T-celler. Derfor er GVHD fraværende eller stærkt forsinket, og undersøgelser kan udvides til mus op til 10 måneders alderen. CB giver en nem, tilgængelig og ikke-invasiv kilde til CD34+ humane hæmatopoietiske stamceller, der letter indkapsling af flere HIS-mus med genetisk identiske immunsystemer 17,18,20,21. I løbet af de sidste par år er HIS musemodeller blevet brugt i vid udstrækning til at studere immunterapi og TME 3,4,5,6. På trods af udviklingen af humane afledte immunsystemer i disse mus vokser humane xenografttumorer med lignende hastigheder sammenlignet med kontrolimmunodeficiente mus og giver mulighed for det komplekse samspil mellem kræftcellerne og immuncellerne, hvilket er vigtigt for at opretholde mikromiljøet i den indpodede PDX 3,7,8 . Denne protokol er blevet brugt til at udføre over 50 undersøgelser, der tester behandlinger i HIS-BRGS-mus med PDX'er og CDX'er. En vigtig konklusion er, at humane tumorer i HIS-musene opretholder deres unikke TME som defineret ved molekylær evaluering af tumoren i forhold til den oprindelige patientprøve og immuninfiltrategenskaber 3,22,23. Vores gruppe fokuserer på dybdegående evaluering af HIS i både immunorganer og tumoren ved hjælp af multiparameterflowcytometri. Heri beskriver vi en protokol til humanisering af BRGS-mus, evaluering af kimærisme, implantation af humane tumorer, tumorvækstmålinger, kræftbehandlingsadministration og analyse af HIS-cellerne ved flowcytometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt dyrearbejde blev udført under dyreprotokoller godkendt af University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC protokoller #00593 og #00021). Alt dyrearbejde blev udført i overensstemmelse med Office of Laboratory Animal Resources (OLAR), en akkrediteret facilitet af American Association for Laboratory Animal Care ved University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus. Alle humane navlestrengsblodprøver er taget som donationer fra afidentificerede donorer og skal derfor ikke godkendes af den humanvidenskabelige videnskabsetiske komité.

BEMÆRK: Sammensætninger af alle medier og løsninger, der er nævnt i protokollen, er inkluderet i supplerende fil 1. Figur 1 illustrerer den overordnede protokol for generering og analyse af immunresponser på tumorer i HIS-BRGS-mus.

1. Generering af HIS mus

  1. Musehold af BALB/c -Rag2 null Il2RγCnull SirpαNOD (BRGS) mus
    BEMÆRK: Denne stamme er ekstremt immundefekt uden T-, B- eller NK-celler. Derfor skal der anvendes strenge foranstaltninger for at forhindre opportunistiske infektioner. Vedligehold kolonien på en diæt, der indeholder trimethoprim og sulfadiazin på en skiftevis 2 ugers tidsplan med en normal kost. Oprethold i det højest mulige niveau af forsigtighedsrum (f.eks. en barrierebruserfacilitet med begrænset adgang).
    1. Bevar kolonier af BALB/c -Rag2 null Il2RγC null Sirpα NOD (BRGS) og BALB/c Rag2 null Il2RγC null SirpaBalb/c (BRG) homozygote mus som opdrættere.
    2. Opdræt BRGS N / N× BRG B/ B for at generere BRGSB / N-hvalpe, der skal bruges som modtagere af humane stamceller. I denne koloni er BRGSB / N sundere end BRGS N/ N og engraft på tilsvarende niveauer (mere end BRG).
  2. CD34+ human stamcelleisolering fra navlestrengs-CB
    BEMÆRK: Der anvendes ingen antibiotika til denne procedure. Derfor er god steril teknik afgørende.
    1. Placer et 50 ml konisk rørstativ samt 3x 15 ml og ~ 10x 50 ml koniske rør i et steriliseret biosikkerhedsskab (BSC). Sprøjt en blodopsamlingspose med 70% ethanol og lad den tørre i BSC.
    2. Beregn antallet af 50 ml koniske rør, der kræves til isolering af CB-densitetsgradient = CB-volumen/15, rundet op og til et jævnt rørtal. Beregn blodvolumen pr. rør = CB-volumen/antal rør. Hæld blod forsigtigt fra CB-posen i hvert konisk rør; dette er maksimalt 15 ml pr. Rør. Brug en automatisk pipetter og en 25 ml serologisk pipette til at blande blodet 1:1 med sterilt PBS ved pipettering op og ned.
    3. Brug en automatisk pipetter ved lav hastighed og en 10 ml serologisk pipette til langsomt at lægge blodet under stuetemperatur (RT) 1,077 g/ml densitetsgradientopløsning (se materialetabellen) uden at forstyrre grænsefladen. Sørg for, at pipettespidsen ikke rører rørbunden af røret. Gentag for alle rør. Derefter centrifugeres i 30 minutter ved 850 x g uden bremsning ved RT for at sikre opretholdelse af densitetsgradienten.
    4. Visualiser den cellulære buffy frakke oven på densitetsgradienten på 1,077 g / ml som et uklart hvidt lag. Plasmalaget fjernes og kasseres ned til ca. 10 ml over buffycoaten ved hjælp af en 25 ml serologisk pipette og en automatisk pipetter.
    5. Saml buffy frakken med en steril overførsel eller serologisk pipette. Brug pipetten som en spatel til at skrabe cellerne ud af siden af det koniske rør, mens du slipper pæren (eller pipetterer langsomt) for at trække cellerne op. Kombiner buffy coats fra to 50 ml koniske rør til et nyt 50 ml konisk rør.
    6. Cellerne vaskes ved at hælde 45 ml steril HBSS indeholdende 2% FBS i hvert konisk rør. Centrifuger i 11 min ved 360 x g ved RT.
    7. Opsug vaskemediet ned til pillen i alle rør. Brug en 10 ml serologisk pipette og en automatisk pipetter til at resuspendere den første pellet i 10 ml HBSS indeholdende 2% FBS. Resuspender hver pellet i de samme 10 ml HBSS, og skyl hvert rør med yderligere 10 ml HBSS for at samle alle cellerne i et enkelt rør.
    8. Hæld 45 ml steril HBSS indeholdende 2% FBS i det koniske rør. Der centrifugeres i 10 minutter ved 360 x g ved 4 °C.
    9. Opsug vaskebufferen ned til cellepelleten, og opslæft pillen igen i 20 ml magnetisk celleseparatorbuffer (se materialetabel). Fjern en lille prøve for at tælle cellerne med et hæmacytometer ved en 1:20 fortynding i methylenblåt. Tilføj antallet af blå og hvide celler. Der centrifugeres ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: Denne protokol bruger magnetisk perleteknologi (se materialetabel). Protokollen kan modificeres til brug med enhver celleseparationsteknologi med tilstrækkelig renhed og udbytte af CD34+ stamcellerne.
    10. Supernatanten suges op, og CD34+-cellepelletten opsuges isoleret fra navlestrengsblod i 300 μL magnetisk celleseparatorbuffer pr. 1 x 108 celler. Tilsæt først 100 μL FcR-blokerende reagens og derefter 100 μL CD34+ magnetiske perler pr. 1 x 108 celler. Inkuber ved 4 °C i 30 minutter (ingen is).
    11. Der tilsættes 5 ml magnetisk celleseparatorbuffer pr. 1 x 108 celler, og centrifugeres ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C. Gentag vasketrinnet og resuspender pellet i 500 μL magnetisk celleseparatorbuffer pr. 1 x 108 celler i et 15 ml konisk rør mærket "ufraktioneret".
    12. Mærk yderligere to 15 ml koniske rør "CD34-" og "CD34+". Placer de tre koniske rør på 15 ml (ufraktioneret, CD34- og CD34+) på henholdsvis plads A1, B1 og C1 på et kølestativ (se materialetabellen). Adskil cellerne ved hjælp af det positive selektionsprogram med to kolonner på en automatisk magnetisk celleseparator (se materialetabellen) i en BSC i henhold til producentens instrumentinstruktioner.
  3. Udvidelse og frysning af CD34+ humane stamceller
    1. Alikvote 10 μL af den genvundne CD34+ cellesuspension (2 ml) på et hæmocytometerglas og tæl cellerne under 10x forstørrelse. Beregn det samlede antal CD34+ celler ved at gange celletallet med 2 x 104. Divider det samlede CD34+ celleantal med 250.000 for at beregne antallet af hætteglas, der skal fryses (50.000 celler pr. musehvalp før in vitro-udvidelse ).
    2. Forbered CB-mediet Iscoves 10% FCS (plus 1 ml ekstra til filtreringstab), suppleret med 40 ng/ml stamcellefaktor, 20 ng/ml Flt3L og 10 ng/ml IL-6, og passér gennem et 0,22 μm filter. CD34+ cellerne resuspenderes ved 100.000 pr. ml CB-medium, og der inkuberes ved 37 °C. På dag 3 tilsættes et tilsvarende volumen CB-medium uden cytokiner til kolben indeholdende cellerne og CB-mediet med cytokiner.
      BEMÆRK: Tilsætning af disse cytokiner til CB-mediet fremmer overlevelse og udvidelse af CD34+ cellerne, samtidig med at differentiering forhindres.
    3. Høst de udvidede CD34+ celler på dag 5. Pipetter cellesuspensionen op og ned og opsamles i et 50 ml konisk rør. Der tilsættes nok CB-medium til at dække bunden af kolben. Brug en celleskraber til at skrabe hele bunden af kolben. Alle medier samles i det samme 50 ml rør, og centrifugeres ved 360 x g i 11 min.
    4. Resuspender cellerne i 2 ml CB-medium. Gem den sidste dråbe fra pipetten i en plade med 96 brønde til tælling. Fortynd cellerne 1: 1 i trypanblåt og tilsæt 10 μL til hæmacytometeret, tæl derefter og gennemsnit celler fra fire kvadranter. Beregn det samlede antal CD34+ celler ved at gange celletallet med 4 x 104, og registrer levedygtigheden.
    5. Der fremstilles n+1 ml frysemedium, hvor n er antallet af frysehætteglas beregnet i trin 1.3.1. Forbered frysemedium ved at tilsætte 10% (v / v) DMSO til FBS og hold på is. Mærk kryovialerne med CB#, CD34+ d5 og dato.
    6. Drej CD34+ cellerne ned ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C. Opsug mediet ned til pelleten og resuspender cellepelleten i frysemedium. Der alikvotes 1 ml cellesuspension til hvert hætteglas, og resten fordeles ligeligt mellem hætteglassene. Hætteglassene tilsættes til en isopropanolcellefryser, der er nedkølet til 4 °C, anbringes ved -80 °C og overføres til flydende nitrogen for at opbevare dem i >90 dage.
  4. Bestråling af museunger
    1. Saml BRGSB / N-hvalpene 1-3 dage efter fødslen i en autoklaveret plastkasse med polstring. Tilsæt en lille mængde strøelse med hvalpene. Mærk kassen med burnummer og antal hvalpe.
    2. Opsæt bestrålingsvæsken (se materialetabellen) til en dosis på 300 rad. Sæt kassen med hvalpe i bestråleren og udsæt dem for 300 rad. Tag hvalpene tilbage til deres bur, læg dem i en bunke og dæk med strøelse.
  5. Pup injektioner og CD34+ celle forberedelse
    1. Begynd CD34+ celleforberedelse ~3 timer efter bestråling. Varm 10 ml CB-medier i et 50 ml konisk rør. Udfør alle trin i en steril BSC.
    2. Hent et hætteglas med in vitro udvidede og frosne CD34+ celler for hver fire til seks hvalpe, der skal injiceres. Optø hurtigt ved 55 °C, indtil blot en lille mængde is er synlig, og tilsæt cellerne til det opvarmede CB-medium (hætteglasset skal stadig være køligt at røre ved.) Brug 1 ml medium til at skylle hvert hætteglas og drej cellerne ved 360 x g i 12 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: Hurtig optøning ved 55 °C viste sig at give bedre cellelevedygtighed (90% -95%) end optøning ved 37 °C.
    3. Opsug mediet forsigtigt. Resuspender den (lille) pellet i 2 ml CB-medier, bland forsigtigt, og tilsæt ~ 30 μL af cellesuspensionen til et enkelt hul i en tælleplade. Fortynd 1: 1 i trypanblåt, tilsæt derefter 10 μL til et hæmocytometer og tæl og gennemsnit cellerne fra fire kvadranter.
    4. Beregn det samlede antal CD34+ celler ved at gange celletallet med 4 x 104 og registrer derefter levedygtigheden. Spin ved 360 x g i 12 minutter ved 4 °C.
    5. Opsug mediet forsigtigt og resuspender cellepelleten i 100 μL steril PBS pr. n + 1 hvalpe til injektion, hvilket resulterer i 250.000-450.000 CD34 + celler pr. Mus. Placer det koniske rør på is i en transportbeholder og rejs til vivarium for injektion af hvalpen.
    6. Medbring en varmelampe, bleer, 1 ml sprøjte, 18 G kanyle, 30 G kanyle og CD34+ cellepræparatet i sterile beholdere til vivarium BSC. Placer en steril ble ~ 2 ft under varmelampen. Hent buret med det strøelse, der skal injiceres, og læg det i BSC.
    7. Saml sprøjten med en 18 G skrå kanyle. Match vinklen på det koniske rør med nålens skråning, bland forsigtigt og træk cellesuspensionen op. Placer hvalpene på bleen for at varme (pas på overophedning). Fjern luft fra sprøjten, og erstat 18 G-kanylen med 30 G-kanylen, og skub derefter forsigtigt sprøjten, indtil cellesuspensionen er lige ved kanylespidsen.
      BEMÆRK: Alternativt kan en insulinsprøjte anvendes.
    8. Tag en hvalp ad gangen til kanten af bleen væk fra varmelampen. Immobiliser hvalpen på sin side under tommelfingeren og pegefingeren, hvilket giver et klart udsyn til ansigtet. Bemærk venen over kinden, hvor øret vil være. Stik kanylen grundigt ind i venen (IV) nærmest øjet, og injicer langsomt 50 μL celler.
    9. Kontroller, om der dannes en boble fra en subkutan injektion. Hvis det er tilfældet, skal du stikke nålen dybere ind og fortsætte med at injicere celler. En lille dråbe blod / hæmatom vil være synlig, når det lykkes.
      BEMÆRK: Se proceduren af Gombash Lampe et al.24 vedrørende injektion af hvalpe.
    10. Når hvalpen stadig er immobiliseret, skal du udføre en intrahepatisk injektion (IH) med yderligere 50 μL celler (100 μL i alt pr. Hvalp IV + IH). Leveren kan visualiseres som en mørk plet mellem det hvide mælkebånd og brystkassen. Placer den injicerede hvalp på en ble længere væk fra de ikke-injicerede hvalpe og varme.
      BEMÆRK: IV-injektion resulterer i bedre langsigtet kimærisme end IH-injektion alene25, men IV-injektioner er ikke altid vellykkede. Derfor sikrer opdeling af injektionen mellem IV og IH engraftment i en større procentdel af mus.
    11. Gentag både ansigtsvene- og IH-injektioner for alle hvalpe. Rens alt blod, returner hvalpe til reden i deres bur og dæk med strøelse.

2. Test af menneskelig kimærisme i blod

  1. Test kimærisme i blodet hos HIS mus ved både 10 og 14 ugers alderen. Der indsamles 50 μL blod via retroorbitalvenen eller ved hjælp af en alternativ IACUC-godkendt metode.
    1. Ved retroorbitale blødninger bedøves mus med en isofluranfordamper indstillet til 5 i 1-2 minutter og drejes derefter fordamperindstillingen ned til 4. Skru fordamperen ned efter behov for at lade musene forblive tilstrækkeligt iltede, mens de er under bedøvelse. Hold ikke musene under isofluran i mere end 5 min.
    2. Placer næsen på den bedøvede mus i isofluranfordamperens næsekeglefastgørelse, og læg en dråbe smertestillende middel (0,5% proparacain HCI oftalmisk opløsning USP) på øjet.
    3. Efter 1 minut fjernes proparacainen ved hjælp af en steril gaze, proptose øjet og indsætter et 75 mm hepariniseret hæmatokritrør retro-orbitalt for at opsamle 50 μL blod. Skub blodet ud i et 1,5 ml mikrofugerør indeholdende 50 μL heparin og bland forsigtigt.
    4. Klem øjet lukket med sterilt gasbind for at stoppe blødningen og påfør en dråbe proparacain. Fjern musen fra isofluran og kom dig i et rent bur.
  2. PBMC-isolering fra museblod
    1. Bland blodet / heparinet ved forsigtigt at pipettere op og ned og langsomt overlejre oven på 500 μL med 1.077 g / ml densitetsgradient, pas på ikke at forstyrre grænsefladen. Centrifuger slangerne ved 1.220 x g i 20 minutter ved RT uden bremser.
    2. Visualiser den cellulære buffy coat som et uklart lag oven på 1,077 g / ml densitetsgradienten under plasmaet. Fjern så mange af cellerne som muligt fra buffy coaten med en 200 μL pipette og tilsæt til nye 1,5 ml rør indeholdende 750 μL høstmedium. Der centrifugeres ved 360 x g i 11 minutter ved RT.
    3. Opsug mediet ned til 50 μL og genopslæm pellet i 750 μL høstmedium. Der centrifugeres ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C, og der suges ned igen til 50 μl. Cellerne er klar til at blive resuspenderet i overfladepletten.
  3. Overfladefarvning og flowcytometrisk analyse
    1. Udfyld regnearket med farvepanelet (tabel 1; regnearket "spektral flow bleed panel") med musenumre og forberede antistoffarvningscocktailen ved at tilføje alle fluorescerende antistoffer til farvningsbufferen (supplerende fil 1). Lav et pladelayout for at tilføje prøverne til en 96-brønds U-bundplade. Marker bunden af brønde ved hjælp af en permanent markør. Der titreres antistoffer ved hjælp af en standardprocedure før farvning for at bestemme den passende koncentration26.
    2. Tilsæt 62 μL af overfladepletcocktailen til hver brønd i U-bundpladen med 96 brønde. Cellerne i de 50 μL, der er tilbage i røret, resuspenderes, og hver prøve tilsættes til det tilsvarende hul. Inkluder en brønd til en positiv farvningskontrol (humane PBMC'er + musesplenocytter, 1 x 106 celler hver) for at plette sammen med prøverne. Bland ved pipettering og inkuber blandingen i 15 minutter ved 4 °C.
    3. Der centrifugeres ved 680 x g i 3 minutter ved 4 °C. Svip pladen ud i vasken for at fjerne supernatanten, og vask cellerne ved at opslæmme 150 μL farvningsbuffer ved forsigtigt at pipettere ~10x. Drej og resuspender hvert hul i 150 μL farvningsbuffer.
    4. Hent dataene for 100 μL af hver prøve på et flowcytometer (se materialetabellen), og eksportér .fcs-filerne. Importer .fcs-filerne til redigeringssoftwaren til flowdata (se materialetabellen). Påfør en polygonport på et FSC-A x SSC-A-plot, der omgiver cellerne, undtagen snavs. Vælg cellerne i porten (se tabel 1; "spektral flow bleed gating" regneark).
    5. Skift akserne til (FSC-A x FSC-H), og port cellerne indeholdt på den lineære diagonal eksklusive dubletterne, der stikker ud fra linjen. Markér disse celler, og skift akserne til (hCD45 x mCD45).
    6. Anvend en polygonport på hCD45+ populationen og anvend navnet "menneske". Anvend en polygonport på mCD45+-populationen, og anvend navnet "mus". Opret en optællingsstatistik for både populationer af mennesker og mus.
    7. Vælg den menneskelige population, og skift akserne til (CD19 x CD3). Anvend en polygonport på CD19+ cellerne og navngiv den "B-celler". Anvend en polygonport på CD3+-populationen, og navngiv den "T-celler". Anvend en polygonport på den dobbelte negative population og navngiv den "NonTB".
    8. Vælg T-cellepopulationen, og skift akserne til (CD8 x CD4). Anvend en polygonport på de CD4- og CD8-positive populationer, og navngiv dem henholdsvis "CD4+" og "CD8+".
    9. Vælg populationen af ikke-TB, og skift akserne til (CD56 x myeloid). Anvend en polygonport på den samlede CD56-positive population inklusive de dobbelt positive hændelser, og navngiv den "NK-celler". Anvend en polygonport på CD56-negativ og myeloid positiv population og navngiv den "myeloid".
    10. Opret en tabel til procent- og tællestatistikker for alle populationer og eksporter til et regnearkssoftware (se Materialetabel). Beregn %hCD45 kimærisme =% hCD45 / (% hCD45 + mCD45).
    11. Ekskluder HIS-mus, der er <20% hCD45+ (af mCD45 + hCD45) til yderligere eksperimenter.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev PBMC'er fremstillet ved anvendelse af en 1,077 g / ml densitetsgradientseparation for en renere RBC-udtømning. Denne procedure udelukkede humane og musegranulocytter fra PBMC-laget. Alternativt kan RBC-lysis anvendes.

