Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av en mus spontan autoimmun tyreoiditt modell

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Flere typer dyremodeller av Hashimotos tyreoiditt har blitt etablert, som har spontan autoimmun tyroiditt i NOD-musen. H-2h4 mus er en enkel og pålitelig modell for HT-induksjon. Denne artikkelen beskriver denne tilnærmingen og evaluerer den patologiske prosessen for en bedre forståelse av SAT-murinmodellen.

Abstract

I de senere år har Hashimotos tyreoiditt (HT) blitt den vanligste autoimmune skjoldbrusk sykdommen. Det er preget av lymfocyttinfiltrasjon og deteksjon av spesifikke serumautoantistoffer. Selv om den potensielle mekanismen fortsatt ikke er klar, er risikoen for Hashimotos tyreoiditt relatert til genetiske og miljømessige faktorer. For tiden finnes det flere typer modeller av autoimmun tyroiditt, inkludert eksperimentell autoimmun tyroiditt (EAT) og spontan autoimmun tyroiditt (SAT).

EAT hos mus er en vanlig modell for hormonbehandling, som immuniseres med lipopolysakkarid (LPS) kombinert med tyreoglobulin (Tg) eller suppleres med komplett Freunds adjuvans (CFA). EAT-musemodellen er allment etablert i mange typer mus. Imidlertid er sykdomsprogresjonen mer sannsynlig forbundet med Tg-antistoffresponsen, som kan variere i forskjellige eksperimenter.

SAT er også mye brukt i studiet av hormonbehandling i NOD. H-2H4 mus. The NOD. H2h4 mus er en ny stamme hentet fra krysset av nonobese diabetiker (NOD) mus med B10. A(4R), som induseres signifikant for hormonbehandling med eller uten jod. Under induksjonen ble NOD. H-2h4 mus har et høyt nivå av TgAb ledsaget av lymfocyttinfiltrasjon i skjoldbruskkjertelfollikkelvevet. For denne typen musemodell er det imidlertid få studier for å evaluere den patologiske prosessen under induksjon av jod.

En SAT-musemodell for HT-forskning er etablert i denne studien, og den patologiske endringsprosessen evalueres etter en lang periode med jodinduksjon. Gjennom denne modellen kan forskere bedre forstå den patologiske utviklingen av hormonbehandling og screene nye behandlingsmetoder for hormonbehandling.

Introduction

Hashimotos tyreoiditt (HT), også kjent som kronisk lymfatisk tyreoiditt eller autoimmun tyreoiditt, ble først rapportert i 19121. HT er preget av lymfocyttinfiltrasjon og skade på skjoldbruskkjertelfollikulært vev. Laboratorietester manifesteres hovedsakelig som økende thyroid-spesifikke antistoffer, inkludert anti-tyreoglobulinantistoff (TgAb) og anti-thyroid peroxidase antistoff (TPOAb)2. Forekomsten av HT ligger i området 0,4% -1,5%, og står for 20% -25% av alle skjoldbrusk sykdommer, og denne verdien har økt de siste årene3. I tillegg har et stort antall studier rapportert at hormonbehandling er assosiert med onkogenese og tilbakefall av papillær skjoldbruskkarsinom (PTC) 4,5; De potensielle mekanismene er fortsatt kontroversielle. Autoimmun tyroiditt er også en viktig faktor i kvinnelig infertilitet6. Derfor må patogenesen av hormonbehandling være tydelig, for hvilken en stabil og enkel dyremodell er avgjørende.

For å studere etiologien til HT har to hovedtyper av murinmodeller blitt anvendt, inkludert eksperimentell autoimmun tyroiditt (EAT) og spontan autoimmun tyroiditt (SAT) i de nåværende studiene 7,8. Følsomme mus ble immunisert med spesifikke thyreoideaantigener (inkludert rå skjoldbruskkjertel, renset tyreoglobulin [TG], tyreoideaperoksidase [TPO], rekombinant TPO-ektodomene og utvalgte TPO-peptider) for å etablere EAT murin-modellen. I tillegg brukes adjuvans, inkludert lipopolysakkarid (LPS), komplett Freunds adjuvans (CFA) og andre uvanlige adjuvanser, også under immuniseringen for å bryte ned immuntoleransen 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

SAT-modellen er en viktig modell for å studere spontan utvikling av autoimmun tyreoiditt, som er basert på NOD. H-2H4 mus. The NOD. H-2h4 mus er en ny stamme hentet fra krysset av NOD og B10. A(4R) mus, etterfulgt av flere tilbakekryssinger til NOD, med det autoimmune tyreoidittfølsomhetsgenet IAk18,19. NIKKE. H-2h4-mus utvikler ikke diabetes, men har høy forekomst av autoimmun tyreoiditt og Sjøgrens syndrom (SS)19. Studier har funnet at intracellulært adhesjonsmolekyl-1 (ICAM-1) er sterkt uttrykt i skjoldbruskkjertelvevet av NOD. H-2H4 mus ved 3-4 ukers alder. Videre, med økningen i jodinntaket, blir immunogeniciteten til tyroglobulinmolekylet forbedret, noe som ytterligere oppregulerer ekspresjonen av ICAM-1, som spiller en viktig rolle i prosessen med monocytinfiltrasjon21. Denne modellen simulerer den autoimmune prosessen mens den verifiserer forholdet mellom joddose og sykdommens alvorlighetsgrad. Den etablerte metoden er stabil, med stor sannsynlighet for suksess. SAT-modellen har blitt brukt til å indusere autoimmun tyroiditt i mange år og fortsetter å være en effektiv metode for å studere patogenesen av autoimmun tyroiditt. Den nåværende konstruksjonsmetoden til EAT-modellen er imidlertid mer komplisert og kostbar; Ulike laboratorier bruker forskjellige immuniseringsmetoder og injeksjonssteder. Videre har mus med ulik genetisk bakgrunn forskjellige induksjonshastigheter, som trenger videre studier for å avsløre den potente mekanismen.

Imidlertid er utviklingen av skjoldbruskbetennelse i SAT-modellen forbundet med natriumjodid, seksuell dimorfisme og oppdrettsforholdene. For å avsløre riktig prosedyre for autoimmun tyroiditt i SAT-modellen, beskrev denne artikkelen metoden for induksjon av autoimmun tyroiditt under forskjellige forhold. I tillegg tillater det studier av patogenesen og immunologisk fremgang av autoimmun tyroiditt i forskjellige stadier av denne sykdommen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen beskrevet nedenfor ble godkjent av retningslinjene for omsorg og bruk etablert av Institutional Animal Care and Use Committee of Sichuan University.

1. Forberedelse

  1. Hus alle mus i spesifikke patogenfrie forhold under 12 timers lys-mørke sykluser (begynner henholdsvis kl. 07:00 og 07:00). Hold romtemperaturen på 22 °C. Bytt sengetøymaterialer hver uke. Gi tilstrekkelige mengder standard gnager chow og vann.
  2. Ved fremstilling av stamoppløsningen av NaI i vann, vei 2,5 g av forbindelsen og oppløs den i 50 ml sterilt, rent vann under vortexing for å gi en stamløsning på 5%. Oppbevar denne stamoppløsningen i en 4 °C fryser, unngå lys, i opptil 8 uker.
  3. For å forberede en arbeidsløsning av NaI, trekk 2,5 ml stamløsning og oppløs den i 250 ml vanlig vann som daglig drikkevann for NOD. H-2H4 mus, for å gi en arbeidsløsning på 0,05%.

2. Induksjon av skjoldbruskbetennelse

  1. SAT-modell
    1. Forbered NOD. H-2H4 mus (8 ukers alder) for studien ved å huse alle mus av ett kjønn (ingen seksuell dimorfisme) i barrierebur (fem dyr per bur) med fôringsbetingelsene beskrevet i trinn 1.1.
    2. Å indusere autoimmun tyroiditt i NOD. H-2h4 mus, mate alle musene med 0,05% NaI i 8 uker. Endre NaI-vannet hver uke og vurder musens status på ukentlig basis, inkludert utseende, vekt, appetitt, mental status og mobilitet.
  2. EAT-modellen
    1. Forbered BALB/c-musene (8 ukers alder) for studien ved å oppbevare alle mus av ett kjønn (ingen seksuell dimorfisme) i barrierebur (fem dyr per bur) med fôringsbetingelsene beskrevet i trinn 1.1. Fôr alle musene med 0,05% NaI i 8 uker.
    2. I løpet av de første 2 ukene injiseres subkutant en blanding av CFA og Tg (200 μL) én gang i uken.
    3. Fra den tredje uken injiseres subkutant en blanding av IFA og Tg (200 μL) én gang i uken i 3 uker.

3. Målinger

  1. Fremstilling av perifere blodprøver
    1. Etter induksjonen, bedøv musene med et volum på 0,01 ml / g bedøvelse ved intraperitoneal injeksjon. Klargjør anestesimiddelet ved å blande midazolam (40 μg/100 μL for sedasjon), medetomidin (7,5 μg/100 μL for sedasjon) og butorfanoldartrat (50 μg/100 μL for analgesi) i fosfatbufret saltvann (PBS).
      MERK: De spesifikke konsentrasjonene av hver komponent i anestesiblandingen er: midazolam 13,33 μg / 100 μL, medetomidin 2,5 μg / 100 μL og butorfanol 16,7 μg / 100 μL. For spesifikke doser brukt til mus er dosene: midazolam 4 μg/g, medetomidin 0,75 μg/g og butorfanol 1,67 μg/g. Anestesidybden ble bekreftet når musens lemmuskulatur slappet av, værhårene ikke hadde berøringsrespons, og det var tap av pedalrefleks.
    2. Etter at musene er bedøvet, forberede perifere blodprøver, ved å feste musen med en hånd og trykke på øyehuden for å stikke øyebollet. Sett deretter kapillærrøret inn i det indre hjørnet av øyet og penetrerer i en 30-45 graders vinkel mot neseborets plan. Påfør trykk mens du forsiktig roterer kapillærrøret. Blod vil strømme inn i røret via kapillærvirkning.
    3. Ha blodet i kjøleskap på 4 °C i 2 timer og sentrifuger deretter ved 1000 × g i 10 minutter ved 4 °C for å få prøven. For videre analyse, lagre resten av prøven ved -80 °C.
  2. Fremstilling av vevsprøver fra skjoldbruskkjertelen
    1. Humant avlive dyret i henhold til institusjonelle retningslinjer. Deretter dissekerer brystveggen for å eksponere hjertet, kutt opp høyre atrium og fyll saltvann inn i venstre ventrikkel med en intravenøs infusjonsnål festet til en 20 ml sprøyte til vevet blir hvitt.
    2. Fest musen på disseksjonsbordet med pinner. Steriliser nakken med 75% etanol. Klipp musens hud langs medianlinjen i nakken fra toppen av brystbenet til underkjeven med vevsaks for å fullstendig eksponere nakkevevet.
    3. Vær oppmerksom på paret rosa kjertler, de submandibulære kjertlene, under hvilke er den fremre luftrørsmuskelen. Separat kjertlene og muskelen med oftalmisk saks og tang for å avsløre luftrøret og skjoldbruskkjertelen.
    4. Separat vevet under brusk, ved hjelp av buede tang for å plukke opp brusk og luftrør sammen. Klipp de distale og proksimale endene av henholdsvis brusk og luftrør, og fjern skjoldbruskkjertelen sammen med luftrøret.
    5. Fordyp kjertlene i 4% paraformaldehyd i 12-24 timer. Overfør deretter vevet til 70% etanol.
    6. Plasser de enkelte lobene av skjoldbruskbiopsimateriale i behandlingskassettene og dehydrer gjennom følgende serielle alkoholgradient: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, etanol i 40 minutter hver; 1/2 xylen + 1/2 absolutt etanol i 2 timer; 100% xylen i 1,5 timer; 100% xylen i 1,5 timer; 1/2 xylen + 1/2 parafin i 2 timer; ovn ved 40 ° C i 40 minutter; parafin I i 30 min; og parafin II i 30 min. Legg dem inn i parafinvoksblokker.
    7. Før farging, avvoks 5 μm tykke skjoldbruskkjertelseksjoner i xylen (som følger) og rehydrerer gjennom følgende reduserende konsentrasjoner av etanol: xylen I i 10 minutter; xylen II i 10 minutter; xylen III i 10 minutter; absolutt etanol I i 5 minutter; absolutt etanol II i 5 minutter; 90% alkohol i 5 minutter; 80% alkohol i 5 min; 70% alkohol i 5 minutter; og 50% alkohol i 5 min.
    8. Farg vevet med hematoksylin og eosin (H&E). Beis med hematoksylin i 15 minutter, skyll med vann fra springen i 15 minutter, tilsett 1% saltsyreetanol i 10 s, skyll med rennende vann, og deretter med 50%, 70% og 80% etanol, hver i 3 minutter. Utfør 0,5% eosinetanolfarging i 2 minutter og skyll med rennende vann. Plasser parafinseksjonene suksessivt i 75% etanol i 2 minutter, 85% etanol i 2 minutter, absolutt etanol i 5 minutter og xylen i 5 minutter. Fest skivene med nøytral tyggegummi og glassglass.
    9. For å vurdere omfanget av lymfocytisk tyreoiditt, score skjoldbruskkjertelen seksjoner som følger: 0: liten eller ingen lymfocyttinfiltrasjon i skjoldbruskkjertelen vev; 1+: mer enn 1/8 av kjertelen er infiltrert i en eller flere foci; 2+: ikke mer enn 1/4 av kjertelen er infiltrert med lymfocytter; 3+: 1/4-1/2 av kjertelen er infiltrert med lymfocytter; 4+: mer enn 1/2 av kjertelen er ødelagt.
      MERK: Det anbefales å fjerne skjoldbruskkjertelen for å holde hele strukturen i musskjoldbruskkjertelen, som er for liten til å fjerne fra luftrøret.
  3. Måling av TPOAb
    MERK: Kinesisk hamster eggstokk (CHO) celler som stabilt uttrykker mus TPO ble etablert i laboratoriet vårt. Mus TPO cDNA ble skåret ut av XbaI og NheI. Deretter ble cDNA overført til pcDNA5/FRT. Etter at plasmidet var vellykket, ble det transfeksjonert til CHO-cellene og selektert med hygromycin B (100 g / ml).
    1. Etter konstruksjon av mTPO-CHO-celler, fortynn museseraen fra trinn 3.1.3 (1:50) og inkuber med mTPO-CHO-cellene i 2 timer. Etter inkubasjon utelukkes cellefarging med propidiumjodid (1 g/ml) og prøven analyseres ved flowcytometri ved hjelp av fluoresceinisotiocyanatkonjugert, affinitetsrenset geitanti-mus IgG. Screene overlevende enkeltcellepopulasjoner etter FSC-A- og SSC-A-kanaler og velge FITC- og PI-merkede celler fra enkeltcellepopulasjonene21.
    2. Inkluder serum fra uimmuniserte BALB/c eller C57BL/6 mus bundet til IgG som negativ kontroll. Inkluder musmonoklonale antistoffer mot humant TPO22 som positive kontroller som gjenkjenner mus TPO23. Uttrykk TPO-bindingsdata som geometriske midler.
  4. Måling av TgAb
    MERK: Bruk et ELISA-sett for å oppdage tyroglobulin ved å følge produsentens instruksjoner.
    1. Fortynn standardprøvene i mikrosentrifugerøret i henhold til instruksjonene. Ta settet ut av kjøleskapet og oppbevar det i romtemperatur i 30 minutter.
    2. Angi standardbrønner, tomme brønner og testbrønner. Blanke brønner får bare buffer, mens standardbrønner får standardløsninger. Legg til 10 μL prøver i testbrønnene. Når du legger til prøvene, prøv å ikke berøre veggene i brønnene, og rist platen forsiktig for å flytte prøvene til bunnen av brønnene.
    3. Inkluder serum fra BALB / c-mus immunisert med Tg, CFA og IFA24 som positiv kontroll og serum fra 8 uker gammel NOD. H-2H4 mus på vanlig vann som negativ kontroll.
    4. Inkuber prøvene i et vannbad på 37 °C i 30 minutter. Fortynn vaskebufferen med destillert vann i forholdet 1:30. Fjern deretter tetningsfilmen, rist av væsken inne i enzymplaten og klapp tørr på absorberende papir, og tilsett 350 μL vaskebuffer i 30 s. Gjenta denne prosedyren fem ganger og klapp deretter brønnene tørre.
    5. Tilsett 50 μL enzymmerkingsreagens til hver brønn, bortsett fra de tomme brønnene, og inkuber i et 37 ° vannbad i 30 minutter. Fjern tetningsfilmen, rist av væsken inne i enzymplaten og klapp tørr på absorberende papir.
    6. Tilsett 50 μL utvikler A til hver brønn etterfulgt av 50 μL utvikler B og rist brønnene forsiktig for å blande i 5 minutter. Tilsett 50 μL av termineringsløsningen i hver brønn i 15 minutter for å stoppe reaksjonen. Mål absorbansen (OD) til hver brønn ved en bølgelengde på 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser. Presenter TgAb-dataene som den optiske tettheten (OD) ved 490 nm.
  5. Måling av T4 og tyreoideastimulerende hormon (TSH)
    MERK: Mål T4- og TSH-nivåer (i 10 μL alikoter) av ELISA ved å følge produsentens instruksjoner.
    1. Fortynn enzymkonjugatet til 1:11 med analysen fortynningsmiddel; fortynn prøvene som skal måles (1:100) med 0,01 M PBS.
    2. Tilsett 10 μL av standarden og prøven til de tilsvarende brønnene, tilsett 100 μL enzymkonjugat til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 1 time.
    3. Kast væsken i brønnene og rengjør den med vaskebuffer tre ganger.
    4. Tilsett 100 μL 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) og inkuber ved romtemperatur i 15 minutter.
    5. Tilsett 50 μL stoppløsning og bland forsiktig i 15-20 s.
    6. Bestem absorbansen (OD) ved hjelp av en mikroplateleser ved en bølgelengde på 450 nm og beregne prøvekonsentrasjonen.
    7. Bruk statistisk programvare for å utføre t-test eller rangsumtest og plotte resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De histologiske endringene var påfallende forskjellige hos kvinner og menn, varigheten av jodinntaket og løsningen av NaI. Som vist i figur 1, ~ 10% av NOD. H-2h4-mus utviklet SAT selv uten jodinduksjon i en alder av 24 uker, og alle musene utviklet til slutt skjoldbruskkjertel. Når det ble gitt vanlig vann, var det ingen signifikant forskjell i histologiske endringer mellom menn og kvinner. Tilsetningen av NaI til drikkevannet akselererte utviklingen av skjoldbruskbetennelse. I oppløsningene på 0,005 %, 0,05 % og 0,5 % nådde SAT maksimal alvorlighetsgrad i henholdsvis uke 16, 8 og 8 etter å ha gitt NaI-vannet. Når skjoldbruskkjertelen ble indusert, fortsatte lymfocyttinfiltrasjon gjennom musens liv. Under induksjonen syntes hunnmus å ha en trend i å utvikle mer alvorlig tyreoiditt enn menn under samme tilstand, men det var ingen signifikante forskjeller i alvorlighetsgraden av lymfocytisk infiltrasjon, noe som kan være begrenset av antall prøver.

Når det ble gitt vanlig vann uten ekstra jod, steg nivået av TgAb ikke signifikant i en alder av 16 uker, og ingen signifikant forskjell ble funnet mellom menn og kvinner. TgAb-nivåer i NOD. H-2h4-mus begynte å stige ved 24 uker, uten forskjell mellom kjønnene, og TgAb-nivåene fortsatte å stige til 72 uker (figur 2A). Med tilsetning av NaI til drikkevann begynte nivåene av TgAb å stige i uke 16, 8 og 8 med løsninger på henholdsvis 0,005%, 0,05% og 0,5% NaI. Nivåene av TgAb viste imidlertid ingen forskjell mellom menn og kvinner i noen av løsningene (figur 2B-D). Uansett om NaI-vann ble gitt, nådde nivåene av TgAb sitt høyeste i en alder av 72 uker (eller 64 uker etter at NaI-vann først ble gitt).

Det var en lengre forsinkelse i detekterbarheten av TPOAb-nivåer sammenlignet med TgAb. Disse antistoffene ble sjelden påvist i NOD. H-2H4 mus med vanlig vann i en alder av 24 uker. Når de ble matet med vanlig vann, viste kvinner mye høyere TPOAb-nivåer enn menn ved 72 uker (figur 2E). Den samme trenden med intersex-forskjeller viste seg også i NOD. H-2h4-mus i løpet av 16, 8 og 8 uker når de fikk NaI-vann på henholdsvis 0,005 %, 0,05 % og 0,5 % (figur 2F-H) Bemerkelsesverdig nok, da konsentrasjonen av NaI var over 0,05 % under induksjonen, nådde nivåene av TPOAb sitt høyeste ved 64 uker etter at NaI-vann først ble gitt, og det var ingen forskjell mellom menn og kvinner (figur 2G, H).

I tillegg er serum TSH nivåer i mannlig NOD. H-2h4-mus var signifikant høyere enn hos hunner i forskjellige fôringsstadier, uavhengig av om NAI-vann ble gitt eller ikke. Når det gis vanlig vann, TSH nivåer av NOD. H-2h4-mus begynte å øke i en alder av 24 uker, og en lignende tendens ble observert i joddiettgruppene med konsentrasjoner på 0,005%, 0,05% og 0,5% ved henholdsvis 16, 8 og 8 uker etter at jod ble gitt separat. TSH-nivåene fortsatte å stige gjennom hele induksjonsperioden, med en topp på 64 uker. Videre var det en signifikant forskjell i TSH-nivåer mellom menn og kvinner i resten av NOD. H-2H4 mus (figur 3A-D). NIKKE. H-2H4-mus opplevde ikke struma eller hypotyreose etter inntak av jod. Uansett om jodmidler ble administrert, var det ingen kjønnsrelatert forskjell i T4-nivåer i NOD. H-2H4 mus. Imidlertid, med økende induksjonsvarighet, hadde nivåene av T4 en tendens til å synke hos begge kjønn i jodvanngruppene (ingen signifikant forskjell) (figur 3E-H).

Seksuell dimorfisme i den patologiske prosessen og TPOAb-nivåer ble funnet i avkommet til NOD. H-2h4 mus, men ikke TgAb. I likhet med andre studier25,26 ble TPOAb-nivåene signifikant økt hos modellmus etter å ha mottatt diettjodid i 2-4 måneder, og det var en kjønnsrelatert forskjell. I tillegg var TSH-nivåene høyere hos mannlige enn kvinnelige NOD. H-2H4 mus med eller uten kostjodidtilskudd, som ligner på andre musestammer. Denne forskjellen forble gjennom hele livet til dyrene, som kanskje ikke har beeb påvirket av nivåene av TPOAb eller TgAb.Når de ble utsatt for 0,05% NaI, utviklet de fleste musene skjoldbruskbetennelse i 8 uker, noe som hadde en lignende effekt med 0,5% NaI. Mens 0,005% NaI hadde en lignende effekt på NOD. H-2h4 mus matet med vanlig vann, kan konsentrasjonen på 0,05% NaI (etter 8 ukers induksjon) være den foretrukne tilstanden for å indusere autoimmun tyroiditt. T4 nivåer i NOD. H-2H4-mus hadde ingen kjønnsrelaterte forskjeller og ble ikke påvirket av jodmidler, noe som stemmer overens med andre studier27,28. Dette kan skyldes den relativt korte starttiden for sykdommen og den kompenserende skjoldbruskfunksjonen til musene, noe som resulterer i et fenomen som ligner på subklinisk hypothyroidisme hos musene. Vi spekulerer i at TSH-aksen til musene til slutt vil bli dekompensert og produsere forskjeller over tid.

Figure 1
Figur 1 Patologiske forandringer og lymfocyttinfiltrasjon inflammasjonsskår i thyreoideakjertler ved NOD. H-2H4 mus med / uten jod diett. (A,C,E,G) Patologiske endringer i skjoldbruskkjertelen under jod dietten på 0%, 0,005%, 0,05% og 0,5% ved HE-farging; 200x forstørrelse, N = 10/gruppe. (B,D,F,G) Inflammasjon i tyreoidea ble bestemt i henhold til lymfocyttinfiltrasjonsområdet; gradering av graden av lymfocyttinfiltrasjon: 0: nesten ingen lymfocyttinfiltrasjon; 1+: mer enn en åttendedel av kjertelen er invadert; 2+: en fjerdedel av kjertelen er invadert; 3+: en fjerdedel til halvparten av kjertelen er invadert; 4+: mer enn halvparten av kjertelen er ødelagt. N = 10/gruppe. Vesentlige forskjeller: *p < 0,05; **p < 0,01. Forkortelser: F = kvinne; M = mann; NW = N uker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Autoantistoffer i NOD. H-2H4 mus på vanlig og jodidholdig vann. (AD) Autoantistoffer mot Tg i NOD. H-2H4 mus på vanlig vann (i en alder av 8, 16, 24 og 72 uker separat) og jodidvann-0,005%, 0,05% og 0,5% (ved 0, 8, 16 og 64 uker etter at jodvannet ble påbegynt). (E-H) Autoantistoffer mot TPO i NOD. H-2H4 mus på vanlig vann (i en alder av 8, 16, 24 og 72 uker separat) og jodidvann-0,005%, 0,05% og 0,5% (ved 0, 8, 16 og 64 uker etter at jodvannet ble påbegynt). Verdier for TgAb er rapportert som ELISA optisk tetthet (OD) 490 nm (gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittlig SEM) og verdier for TPOAb er rapportert som geometrisk gjennomsnitt i flowcytometri. N = 8/gruppe. Signifikante forskjeller: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Forkortelser: Tg = tyroglobulin; TgAb = autoantistoffer mot Tg; TPO = thyroid peroxidase; TPOAb = autoantistoffer mot TPO; F = kvinne; M = mann; NW = N uker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: TSH og T4 nivåer i NOD. H-2H4 mus på vanlig og jodidholdig vann. (AD) TSH og (E-H) T4 nivåer på vanlig vann (i alderen 8, 16, 24 og 72 uker separat) og jodidvann - 0,005%, 0,05% og 0,5% (ved 0, 8, 16 og 64 uker etter at jodvannet ble påbegynt). TSH-verdier ble målt ved radioimmunoassay (mU/L, gjennomsnittlig ± standardfeil av gjennomsnittlig SEM). N = 8/gruppe. Signifikante forskjeller: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; *p < 0,0001. Forkortelser: TSH = skjoldbruskstimulerende hormon; F = kvinne; M = mann; NW = N uker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HT oppstår på grunn av en autoimmun systemforstyrrelse forårsaket av lymfocytter som infiltrerer skjoldbruskkjertelen, noe som ytterligere svekker skjoldbruskfunksjonen, samtidig som skjoldbruskspesifikke antistoffer produseres. Serumnivåer av TSH, TgAb og TPOAb hos HT-pasienter er signifikant forhøyet27. For tiden er to hovedtyper av murinmodeller mye brukt til å studere etiologien til autoimmun tyroiditt: EAT og SAT29. EAT-mus immuniseres for det meste ved hjelp av proteiner og hjelpestoffer for å skape et unormalt immunmiljø in vivo. Denne tilnærmingen har blitt brukt i mange år og fortsetter å være effektiv30,31. I tillegg inkluderer nye tilnærminger for å indusere skjoldbruskbetennelse injisering av dendriske celler (DC) pulserende med Tg32, ekspresjonen av Tg eller TPO in vivo av adenovirale vektorer eller plasmider31, transplantasjon av skjoldbruskkjertelen av allogene mus og injisering av LPS. Imidlertid er den vellykkede konstruksjonen av skjoldbruskkjertelmodellen vanligvis mer begrenset av den genetiske bakgrunnen til den eksperimentelle murinmodellen, syngene antigener og cellebiologiske teknologier. Videre kan spesifikke hjelpestoffer indusere et mer komplekst immunmiljø, noe som gjør det vanskelig å undersøke den immunologiske prosessen med autoimmun tyroiditt. Derfor mener vi at SAT av NOD. H-2h4-mus kan bedre illustrere patogenesen til Hashimotos tyreoiditt sammenlignet med EAT-modellen. Spesielt er immunisering med potente hjelpestoffer og tyroglobulin ikke nødvendig for SAT33. For å øke hastigheten på fremdriften av SAT, tilsettes jod til drikkevannet av NOD. H-2H4 mus. Selv om den resulterende skjoldbruskkjertelen ikke deler den samme mekanismen som skjoldbruskbetennelse forekommer hos mennesker, er jod faktisk en viktig påvirkningsfaktor for skjoldbruskkjertel. Videre kan jodmidler i denne modellen raskt indusere tyreoiditt i NOD. H-2H4 mus, og NOD. H-2H4 mus som ikke mottar jod kan etter hvert utvikle tyreoiditt også. Siden den eksperimentelle protokollen i de fleste laboratorier er forskjellig, utførte vi en mer omfattende evaluering av NOD. H-2H4 mus under induksjon av skjoldbruskkjertel.

I prosessen med modellkonstruksjon trenger noen punkter nøye oppmerksomhet. Tilsetning av drikkevann regelmessig og evaluering av musens generelle tilstand unngår utilsiktet musedød. Det anbefales å ikke holde mer enn fem mus per bur under induksjonen for å gi nok NaI-fôring til hver mus. Antall mus kan imidlertid også endres etter den spesifikke institusjonens regler og forskrifter for dyr. Som seksuell dimorfisme er funnet i vårt laboratorium, foreslås enkeltkjønnede mus for forsøket (for eksperimenter med spesielle krav til påvisning av skjoldbruskspesifikke antistoffer, anbefales kvinne). Det foreslås å velge 8 uker gamle mus, da 10% av musene utvikler spontan skjoldbruskbetennelse i en alder av 16 uker, og alle musene utvikler skjoldbruskbetennelse til slutt uten NaI-vann. Skjoldbrusk lesjoner vedvarer gjennom levetiden til mus og neste generasjon utvikle skjoldbruskkjertel når født. Derfor, for bevaring av mus, anbefales det å bruke 8 uker gamle mus. Det er viktig å merke seg at TPOAb er mer egnet som deteksjonsindikator enn TgAb ved bruk av NOD. H-2H4 mus for å etterligne skjoldbruskkjertel. Ved måling av nivåene av TPOAb må imidlertid varigheten av induksjonen være mer forsinket enn TgAb.

Avslutningsvis beskriver denne artikkelen etableringen av en SAT-modell med NOD. H-2H4 mus og utforskning av påvirkning av ulike faktorer på denne modellen. Selv om det ikke perfekt simulerer patogenesen og mekanismen for autoimmun skjoldbrusk sykdom, NOD. H-2H4 mus er en stabil dyremodell med stort potensial innen autoimmun skjoldbrusk sykdom. Gitt at dette er en enkel dyremodell å konstruere og er svært reproduserbar, er det håpet at denne metoden vil bidra til å forbedre anvendelser av SAT-murinmodeller i forskjellige forskningsinstitusjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Monoklonale antistoffer mot humant TPO (brukt som positive kontroller) ble gitt av Dr. P. Carayon og Dr. J. Ruf (Marseille, Frankrike). Forfatterne takker alle deltakerne i denne studien og medlemmene av vårt forskerteam. Dette arbeidet ble delvis støttet av tilskudd fra Postdoctoral Sustentation Fund of West China Hospital, Sichuan University, Kina (2020HXBH057) og Sichuan Province Science and Technology Support Program (Project No. 2021YFS0166)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ralli, M., et al. Hashimoto's thyroiditis: An update on pathogenic mechanisms, diagnostic protocols, therapeutic strategies, and potential malignant transformation. Autoimmunity Reviews. 19 (10), 102649 (2020).
  2. Zhang, Q. Y., et al. Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto's thyroiditis. Nature Communications. 13 (1), 775 (2022).
  3. Ruggeri, R. M., et al. Autoimmune comorbidities in Hashimoto's thyroiditis: different patterns of association in adulthood and childhood/adolescence. European Journal of Endocrinology. 176 (2), 133-141 (2017).
  4. Resende de Paiva, C., Grønhøj, C., Feldt-Rasmussen, U., von Buchwald, C. Association between Hashimoto's thyroiditis and thyroid cancer in 64,628 patients. Frontiers in Oncology. 7, 53 (2017).
  5. Ehlers, M., Schott, M. Hashimoto's thyroiditis and papillary thyroid cancer: are they immunologically linked. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (12), 656-664 (2014).
  6. Medenica, S., et al. The role of cell and gene therapies in the treatment of infertility in patients with thyroid autoimmunity. International Journal of Endocrinology. 2022, 4842316 (2022).
  7. Rose, N. R. The genetics of autoimmune thyroiditis: the first decade. Journal of Autoimmunity. 37 (2), 88-94 (2011).
  8. Kolypetri, P., King, J., Larijani, M., Carayanniotis, G. Genes and environment as predisposing factors in autoimmunity: acceleration of spontaneous thyroiditis by dietary iodide in NOD.H2(h4) mice. International Reviews of Immunology. 34 (6), 542-556 (2015).
  9. Terplan, K. L., Witebsky, E., Rose, N. R., Paine, J. R., Egan, R. W. Experimental thyroiditis in rabbits, guinea pigs and dogs, following immunization with thyroid extracts of their own and of heterologous species. The American Journal of Pathology. 36 (2), 213-239 (1960).
  10. Alexopoulos, H., Dalakas, M. C. The immunobiology of autoimmune encephalitides. Journal of Autoimmunity. 104, 102339 (2019).
  11. Noviello, C. M., Kreye, J., Teng, J., Prüss, H., Hibbs, R. E. Structural mechanisms of GABA receptor autoimmune encephalitis. Cell. 185 (14), 2469-2477 (2022).
  12. Pudifin, D. J., Duursma, J., Brain, P. Experimental autoimmune thyroiditis in the vervet monkey. Clinical and Experimental Immunology. 29 (2), 256-260 (1977).
  13. Esquivel, P. S., Rose, N. R., Kong, Y. C. Induction of autoimmunity in good and poor responder mice with mouse thyroglobulin and lipopolysaccharide. The Journal of Experimental Medicine. 145 (5), 1250-1263 (1977).
  14. Kong, Y. C., et al. HLA-DRB1 polymorphism determines susceptibility to autoimmune thyroiditis in transgenic mice: definitive association with HLA-DRB1*0301 (DR3) gene. The Journal of Experimental Medicine. 184 (3), 1167-1172 (1996).
  15. Kotani, T., Umeki, K., Hirai, K., Ohtakia, S. Experimental murine thyroiditis induced by porcine thyroid peroxidase and its transfer by the antigen-specific T cell line. Clinical and Experimental Immunology. 80 (1), 11-18 (1990).
  16. Ng, H. P., Banga, J. P., Kung, A. W. C. Development of a murine model of autoimmune thyroiditis induced with homologous mouse thyroid peroxidase. Endocrinology. 145 (2), 809-816 (2004).
  17. Ng, H. P., Kung, A. W. C. Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T cell epitope of thyroid peroxidase. Endocrinology. 147 (6), 3085-3092 (2006).
  18. Ellis, J. S., Braley-Mullen, H. Mechanisms by which B cells and regulatory T Cells influence development of murine organ-specific autoimmune diseases. Journal of Clinical Medicine. 6 (2), 13 (2017).
  19. Fang, Y., Yu, S., Braley-Mullen, H. Contrasting roles of IFN-gamma in murine models of autoimmune thyroid diseases. Thyroid. 17 (10), 989-994 (2007).
  20. Fang, Y., Zhao, L., Yan, F. Chemokines as novel therapeutic targets in autoimmune thyroiditis. Recent Patents on DNA & Gene Sequences. 4 (1), 52-57 (2010).
  21. Chen, C. R., et al. Antibodies to thyroid peroxidase arise spontaneously with age in NOD.H-2h4 mice and appear after thyroglobulin antibodies. Endocrinology. 151 (9), 4583-4593 (2010).
  22. Ruf, J., et al. Relationship between immunological structure and biochemical properties of human thyroid peroxidase. Endocrinology. 125 (3), 1211-1218 (1989).
  23. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., Chong, G., Rapoport, B. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword'. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  24. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., et al. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword’[J]. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  25. Hutchings, P. R., et al. Both CD4(+) T cells and CD8(+) T cells are required for iodine accelerated thyroiditis in NOD mice. Cellular Immunology. 192 (2), 113-121 (1999).
  26. Xue, H., et al. Dynamic changes of CD4+CD25 + regulatory T cells in NOD.H-2h4 mice with iodine-induced autoimmune thyroiditis. Biological Trace Element Research. 143 (1), 292-301 (2011).
  27. Hou, X., et al. Effect of halofuginone on the pathogenesis of autoimmune thyroid disease in different mice models. Endocrine, Metabolic & Immune Disorders Drug Targets. 17 (2), 141-148 (2017).
  28. McLachlan, S. M., et al. Dissociation between iodide-induced thyroiditis and antibody-mediated hyperthyroidism in NOD.H-2h4 mice. Endocrinology. 146 (1), 294-300 (2005).
  29. Danailova, Y., et al. Nutritional management of thyroiditis of hashimoto. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 5144 (2022).
  30. Carayanniotis, G. Molecular parameters linking thyroglobulin iodination with autoimmune thyroiditis. Hormones. 10 (1), 27-35 (2011).
  31. Verginis, P., Li, H. S., Carayanniotis, G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+ T cells. Journal of Immunology. 174 (11), 7433-7439 (2005).
  32. Flynn, J. C., et al. Superiority of thyroid peroxidase DNA over protein immunization in replicating human thyroid autoimmunity in HLA-DRB1*0301 (DR3) transgenic mice. Clinical and Experimental Immunology. 137 (3), 503-512 (2004).
  33. Akeno, N., et al. IFN-α mediates the development of autoimmunity both by direct tissue toxicity and through immune cell recruitment mechanisms. Journal of Immunology. 186 (8), 4693-4706 (2011).

Tags

Tilbaketrekking utgave 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Generering av en mus spontan autoimmun tyreoiditt modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter