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Immunology and Infection

Génération d’un modèle de thyroïdite auto-immune spontanée chez la souris

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Plusieurs types de modèles animaux de la thyroïdite de Hashimoto ont été établis, tout comme la thyroïdite auto-immune spontanée chez la souris NOD. Les souris H-2h4 sont un modèle simple et fiable pour l’induction HT. Cet article décrit cette approche et évalue le processus pathologique pour une meilleure compréhension du modèle murin SAT.

Abstract

Ces dernières années, la thyroïdite de Hashimoto (HT) est devenue la maladie thyroïdienne auto-immune la plus courante. Elle se caractérise par une infiltration lymphocytaire et la détection d’autoanticorps sériques spécifiques. Bien que le mécanisme potentiel ne soit pas encore clair, le risque de thyroïdite de Hashimoto est lié à des facteurs génétiques et environnementaux. À l’heure actuelle, il existe plusieurs types de modèles de thyroïdite auto-immune, y compris la thyroïdite auto-immune expérimentale (EAT) et la thyroïdite auto-immune spontanée (SAT).

L’EAT chez la souris est un modèle courant pour l’HT, qui est immunisée avec un lipopolysaccharide (LPS) combiné à la thyroglobuline (Tg) ou complété par un adjuvant complet de Freund (CFA). Le modèle de souris EAT est largement établi chez de nombreux types de souris. Cependant, la progression de la maladie est plus probablement associée à la réponse des anticorps Tg, qui peut varier selon les expériences.

SAT est également largement utilisé dans l’étude de l’HT dans le NOD. Souris H-2h4. Le hochement de tête. La souris H2h4 est une nouvelle souche obtenue à partir du croisement de la souris diabétique non obèse (NOD) avec la B10. A(4R), qui est significativement induit pour l’HT avec ou sans iode alimentaire. Pendant l’induction, le NOD. La souris H-2h4 a un taux élevé de TgAb accompagné d’une infiltration lymphocytaire dans le tissu folliculaire thyroïdien. Cependant, pour ce type de modèle murin, il existe peu d’études permettant d’évaluer de manière exhaustive le processus pathologique lors de l’induction de l’iode.

Un modèle murin SAT pour la recherche sur l’HT est établi dans cette étude, et le processus de changement pathologique est évalué après une longue période d’induction d’iode. Grâce à ce modèle, les chercheurs peuvent mieux comprendre le développement pathologique de l’HT et examiner de nouvelles méthodes de traitement de l’HT.

Introduction

La thyroïdite de Hashimoto (HT), également connue sous le nom de thyroïdite lymphoïde chronique ou thyroïdite auto-immune, a été signalée pour la première fois en 19121. L’HT se caractérise par une infiltration lymphocytaire et des lésions du tissu folliculaire thyroïdien. Les tests de laboratoire se manifestent principalement par une augmentation des anticorps spécifiques de la thyroïde, y compris les anticorps anti-thyroglobuline (TgAb) et les anticorps anti-peroxydase thyroïdienne (TPOAb)2. L’incidence de l’HT est comprise entre 0,4% et 1,5%, ce qui représente 20% à 25% de toutes les maladies thyroïdiennes, et cette valeur a augmenté ces dernières années3. De plus, un grand nombre d’études ont rapporté que l’HT est associée à l’oncogenèse et à la récurrence du carcinome papillaire de la thyroïde (CTP)4,5; Les mécanismes potentiels sont encore controversés. La thyroïdite auto-immune est également un facteur important dans l’infertilité féminine6. Par conséquent, la pathogenèse de l’HT doit être claire, pour laquelle un modèle animal stable et simple est essentiel.