3. Injektion af tumorer i mus

  1. Før tumorinjektion skal du bekræfte T-cellenumre fra 14 ugers blødningsdata. Tumorer injiceres for at være klar til høst mellem 20-26 uger, hvis T-cellerne er >20%, og mellem 24-28 uger, hvis T-cellerne er <20% af den samlede immuncellepopulation. Denne injektionstiming sikrer, at musene er 20-28 uger gamle og har et tilstrækkeligt antal T-celler ved afslutningen af undersøgelsen.
  2. Injektion af cellelinjeafledte xenotransplantater (CDX)
    BEMÆRK: Proceduren er beskrevet ved hjælp af MDA-MB-231 brystadenokarcinomceller (se materialetabel) som et eksempel.
    1. Optø en prøve frosne celler, vask 1x ved resuspendering i 10 ml DMEM suppleret med 10% FBS, 1% PenStrep og 1% ikke-essentielle aminosyrer, og centrifuger ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C. Substratet suges til og resuspenderes i 10 ml DMEM suppleret med 10 % FBS, 1 % PenStrep og 1 % ikke-essentielle aminosyrer i en T25-kolbe, og der inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2.
      BEMÆRK: Cellelinjerne er godkendt af PCR for at sikre korrekt celletype. Cellesupernatanter testes for mycoplasma via et biokemisk assay før injektion.
    2. Passage og udvidelse af cellerne under eksponentiel vækstfase ved ca. 80% sammenløb.
      1. Opsug mediet, skyl cellerne med 5-10 ml steril PBS (pH 7,2), og inkuber med 1 ml 0,25% trypsin-EDTA i 1-5 minutter, indtil cellerne løsner sig fra kolben.
      2. Tilsæt 5 ml af den samme DMEM og bland ved pipettering op og ned. Hele 6 ml cellesuspension ledes over i en ny vævskulturbehandlet T75-kolbe (1:3 fortynding), og der tilsættes yderligere 10 ml DMEM.
      3. Passage cellerne hver 2-3 dage ved 80% sammenløb ved 1: 3 fortyndingsbelægning i DMEM for at udvide cellerne.
    3. Høst cellerne med 0,25% trypsin-EDTA under den eksponentielle vækstfase inden for seks passager og vask med PBS. Bland PBS og kældermembranekstrakt (se materialetabel) i forholdet 1: 1 og tilsæt cellerne i en slutkoncentration på 5 x 107 celler / ml.
    4. Musene bedøves med isofluran som beskrevet i trin 2.1.1. Subkutant injiceres 100 μL (5 x 106 celler) tumorcellesuspension i hver flanke ved hjælp af en 23 G nål.
  3. Udfør injektion af patientafledte xenotransplantater (PDX) ved hjælp af trocars. Injektionsproceduren og andre udviklings- og vedligeholdelsesinstruktioner til PDX-modellen findes i litteratur27.

4. Måling af tumorvækst

  1. Kontroller tumorfremskridt en gang om ugen efter implantation ved at føle langs flanken for tumorvækst. Når tumorerne er håndgribelige, bedøves musene med isofluran (som beskrevet i trin 2.1.1) og barberes på hver flanke med en elektrisk trimmer, idet man sørger for omkring tumoren for at forhindre sårdannelser, når tumoren vokser.
    BEMÆRK: Mus kan barberes før tumorinjektion for at forhindre skader på huden omkring tumorerne; Imidlertid kan hastigheden af hårvækst hindre tumormålinger.
  2. Mål længden og bredden af tumorerne to gange om ugen ved hjælp af kalibre og registrer målingerne i mm. Rapporter tumormålinger som tumorvolumen (mm3) ved hjælp af formlen Equation 1. Pas på ikke at lade tumorbyrden overstige 2.000 mm 3 pr. Enkelt tumor eller et samlet volumen på 3.000 mm3.
    BEMÆRK: Retningslinjer for brug af mus i kræftforskning varierer fra sted til sted. Der henvises til politikker for pasning og brug af dyr på forskerinstitutionen.

5. Lægemiddelbehandlinger

  1. Alloker HIS-musene i ækvivalente behandlingsgrupper baseret på hCD45-kimærisme, hCD3-kimærisme og hCD8-kimærisme. Når tumorerne når 100 mm3 i gennemsnit, skal du begynde lægemiddelbehandlinger.
    BEMÆRK: Antallet af mus pr. gruppe er baseret på antallet af HIS-mus genereret fra CB. Der anbefales mindst fire mus pr. gruppe. Ikke-todelt matchning af flere grupper (f.eks. i R-vivo Manila-software) er nyttig til denne gruppering28.
  2. Lægemiddelvej og hyppighed
    1. Anti-PD-1-hæmmere (nivolumab, pembrolizumab) injiceres intraperitonialt (i.p.) ved 30 mg/kg 1x ugentligt eller 20 mg/kg 2x ugentligt ved enkeltbehandlinger eller 10-15 mg/kg 2x ugentligt ved kombinationsbehandlinger.
    2. Dosis kombinationsterapierne, såsom målrettede terapier, kemoterapi og bestråling, i overensstemmelse med det eksperimentelle design. Målrettede terapier og kemoterapier kan gives gennem oral sonde, i.p. injektion eller mad.
      BEMÆRK: Doser kan varieres og optimeres i henhold til offentliggjorte data og tumormodellen. Dosisundersøgelser testes ofte hos immundeficiente modtagere forud for HIS-museundersøgelser.
  3. Overvåg musene mindst 3x om ugen for sundhedsmæssige ændringer såsom vægttab, løs afføring, krumbøjet kropsholdning, nedsat mobilitet og pelstab. Nogle symptomer kan være tegn på lægemiddeltoksicitet eller GVHD, og lægemiddeldosering skal muligvis reduceres eller stoppes. Aflive mus efter behov i henhold til politikker for dyrepleje og brug.

6. Høstning af musevæv og tumorer ved afslutningen af undersøgelsen

  1. Aflive musene enkeltvis i henhold til institutionelle og veterinære retningslinjer ved hjælp af komprimeret CO 2 -gas med en strømningshastighed på2,75 l / min. Overvåg musene i CO2 i 1 min forbi døden og udfør derefter cervikal dislokation som en sekundær form for eutanasi.
  2. Blodindsamling
    1. Saml blod via intrakardial punktering. Hold musen i opretstående stilling og stik en 1 ml sprøjte med en 25 G kanyle direkte ind i hjertet fra en linje lige til venstre for midterlinjen og under ribbenene. Saml blodet i en sprøjte ideelt gennem en lang trækning og overfør til et mærket 1,5 ml rør.
      BEMÆRK: Yderligere nåleindsættelser kan udføres for at opsamle yderligere blod fra hjørnerne af lungehulen med omhu.
    2. Lad blodet stå ved 4 °C i 1 time, og centrifuger derefter blodet i en mikrocentrifuge i 6 minutter ved 7.800 x g. Saml den klare væske (sera) over blodgrænsefladen i et andet rent og mærket 1,5 ml rør. Serumet opbevares ved -20 °C til downstream-analyse, såsom humane og museinflammatoriske cytokin- eller immunglobulintitere.
  3. Dissektion af væv
    1. Efter injektion og vækst af tumorceller i musene og administration af lægemiddelbehandlinger høstes vævene. Placer musene på et skumdissektionsbræt med stifter til at holde dem på plads, og arme og ben strakt ud i 45° vinkler. Lav et snit op midt på torsoen, start nær bækkenet og strækker sig til hagen, og prøv at undgå at skære peritoneum (selvom dette ikke er vigtigt). Træk huden til kanten og hold den på plads med stifter.
    2. Uddrag lymfeknuderne (LN'er) ved hjælp af fine tang i følgende rækkefølge: inguinal, aksillær, cervikal, mesenterisk, hiatal.
      BEMÆRK: Hos HIS-mus er LN'erne ofte meget små, ligner anlage eller "betændte" med et tydeligt udseende i modsætning til en vildtypemus. Derfor tages væv, der ligner LN'er, fra hvert sted. De perifere LN'er fremstår ofte som væskefyldte "bolde", mens de mesenteriske LN'er er tættere. De mesenteriske LN'er er de mest indlysende og konsistente og observeres som en eller to forskellige tættere knuder i modsætning til en streng.
    3. Placer LN'erne på den ene side af frostede glasglas i 8 ml høstmedium i en petriskål. Hold diasene vinkelret på hinanden med de frostede kanter indad, tryk forsigtigt vævene, indtil det cellulære indhold frigives.
    4. Skyl diasene flere gange ved at trække dem fra hinanden og sammen for at frigøre den maksimale mængde celler. Saml cellerne med en 5 tommer glaspipette og filtrer dem gennem en 9 tommer bomuldstilsluttet pipette i et mærket 15 ml konisk rør.
    5. Uddrag milten fra øverste venstre side af maven ved hjælp af enten to par tang eller tang og saks. Bemærk miltens størrelse som et skøn over volumen af resuspensionsmedier. Opsaml og filtrer milten ved mekanisk fordøjelse ved hjælp af frostede glasskinner, som med LN'erne.
      BEMÆRK: Enhver teknik til fremstilling af væv til enkeltcellesuspensioner kan anvendes.
    6. Udfør tælling og resuspension af cellerne fra vævsprøver som beskrevet nedenfor.
      1. Lymfecellerne centrifugeres ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C. Opsug væsken og resuspender cellepillen i 1 ml høstmedium med DNase.
      2. Erytrocytter fjernes fra miltcellerne ved inkubation med 3 ml ACK-lysisbuffer ved RT i 3 minutter efterfulgt af tilsætning af 10 ml høstmedium/DNase. Miltcellerne centrifugeres igen, supernatanten suges til syne, og cellerne resuspenderes i 1-10 ml høstmedie/DNase, baseret på miltstørrelsen (f.eks. 1 ml for meget små milt og op til 10 ml for de største milt).
      3. Der tilsættes en 10 μL delprøve cellesuspension til 90 μL medier og regne med et hæmocytometer. LN'erne og miltcellerne centrifugeres, supernatanterne suges op, og cellerne resuspenderes i høstmedium i en koncentration på 1 x 108 celler/ml eller mindst 80 μl.
    7. Uddrag tumorerne.
      1. Fjern tumoren fra den åbne flanke ved at holde tumoren med tang, mens du langsomt klipper ved tumormargenerne med dissektionssaks.
      2. Når tumoren er fjernet, vejer den og fjerner 1/4 for RNA og immunhistokemi (IHC) behandling. Opdel 1/4 tumoren i halvdelen; Den ene halvdel (1/8 af hele tumoren) anbringes i en kryovial, lynfryses i væskeN2 og opbevares ved -80 °C til genomiske undersøgelser nedstrøms.
      3. Placer den anden 1/8 af tumoren i et mærket prøverør indeholdende 10% formalin. Den næste dag skylles og resuspenderes vævet i 70% ethanol indtil fremtidig brug. Placer de resterende 3/4 af tumoren i en 6 cm skål og hak i ~ 1 mm stykker ved hjælp af et skalpelblad.
      4. Transport tumorstykkerne ind i et dissociationsrør (se materialetabel), skyl skålen med 5 ml ufuldstændig tumorinfiltrerende leukocyt (TIL) medium og tilsæt til dissociationsrøret.
        BEMÆRK: For tumorer, der vejer >0,4 g, skylles skålen med 10 ml TIL ufuldstændigt medie og tilsættes til dissociationsrøret.
      5. Tilsæt kollagenasepræparat (se materialetabel) i en slutkoncentration på 50 mg/ml til vævet i dissociationsrøret. Dissocier vævet ved hjælp af mekanisk dissociation ved 37 °C i 30 min til 1 time, afhængigt af tumorens fasthed.
      6. Efter dissociation føres suspensionen over et 100 μm filter ind i et 50 ml konisk rør og skylles filteret med 10 ml TIL hele mediet. Serumet i dette medie vil stoppe kollagenasereaktionen og beskytte cellerne mod yderligere nedbrydning.
      7. Centrifuger enkeltcellesuspensionen ved 360 x g i 10 minutter ved 4 °C. Resuspender pelleten i lige nok høstmedium med DNase, så cellesuspensionen let kan passere gennem en P1000-pipettespids og registrere volumen til nedstrømsanalyse.
        BEMÆRK: Et mindre volumen øger samlingen af tumorimmunceller, men er mere modtagelig for flowcytometertilstopninger.

7. Cellefarvning og flowcytometriske analyser

  1. Pletforberedelse og cellebelægning
    1. Forbered farvningscocktails: På høstdagen tilføjes antallet af prøver til farvningsarket (tabel 2; "Konventionelt flow A-panel", "Spectral Flow B-panel" og "Konventionelt flow C-panel" regneark) til alle pletter og udskrivning. Forbered overfladepletcocktails til pletter A og B i farvningsbuffer (SB) ved at tilsætte hvert antistof individuelt med en ny spids, markere hvert reagens på farten og opbevare ved 4 ° C, indtil det er nødvendigt. Forbered passende levedygtighedsfarvestoffer i azidfri PBS og opbevar ved 4 °C, indtil de skal bruges (varm til RT før brug). Forbered overfladeplet C-cocktail på dag 2 i SB sammen med intracellulære pletter B og C i deres respektive permeabiliseringsbuffere.
    2. Opret et pladelayout for alle prøver i farvningsarket, og alikvote 100 μL azidfri PBS til hullerne. Inkluder ufarvede kontroller for hvert væv og plet (til spektral cytometri).
    3. Cellerne tilsættes til plader med 96 brønde indeholdende 50 μL PBS. For plet A resuspenderes hver vævsgruppe i det passende volumen som angivet på farvningsarket og opbevares ved 4 °C, indtil det opsamles på flowcytometer samme dag. For pletter B og C tilsættes 25 μL lymfe og 60 μL ikke-lymfevævscellesuspensioner til hullerne med PBS.
    4. Udfør in vitro-stimulering af cytokiner til påvisning ved intracellulær farvning ved anvendelse af plet C.
      1. Pletpladen C 96 centrifugeres fra trin 7.1.3 ved 680 x g i 3 minutter ved 4 °C. Der tilsættes 200 μL TIL-komplette medier (RPMI 1640, 10 mM HEPES [pH 7], 10% FBS) til hvert hul. Pladen opbevares med celleopslæmningen ved 4 °C natten over.
      2. Tidligt den følgende morgen fortyndes cellestimuleringscocktailen (se materialetabel) 1:500 i komplette TIL-medier. Pladen med cellesuspensionen centrifugeres ved 680 x g for at pelletere cellerne, og svip for at fjerne mediet. Cellerne resuspenderes i 200 μL af den tilberedte cellestimuleringscocktail og inkuberes ved 37 °C i 1 time.
      3. Der tilsættes 25 μL proteintransporthæmmeropløsning indeholdende monensin ved en 1:1.000 fortynding i komplette TIL-medier, cellerne blandes og inkuberes ved 37 °C i yderligere 4 timer for at muliggøre intracellulær akkumulering af cytokiner.
    5. Udfør cellefarvning.
      1. For pletter A og B (dag 1) og for pletter C (dag 2) centrifugeres ved 680 x g i 3 minutter ved 4 °C. Svip pladerne og tilsæt de passende levedygtighedsfarvestoffer til brøndene. Bland godt ved forsigtigt at pipettere op og ned med en multikanalpipette og inkuber i 15 minutter ved RT.
      2. Pladerne centrifugeres (som i trin 7.1.5.1), derefter tilsættes passende overfladepletter til pladerne, og blandes forsigtigt ved pipettering med en flerkanalpipette. Der inkuberes i 15 minutter ved 4 °C og centrifugeres igen. Svip pladerne, vask cellerne ved forsigtigt pipettering op og ned med 150 μL SB, og centrifuger.
      3. Svip pladerne, gentag vasken ved forsigtigt at pipettere op og ned med 150 μL SB, og centrifuger ved 680 x g i 3 minutter ved 4 °C. For plet A resuspenderes hver vævsgruppe i det relevante volumen som anført på farvningsarket og opbevares ved 4 °C. For plet B skal du rette med FoxP3 transkriptionsfaktorsæt fikseringsmiddel (se materialetabel) i 30 minutter ved RT. For plet C fastgøres 1% (v / v) paraformaldehyd i SB i 30 minutter ved RT.
      4. Fastpladerne centrifugeres ved 480 x g i 3 minutter ved 4 °C. Vask 1x i SB. For plet B kan cellerne efterlades natten over.
      5. Permeabiliser cellerne: Resuspender hullerne i 150 μL FoxP3 transkriptionsfaktorsætpermeabiliseringsbuffer for plet B og i 0,5% (w / v) saponin i SB for plet C. Inkuber i 15 minutter ved RT. Centrifuger de faste plader ved 480 x g i 3 minutter ved 4 °C.
      6. Svip pladerne og tilsæt de respektive intracellulære farvningscocktails til plet B og plet C. Inkuber i 30 minutter ved RT.
      7. Fastpladerne centrifugeres ved 480 x g i 3 minutter ved 4 °C, og pladerne svirpes. Vask cellerne med 150 μL af de tilsvarende permeabiliseringsbuffere (plet B, FoxP3 transkriptionsfaktorsæt permeabiliseringsbuffer; plet C, saponin).
      8. Pladerne svirpes og vaskes ved pipettering op og ned i 150 μL SB. Der centrifugeres ved 480 x g i 3 minutter ved 4 °C. Svip pladerne, og ophvirvl cellerne i SB igen efter vævsgruppe i de relevante mængder, der er noteret på farvningsarket.
        BEMÆRK: Prøverne er nu klar til erhvervelse ved spektral flowcytometri.
      9. Opsæt flowcytometeret (se materialetabellen) med passende enkeltfarvede kontroller for hver plet og ufarvede prøver for hver vævsgruppe for at tage højde for forskelle i autofluorescens under ublanding. Hent de relevante mængder pr. vævsgruppe som defineret i farvningsarket (tabel 2), og eksportér .fcs-filerne.
  2. Analyse af flowcytometridata
    1. Brug flowcytometrianalysesoftwaren (se materialetabel) til at oprette et nyt arbejdsområde. Opret nye grupper for hvert organ (LN, milt og TIL). Importer .fcs-filerne for hvert organ til gruppen.
    2. Opret et bivariat prikplot, indstil akserne til (FSC-A x SSC-A), og anvend en polygonport på cellulære hændelser, undgå hændelser på kanterne (alle celleporte). Vælg de cellulære hændelser, skift akserne til (FSC-A x FSC-H), og anvend en polygonport på begivenhederne på den lineære diagonal, undtagen begivenheder, der afviger fra diagonalen for at generere "singlets" -porten. Vælg porten "singlets", og skift akserne til (hCD45 x mCD45). Anvend polygonporte på de positive hCD45- og mCD45-hændelser, og navngiv dem henholdsvis "menneske" og "mus".
    3. Vælg den menneskelige population, og skift Y-aksen til Live/Dead Aqua. Anvend en polygonport på den levende / døde negative, hCD45-positive befolkning og navngiv den "levende menneske". Vælg musepopulationen, og skift X-aksen til Live/Dead Aqua. Anvend en polygonport på den levende / døde negative, mCD45-positive population, og navngiv den "levende mus".
    4. På samme måde skal du vælge moderporten og X- og Y-akserne som beskrevet i regnearkene "Konventionel flow A-gating", "Spectral Flow B-gating" og "Konventionel flow C-gating" (tabel 2) for at isolere de angivne populationer (f.eks. humane B-celler, aktiverede T-celler).
      BEMÆRK: Repræsentativ gating for hver plet (Bleed, A, B, C) er inkluderet i supplerende fil 2.
    5. Opret tælle- og frekvenseksporttabeller i flowcytometrianalysesoftwaren for alle populationer, og eksporter til et regnearkssoftware. Forældrepopulationen for hyppigheder er angivet i tabel 2.
    6. Brug dataene til at generere grafer baseret på eksperimentelle behandlingsgrupper.
      BEMÆRK: Dataene kan også analyseres ved hjælp af R-pakker i analysesoftwaren. Der kan oprettes en enkelt .fcs-fil fra alle prøver, der skal analyseres, ved hjælp af sammenkædningsfunktionen. Disse data kan reduceres dimensionelt med T-SNE algoritmen, samtidig med at der tilføjes søgeordsparametre for vævstype og behandlingsgruppe. FlowSOM-algoritmen kan derefter bruges til at gruppere populationer, og ClusterExplorer-værktøjet kan bruges til at identificere populationerne. Nye cellepopulationer kan identificeres på denne måde, sammenlignes visuelt og kvantificeres mellem behandlingsgrupper eller inden for forskellige væv.
    7. Korrelere immunparametre for tumorer inden for samme behandlingsgruppe med væksten for den tumor for at definere immuntyper, der korrelerer med tumorvæksthæmning. Kvantificer tumorvækst ved den specifikke væksthastighed (SGR) for den tumor, en måling, der tager højde for forskellen i tumorvolumener over en bestemt tid. Denne måling normaliserer tumorer høstet på forskellige dage på grund af musens sundhed og behandlingsstartdatoer.
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Efter flanketumorprotokollen og eksperimentel tidslinje (figur 1) blev tumorvækst og immunrespons på en målrettet tyrosinkinasehæmmer (TKI) terapi og nivolumab kombinationsbehandling undersøgt i to forskellige humane kolorektal cancer (CRC) PDX'er. TKI-lægemidlerne er blevet undersøgt i immunodeficiente værter for kun at evaluere tumorvækst29. Denne model muliggjorde undersøgelsen af ændringer i immunresponset af TKI alene, og endnu vigtigere, i kombination med anti-PD-1. Denne undersøgelse var fokuseret på de kombinationsbehandlede kohorter i to forskellige eksperimenter, der repræsenterer en vellykket evaluering ved hjælp af HIS-BRGS-mus og et teknisk fejlbehæftet eksperiment. For PDX CRC307P bremsede kombinationsbehandlingen væksten af tumoren, som bestemt af tumorvækstvolumener over tid, tumorvægte ved høst og SGR (figur 2A-C). På den anden side var væksten af en PDX udviklet fra en metastatisk tumor fra den samme patient, PDX CRC307M, testet i en anden kohorte af HIS-BRGS-mus, mindre påvirket af den samme kombinationsbehandling i HIS-BRGS-mus (figur 2D).

På trods af allokeringen af HIS-BRGS-mus i ækvivalente eksperimentelle grupper baseret på samlet human (hCD45+) og human T-celle (hCD3+) kimærisme i blodet før tumorimplantation (figur 3A-C), steg begge parametre i det perifere immunsystem (milt) og de tumorinfiltrerende leukocytter (TIL) i kombination behandlede CRC307P-bærende mus, men ikke CRC307M-modellen (figur 3D-F ). Især selvom begge HIS-BRGS-kohorter havde sammenlignelig human og T-cellekimærisme i blodet før tumorimplantation, havde CRC307M-kohorten meget lidt lymfeknudekimærisme og undlod at udvikle mærkbare niveauer af T-celler i milten i den behandlede kohorte (figur 3D-F). CRC307M-eksperimentet repræsenterer et teknisk fejlbehæftet eksempel på grund af generelt utilstrækkelig miltcellekimærisme og lymfeknudekimærisme. Vi foreslår udelukkelse af HIS-mus, der har <20% hCD3+ kimærisme i milten og/eller <1,5 x 106 hCD45+ celler i lymfeknuderne ved undersøgelsens afslutning. For CRC307M-modellen blev størstedelen af musene udelukket, hovedsagelig på grund af meget små lymfeknuder, hvilket kun efterlod to mus pr. Kohorte.

Yderligere undersøgelse af de humane T-celler (figur 4A) afslørede flere aktiverede (HLA-DR +) T-celler i CR307P-tumorerne, men ikke lymfen, fra kombinationsbehandlede mus (figur 4B). I CRC307M "negative" eksperiment var der ingen signifikant stigning i HLA-DR + T-celler i TIL'erne hos behandlede HIS-BRGS-mus, når man analyserede alle musene, hvilket tyder på, at denne ikke-optimale HIS-BRGS-kohorte påvirkede datasignifikansen på grund af HIS-mus med meget få T-celler og ingen aktivering (figur 4B). Faktisk nåede stigningen i HLA-DR + T-celler i TIL'erne i CRC307M-modellen betydning, når man udelukkede HIS-BRGS-mus med lav T-cellekimærisme (figur 4B). Derudover var der flere effektorhukommelse CD8 + T-celler og færre TIM-3 + (terminalt opbrugte) T-celler i de kombinationsbehandlede CRC307P-tumorer, mens denne forskel ikke blev bemærket i CRC307M-modellen (figur 4C, D). I dette eksperiment blev der ikke observeret ændringer i frekvenserne af cytotoksiske T-celler (Granzyme B+ eller IFNγ+TNFα+) populationer blandt de kombinationsbehandlede mus, selvom højere cytotoksiske T-celler blev observeret i ubehandlede (figur 4E) eller behandlede (data ikke vist) tumorer i forhold til lymfeknuder. Det er vigtigt, at selvom der ikke var nogen forskelle i frekvenser blandt T-cellepopulationerne, blev der observeret et højere antal cytotoksiske T-celler i tumorerne hos behandlede HIS-CRC307P-BRGS-mus med højere frekvenser (figur 3B) og antal humane T-celler i tumorerne. På den anden side viste denne kombinationsbehandling ingen effekt på frekvenserne af Tregs i hverken CRC307P lymfeorganer eller tumorer, selvom CRC307M-dataene viste en tendens til reduceret Tregs, der skulle valideres i et andet eksperiment (figur 4F).

Ud over at forhøre det humane immunsystem blev immunrelaterede ændringer på tumorceller også evalueret ved anvendelse af flowcytometri (figur 5A). Ved at gating på EpCAM+ celler, som beskrevet i protokollen, blev der fundet øget ekspression af både MHC klasse I (HLA-ABC) og klasse II (HLA-DR) på CRC307P tumorceller udskåret fra kombinationsbehandlede HIS-BRGS mus (figur 5B). I CRC307M-modellen inducerede den samme lægemiddelbehandling HLA klasse II-ekspression på tumorcellerne, dog i mindre grad end i CRC307P-modellen (figur 5C). Kombinationsbehandlingen synes således at inducere opregulering af MHC klasse II, uafhængig af T-celleinfiltration (figur 5B,C). Især var MHC-ekspressionen på tumorcellerne lavere end på humane immunceller, et fund i overensstemmelse med humane tumorrapporter (figur 5B). Tilsvarende resulterede kombinationsbehandlingen i øget PD-L1-ekspression på EpCAM+ CRC307P-tumorcellerne (figur 5D).

Endelig blev korrelationer mellem immunresponser og tumorvækst undersøgt ved at plotte sgr af tumoren versus immunparametre. Selvom hyppigheden af CD4+ T-celler i tumorer hos ubehandlede mus ikke viste nogen sammenhæng med tumorvækst, viste øgede CD4+ T-celler en signifikant (figur 6A) korrelation med mindre tumorvækst og mere specifikt HLA-DR+ aktiverede T-celler (figur 6B) i de kombinationsbehandlede HIS-mus.

Figure 1
Figur 1: Skematisk illustration af generering af HIS-BRGS-mus og implantation af humane CDX- eller PDX-tumorer til kræftimmunterapistudier. Tidslinjen er vigtig for at sikre tilstedeværelsen af T-celler, der tager måneder at indpode i de CB-afledte HIS-mus. Oprettet med Biorender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Analyse af tumorvækst. Tumorvækstmålinger for CRC307P PDX i kontrol (sort) eller kombinationsbehandlet (rød) HIS-BRGS-mus kvantificeret med (A) volumen over tid, (B) vægte ved afslutningen af undersøgelsen eller (C) specifik væksthastighed (SGR). d) SGR for CRC307M PDX. Data inkluderer tumorer implanteret i begge flanker af seks HIS-BRGS-køretøjsmus, syv kombinationsbehandlede BRGS-mus til CRC307P og kun to køretøjs- og kombinationsbehandlede mus til CRC307M på grund af høje eksklusionsrater. Statistiske analyser mellem to uafhængige grupper blev udført ved hjælp af uparret, parametrisk to-gruppe Welchs t-test. **p < 0,01, ****p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Human immun- og T-cellekimærisme i lymfeorganer og tumorer hos CRC PDX tumorbærende HIS-BRGS-mus. (A) Repræsentativ flowcytometrianalyse af humane (hCD45) og mus (mCD45) hæmatopoietiske og humane T-celler (CD3) i perifert blod (PBMC) før tumorimplantation og i LN'er og tumorer (TIL) ved undersøgelsens afslutning. (B,C) Ækvivalent human og T-cellekimærisme i blod efter 14 uger i HIS-BRGS-mus efterfølgende injiceret med (B) CRC307P eller (C) CRC307M PDX'er og ubehandlet eller behandlet med kombinationsimmunterapi (Tx). (D-F) Forhøjede humane T-celler i lymfeorganer og tumorer (TIL) hos kombinationsbehandlede HIS-BRGS-CRC307P-mus, men ikke HIS-BRGS-CRC307M-mus. Data viser humane og T-cellefrekvenser på Y-aksen som en procentdel af forældrepopulationen i (D) lymfeknuder (LN'er), (E) milt (SP) og (F) tumorer hos individuelle mus ved afslutningen af undersøgelsen. Statistiske analyser mellem to uafhængige grupper blev udført ved hjælp af uparret, parametrisk to-gruppe Welchs t-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Analyse af T-celleaktivering ved flowcytometri i perifere lymfeorganer og tumorer i CRC PDX-bærende HIS-BRGS-mus. (A) Repræsentativ flowcytometrianalyse af T-celler i LN'er, milt (SP'er) og tumorer (TIL'er) udskåret fra HIS-BRGS-mus, der måler følgende populationer: aktiverede T-celler (HLA-DR+), naive T-celler (CD45RA+ CCR7+), Tem (CD45RA-, CCR7-), Tregs (CD25+, FoxP3+) og cytotoksiske T-celler (Granzyme B+, TNFα+ og/eller IFNγ+). (B-D) Frekvenser af angivne T-cellepopulationer i lymfeorganer eller TIL'er af HIS-CRC307P-BRGS og HIS-CRC307M-BRGS-mus: (B) HLA-DR+ aktiverede T-celler, (C) CCR7-CD45RA-Tem CD8+ T-celler, (D) hæmmende receptor TIM-3 CD8+ T-celler, (E) Granzyme B CD8+ T-celler og (F) CD25+FoxP3+ CD4+ Tregs. For HIS-CRC307M-BRGS-musene i (B) viser det første datasæt alle mus analyseret ved høst, mens det andet datasæt kun inkluderer dem med tilstrækkelig LN og miltcellekimærisme. I alle grafer repræsenterer de fyldte symboler for 307M mus med tilstrækkelig kimærisme, mens åbne symboler er udelukket HIS mus. Statistiske analyser mellem to uafhængige grupper blev udført ved hjælp af uparret, parametrisk to-gruppe Welchs t-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Flowcytometrianalyse af MHC klasse I, II og PD-L1 på humane tumorer i HIS-BRGS-mus. (A) Repræsentative flowcytometripunktplot, der illustrerer gatingstrategi til måling af ekspressionsniveauer af MHC klasse I (HLA-ABC), KLASSE II (HLA-DR) og PD-L1 på epitel (EpCAM+) humane tumorer i HIS-BRGS-mus. (B-D) Gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) af HLA-ABC (B), HLA-DR (B,C) og PD-L1 (D) på humane (hCD45+) og tumorceller (EpCAM+) fra dissocierede CRC307P (B,D) eller CRC307M (C) PDX'er udskåret fra HIS-BRGS-mus. Statistiske analyser mellem to uafhængige grupper blev udført ved hjælp af uparret, parametrisk to-gruppe Welchs t-test. *p <0,05, **p<0,01, ****p<0,0001. Forkortelse: Tx = Behandling Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Analyse af immunkorrelater af respons. SGR'erne af CRC307P tumorvækst i flankerne af ubehandlede (Veh) eller kombinationsimmunterapibehandlede (Tx) HIS-BRGS-mus blev plottet versus frekvensen af (A) CD4 + eller (B) HLA-DR + T-celler som en indikator for immunparametre, der korrelerer med reduceret tumorvækst (dvs. mindre SGR). En simpel lineær regressionsanalyse blev udført for at indikere signifikante korrelationer. R2-værdier angiver graden af korrelation. *p < 0,05. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Arbejdsark med overfladefarvningspanel. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: Cellefarvningspaneler og flowcytometri-gating-regneark. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende fil 1: Opskrifter på medier og løsninger anvendt i undersøgelsen. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Repræsentativ flowcytometri gating for hver plet. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I løbet af de sidste 6 år har vores forskerteam ved hjælp af vores ekspertise inden for både immunologi og humaniserede mus udviklet en meget tiltrængt præklinisk model til at teste immunterapier på en række humane tumorer 3,7,30,31. Denne protokol understreger overvejelsen af modellens variabilitet med særlig vægt på de immunterapicentrerede humane T-cellepopulationer. I denne protokol beskrives dannelsen af HIS-mus såvel som immunanalysen af både deres lymfeorganer og tumoren. Flowcytometriprotokoller udviklet til traditionelle kompensationsbaserede cytometre og spektrale cytometre er også inkluderet. Evnen til at forhøre ændringer i immunsystemet i store tumorprøver såvel som i periferien repræsenterer en betydelig fordel for denne prækliniske model. En yderligere fordel ved dette system er, at flere mus, der har den samme unikke humane tumor, kan allokeres i separate kohorter og behandles med forskellige kombinationer af immunterapilægemidler, der i det væsentlige udfører et "mini" lægemiddelforsøg. Kombineret muliggør disse to faktorer undersøgelse af virkningsmekanismerne og resistensen af foreslåede (kombinations)immunterapier. Modellen har evnen til at teste lægemiddeltiming og dosering på en lang række humane tumorer og en lang række immunmålrettede behandlinger, herunder målrettede terapier, biologiske lægemidler, kemoterapier, stråling og endda cellebaserede terapier.

På grund af den iboende variabilitet i HIS-musekimærismen kræves et højere antal mus pr. behandlingsgruppe end en typisk syngeneisk tumormodel. Ved hjælp af disse protokoller er kohorter på fem til syv HIS-BRGS-mus pr. behandlingsarm tilstrækkelige til at opnå statistiske forskelle i immunparametre. Denne variation i kimærisme repræsenterer en udfordring i denne model og skal overvejes. Et eksperimentelt eksempel, der demonstrerer både tumorvækst og immunrespons ved en kombinationsbehandling til en CRC PDX, er blevet vist her, samt et eksempel, hvor den samme behandling til en anden CRC PDX ikke viste et lignende stærkt respons. Denne forskel i eksperimentelt resultat kan skyldes den forskellige PDX (samme patient, men metastatisk vs. primær) og / eller kimærisme. I det andet forsøg var der meget få T-celler i milten hos størstedelen af musene i behandlingsgruppen samt meget små LN'er; flere laboratorier har vist, at den største batch-til-batch variabilitet blandt HIS-modeller er T-cellefrekvenserne 20,32,33. Vi har også vist, at menneskelig indkapsling i LN'erne korrelerer stærkt med T-cellekimærisme32. På tværs af mere end 40 eksperimenter har vi bemærket et krav om 20% T-celler i milten for tilstrækkelig kimærisme til at detektere behandlingsrelaterede immunændringer3. Ved ofring er det vigtigt at sikre signifikant T-cellerekonstitution, som vi definerer som bemærkelsesværdig LN-udvikling (>1,5 x 106 hCD45-celler) og >20% T-celler (af hCD45+ celler) i milten. HIS-mus, der ikke opfylder dette krav, fjernes fra datasættet. Chimerisme i blodet før tumorimplantat hjælper med at forudsige denne parameter; Der er dog forskelle i T-celleudvikling hos individuelle mus over tid, der bedst overvejes i slutningen af undersøgelsen. Heldigvis udvikler ca. 95% af HIS-BRGS-musekohorterne i denne model tilstrækkelig T-cellekimærisme til immunterapistudier. Det skal understreges, at dataanalysen i slutningen af undersøgelsen altid skal omfatte forhør af kimærismen i de perifere lymfeorganer og fjerne HIS-mus, der ikke opfylder den menneskelige og T-cellekimærisme. I forsøg med mindre end fire HIS-mus pr. kohorte efter denne justering bør resultaterne valideres med en anden HIS-BRGS-kohorte afledt af en særskilt CB.

Selvom vores gruppe har fokuseret på modtageren af BRGS-musemodellen, er der adskillige modeller tilgængelige over hele verden. For eksempel er NSG (NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg tm1Wjl / SzJ) modtager den mest karakteriserede model og ligner NOG (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Sug / Jic) og endda NRG (NOD-Rag1 tm1Mom Il2rg tm1Wjl / SzJ) -modellen, der bruger Rag-mutationer til genetisk ablation af mus T- og B-celler i stedet for SCID-mutationen20. Disse modeller er alle på NOD-baggrundsstammen og har således SIRPaNOD-allel, hvilket er vigtigt for at undgå fagocytose af humane celler ved værtsmakrofager13. Rapporter tyder på lignende kimærisme i disse "grundlæggende" humaniserede musemodeller som i BRGS-modellen, med for det meste humane B-celler i de første par måneder efterfulgt af engraftment med humane T-celler32,34,35. I disse modeller er NK og myeloide celler underrepræsenteret i forhold til et menneske36,37. Der er flere iterationer af "næste generation" humaniserede musemodtagere, der kan forbedre afstamningsspecifik udvikling gennem introduktion af menneskespecifikke cytokiner. For eksempel har NSG-SGM3 (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl Tg (CMV-IL3, CSF2, KITLG) 1Eav / MloySzJ) mus humane IL-3, GM-CSF og SCF cytokiner og forbedret human myelopoiesis 37 eller humane HLA-transgener til selektion på en human HLA (f.eks. NSG-HLA-A2 eller BRGS-HLA-A2 / DR238,39). Omfattende anmeldelser om dette emne20,21 anbefales til læsere. HIS-musemodeller bør valideres i hvert laboratorium med deres egen kilde til humane stamceller. Denne validering bør omfatte kvantificering af den humane kimærisme, herunder humane B-, T-, NK- og myeloide celler, i blodet over tid og i LN'er, milt, knoglemarv og thymus mellem 16-20 uger og igen mellem 24-28 uger. Der bør lægges særlig vægt på multi-lineage engraftment, herunder T-cellekimærisme. Derudover bør vækstraterne for tumorer testes i HIS-musene i forhold til ikke-humaniserede mus af samme stamme. Det er plausibelt, at signifikante forbedringer i HIS musemodeller kan resultere i afvisning af tumoren. Som et ressourcebesparelsesforsøg udføres disse vækstkurver ofte samtidig med immunresponsdataanalyserne. Kommercielt tilgængelige HIS-mus bør indeholde omfattende kimærismedata fra blodet samt henvisninger til kimærisme i andre organer fra andre kohorter.

De eksperimentelle protokoller til analyse af tumorvækst og immunresponser i HIS-mus til humane CDX'er eller PDX'er kræver standard laboratoriemetoder og immunologisk ekspertise. Genereringen af HIS-mus, herunder isolering af stamcellerne, injektion i immundefekte mus og test af menneskelig kimærisme i blodet, er alle relativt enkle laboratorieprocedurer. De logistiske spørgsmål omkring denne procedure, herunder avl af meget immundefekte musestammer, erhvervelse af en pålidelig kilde til humane HSC'er osv., Er den mest besværlige komponent i protokollen. Proceduremæssigt skal der lægges større vægt på eksperimentelt design, herunder tidspunktet for tumorimplantation (typisk 19-21 uger, når der er nok T-celler til stede), lægemiddeldosering og timing ved studiets afslutning. Erhvervelse af tumormålingsdata er en anden rutinemæssig procedure. Men da immundataene ofte er mere informative end tumorvækstdataene i dette system, kan flowcytometriske analyser af immunresponserne give relevante data. Farvning af celler til flowcytometri er en anden ligetil procedure, ligesom det er at lære at køre et flowcytometer. Analysen og fortolkningen af disse data kræver imidlertid unik ekspertise. Mens dette manuskript fungerer som rygrad til at udføre immuno-onkologiske undersøgelser i HIS-mus, skal hvert protokoltrin optimeres i et nyt laboratorium. Erfaring, opretholdelse af musenes sundhed, erhvervelse af tilstrækkelige HSC'er fra CB-enheder og timing af tumorinjektionerne til tilstrækkelige T-celler kræver mest opmærksomhed og fejlfinding.

HIS-BRGS-musene udviser ekstrem immunundertrykkelse svarende til den, der observeres i mange humane tumorer. Denne immunsuppression er bemærkelsesværdig, da høje ekspressionsniveauer af PD-1 og TIGIT, endnu mindre TIM-3, observeres på T-cellerne i de perifere immunorganer hos HIS-BRGS-musene 3,7. Disse T-celler viser også markører for immunaktivering, herunder høj ekspression af HLA-DR og lav ekspression af CCR7 og CD45RA, hvilket indikerer T-effektorceller, som vist her i figur 4 og i referencer 3,7. Denne kvalitet er et centralt paradoks for systemet; immunsuppressionen tillader vækst af allogene humane tumorer i nærvær af en allogen HIS med hastigheder svarende til eller endda hurtigere end ikke-humaniserede BRGS eller nøgne (Nu / J) mus 3,7,23. Imidlertid har immunstimuli vist sig at være i stand til at overvinde denne immunsuppression og afvise en tumor 7,8. Selvom signifikante ændringer i tumorvækst mellem køretøjs- og behandlede mus ikke altid observeres, er der fundet signifikante forskelle i immunfænotyper oftere, så analyse af tumorvæksthastighederne korreleret med immunfænotyper foreslås. I denne analyse blev immunparametre fundet, der signifikant korrelerer med reduceret tumorvækst3. Disse data tyder på, at bestemte "immunokorrelater" er behandlingsrelaterede og deltager i tumorkontrol. Således giver tumorvækstmålinger kombineret med immunfænotyper i HIS-musemodellen vigtige prækliniske data med hensyn til tumorimmunresponser på unikke humane tumorer. Udfordringen for enhver præklinisk model er korrelation til kliniske resultater. HIS mus onkologi feltet har flere eksempler på klinisk korrelation: 1) vi og andre har vist, at den humane immuninfiltration korrelerer med tumortypen 3,22,23,40; 2) vi har vist vellykket behandling med anti-PD-1 i et ACC Lynch syndrom PDX taget fra en patient, der efterfølgende reagerede på denne behandling31; og 3) vi har vist overlegne svar på en CRC MSS hi PDX, en kræft med høje responsrater i klinikken over den notorisk dårligt reagerende CRC MSS PDX7. Sammen med in vitro og andre in vivo modeller udgør disse data en sammenhæng til oversættelse til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke både Animal Research Facility (OLAR) for deres pleje af vores mus og Flow Cytometry Shared Resource støttet af Cancer Center Support Grant (P30CA046934) på vores institut for deres enorme hjælp i alt vores arbejde. Vi anerkender også både Gail Eckhardt og Anna Capasso for vores indledende samarbejde, der studerer immunterapier til humane PDX'er i vores HIS-BRGS-model. Denne undersøgelse blev delvist støttet af National Institutes of Health P30CA06934 Cancer Center Support Grant med brug af PHISM (Pre-clinical Human Immune System Mouse Models) Shared Resource, RRID: SCR_021990 and Flow Cytometry Shared Resource, RRID: SCR_022035. Denne forskning blev delvist støttet af NIAID fra National Institutes of Health under kontraktnummer 75N93020C00058.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe w/needles McKesson 1031815
15 mL tubes Grenier Bio-One 188271
2-mercaptoethanol Sigma M6250
50 mL tubes Grenier Bio-One 227261
AutoMACS Pro Separator Miltenyi 130-092-545
BD Golgi Stop Protein Transport Inhibitor with monensin BD Bioscience BDB563792
BSA Fisher Scientific BP1600100
Cell Stim Cocktail Life Technologies 509305
Chill 15 Rack Miltenyi 130-092-952
Cotton-plugged glass pipettes Fisher Scientific 13-678-8B
Cultrex Basement membrane extract R&D Systems 363200502
Cytek Aurora Cytek
DNase Sigma 9003-98-9
eBioscience FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set Invitrogen 00-5523-00
Embryonic Stemcell FCS Gibco 10439001
Eppendorf Tubes; 1.5 mL volume Grenier Bio-One 616201
Excel Microsoft
FBS Benchmark 100-106 500mL
Ficoll Hypaque GE Healthcare 45001752
FlowJo Software BD Biosciences
Forceps - fine Roboz Surgical  RS5045
Forceps normal Dumont RS4919
Formaldehyde Fisher F75P1GAL
Frosted Glass Slides Corning 1255310
Gentlemacs C-Tubes Miltenyi    130-096-334
GentleMACS Dissociator Miltenyi 130-093-235
glass pipettes DWK Life Sciences 63A53
Glutamax Gibco 11140050
HBSS w/ Ca & Mg Sigma 55037C
HEPES Corning MT25060CI
IgG standard Sigma I2511
IgM standard Sigma 401108
IMDM Gibco 12440053
Liberase DL Roche 5466202001
LIVE/DEAD Fixable Blue Thermo L23105
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MEM Gibco 1140050
mouse anti-human IgG-AP Southern Biotech JDC-10
mouse anti-human IgG-unabeled Southern Biotech H2
mouse anti-human IgM-AP Southern Biotech UHB
mouse anti-human IgM-unlabeled Southern Biotech SA-DA4
MultiRad 350 Precision X-Ray
PBS Corning 45000-446
Pen Strep Gibco 15140122
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713A
p-nitrophenyl substrate Thermo 34045
PRISM Graphpad
Rec Hu FLT3L R&D systems 308-FK-005/CF
Rec Hu IL6 R&D systems 206-IL-010/CF
Rec Hu SCF R&D systems 255SC010
RPMI 1640 Corning 45000-39
Saponin Sigma 8047-15-2
Scissors McKesson 862945
Serological pipettes 25 mL Fisher Scientific 1367811
Sterile filter Nalgene 567-0020
Sterile molecular water Sigma 7732-18-5
Yeti Cell Analyzer Bio-Rad 12004279
Zombie Green biolegend 423112

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chulpanova, D. S., Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Mouse tumor models for advanced cancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 4118 (2020).
  2. Olson, B., Li, Y., Lin, Y., Liu, E. T., Patnaik, A. Mouse models for cancer immunotherapy research. Cancer Discovery. 8 (11), 1358-1365 (2018).
  3. Marin-Jimenez, J. A., et al. Testing cancer immunotherapy in a human immune system mouse model: correlating treatment responses to human chimerism, therapeutic variables and immune cell phenotypes. Frontiers in Immunology. 12, 607282 (2021).
  4. Yin, L., Wang, X. J., Chen, D. X., Liu, X. N., Wang, X. J. Humanized mouse model: a review on preclinical applications for cancer immunotherapy. American Journal of Cancer Research. 10 (12), 4568-4584 (2020).
  5. Cogels, M. M., et al. Humanized mice as a valuable pre-clinical model for cancer immunotherapy research. Frontiers in Oncology. 11, 784947 (2021).
  6. Jin, K. T., et al. Development of humanized mouse with patient-derived xenografts for cancer immunotherapy studies: A comprehensive review. Cancer Science. 112 (7), 2592-2606 (2021).
  7. Capasso, A., et al. Characterization of immune responses to anti-PD-1 mono and combination immunotherapy in hematopoietic humanized mice implanted with tumor xenografts. Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 37 (2019).
  8. Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. The FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
  9. Yong, K. S. M., et al. Humanized mouse as a tool to predict immunotoxicity of human biologics. Frontiers in Immunology. 11, 553362 (2020).
  10. Shen, H. W., Jiang, X. L., Gonzalez, F. J., Yu, A. M. Humanized transgenic mouse models for drug metabolism and pharmacokinetic research. Current Drug Metabolism. 12 (10), 997-1006 (2011).
  11. Bosma, G. C., Custer, R. P., Bosma, M. J. A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature. 301 (5900), 527-530 (1983).
  12. Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. The Journal of Immunology. 154 (1), 180-191 (1995).
  13. Legrand, N., et al. Functional CD47/signal regulatory protein alpha (SIRP(alpha)) interaction is required for optimal human T- and natural killer- (NK) cell homeostasis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13224-13229 (2011).
  14. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  15. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  16. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  17. Traggiai, E., et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science. 304 (5667), 104-107 (2004).
  18. Theocharides, A. P., Rongvaux, A., Fritsch, K., Flavell, R. A., Manz, M. G. Humanized hemato-lymphoid system mice. Haematologica. 101 (1), 5-19 (2016).
  19. Goldman, J. P., et al. Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain. British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).
  20. Stripecke, R., et al. Innovations, challenges, and minimal information for standardization of humanized mice. EMBO Molecular Medicine. 12 (7), (2020).
  21. Allen, T. M., et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nature Immunology. 20 (7), 770-774 (2019).
  22. Gammelgaard, O. L., Terp, M. G., Preiss, B., Ditzel, H. J. Human cancer evolution in the context of a human immune system in mice. Molecular Oncology. 12 (10), 1797-1810 (2018).
  23. Rios-Doria, J., Stevens, C., Maddage, C., Lasky, K., Koblish, H. K. Characterization of human cancer xenografts in humanized mice. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (1), 000416 (2020).
  24. Gombash Lampe, S. E., Kaspar, B. K., Foust, K. D. Intravenous injections in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. (93), e52037 (2014).
  25. Lang, J., Weiss, N., Freed, B. M., Torres, R. M., Pelanda, R. Generation of hematopoietic humanized mice in the newborn BALB/c-Rag2null Il2rγnull mouse model: a multivariable optimization approach. Clinical Immunology. 140 (1), 102-116 (2011).
  26. Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: a multifaceted challenge. Cytometry Part A. 97 (2), 116-125 (2020).
  27. Bagby, S., et al. Development and maintenance of a preclinical patient derived tumor xenograft model for the investigation of novel anti-cancer therapies. Journal of Visualized Experiments. (115), e54393 (2016).
  28. Laajala, T. D., et al. Optimized design and analysis of preclinical intervention studies in vivo. Scientific Reports. 6, 30723 (2016).
  29. Na, Y. S., et al. Establishment of patient-derived xenografts from patients with gastrointestinal stromal tumors: analysis of clinicopathological characteristics related to engraftment success. Scientific Reports. 10 (1), 7996 (2020).
  30. Tentler, J. J., et al. RX-5902, a novel beta-catenin modulator, potentiates the efficacy of immune checkpoint inhibitors in preclinical models of triple-negative breast cancer. BMC Cancer. 20 (1), 1063 (2020).
  31. Lang, J., et al. Development of an adrenocortical cancer humanized mouse model to characterize anti-PD1 effects on tumor microenvironment. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (1), 26-42 (2020).
  32. Lang, J., et al. Studies of lymphocyte reconstitution in a humanized mouse model reveal a requirement of T cells for human B cell maturation. The Journal of Immunology. 190 (5), 2090-2101 (2013).
  33. Katano, I., et al. NOD-Rag2null IL-2Rγnull mice: an alternative to NOG mice for generation of humanized mice. Experimental Animalas. 63 (3), 321-330 (2014).
  34. Brehm, M. A., et al. Parameters for establishing humanized mouse models to study human immunity: analysis of human hematopoietic stem cell engraftment in three immunodeficient strains of mice bearing the IL2rγ(null) mutation. Clinical Immunology. 135 (1), 84-98 (2010).
  35. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of immunodeficient mice bearing human immune systems by the engraftment of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 1438, 67-78 (2016).
  36. Andre, M. C., et al. Long-term human CD34+ stem cell-engrafted nonobese diabetic/SCID/IL-2Rγnull mice show impaired CD8+ T cell maintenance and a functional arrest of immature NK cells. The Journal of Immunology. 185 (5), 2710-2720 (2010).
  37. Wunderlich, M., et al. Improved multilineage human hematopoietic reconstitution and function in NSGS mice. PLoS One. 13 (12), 0209034 (2018).
  38. Lee, J., Brehm, M. A., Greiner, D., Shultz, L. D., Kornfeld, H. Engrafted human cells generate adaptive immune responses to Mycobacterium bovis BCG infection in humanized mice. BMC Immunology. 14, 53 (2013).
  39. Masse-Ranson, G., et al. Accelerated thymopoiesis and improved T-cell responses in HLA-A2/-DR2 transgenic BRGS-based human immune system mice. European Journal of Immunology. 49 (6), 954-965 (2019).
  40. Oswald, E., et al. Immune cell infiltration pattern in non-small cell lung cancer PDX models is a model immanent feature and correlates with a distinct molecular and phenotypic make-up. Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (4), 004412 (2022).

Tags

Kræftforskning nr. 190

Erratum

Formal Correction: Erratum: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors
Posted by JoVE Editors on 05/25/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. The Authors section was updated from:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

to:

Jordi M. Lanis1
Matthew S. Lewis1
Hannah Strassburger1
Kristina Larsen1
Stacey M. Bagby2
Adrian T. A. Dominguez2
Juan A. Marín-Jiménez3
Roberta Pelanda1
Todd M. Pitts2
Julie Lang1
1Department of Immunology and Microbiology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
2Division of Oncology, School of Medicine, University of Colorado Denver Anschutz Medical Campus
3Department of Medical Oncology, Catalan Institute of Oncology (ICO-L’Hospitalet)

Test af kræftimmunotermiske lægemidler i en humaniseret musemodel, der bærer humane tumorer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lanis, J. M., Lewis, M. S.,… More

Lanis, J. M., Lewis, M. S., Strassburger, H., Larsen, K., Bagby, S. M., Dominguez, A. T. A., Marín-Jiménez, J. A., Pelanda, R., Pitts, T. M., Lang, J. Testing Cancer Immunotherapeutics in a Humanized Mouse Model Bearing Human Tumors. J. Vis. Exp. (190), e64606, doi:10.3791/64606 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter