Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generatie van een muis Spontane auto-immuun thyroiditis model

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Verschillende soorten diermodellen van Hashimoto's thyroiditis zijn vastgesteld, net als spontane auto-immune thyroiditis bij de NOD-muis. H-2h4-muizen zijn een eenvoudig en betrouwbaar model voor HT-inductie. Dit artikel beschrijft deze aanpak en evalueert het pathologische proces voor een beter begrip van het SAT-muizenmodel.

Abstract

In de afgelopen jaren is Hashimoto's thyroiditis (HT) de meest voorkomende auto-immuun schildklierziekte geworden. Het wordt gekenmerkt door lymfocyteninfiltratie en de detectie van specifieke serumautoantilichamen. Hoewel het potentiële mechanisme nog steeds niet duidelijk is, is het risico op Hashimoto's thyroiditis gerelateerd aan genetische en omgevingsfactoren. Op dit moment zijn er verschillende soorten modellen van auto-immune thyroiditis, waaronder experimentele auto-immune thyroiditis (EAT) en spontane auto-immune thyroiditis (SAT).

EAT bij muizen is een veel voorkomend model voor HT, dat wordt geïmmuniseerd met lipopolysaccharide (LPS) in combinatie met thyroglobuline (Tg) of aangevuld met volledig Freund's adjuvans (CFA). Het EAT-muismodel is op grote schaal ingeburgerd in vele soorten muizen. De ziekteprogressie is echter waarschijnlijker geassocieerd met de Tg-antilichaamrespons, die in verschillende experimenten kan variëren.

SAT wordt ook veel gebruikt in de studie van HT in de NOD. H-2h4 muis. De NOD. H2h4-muis is een nieuwe stam die wordt verkregen uit de kruising van de niet-obese diabetische (NOD) muis met de B10. A(4R), dat significant wordt geïnduceerd voor HT met of zonder jodiumvoeding. Tijdens de inductie, de NOD. H-2h4 muis heeft een hoog niveau van TgAb vergezeld van lymfocyteninfiltratie in het schildklierfolliculaire weefsel. Voor dit type muismodel zijn er echter weinig studies om het pathologische proces tijdens de inductie van jodium uitgebreid te evalueren.

Een SAT-muismodel voor HT-onderzoek wordt in deze studie vastgesteld en het pathologische veranderingsproces wordt geëvalueerd na een lange periode van jodiuminductie. Door dit model kunnen onderzoekers de pathologische ontwikkeling van HT beter begrijpen en nieuwe behandelmethoden voor HT screenen.

Introduction

Hashimoto's thyroiditis (HT), ook bekend als chronische lymfatische thyroiditis of auto-immune thyroiditis, werd voor het eerst gemeld in 19121. HT wordt gekenmerkt door lymfocyteninfiltratie en schade aan schildklierfolliculaire weefsel. Laboratoriumtests manifesteren zich voornamelijk als toenemende schildklierspecifieke antilichamen, waaronder anti-thyroglobuline-antilichaam (TgAb) en anti-schildklierperoxidase-antilichaam (TPOAb)2. De incidentie van HT ligt in het bereik van 0,4% -1,5%, goed voor 20% -25% van alle schildklieraandoeningen, en deze waarde is de afgelopen jaren toegenomen3. Daarnaast is in een groot aantal studies gemeld dat HT geassocieerd is met de oncogenese en herhaling van papillair schildkliercarcinoom (PTC)4,5; De potentiële mechanismen zijn nog steeds controversieel. Auto-immune thyroiditis is ook een belangrijke factor bij vrouwelijke onvruchtbaarheid6. Daarom moet de pathogenese van HT duidelijk zijn, waarvoor een stabiel en eenvoudig diermodel essentieel is.

Om de etiologie van HT te bestuderen, zijn twee hoofdtypen muizenmodellen gebruikt, waaronder experimentele auto-immune thyroiditis (EAT) en spontane auto-immune thyroiditis (SAT) in de huidige studies 7,8. Gevoelige muizen werden geïmmuniseerd met specifieke schildklierantigenen (waaronder de ruwe schildklier, gezuiverd thyroglobuline [TG], schildklierperoxidase [TPO], recombinant TPO-ectodomein en geselecteerde TPO-peptiden) om het EAT-muizenmodel vast te stellen. Bovendien worden de adjuvantia, waaronder lipopolysaccharide (LPS), complete Freund's adjuvans (CFA) en andere ongebruikelijke adjuvantia, ook gebruikt tijdens de immunisatie om immuuntolerantie 9,10,11,12,13,14,15,16,17 af te breken.

Het SAT-model is een belangrijk model om de spontane ontwikkeling van auto-immune thyroiditis te bestuderen, die gebaseerd is op NOD. H-2h4 muizen. De NOD. H-2h4 muis is een nieuwe stam verkregen uit de kruising van NOD en B10. A(4R)-muizen, gevolgd door meerdere backcrosses naar NOD, met het auto-immune thyroiditis-gevoeligheidsgen IAk18,19. KNIKKEN. H-2h4-muizen ontwikkelen geen diabetes, maar hebben een hoge incidentie van auto-immune thyroiditis en het syndroom van Sjögren (SS)19. Studies hebben aangetoond dat intracellulair adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) sterk tot expressie komt in het schildklierweefsel van NOD. H-2h4 muizen op een leeftijd van 3-4 weken. Bovendien wordt met de toename van de jodiuminname de immunogeniciteit van het thyroglobulinemolecuul verbeterd, wat de expressie van ICAM-1, dat een belangrijke rol speelt in het proces van monocyteninfiltratie21, verder reguleert. Dit model simuleert het auto-immuunproces en verifieert de relatie tussen jodiumdosis en de ernst van de ziekte. De gevestigde methode is stabiel, met een grote kans op succes. Het SAT-model wordt al vele jaren toegepast om auto-immune thyroiditis te induceren en blijft een effectieve methode om de pathogenese van auto-immune thyroiditis te bestuderen. De huidige bouwmethode van het EAT-model is echter ingewikkelder en duurder; Verschillende laboratoria gebruiken verschillende immunisatiemethoden en injectieplaatsen. Bovendien hebben muizen met verschillende genetische achtergronden verschillende inductiesnelheden, die verder moeten worden bestudeerd om het krachtige mechanisme te onthullen.

De ontwikkeling van thyroiditis in het SAT-model is echter geassocieerd met natriumjodide, seksueel dimorfisme en de opfokomstandigheden. Om de juiste procedure van auto-immune thyroiditis in het SAT-model te onthullen, beschreef dit artikel de methode van inductie van auto-immune thyroiditis in verschillende omstandigheden. Bovendien maakt het de studie van de pathogenese en immunologische voortgang van auto-immune thyroiditis in verschillende stadia van deze ziekte mogelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het hieronder beschreven protocol is goedgekeurd door de zorg- en gebruiksrichtlijnen die zijn vastgesteld door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Sichuan.

1. Voorbereiding

  1. Plaats alle muizen in specifieke pathogeenvrije omstandigheden onder licht-donkercycli van 12 uur (respectievelijk beginnend om 07:00 uur en 19:00 uur). Houd de kamertemperatuur op 22 °C. Vervang het beddengoed elke week. Zorg voor voldoende hoeveelheden standaard knaagdier chow en water.
  2. Weeg bij het bereiden van de stamoplossing van NaI in water 2,5 g van de verbinding en los deze op in 50 ml steriel, zuiver water onder vortexing om een stamoplossing van 5% te verkrijgen. Bewaar deze stockoplossing in een vriezer van 4 °C, zonder licht, gedurende maximaal 8 weken.
  3. Om een werkoplossing van NaI te bereiden, zuigt u 2,5 ml stockoplossing op en lost u deze op in 250 ml gewoon water als het dagelijkse drinkwater voor NOD. H-2h4 muizen, om een werkoplossing van 0,05% te geven.

2. Inductie van thyroiditis

  1. SAT-model
    1. Bereid de NOD voor. H-2h4-muizen (8 weken oud) voor het onderzoek door alle muizen van één geslacht (geen seksueel dimorfisme) in barrièrekooien (vijf dieren per kooi) te huisvesten met de voedingsomstandigheden beschreven in stap 1.1.
    2. Om auto-immune thyroiditis bij NOD te induceren. H-2h4 muizen, voed alle muizen met 0,05% NaI gedurende 8 weken. Ververs het NaI-water elke week en beoordeel de status van de muizen wekelijks, inclusief uiterlijk, gewicht, eetlust, mentale status en mobiliteit.
  2. EAT-model
    1. Bereid de BALB/c-muizen (8 weken oud) voor op het onderzoek door alle muizen van één geslacht (geen seksueel dimorfisme) in barrièrekooien (vijf dieren per kooi) te huisvesten met de voedingsomstandigheden beschreven in stap 1.1. Voer alle muizen met 0,05% NaI gedurende 8 weken.
    2. Injecteer gedurende de eerste 2 weken eenmaal per week subcutaan een mengsel van CFA en Tg (200 μL).
    3. Injecteer vanaf de derde week subcutaan een mengsel van IFA en Tg (200 μL) eenmaal per week gedurende 3 weken.