Pour étudier l’étiologie de l’HT, deux principaux types de modèles murins ont été utilisés, y compris la thyroïdite auto-immune expérimentale (EAT) et la thyroïdite auto-immune spontanée (SAT) dans les présentes études 7,8. Les souris sensibles ont été immunisées avec des antigènes thyroïdiens spécifiques (y compris la thyroïde brute, la thyroglobuline purifiée [TG], la peroxydase thyroïdienne [TPO], l’ectodomaine TPO recombinant et certains peptides TPO) pour établir le modèle murin EAT. En outre, les adjuvants, y compris le lipopolysaccharide (LPS), l’adjuvant complet de Freund (CFA) et d’autres adjuvants inhabituels, sont également utilisés pendant la vaccination pour briser la tolérance immunitaire 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Le modèle SAT est un modèle important pour étudier le développement spontané de la thyroïdite auto-immune, qui est basé sur la NOD. Souris H-2h4. Le hochement de tête. La souris H-2h4 est une nouvelle souche obtenue à partir du croisement de NOD et B10. Souris A(4R), suivies de multiples rétrocroisements vers NOD, avec le gène de susceptibilité à la thyroïdite auto-immune IAk18,19. HOCHER. Les souris H-2h4 ne développent pas de diabète, mais ont une incidence élevée de thyroïdite auto-immune et de syndrome de Sjögren (SS)19. Des études ont montré que la molécule d’adhésion intracellulaire-1 (ICAM-1) est fortement exprimée dans le tissu thyroïdien de NOD. Souris H-2h4 à l’âge de 3-4 semaines. De plus, avec l’augmentation de l’apport en iode, l’immunogénicité de la molécule de thyroglobuline est renforcée, ce qui régule davantage l’expression de l’ICAM-1, qui joue un rôle important dans le processus d’infiltration des monocytes21. Ce modèle simule le processus auto-immun tout en vérifiant la relation entre la dose d’iode et la gravité de la maladie. La méthode établie est stable, avec une forte probabilité de succès. Le modèle SAT a été appliqué pour induire la thyroïdite auto-immune pendant de nombreuses années et continue d’être une méthode efficace pour étudier la pathogenèse de la thyroïdite auto-immune. Cependant, la méthode de construction actuelle du modèle EAT est plus compliquée et coûteuse; Différents laboratoires utilisent différentes méthodes d’immunisation et différents sites d’injection. En outre, les souris ayant des antécédents génétiques différents ont des taux d’induction différents, qui nécessitent une étude plus approfondie pour révéler le mécanisme puissant.

Cependant, le développement de la thyroïdite dans le modèle SAT est associé à l’iodure de sodium, au dimorphisme sexuel et aux conditions d’élevage. Pour révéler la procédure appropriée de thyroïdite auto-immune dans le modèle SAT, cet article a décrit la méthode d’induction de la thyroïdite auto-immune dans différentes conditions. En outre, il permet l’étude de la pathogenèse et du progrès immunologique de la thyroïdite auto-immune à différents stades de cette maladie.

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Protocol

Le protocole décrit ci-dessous a été approuvé par les directives de soin et d’utilisation établies par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Sichuan.

1. Préparation

  1. Hébergez toutes les souris dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes sous des cycles lumière-obscurité de 12 h (à partir de 07h00 et 19h00, respectivement). Maintenez la température ambiante à 22 °C. Changez les matériaux de literie chaque semaine. Fournir des quantités adéquates de chow et d’eau standard pour rongeurs.
  2. Lors de la préparation de la solution mère de NaI dans l’eau, peser 2,5 g du composé et le dissoudre dans 50 ml d’eau pure stérile sous vortex pour obtenir une solution mère de 5%. Conservez cette solution mère dans un congélateur à 4 °C, en évitant la lumière, jusqu’à 8 semaines.
  3. Pour préparer une solution de travail de NaI, prélever 2,5 mL de solution mère et la dissoudre dans 250 mL d’eau ordinaire comme eau potable quotidienne pour NOD. Souris H-2h4, pour donner une solution de travail de 0,05%.

2. Induction de la thyroïdite

  1. Modèle SAT
    1. Préparez le NOD. Souris H-2h4 (8 semaines) pour l’étude en hébergeant toutes les souris d’un seul sexe (sans dimorphisme sexuel) dans des cages de barrière (cinq animaux par cage) avec les conditions d’alimentation décrites à l’étape 1.1.
    2. Pour induire une thyroïdite auto-immune dans NOD. Souris H-2h4, nourrissez toutes les souris avec 0,05% de NaI pendant 8 semaines. Changez l’eau NaI chaque semaine et évaluez l’état des souris sur une base hebdomadaire, y compris l’apparence, le poids, l’appétit, l’état mental et la mobilité.
  2. Modèle EAT
    1. Préparer les souris BALB/c (âgées de 8 semaines) à l’étude en hébergeant toutes les souris d’un seul sexe (sans dimorphisme sexuel) dans des cages de barrière (cinq animaux par cage) avec les conditions d’alimentation décrites à l’étape 1.1. Nourrissez toutes les souris avec 0,05% de NaI pendant 8 semaines.
    2. Pendant les 2 premières semaines, injecter par voie sous-cutanée un mélange de CFA et de Tg (200 μL) une fois par semaine.
    3. À partir de la troisième semaine, injectez par voie sous-cutanée un mélange d’IFA et de Tg (200 μL) une fois par semaine pendant 3 semaines.

3. Mesures

  1. Préparation des échantillons de sang périphérique
    1. Après l’induction, anesthésier les souris avec un volume de 0,01 mL/g d’anesthésique par injection intrapéritonéale. Préparer l’anesthésique en mélangeant le midazolam (40 μg/100 μL pour la sédation), la médétomidine (7,5 μg/100 μL pour la sédation) et le tartrate de butorphanol (50 μg/100 μL pour l’analgésie) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      NOTE: Les concentrations spécifiques de chaque composant dans le mélange d’anesthésie sont: midazolam 13,33μg / 100μL, médétomidine 2,5 μg / 100μL et butorphanol 16,7 μg / 100 μL. Pour les doses spécifiques utilisées chez la souris, les doses sont: midazolam 4μg / g, médétomidine 0,75 μg / g et butorphanol 1,67 μg / g. La profondeur de l’anesthésie a été confirmée lorsque les muscles des membres de la souris se sont détendus, que les moustaches n’ont pas eu de réponse au toucher et qu’il y a eu une perte du réflexe de pédale.
    2. Une fois les souris anesthésiées, préparez les échantillons de sang périphérique, en fixant la souris d’une main et en appuyant sur la peau de l’œil pour faire saillie du globe oculaire. Ensuite, insérez le tube capillaire dans le coin interne de l’œil et pénétrez à un angle de 30-45 degrés par rapport au plan de la narine. Appliquez une pression tout en tournant doucement le tube capillaire. Le sang circulera dans le tube par capillarité.
    3. Mettre le sang dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 2 h, puis centrifuger à 1 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir l’échantillon. Pour une analyse plus approfondie, conserver le reste de l’échantillon à -80 °C.
  2. Préparation d’échantillons de tissus thyroïdiens
    1. Euthanasier l’animal sans cruauté conformément aux politiques institutionnelles. Ensuite, disséquez la paroi thoracique pour exposer le cœur, ouvrez l’oreillette droite et perfusez une solution saline dans le ventricule gauche à l’aide d’une aiguille de perfusion intraveineuse fixée à une seringue de 20 ml jusqu’à ce que le tissu devienne blanc.
    2. Fixez la souris sur la table de dissection avec des broches. Stérilisez le cou avec de l’éthanol à 75%. Coupez la peau de la souris le long de la ligne médiane du cou, du haut du sternum à la mâchoire inférieure, avec des ciseaux à tissu, pour exposer complètement le tissu du cou.
    3. Observez la paire de glandes roses, les glandes sous-maxillaires, en dessous desquelles se trouve le muscle antérieur de la trachée. Séparez les glandes et les muscles avec des ciseaux ophtalmiques et des forceps pour exposer la trachée et le cartilage thyroïdien.
    4. Séparez le tissu sous le cartilage, à l’aide d’une pince incurvée pour ramasser le cartilage et la trachée ensemble. Coupez les extrémités distales et proximales du cartilage et de la trachée, respectivement, et retirez la glande thyroïde avec la trachée.
    5. Immerger les glandes dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 12-24 h. Ensuite, transférez le tissu à 70% d’éthanol.
    6. Placer les lobes individuels du matériel de biopsie thyroïdienne dans les cassettes de traitement et déshydrater à travers le gradient d’alcool en série suivant: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, éthanol pendant 40 minutes chacun; 1/2 xylène + 1/2 éthanol absolu pendant 2 h; 100% xylène pendant 1,5 h; 100% xylène pendant 1,5 h; 1/2 xylène + 1/2 paraffine pendant 2 h; étuve à 40°C pendant 40 min; paraffine I pendant 30 min; et paraffine II pendant 30 min. Intégrez-les dans des blocs de cire de paraffine.
    7. Avant la coloration, dépaurner des coupes de tissu thyroïdien de 5 μm d’épaisseur dans du xylène (comme suit) et réhydrater en utilisant les concentrations décroissantes d’éthanol suivantes: xylène I pendant 10 min; xylène II pendant 10 min; xylène III pendant 10 min; éthanol absolu I pendant 5 min; éthanol absolu II pendant 5 min; 90% d’alcool pendant 5 min; 80% d’alcool pendant 5 min; 70% d’alcool pendant 5 min; et 50% d’alcool pendant 5 min.
    8. Colorer les tissus avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E). Colorer à l’hématoxyline pendant 15 min, rincer à l’eau du robinet pendant 15 min, ajouter de l’éthanol à 1% d’acide chlorhydrique pendant 10 s, rincer à l’eau courante, puis avec de l’éthanol à 50%, 70% et 80%, chacun pendant 3 min. Colorer à l’éthanol éosine à 0,5% pendant 2 min et rincer à l’eau courante. Placer successivement les sections de paraffine dans de l’éthanol à 75% pendant 2 min, de l’éthanol à 85% pendant 2 min, de l’éthanol absolu pendant 5 min et du xylène pendant 5 min. Fixez les tranches avec de la gomme neutre et des lames de verre.
    9. Pour évaluer l’étendue de la thyroïdite lymphocytaire, notez les sections thyroïdiennes comme suit: 0: peu ou pas d’infiltration lymphocytaire dans le tissu thyroïdien; 1+: plus de 1/8 de la glande est infiltrée dans un ou plusieurs foyers; 2+: pas plus de 1/4 de la glande est infiltrée par les lymphocytes; 3+: 1/4-1/2 de la glande est infiltrée par les lymphocytes; 4+: plus de la moitié de la glande est détruite.
      REMARQUE: Il est recommandé d’enlever le cartilage thyroïdien pour conserver toute la structure de la thyroïde de souris, qui est trop petite pour être retirée de la trachée.
  3. Mesure de TPOAb
    REMARQUE: Les cellules d’ovaire de hamster chinois (CHO) exprimant de manière stable la TPO de souris ont été établies dans notre laboratoire. L’ADNc TPO de souris a été excisé par XbaI et NheI. Ensuite, l’ADNc a été transféré à pcDNA5 / FRT. Une fois le plasmide construit avec succès, il a été transfecté dans les cellules CHO et sélectionné avec de l’hygromycine B (100 g / mL).
    1. Après la construction des cellules mTPO-CHO, diluer les sérums de souris de l’étape 3.1.3 (1:50) et incuber avec les cellules mTPO-CHO pendant 2 h. Après incubation, exclure la coloration cellulaire avec de l’iodure de propidium (1 g/mL) et analyser l’échantillon par cytométrie en flux à l’aide d’IgG anti-souris de chèvre conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine et purifiée par affinité. Cribler les populations unicellulaires survivantes par canaux FSC-A et SSC-A et sélectionner les cellules marquées FITC et PI dans les populations unicellulaires21.
    2. Inclure le sérum de souris BALB/c ou C57BL/6 non immunisées liées aux IgG comme témoin négatif. Inclure les anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la TPO22 humaine en tant que témoins positifs qui reconnaissent la TPO23 chez la souris. Exprimer les données de liaison TPO sous forme de moyens géométriques.
  4. Mesure de l’AcAb
    REMARQUE: Utilisez une trousse ELISA pour détecter la thyroglobuline en suivant les instructions du fabricant.
    1. Diluer les échantillons étalons dans le tube de microcentrifugation conformément aux instructions. Sortez le kit du réfrigérateur et conservez-le à température ambiante pendant 30 min.
    2. Réglez les puits standard, les puits vierges et les puits d’essai. Les puits vierges ne reçoivent que des tampons, tandis que les puits standard obtiennent des solutions standard. Ajouter 10 μL d’échantillons dans les puits d’essai. Lors de l’ajout des échantillons, essayez de ne pas toucher les parois des puits et secouez doucement la plaque pour déplacer les échantillons au fond des puits.
    3. Inclure le sérum de souris BALB/c immunisées avec Tg, CFA et IFA24 comme témoin positif et le sérum de NOD âgé de 8 semaines. Souris H-2h4 sur de l’eau ordinaire comme témoin négatif.
    4. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min. Diluer le tampon de lavage avec de l’eau distillée dans un rapport de 1:30. Ensuite, retirez le film d’étanchéité, secouez le liquide à l’intérieur de la plaque enzymatique et séchez-le tapoter sur du papier absorbant, puis ajoutez 350 μL de tampon de lavage pendant 30 s. Répétez cette procédure cinq fois, puis séchez les puits.
    5. Ajouter 50 μL de réactif de marquage enzymatique à chaque puits, à l’exception des puits blancs, et incuber dans un bain-marie à 37° pendant 30 min. Retirez le film d’étanchéité, secouez le liquide à l’intérieur de la plaque enzymatique et séchez-le en tapotant sur du papier absorbant.
    6. Ajouter 50 μL de révélateur A à chaque puits, suivi de 50 μL de révélateur B et agiter doucement les puits pour mélanger pendant 5 minutes. Ajouter 50 μL de la solution de terminaison dans chaque puits pendant 15 minutes pour arrêter la réaction. Mesurer l’absorbance (OD) de chaque puits à une longueur d’onde de 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Présentez les données TgAb sous forme de densité optique (DO) à 490 nm.
  5. Mesure de la T4 et de l’hormone stimulant la thyroïde (TSH)
    NOTA : Mesurer les taux de T4 et de TSH (dans des aliquotes de 10 μL) par ELISA en suivant les instructions du fabricant.
    1. Diluer le conjugué enzymatique à 1:11 avec le diluant de dosage; diluer les échantillons à mesurer (1:100) à l’aide de 0,01 M de PBS.
    2. Ajouter 10 μL de l’étalon et de l’échantillon aux puits correspondants, ajouter 100 μL de conjugué enzymatique à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 1 h.
    3. Jetez le liquide dans les puits et nettoyez-le trois fois avec un tampon de lavage.
    4. Ajouter 100 μL de 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) et incuber à température ambiante pendant 15 min.
    5. Ajouter 50 μL de solution stop et mélanger doucement pendant 15-20 s.
    6. Déterminer l’absorbance (OD) à l’aide d’un lecteur de microplaques à une longueur d’onde de 450 nm et calculer la concentration de l’échantillon.
    7. Utilisez un logiciel statistique pour effectuer le test t ou le test de somme de rang et tracez les résultats.

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Representative Results

Les changements histologiques étaient remarquablement différents chez les femmes et les hommes, la durée de l’apport en iode et la solution de NaI. Comme le montre la figure 1, ~10% de NOD. Les souris H-2h4 ont développé SAT même sans induction d’iode à l’âge de 24 semaines, et toutes les souris ont finalement développé une thyroïdite. Lorsqu’on leur donnait de l’eau régulière, il n’y avait pas de différence significative dans les changements histologiques entre les mâles et les femelles. L’ajout de NaI à l’eau potable a accéléré le développement de la thyroïdite. Dans les solutions de 0,005%, 0,05% et 0,5%, SAT a atteint une gravité maximale dans les semaines 16, 8 et 8, respectivement, après avoir administré l’eau NaI. Une fois la thyroïdite induite, l’infiltration lymphocytaire s’est poursuivie tout au long de la vie de la souris. Au cours de l’induction, les souris femelles semblaient avoir tendance à développer une thyroïdite plus sévère que les mâles dans la même condition, mais il n’y avait pas de différences significatives dans la gravité de l’infiltration lymphocytaire, qui pourrait être limitée par le nombre d’échantillons.

Lorsqu’on lui administrait de l’eau ordinaire sans iode supplémentaire, le taux de TgAb n’augmentait pas de manière significative à l’âge de 16 semaines, et aucune différence significative n’a été observée entre les hommes et les femmes. Taux d’AbT dans le NOD. Les souris H-2h4 ont commencé à augmenter à 24 semaines, sans différence entre les sexes, et les taux de TgAb ont continué d’augmenter jusqu’à 72 semaines (Figure 2A). Avec l’ajout de NaI à l’eau potable, les niveaux de TgAb ont commencé à augmenter aux semaines 16, 8 et 8 avec des solutions de 0,005%, 0,05% et 0,5% NaI, respectivement. Cependant, les taux de TgAb n’ont montré aucune différence entre les mâles et les femelles dans aucune des solutions (Figure 2B-D). Peu importe si de l’eau NaI a été administrée, les niveaux de TgAb ont atteint leur maximum à l’âge de 72 semaines (ou 64 semaines après la première administration d’eau NaI).

Il y avait un délai plus long dans la détectabilité des niveaux de TPOAb par rapport à TgAb. Ces anticorps ont rarement été détectés dans NOD. Souris H-2h4 avec de l’eau régulière à l’âge de 24 semaines. Lorsqu’elles étaient nourries avec de l’eau ordinaire, les femelles présentaient des niveaux de TPOAb beaucoup plus élevés que les mâles à 72 semaines (figure 2E). La même tendance de différence intersexuée émergeait également dans NOD. Souris H-2h4 pendant 16, 8 et 8 semaines lorsqu’elles ont reçu de l’eau NaI de 0,005%, 0,05% et 0,5%, respectivement (Figure 2F-H) Fait remarquable, cependant, lorsque la concentration de NaI était supérieure à 0,05% pendant l’induction, les niveaux de TPOAb ont atteint leur plus haut niveau 64 semaines après la première administration d’eau NaI, et il n’y avait aucune différence entre les mâles et les femelles (Figure 2G, H).

En outre, les taux sériques de TSH chez les mâles NOD. Les souris H-2h4 étaient significativement plus élevées que celles des femelles à différents stades d’alimentation, que l’eau NAI ait été administrée ou non. Lorsqu’on lui donne de l’eau ordinaire, les niveaux de TSH de NOD. Les souris H-2h4 ont commencé à augmenter à l’âge de 24 semaines, et une tendance similaire a été observée dans les groupes de régime iodé avec des concentrations de 0,005%, 0,05% et 0,5% à 16, 8 et 8 semaines, respectivement, après que l’iode ait été administré séparément. Les taux de TSH ont continué d’augmenter tout au long de la période d’induction, atteignant un sommet de 64 semaines. De plus, il y avait une différence significative dans les niveaux de TSH entre les hommes et les femmes dans le reste de la NOD. Souris H-2h4 (Figure 3A-D). HOCHER. Les souris H-2h4 n’ont pas souffert de goitre ou d’hypothyroïdie après l’ingestion d’iode. Peu importe si des agents d’iode ont été administrés, il n’y avait pas de différence liée au sexe dans les niveaux de T4 dans NOD. Souris H-2h4. Cependant, avec l’augmentation de la durée de l’induction, les niveaux de T4 avaient tendance à diminuer chez les deux sexes dans les groupes de l’eau iodée (aucune différence significative) (Figure 3E-H).

Un dimorphisme sexuel dans le processus pathologique et les niveaux de TPOAb ont été trouvés dans la descendance de NOD. Souris H-2h4, mais pas TgAb. Comme dans d’autres études25,26, les taux de TPOAb ont été significativement augmentés chez les souris modèles après avoir reçu de l’iodure alimentaire pendant 2 à 4 mois, et il y avait une différence liée au sexe. De plus, les taux de TSH étaient plus élevés chez les hommes que chez les femmes. Souris H-2h4 avec ou sans supplémentation en iodure alimentaire, ce qui est similaire à d’autres souches de souris. Cette différence est restée tout au long de la vie des animaux, qui peuvent ne pas avoir été influencés par les niveaux de TPOAb ou de TgAb.Lorsqu’elles ont été exposées à 0,05% de NaI, la plupart des souris ont développé une thyroïdite en 8 semaines, ce qui a eu un effet similaire avec 0,5% de NaI. Alors que 0,005% NaI a eu un effet similaire sur NOD. Souris H-2h4 nourries avec de l’eau ordinaire, la concentration de 0,05% NaI (après 8 semaines d’induction) pourrait être la condition préférable pour induire une thyroïdite auto-immune. T4 niveaux dans NOD. Les souris H-2h4 n’avaient aucune différence liée au sexe et n’étaient pas affectées par les agents iodés, ce qui est cohérent avec d’autres études27,28. Cela peut être dû au temps d’apparition relativement court de la maladie et à la fonction thyroïdienne compensatoire des souris, ce qui entraîne un phénomène similaire à l’hypothyroïdie subclinique chez les souris. Nous supposons que l’axe TSH des souris finirait par se décompenser et produire des différences au fil du temps.

Figure 1
Figure 1: Changements pathologiques et scores inflammatoires d’infiltration lymphocytaire des glandes thyroïdes dans NOD. Souris H-2h4 avec/sans régime iodé. (A,C,E,G) Changements pathologiques de la glande thyroïde sous le régime iodé de 0%, 0,005%, 0,05% et 0,5% par coloration HE; Grossissement 200x, N = 10/groupe. (B,D,F,G) L’inflammation thyroïdienne a été déterminée en fonction de la zone d’infiltration des lymphocytes; classification du degré d’infiltration lymphocytaire: 0: presque pas d’infiltration lymphocytaire; 1+: plus d’un huitième de la glande est envahi; 2+: un quart de la glande est envahi; 3+ : un quart à la moitié de la glande est envahie ; 4+: plus de la moitié de la glande est détruite. N = 10/groupe. Différences significatives : *p < 0,05 ; **p < 0,01. Abréviations : F = femme; M = mâle; NW = N semaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Autoanticorps dans NOD. Souris H-2h4 sur de l’eau ordinaire et contenant de l’iodure. (A-D) Autoanticorps contre Tg dans NOD. Souris H-2h4 sur de l’eau ordinaire (à l’âge de 8, 16, 24 et 72 semaines séparément) et de l’eau iodée - 0,005%, 0,05% et 0,5% (à 0, 8, 16 et 64 semaines après le début de l’eau iodée). (E-H) Autoanticorps à la TPO dans NOD. Souris H-2h4 sur de l’eau ordinaire (à l’âge de 8, 16, 24 et 72 semaines séparément) et de l’eau iodée - 0,005%, 0,05% et 0,5% (à 0, 8, 16 et 64 semaines après le début de l’eau iodée). Les valeurs pour TgAb sont rapportées en densité optique ELISA (OD) 490 nm (moyenne ±erreur type de la MEB moyenne) et les valeurs pour TPOAb sont rapportées en moyenne géométrique en cytométrie de flux. N = 8/groupe. Différences significatives : *p < 0,05 ; **p < 0,01; p < 0,001. Abréviations : Tg = thyroglobuline; TgAb = autoanticorps contre la Tg; TPO = peroxydase thyroïdienne; TPOAb = autoanticorps contre la TPO; F = femelle; M = mâle; NW = N semaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Niveaux de TSH et de T4 dans le NOD. Souris H-2h4 sur de l’eau ordinaire et contenant de l’iodure. (A-D) Taux de TSH et de T4 (E-H) sur de l’eau ordinaire (à l’âge de 8, 16, 24 et 72 semaines séparément) et de l’iodure - 0,005%, 0,05% et 0,5% (à 0, 8, 16 et 64 semaines après le début de l’eau iodée). Les valeurs de TSH ont été mesurées par dosage radioimmunologique (mU/L, moyenne ± erreur-type de la MEB moyenne). N = 8/groupe. Différences significatives : *p < 0,05 ; **p < 0,01; p < 0,001; *p < 0,0001. Abréviations : TSH = hormone stimulant la thyroïde; F = femelle; M = mâle; NW = N semaines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’HT se produit en raison d’un trouble du système auto-immun causé par des lymphocytes infiltrant la glande thyroïde, altérant davantage la fonction thyroïdienne, tout en produisant des anticorps spécifiques à la thyroïde. Les taux sériques de TSH, de TgAb et de TPOAb chez les patients HT sont significativement élevés27. À l’heure actuelle, deux principaux types de modèles murins sont largement utilisés pour étudier l’étiologie de la thyroïdite auto-immune: EAT et SAT29. Les souris EAT sont principalement immunisées à l’aide de protéines et d’adjuvants pour créer un environnement immunitaire anormal in vivo. Cette approche est utilisée depuis de nombreuses années et continue d’être efficace30,31. En outre, de nouvelles approches pour induire la thyroïdite comprennent l’injection de cellules dendriques (DC) pulsées avec Tg32, l’expression de Tg ou de TPO in vivo par des vecteurs adénoviraux ou des plasmides31, la transplantation de la glande thyroïde de souris allogéniques et l’injection de LPS. Cependant, la construction réussie du modèle de thyroïdite est généralement plus limitée par le contexte génétique du modèle murin expérimental, les antigènes syngéniques et les technologies de biologie cellulaire. En outre, des adjuvants spécifiques peuvent induire un environnement immunitaire plus complexe, ce qui rend difficile l’étude du processus immunologique de la thyroïdite auto-immune. Par conséquent, nous croyons que le SAT de NOD. Les souris H-2h4 peuvent mieux illustrer la pathogenèse de la thyroïdite de Hashimoto par rapport au modèle EAT. Plus précisément, l’immunisation avec des adjuvants puissants et de la thyroglobuline n’est pas nécessaire pour SAT33. Pour accélérer la progression de SAT, de l’iode est ajouté à l’eau potable de NOD. Souris H-2h4. Bien que la thyroïdite résultante ne partage pas le même mécanisme par lequel la thyroïdite se produit chez l’homme, l’iode est en effet un facteur d’influence important de la thyroïdite. De plus, dans ce modèle, les agents iodés peuvent rapidement induire une thyroïdite dans le NOD. souris H-2h4, et NOD. Les souris H-2h4 qui ne reçoivent pas d’iode peuvent éventuellement développer une thyroïdite ainsi. Comme le protocole expérimental dans la plupart des laboratoires est différent, nous avons effectué une évaluation plus complète de l’avis de développement. Souris H-2h4 lors de l’induction de la thyroïdite.

Dans le processus de construction du modèle, certains points nécessitent une attention particulière. L’ajout régulier d’eau potable et l’évaluation de l’état général des souris évitent la mort accidentelle des souris. Il est recommandé de ne pas garder plus de cinq souris par cage pendant l’induction pour fournir suffisamment d’alimentation en NaI à chaque souris. Cependant, le nombre de souris peut également changer en fonction des règles et règlements de l’institution spécifique pour les animaux. Comme le dimorphisme sexuel est trouvé dans notre laboratoire, des souris unisexes sont suggérées pour l’expérience (pour les expériences avec des exigences spéciales pour la détection d’anticorps spécifiques de la thyroïde, les femelles sont recommandées). Il est suggéré de sélectionner des souris âgées de 8 semaines, car 10% des souris développent une thyroïdite spontanée à l’âge de 16 semaines et toutes les souris développent une thyroïdite éventuellement sans eau NaI. Les lésions thyroïdiennes persistent tout au long de la vie des souris et la génération suivante développe une thyroïdite à la naissance. Par conséquent, pour la conservation des souris, il est recommandé d’utiliser des souris âgées de 8 semaines. Il est important de noter que TPOAb est plus approprié comme indicateur de détection que TgAb lors de l’utilisation de NOD. Souris H-2h4 pour imiter la thyroïdite. Cependant, lors de la mesure des niveaux de TPOAb, la durée de l’induction doit être plus retardée que celle de TgAb.

En conclusion, cet article décrit l’établissement d’un modèle SAT avec NOD. Les souris H-2h4 et l’exploration de l’influence de différents facteurs sur ce modèle. Bien qu’il ne simule pas parfaitement la pathogenèse et le mécanisme de la maladie thyroïdienne auto-immune, le NOD. La souris H-2h4 est un modèle animal stable avec un grand potentiel dans le domaine des maladies thyroïdiennes auto-immunes. Étant donné qu’il s’agit d’un modèle animal facile à construire et hautement reproductible, on espère que cette méthode contribuera à améliorer les applications des modèles murins SAT dans différentes institutions de recherche.

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Disclosures

Tous les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Acknowledgments

Les anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la TPO humaine (utilisés comme témoins positifs) ont été fournis par le Dr P. Carayon et le Dr J. Ruf (Marseille, France). Les auteurs remercient tous les participants à cette étude et les membres de notre équipe de recherche. Ce travail a été en partie soutenu par des subventions du Fonds de soutien postdoctoral de l’hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan, Chine (2020HXBH057) et du Programme de soutien scientifique et technologique de la province du Sichuan (projet n ° 2021YFS0166)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

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rétractation numéro 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Génération d’un modèle de thyroïdite auto-immune spontanée chez la souris
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Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

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