3. Metingen

  1. Bereiding van perifere bloedmonsters
    1. Na de inductie, verdoven de muizen met een volume van 0,01 ml / g anestheticum door intraperitoneale injectie. Bereid het verdovingsmiddel voor door midazolam (40 μg/100 μL voor sedatie), medetomidine (7,5 μg/100 μL voor sedatie) en butorfanoldartraat (50 μg/100 μL voor analgesie) te mengen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
      OPMERKING: De specifieke concentraties van elk bestanddeel in het anesthesiemengsel zijn: midazolam 13,33μg/100μL, medetomidine 2,5μg/100μL en butorphanol 16,7μg/100μL. Voor specifieke doseringen die bij muizen worden gebruikt, zijn de doses: midazolam 4μg / g, medetomidine 0,75μg / g en butorphanol 1,67μg / g. Anesthesiediepte werd bevestigd wanneer de ledemaatspieren van de muis ontspanden, de snorharen geen aanraakrespons hadden en er verlies van pedaalreflex was.
    2. Nadat de muizen zijn verdoofd, bereidt u de perifere bloedmonsters voor door de muis met één hand te fixeren en op de ooghuid te drukken om de oogbol uit te steken. Steek vervolgens de capillaire buis in de binnenste ooghoek en peneer in een hoek van 30-45 graden tot het vlak van het neusgat. Oefen druk uit terwijl u de capillaire buis voorzichtig draait. Bloed zal via capillaire werking in de buis stromen.
    3. Zet het bloed gedurende 2 uur in een koelkast van 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 1.000 × g bij 4 °C om het monster te verkrijgen. Bewaar voor verdere analyse de rest van het monster bij -80 °C.
  2. Bereiding van schildklierweefselmonsters
    1. Euthanaseer het dier op humane wijze volgens het institutionele beleid. Ontleed vervolgens de borstwand om het hart bloot te leggen, snijd het rechteratrium open en injecteer zoutoplossing in de linkerkamer met een intraveneuze infusienaald die is bevestigd aan een spuit van 20 ml totdat het weefsel wit wordt.
    2. Bevestig de muis met pinnen op de snijtafel. Steriliseer de nek met 75% ethanol. Knip de huid van de muis langs de middenlijn van de nek van de bovenkant van het borstbeen naar de onderkaak met een weefselschaar om het nekweefsel volledig bloot te leggen.
    3. Observeer het paar roze klieren, de submandibulaire klieren, waaronder de voorste luchtpijpspier is. Scheid de klieren en spieren met een oogheelkundige schaar en tang om de luchtpijp en het schildklierkraakbeen bloot te leggen.
    4. Scheid het weefsel onder het kraakbeen en gebruik een gebogen tang om het kraakbeen en de luchtpijp samen op te pakken. Snijd de distale en proximale uiteinden van respectievelijk het kraakbeen en de luchtpijp en verwijder de schildklier samen met de luchtpijp.
    5. Dompel de klieren gedurende 12-24 uur onder in 4% paraformaldehyde. Breng vervolgens het weefsel over naar 70% ethanol.
    6. Plaats de afzonderlijke lobben van schildklierbiopsiemateriaal in de verwerkingscassettes en droog uit door de volgende seriële alcoholgradiënt: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, ethanol gedurende 40 minuten elk; 1/2 xyleen + 1/2 absolute ethanol gedurende 2 uur; 100% xyleen gedurende 1,5 uur; 100% xyleen gedurende 1,5 uur; 1/2 xyleen + 1/2 paraffine gedurende 2 uur; oven op 40 ° C gedurende 40 minuten; paraffine I gedurende 30 min; en paraffine II gedurende 30 min. Sluit ze in paraffinewasblokken in.
    7. Dewax vóór de kleuring 5 μm dikke schildklierweefselsecties in xyleen (als volgt) en rehydrateer door de volgende afnemende concentraties ethanol: xyleen I gedurende 10 minuten; xyleen II gedurende 10 minuten; xyleen III gedurende 10 minuten; absolute ethanol I gedurende 5 min; absolute ethanol II gedurende 5 min; 90% alcohol gedurende 5 min; 80% alcohol gedurende 5 min; 70% alcohol gedurende 5 min; en 50% alcohol gedurende 5 min.
    8. Kleuring van de weefsels met hematoxyline en eosine (H &E). Bevlek met hematoxyline gedurende 15 minuten, spoel met leidingwater gedurende 15 minuten, voeg 1% zoutzuurethanol toe gedurende 10 s, spoel af met stromend water en vervolgens met 50%, 70% en 80% ethanol, elk gedurende 3 minuten. Voer 0,5% eosine-ethanolkleuring uit gedurende 2 minuten en spoel af met stromend water. Plaats de paraffinesecties achtereenvolgens in 75% ethanol gedurende 2 minuten, 85% ethanol gedurende 2 minuten, absolute ethanol gedurende 5 minuten en xyleen gedurende 5 minuten. Bevestig de plakjes met neutrale gom en glasglaasjes.
    9. Om de omvang van lymfatische thyroiditis te evalueren, scoort u de schildkliersecties als volgt: 0: weinig of geen lymfocyteninfiltratie in het schildklierweefsel; 1+: meer dan 1/8 van de klier is geïnfiltreerd in een of meerdere foci; 2+: niet meer dan 1/4 van de klier is geïnfiltreerd met lymfocyten; 3+: 1/4-1/2 van de klier is geïnfiltreerd met lymfocyten; 4+: meer dan 1/2 van de klier wordt vernietigd.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het schildklierkraakbeen te verwijderen om de hele structuur van de schildklier van de muis te behouden, die te klein is om uit de luchtpijp te verwijderen.
  3. Meting van TPOAb
    OPMERKING: Chinese hamster ovarium (CHO) cellen stabiel tot expressie brengen muis TPO werden vastgesteld in ons laboratorium. Muis TPO cDNA werd weggesneden door XbaI en NheI. Vervolgens werd het cDNA overgebracht naar pcDNA5/FRT. Nadat het plasmide met succes was geconstrueerd, werd het getransfecteerd in de CHO-cellen en geselecteerd met hygromycine B (100 g / ml).
    1. Na de bouw van mTPO-CHO-cellen verdunt u de muizensera uit stap 3.1.3 (1:50) en incubeert u gedurende 2 uur met de mTPO-CHO-cellen. Sluit na incubatie celkleuring met propidiumjodide (1 g / ml) uit en analyseer het monster door flowcytometrie met behulp van fluoresceïne-isothiocyanaat-geconjugeerde, affiniteitsgezuiverde geitenanti-muis IgG. Screen overlevende eencellige populaties door FSC-A- en SSC-A-kanalen en selecteer FITC- en PI-gelabelde cellen uit de eencellige populaties21.
    2. Neem het serum van niet-gevaccineerde BALB/c- of C57BL/6-muizen gebonden aan IgG op als negatieve controle. Neem monoklonale antilichamen van muizen tegen humaan TPO22 op als positieve controles die muis TPO23 herkennen. Druk TPO-bindingsgegevens uit als geometrische middelen.
  4. Meting van TgAb
    OPMERKING: Gebruik een ELISA-kit om thyroglobuline te detecteren door de instructies van de fabrikant te volgen.
    1. Verdun de standaardmonsters in de microcentrifugebuis volgens de instructies. Haal de kit uit de koelkast en bewaar hem 30 minuten op kamertemperatuur.
    2. Stel de standaardputten, lege putten en testputten in. Lege putten krijgen alleen buffer, terwijl standaardputten standaardoplossingen krijgen. Voeg 10 μL monsters toe aan de testputten. Probeer bij het toevoegen van de monsters de wanden van de putten niet aan te raken en schud de plaat voorzichtig om de monsters naar de bodem van de putten te verplaatsen.
    3. Neem serum op van BALB / c-muizen geïmmuniseerd met Tg, CFA en IFA24 als de positieve controle en serum van 8 weken oude NOD. H-2h4 muizen op regulier water als negatieve controle.
    4. Incubeer de monsters in een waterbad van 37 °C gedurende 30 minuten. Verdun de wasbuffer met gedestilleerd water in een verhouding van 1:30. Verwijder vervolgens de afdichtingsfilm, schud de vloeistof in de enzymplaat af en dep droog op absorberend papier en voeg 350 μL wasbuffer toe gedurende 30 s. Herhaal deze procedure vijf keer en dep de putjes droog.
    5. Voeg 50 μL enzymetiketteringsreagens toe aan elke put, behalve de lege putten, en incuber in een waterbad van 37 ° gedurende 30 minuten. Verwijder de afdichtingsfilm, schud de vloeistof in de enzymplaat af en dep droog op absorberend papier.
    6. Voeg 50 μL ontwikkelaar A toe aan elke put, gevolgd door 50 μL ontwikkelaar B en schud de putjes voorzichtig om gedurende 5 minuten te mengen. Voeg gedurende 15 minuten 50 μL van de beëindigingsoplossing toe in elk putje om de reactie te stoppen. Meet de absorptie (OD) van elke put bij een golflengte van 450 nm met behulp van een microplaatlezer. Presenteer de TgAb-gegevens als de optische dichtheid (OD) bij 490 nm.
  5. Meting van T4 en schildklierstimulerend hormoon (TSH)
    OPMERKING: Meet T4- en TSH-niveaus (in aliquots van 10 μl) door ELISA door de instructies van de fabrikant te volgen.
    1. Verdun het enzymconjugaat tot 1:11 met het testverdunningsmiddel; verdun de te meten monsters (1:100) met 0,01 M PBS.
    2. Voeg 10 μL van de standaard en het monster toe aan de overeenkomstige putjes, voeg 100 μL enzymconjugaat toe aan elk putje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    3. Gooi de vloeistof in de putjes en maak deze drie keer schoon met wasbuffer.
    4. Voeg 100 μL 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Voeg 50 μL stopoplossing toe en meng voorzichtig gedurende 15-20 s.
    6. Bepaal de absorptie (OD) met behulp van een microplaatlezer bij een golflengte van 450 nm en bereken de monsterconcentratie.
    7. Gebruik statistische software voor het uitvoeren van t-test of rank sum test en plot de resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De histologische veranderingen waren opvallend verschillend bij vrouwen en mannen, de duur van de jodiuminname en de oplossing van NaI. Zoals weergegeven in figuur 1, ~10% van NOD. H-2h4-muizen ontwikkelden SAT, zelfs zonder jodiuminductie op de leeftijd van 24 weken, en alle muizen ontwikkelden uiteindelijk thyroiditis. Bij regelmatig water was er geen significant verschil in de histologische veranderingen tussen mannetjes en vrouwtjes. De toevoeging van NaI aan het drinkwater versnelde de ontwikkeling van thyroiditis. In de oplossingen van 0,005%, 0,05% en 0,5% bereikte SAT de maximale ernst in respectievelijk week 16, 8 en 8, na toediening van het NaI-water. Zodra thyroiditis was geïnduceerd, ging lymfocyteninfiltratie door gedurende het hele leven van de muis. Tijdens de inductie leken vrouwelijke muizen een trend te hebben in het ontwikkelen van ernstigere thyroiditis dan mannen onder dezelfde aandoening, maar er waren geen significante verschillen in de ernst van lymfatische infiltratie, die mogelijk beperkt wordt door het aantal monsters.

Bij regelmatig water zonder extra jodium steeg het niveau van TgAb niet significant op de leeftijd van 16 weken en werd er geen significant verschil gevonden tussen mannen en vrouwen. TgAb-niveaus in NOD. H-2h4-muizen begonnen te stijgen na 24 weken, zonder verschil tussen geslachten, en TgAb-niveaus bleven stijgen tot 72 weken (figuur 2A). Met de toevoeging van NaI aan drinkwater begonnen de niveaus van TgAb te stijgen in week 16, 8 en 8 met oplossingen van respectievelijk 0,005%, 0,05% en 0,5% NaI. De niveaus van TgAb vertoonden echter geen verschil tussen mannen en vrouwen in een van de oplossingen (figuur 2B-D). Ongeacht of NaI-water werd gegeven, bereikten de niveaus van TgAb hun hoogste op de leeftijd van 72 weken (of 64 weken nadat NaI-water voor het eerst werd gegeven).

Er was een langere vertraging in de detecteerbaarheid van TPOAb-niveaus in vergelijking met TgAb. Deze antilichamen werden zelden gedetecteerd bij NOD. H-2h4 muizen met gewoon water op de leeftijd van 24 weken. Wanneer ze met gewoon water werden gevoed, vertoonden vrouwtjes veel hogere TPOAb-niveaus dan mannen na 72 weken (figuur 2E). Dezelfde trend van intersekseverschil was ook aan het ontstaan bij NOD. H-2h4-muizen gedurende de duur van 16, 8 en 8 weken wanneer NaI-water van respectievelijk 0,005%, 0,05% en 0,5% werd toegediend (figuur 2F-H) Opmerkelijk is echter dat wanneer de concentratie van NaI meer dan 0,05% was tijdens de inductie, de niveaus van TPOAb hun hoogste bereikten 64 weken nadat NaI-water voor het eerst werd gegeven, en er was geen verschil tussen mannen en vrouwen (figuur 2G, H).

Bovendien, serum TSH-niveaus bij mannelijke NOD. H-2h4-muizen waren significant hoger dan die van vrouwtjes in verschillende voedingsstadia, ongeacht of NAI-water werd gegeven of niet. Wanneer regelmatig water wordt gegeven, zijn de TSH-niveaus van NOD. H-2h4-muizen begonnen te stijgen op de leeftijd van 24 weken en een vergelijkbare tendens werd waargenomen in de jodiumdieetgroepen met de concentraties van 0,005%, 0,05% en 0,5% op respectievelijk 16, 8 en 8 weken, nadat jodium afzonderlijk was gegeven. TSH-niveaus bleven stijgen gedurende de inductieperiode, met een piek van 64 weken. Bovendien was er een significant verschil in TSH-niveaus tussen mannen en vrouwen in de rest van de NOD. H-2h4 muizen (figuur 3A-D). KNIKKEN. H-2h4-muizen ondervonden geen struma of hypothyreoïdie na inname van jodium. Ongeacht of jodiummiddelen werden toegediend, was er geen geslachtsgerelateerd verschil in T4-niveaus in NOD. H-2h4 muizen. Naarmate de duur van de inductie toenam, hadden de niveaus van T4 echter de neiging om bij beide geslachten in de jodiumwatergroepen af te nemen (geen significant verschil) (figuur 3E-H).

Seksueel dimorfisme in het pathologische proces en TPOAb-niveaus werden gevonden in het nageslacht van NOD. H-2h4 muizen, maar niet TgAb. Net als bij andere studies25,26 waren de TPOAb-niveaus significant verhoogd bij modelmuizen na het ontvangen van jodide via de voeding gedurende 2-4 maanden, en er was een geslachtsgerelateerd verschil. Bovendien waren de TSH-niveaus hoger bij mannelijke dan vrouwelijke NOD. H-2h4-muizen met of zonder suppletie met jodide in de voeding, die vergelijkbaar is met andere muizenstammen. Dit verschil bleef gedurende het hele leven van de dieren, die mogelijk niet werden beïnvloed door de niveaus van TPOAb of TgAb.Bij blootstelling aan 0,05% NaI ontwikkelden de meeste muizen thyroiditis in 8 weken, wat een vergelijkbaar effect had met 0,5% NaI. Terwijl 0,005% NaI een vergelijkbaar effect had op NOD. H-2h4 muizen gevoed met gewoon water, de concentratie van 0,05% NaI (na 8 weken inductie) kan de voorkeursvoorwaarde zijn om auto-immune thyroiditis te induceren. T4-niveaus in NOD. H-2h4-muizen hadden geen geslachtsgerelateerde verschillen en werden niet beïnvloed door jodiummiddelen, wat consistent is met andere onderzoeken27,28. Dit kan te wijten zijn aan de relatief korte aanvangstijd van de ziekte en de compenserende schildklierfunctie van de muizen, wat resulteert in een fenomeen dat vergelijkbaar is met subklinische hypothyreoïdie bij de muizen. We speculeren dat de TSH-as van de muizen uiteindelijk gedecompenseerd zou worden en in de loop van de tijd verschillen zou produceren.

Figure 1
Figuur 1: Pathologische veranderingen en lymfocyteninfiltratie inflammatoire scores van schildklieren bij NOD. H-2h4 muizen met/zonder het jodium dieet. (A,C,E,G) Pathologische veranderingen van de schildklier onder het jodiumdieet van 0%, 0,005%, 0,05% en 0,5% door HE-kleuring; 200x vergroting, N = 10/groep. (B,D,F,G) Schildklierontsteking werd bepaald op basis van het lymfocyteninfiltratiegebied; gradatie van de mate van lymfocyteninfiltratie: 0: bijna geen lymfocyteninfiltratie; 1+: meer dan een achtste van de klier wordt binnengedrongen; 2+: een kwart van de klier wordt binnengedrongen; 3+: een kwart tot de helft van de klier wordt binnengedrongen; 4+: meer dan de helft van de klier wordt vernietigd. N = 10/groep. Significante verschillen: *p < 0,05; **p < 0,01. Afkortingen: F = vrouwelijk; M = man; NW = N weken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Autoantilichamen bij NOD. H-2h4 muizen op regulier en jodidehoudend water. (A-D) Auto-antilichamen tegen Tg in NOD. H-2h4-muizen op gewoon water (op de leeftijd van 8, 16, 24 en 72 weken afzonderlijk) en jodidewater-0,005%, 0,05% en 0,5% (op 0, 8, 16 en 64 weken nadat het jodiumwater was begonnen). (E-H) Auto-antilichamen tegen TPO in NOD. H-2h4-muizen op gewoon water (op de leeftijd van 8, 16, 24 en 72 weken afzonderlijk) en jodidewater-0,005%, 0,05% en 0,5% (op 0, 8, 16 en 64 weken nadat het jodiumwater was begonnen). Waarden voor TgAb worden gerapporteerd als ELISA optische dichtheid (OD) 490 nm (gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde SEM) en waarden voor TPOAb worden gerapporteerd als het geometrische gemiddelde in flowcytometrie. N = 8/groep. Significante verschillen: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Afkortingen: Tg = thyroglobuline; TgAb = auto-antilichamen tegen Tg; TPO = schildklierperoxidase; TPOAb = auto-antilichamen tegen TPO; F = vrouw; M = man; NW = N weken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: TSH- en T4-niveaus in NOD. H-2h4 muizen op regulier en jodidehoudend water. (A-D) TSH- en (E-H) T4-niveaus op regulier water (op de leeftijd van 8, 16, 24 en 72 weken afzonderlijk) en jodidewater-0,005%, 0,05% en 0,5% (op 0, 8, 16 en 64 weken nadat het jodiumwater was begonnen). TSH-waarden werden gemeten met behulp van een radioimmunoassay (mU/L, gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde SEM). N = 8/groep. Significante verschillen: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; *p < 0,0001. Afkortingen: TSH = schildklierstimulerend hormoon; F = vrouw; M = man; NW = N weken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HT treedt op als gevolg van een aandoening van het auto-immuunsysteem veroorzaakt door lymfocyten die de schildklier infiltreren, waardoor de schildklierfunctie verder wordt aangetast, terwijl schildklierspecifieke antilichamen worden geproduceerd. Serum TSH-, TgAb- en TPOAb-spiegels bij HT-patiënten zijn significant verhoogd27. Op dit moment worden twee belangrijke soorten muizenmodellen veel gebruikt om de etiologie van auto-immune thyroiditis te bestuderen: EAT en SAT29. EAT-muizen worden meestal geïmmuniseerd met behulp van eiwitten en adjuvantia om in vivo een abnormale immuunomgeving te creëren. Deze aanpak wordt al vele jaren gebruikt en is nog steeds effectief30,31. Bovendien omvatten nieuwe benaderingen om thyroiditis te induceren het injecteren van dendrische cellen (DC's) gepulseerd met Tg32, de expressie van Tg of TPO in vivo door adenovirale vectoren of plasmiden31, het transplanteren van de schildklier van allogene muizen en het injecteren van LPS. De succesvolle constructie van het thyroiditismodel wordt echter meestal meer beperkt door de genetische achtergrond van het experimentele muizenmodel, syngenetische antigenen en celbiologische technologieën. Bovendien kunnen specifieke adjuvantia een complexere immuunomgeving induceren, waardoor het moeilijk wordt om het immunologische proces van auto-immune thyroiditis te onderzoeken. Daarom geloven wij dat de SAT van NOD. H-2h4-muizen kunnen de pathogenese van Hashimoto's thyroiditis beter illustreren in vergelijking met het EAT-model. In het bijzonder is immunisatie met krachtige adjuvantia en thyroglobuline niet nodig voor SAT33. Om de voortgang van SAT te versnellen, wordt jodium toegevoegd aan het drinkwater van NOD. H-2h4 muizen. Hoewel de resulterende thyroiditis niet hetzelfde mechanisme deelt waarmee thyroiditis bij mensen optreedt, is jodium inderdaad een belangrijke beïnvloedende factor van thyroiditis. Bovendien kunnen jodiummiddelen in dit model snel thyroiditis bij NOD induceren. H-2h4 muizen, en NOD. H-2h4-muizen die geen jodium krijgen, kunnen uiteindelijk ook thyroiditis ontwikkelen. Omdat het experimentele protocol in de meeste laboratoria anders is, hebben we een uitgebreidere evaluatie van de NOD uitgevoerd. H-2h4 muizen tijdens de inductie van thyroiditis.

In het proces van modelbouw hebben sommige punten zorgvuldige aandacht nodig. Door regelmatig drinkwater toe te voegen en de algemene toestand van de muizen te evalueren, wordt onbedoelde muizensterfte voorkomen. Het wordt aanbevolen om tijdens de inductie niet meer dan vijf muizen per kooi te houden om elke muis voldoende NaI-voeding te geven. Het aantal muizen kan echter ook veranderen als gevolg van de regels en voorschriften van de specifieke instelling voor dieren. Omdat seksueel dimorfisme in ons laboratorium wordt gevonden, worden muizen van één geslacht voorgesteld voor het experiment (voor experimenten met speciale vereisten voor de detectie van schildklierspecifieke antilichamen worden vrouwelijke aanbevolen). Er wordt voorgesteld om muizen van 8 weken oud te selecteren, omdat 10% van de muizen spontane thyroiditis ontwikkelt op de leeftijd van 16 weken en alle muizen uiteindelijk thyroiditis ontwikkelen zonder NaI-water. De schildklierlaesies blijven gedurende de hele levensduur van de muizen bestaan en de volgende generatie ontwikkelt thyroiditis wanneer ze worden geboren. Daarom wordt het voor het behoud van muizen aanbevolen om muizen van 8 weken oud te gebruiken. Het is belangrijk op te merken dat TPOAb meer geschikt is als detectie-indicator dan TgAb bij gebruik van NOD. H-2h4 muizen om thyroiditis na te bootsen. Bij het meten van de niveaus van TPOAb moet de duur van de inductie echter meer vertraagd zijn dan TgAb.

Concluderend beschrijft dit artikel de oprichting van een SAT-model met NOD. H-2h4 muizen en de verkenning van de invloed van verschillende factoren op dit model. Hoewel het niet perfect de pathogenese en het mechanisme van auto-immuun schildklierziekte simuleert, de NOD. H-2h4 muis is een stabiel diermodel met een groot potentieel op het gebied van auto-immuun schildklieraandoeningen. Aangezien dit een gemakkelijk diermodel is om te construeren en zeer reproduceerbaar is, wordt gehoopt dat deze methode zal helpen bij het verbeteren van toepassingen van SAT-muizenmodellen in verschillende onderzoeksinstellingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Acknowledgments

Muis monoklonale antilichamen tegen humaan TPO (gebruikt als positieve controles) werden geleverd door Dr. P. Carayon en Dr. J. Ruf (Marseille, Frankrijk). De auteurs bedanken alle deelnemers aan deze studie en de leden van ons onderzoeksteam. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van het Postdoctoral Sustentation Fund of West China Hospital, Sichuan University, China (2020HXBH057) en het Sichuan Province Science and Technology Support Program (Project No. 2021YFS0166)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ralli, M., et al. Hashimoto's thyroiditis: An update on pathogenic mechanisms, diagnostic protocols, therapeutic strategies, and potential malignant transformation. Autoimmunity Reviews. 19 (10), 102649 (2020).
  2. Zhang, Q. Y., et al. Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto's thyroiditis. Nature Communications. 13 (1), 775 (2022).
  3. Ruggeri, R. M., et al. Autoimmune comorbidities in Hashimoto's thyroiditis: different patterns of association in adulthood and childhood/adolescence. European Journal of Endocrinology. 176 (2), 133-141 (2017).
  4. Resende de Paiva, C., Grønhøj, C., Feldt-Rasmussen, U., von Buchwald, C. Association between Hashimoto's thyroiditis and thyroid cancer in 64,628 patients. Frontiers in Oncology. 7, 53 (2017).
  5. Ehlers, M., Schott, M. Hashimoto's thyroiditis and papillary thyroid cancer: are they immunologically linked. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (12), 656-664 (2014).
  6. Medenica, S., et al. The role of cell and gene therapies in the treatment of infertility in patients with thyroid autoimmunity. International Journal of Endocrinology. 2022, 4842316 (2022).
  7. Rose, N. R. The genetics of autoimmune thyroiditis: the first decade. Journal of Autoimmunity. 37 (2), 88-94 (2011).
  8. Kolypetri, P., King, J., Larijani, M., Carayanniotis, G. Genes and environment as predisposing factors in autoimmunity: acceleration of spontaneous thyroiditis by dietary iodide in NOD.H2(h4) mice. International Reviews of Immunology. 34 (6), 542-556 (2015).
  9. Terplan, K. L., Witebsky, E., Rose, N. R., Paine, J. R., Egan, R. W. Experimental thyroiditis in rabbits, guinea pigs and dogs, following immunization with thyroid extracts of their own and of heterologous species. The American Journal of Pathology. 36 (2), 213-239 (1960).
  10. Alexopoulos, H., Dalakas, M. C. The immunobiology of autoimmune encephalitides. Journal of Autoimmunity. 104, 102339 (2019).
  11. Noviello, C. M., Kreye, J., Teng, J., Prüss, H., Hibbs, R. E. Structural mechanisms of GABA receptor autoimmune encephalitis. Cell. 185 (14), 2469-2477 (2022).
  12. Pudifin, D. J., Duursma, J., Brain, P. Experimental autoimmune thyroiditis in the vervet monkey. Clinical and Experimental Immunology. 29 (2), 256-260 (1977).
  13. Esquivel, P. S., Rose, N. R., Kong, Y. C. Induction of autoimmunity in good and poor responder mice with mouse thyroglobulin and lipopolysaccharide. The Journal of Experimental Medicine. 145 (5), 1250-1263 (1977).
  14. Kong, Y. C., et al. HLA-DRB1 polymorphism determines susceptibility to autoimmune thyroiditis in transgenic mice: definitive association with HLA-DRB1*0301 (DR3) gene. The Journal of Experimental Medicine. 184 (3), 1167-1172 (1996).
  15. Kotani, T., Umeki, K., Hirai, K., Ohtakia, S. Experimental murine thyroiditis induced by porcine thyroid peroxidase and its transfer by the antigen-specific T cell line. Clinical and Experimental Immunology. 80 (1), 11-18 (1990).
  16. Ng, H. P., Banga, J. P., Kung, A. W. C. Development of a murine model of autoimmune thyroiditis induced with homologous mouse thyroid peroxidase. Endocrinology. 145 (2), 809-816 (2004).
  17. Ng, H. P., Kung, A. W. C. Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T cell epitope of thyroid peroxidase. Endocrinology. 147 (6), 3085-3092 (2006).
  18. Ellis, J. S., Braley-Mullen, H. Mechanisms by which B cells and regulatory T Cells influence development of murine organ-specific autoimmune diseases. Journal of Clinical Medicine. 6 (2), 13 (2017).
  19. Fang, Y., Yu, S., Braley-Mullen, H. Contrasting roles of IFN-gamma in murine models of autoimmune thyroid diseases. Thyroid. 17 (10), 989-994 (2007).
  20. Fang, Y., Zhao, L., Yan, F. Chemokines as novel therapeutic targets in autoimmune thyroiditis. Recent Patents on DNA & Gene Sequences. 4 (1), 52-57 (2010).
  21. Chen, C. R., et al. Antibodies to thyroid peroxidase arise spontaneously with age in NOD.H-2h4 mice and appear after thyroglobulin antibodies. Endocrinology. 151 (9), 4583-4593 (2010).
  22. Ruf, J., et al. Relationship between immunological structure and biochemical properties of human thyroid peroxidase. Endocrinology. 125 (3), 1211-1218 (1989).
  23. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., Chong, G., Rapoport, B. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword'. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  24. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., et al. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword’[J]. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  25. Hutchings, P. R., et al. Both CD4(+) T cells and CD8(+) T cells are required for iodine accelerated thyroiditis in NOD mice. Cellular Immunology. 192 (2), 113-121 (1999).
  26. Xue, H., et al. Dynamic changes of CD4+CD25 + regulatory T cells in NOD.H-2h4 mice with iodine-induced autoimmune thyroiditis. Biological Trace Element Research. 143 (1), 292-301 (2011).
  27. Hou, X., et al. Effect of halofuginone on the pathogenesis of autoimmune thyroid disease in different mice models. Endocrine, Metabolic & Immune Disorders Drug Targets. 17 (2), 141-148 (2017).
  28. McLachlan, S. M., et al. Dissociation between iodide-induced thyroiditis and antibody-mediated hyperthyroidism in NOD.H-2h4 mice. Endocrinology. 146 (1), 294-300 (2005).
  29. Danailova, Y., et al. Nutritional management of thyroiditis of hashimoto. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 5144 (2022).
  30. Carayanniotis, G. Molecular parameters linking thyroglobulin iodination with autoimmune thyroiditis. Hormones. 10 (1), 27-35 (2011).
  31. Verginis, P., Li, H. S., Carayanniotis, G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+ T cells. Journal of Immunology. 174 (11), 7433-7439 (2005).
  32. Flynn, J. C., et al. Superiority of thyroid peroxidase DNA over protein immunization in replicating human thyroid autoimmunity in HLA-DRB1*0301 (DR3) transgenic mice. Clinical and Experimental Immunology. 137 (3), 503-512 (2004).
  33. Akeno, N., et al. IFN-α mediates the development of autoimmunity both by direct tissue toxicity and through immune cell recruitment mechanisms. Journal of Immunology. 186 (8), 4693-4706 (2011).

Tags

Intrekking Nummer 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Generatie van een muis Spontane auto-immuun thyroiditis model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter