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Summary
하시모토 갑상선염의 여러 유형의 동물 모델이 확립되었으며, NOD 마우스의 자발성 자가면역 갑상선염도 확립되었습니다. H-2h4 마우스는 HT 유도를 위한 간단하고 신뢰할 수 있는 모델입니다. 이 기사에서는 이 접근 방식을 설명하고 SAT 쥐 모델을 더 잘 이해하기 위해 병리학적 과정을 평가합니다.
Abstract
최근 몇 년 동안 하시모토 갑상선염(HT)은 가장 흔한 자가면역 갑상선 질환이 되었습니다. 그것은 림프구 침윤과 특정 혈청자가 항체의 검출을 특징으로합니다. 잠재적인 메커니즘은 아직 명확하지 않지만 하시모토 갑상선염의 위험은 유전적 및 환경적 요인과 관련이 있습니다. 현재 실험적 자가면역 갑상선염(EAT) 및 자발성 자가면역 갑상선염(SAT)을 포함하여 여러 유형의 자가면역 갑상선염 모델이 있습니다.
생쥐의 EAT는 티로글로불린(Tg)과 결합된 지질다당류(LPS)로 면역화되거나 완전 프로인트 보조제(CFA)로 보충되는 HT의 일반적인 모델입니다. EAT 마우스 모델은 많은 유형의 마우스에서 널리 확립되어 있습니다. 그러나, 질환 진행은 Tg 항체 반응과 연관될 가능성이 더 높으며, 이는 상이한 실험에서 다를 수 있다.
SAT는 NOD의 HT 연구에도 널리 사용됩니다. H-2h4 마우스. 고개를 끄덕입니다. H2h4 마우스는 B10과 함께 비만하지 않은 당뇨병(NOD) 마우스의 교배로부터 얻은 새로운 균주이다. A(4R), 이는 요오드 공급 유무에 관계없이 HT에 대해 유의하게 유도됩니다. 유도하는 동안 NOD. H-2h4 마우스는 갑상선 여포 조직에 림프구 침윤을 동반하는 높은 수준의 TgAb를 가지고 있습니다. 그러나 이러한 유형의 마우스 모델의 경우 요오드 유도 동안 병리학적 과정을 종합적으로 평가하는 연구는 거의 없습니다.
본 연구에서는 HT 연구를 위한 SAT 마우스 모델을 확립하고, 장기간의 요오드 유도 후 병리학적 변화 과정을 평가한다. 이 모델을 통해 연구자들은 HT의 병리학적 발달을 더 잘 이해하고 HT에 대한 새로운 치료 방법을 선별할 수 있습니다.
Introduction
하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis, HT)은 만성 림프구성 갑상선염 또는 자가면역성 갑상선염으로도 알려져 있으며, 1912년에 처음 보고되었다1. HT는 림프구 침윤과 갑상선 여포 조직 손상을 특징으로 합니다. 실험실 검사는 주로 항갑상선글로불린 항체(TgAb) 및 항갑상선 과산화효소 항체(TPOAb)를 포함한 갑상선 특이적 항체의 증가로 나타납니다.2. HT의 발병률은 0.4%-1.5% 범위로 모든 갑상선 질환의 20%-25%를 차지하며 이 값은 최근 몇 년 동안 증가했습니다3. 또한 많은 연구에서 HT가 유두상 갑상선 암종(PTC)의 종양 발생 및 재발과 관련이 있다고 보고했습니다.4,5; 잠재적 메커니즘은 여전히 논란의 여지가 있습니다. 자가면역성 갑상선염은 여성 불임의 중요한 요인이기도하다 6. 따라서 HT의 발병기전이 명확해야 하며, 이를 위해서는 안정적이고 단순한 동물 모델이 필수적입니다.
HT의 병인을 연구하기 위해 본 연구에서 실험적 자가면역 갑상선염(EAT)과 자발성 자가면역 갑상선염(SAT)을 포함하여 두 가지 주요 종류의 쥐 모델이 사용되었습니다 7,8. 감수성 마우스를 특정 갑상선 항원(조갑상선, 정제된 티로글로불린[TG], 갑상선 과산화효소[TPO], 재조합 TPO 엑토도메인 및 선택된 TPO 펩티드 포함)으로 면역화하여 EAT 쥐 모델을 확립했습니다. 또한, 지질다당류(LPS), 완전 프로인트 보조제(CFA) 및 다른 특이한 보조제를 포함하는 보조제는 또한 면역 관용(9,10,11,12,13,14,15,16,17)을 분해하기 위해 면역화 동안 사용된다.
SAT 모델은 NOD를 기반으로 하는 자가면역성 갑상선염의 자발적 발달을 연구하는 중요한 모델입니다. H-2h4 마우스. 고개를 끄덕입니다. H-2h4 마우스는 NOD와 B10의 교배로부터 얻은 새로운 균주이다. A(4R) 마우스, 자가면역 갑상선염 감수성 유전자 IAk18,19를 사용하여 NOD에 대한 다중 백크로스. 끄덕이다. H-2h4 마우스는 당뇨병이 발생하지 않지만 자가면역 갑상선염과 쇼그렌 증후군(SS) 발병률이 높습니다19. 연구에 따르면 세포 내 접착 분자-1(ICAM-1)은 NOD의 갑상선 조직에서 고도로 발현됩니다. 3-4주령의 H-2H4 마우스. 또한, 요오드 섭취가 증가함에 따라 티로 글로불린 분자의 면역 원성이 향상되어 단핵구 침윤 과정에서 중요한 역할을하는 ICAM-1의 발현을 더욱 상향 조절한다21. 이 모델은 요오드 용량과 질병 중증도 사이의 관계를 확인하면서 자가면역 과정을 시뮬레이션합니다. 확립 된 방법은 안정적이며 성공 확률이 높습니다. SAT 모델은 수년 동안 자가면역성 갑상선염을 유발하는 데 적용되어 왔으며 자가면역성 갑상선염의 발병기전을 연구하는 효과적인 방법이기도 합니다. 그러나 현재 EAT 모델의 구성 방법은 더 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 다른 실험실은 다른 예방 접종 방법과 주사 부위를 사용합니다. 또한, 유전적 배경이 다른 마우스는 유도 속도가 다르기 때문에 강력한 메커니즘을 밝히기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.
그러나 SAT 모델에서 갑상선염의 발병은 요오드화 나트륨, 성적 이형성 및 양육 조건과 관련이 있습니다. SAT 모델에서자가 면역 갑상선염의 적절한 절차를 밝히기 위해이 기사에서는 다양한 조건에서자가 면역 갑상선염을 유도하는 방법을 설명했습니다. 또한, 이 질환의 여러 단계에서 자가면역 갑상선염의 발병기전 및 면역학적 진행을 연구할 수 있습니다.
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Protocol
아래에 설명된 프로토콜은 쓰촨 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 제정한 관리 및 사용 지침에 의해 승인되었습니다.
1. 준비
- 모든 마우스를 12시간 명암 주기(각각 오전 07:00 및 오후 07:00에 시작)에서 특정 병원체가 없는 조건에 수용합니다. 실내 온도를 22°C로 유지합니다. 매주 침구 재료를 교체하십시오. 적절한 양의 표준 설치류 차우와 물을 제공하십시오.
- NaI의 원액을 물에 조제할 때, 화합물 2.5g을 칭량하여 볼텍싱하에 멸균된 순수 50mL에 용해시켜 5%의 원액을 얻었다. 이 스톡 용액을 빛을 피하고 4°C 냉동고에 최대 8주 동안 보관하십시오.
- NaI의 작동 용액을 준비하기 위해 원액 2.5mL를 뽑아 NOD의 일일 음용수로 일반 물 250mL에 녹입니다. H-2H4 마우스를 0.05%의 작업용액으로 수득하였다.
2. 갑상선염 유도
- SAT 모델
- NOD를 준비합니다. H-2h4 마우스(8주령)를 위해 연구를 위해 단일 성별(성적 이형성 없음)의 모든 마우스를 배리어 케이지(케이지 당 5마리)에 1.1단계에 기재된 섭식 조건으로 수용하였다.
- NOD에서 자가면역 갑상선염을 유도합니다. H-2h4 마우스는 모든 마우스에 8주 동안 0.05% NaI를 공급합니다. 매주 NaI 물을 교체하고 외모, 체중, 식욕, 정신 상태 및 이동성을 포함하여 매주 생쥐의 상태를 평가합니다.
- EAT 모델
- 1.1단계에 설명된 섭식 조건으로 배리어 케이지(케이지당 5마리)에 단일 성별(성적 이형성 없음)의 모든 마우스를 수용하여 연구를 위해 BALB/c 마우스(8주령)를 준비합니다. 모든 마우스에 0.05% NaI를 8주 동안 공급합니다.
- 처음 2주 동안 일주일에 한 번 CFA와 Tg(200μL)의 혼합물을 피하 주사합니다.
- 3주째부터 IFA와 Tg(200μL)의 혼합물을 3주 동안 주 1회 피하 주사한다.
3. 측정
- 말초 혈액 샘플의 준비
- 유도 후 0.01mL/g 용량의 마우스를 복강주사로 마취한다. 미다졸람(진정 40μg/100μL), 메데토미딘(진정 7.5μg/100μL) 및 부토르파놀 타르타르산염(진통제용 50μg/100μL)을 인산염 완충 식염수(PBS)에 혼합하여 마취제를 준비합니다.
참고: 마취 혼합물의 각 성분의 특정 농도는 미다졸람 13.33μg/100μL, 메데토미딘 2.5μg/100μL 및 부토르파놀 16.7μg/100μL입니다. 생쥐에 사용되는 특정 용량의 경우 용량은 미다졸람 4μg/g, 메데토미딘 0.75μg/g 및 부토르파놀 1.67μg/g입니다. 마취 깊이는 마우스의 사지 근육이 이완되고 수염이 촉감 반응이 없으며 페달 반사가 상실되었을 때 확인되었습니다. - 마우스를 마취시킨 후 한 손으로 마우스를 고정하고 안구 피부를 눌러 안구가 돌출되도록 말초 혈액 샘플을 준비합니다. 그런 다음 모세관을 눈의 안쪽 모서리에 삽입하고 콧 구멍의 평면에 30-45도 각도로 침투하십시오. 모세관을 부드럽게 돌리면서 압력을 가합니다. 혈액은 모세관 작용을 통해 튜브로 흐릅니다.
- 혈액을 4°C 냉장고에 2시간 동안 넣은 다음 1,000× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 샘플을 얻습니다. 추가 분석을 위해 나머지 샘플을 -80°C에서 보관합니다.
- 유도 후 0.01mL/g 용량의 마우스를 복강주사로 마취한다. 미다졸람(진정 40μg/100μL), 메데토미딘(진정 7.5μg/100μL) 및 부토르파놀 타르타르산염(진통제용 50μg/100μL)을 인산염 완충 식염수(PBS)에 혼합하여 마취제를 준비합니다.
- 갑상선 조직 샘플의 준비
- 제도적 정책에 따라 동물을 인도적으로 안락사시킵니다. 그런 다음 흉벽을 해부하여 심장을 노출시키고 우심방을 잘라낸 다음 조직이 하얗게 변할 때까지 20mL 주사기에 부착된 정맥 주입 바늘로 식염수를 좌심실에 주입합니다.
- 핀으로 해부 테이블에 마우스를 고정하십시오. 75 % 에탄올로 목을 소독하십시오. 조직 가위로 흉골 상단에서 아래턱까지 목의 중앙선을 따라 마우스의 피부를 잘라 목 조직을 완전히 노출시킵니다.
- 한 쌍의 분홍색 땀샘, 턱밑 땀샘을 관찰하고 그 아래에는 전방 기관 근육이 있습니다. 안과용 가위와 집게로 땀샘과 근육을 분리하여 기관과 갑상선 연골을 노출시킵니다.
- 구부러진 집게를 사용하여 연골과 기관을 함께 집어 올리고 연골 아래 조직을 분리합니다. 연골과 기관의 원위부와 근위부를 각각 잘라내어 기관과 함께 갑상선을 제거하십시오.
- 땀샘을 4 % 파라 포름 알데히드에 12-24 시간 동안 담그십시오. 그런 다음 조직을 70% 에탄올로 옮깁니다.
- 갑상선 생검 물질의 개별 엽을 처리 카세트에 넣고 다음 직렬 알코올 구배를 통해 탈수합니다: 각각 40분 동안 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 에탄올; 2 시간 동안 1/2 크실렌 + 1/2 절대 에탄올; 1.5 시간 동안 100 % 크실렌; 1.5 시간 동안 100 % 크실렌; 2시간 동안 1/2 크실렌 + 1/2 파라핀; 40 ° C에서 40 분 동안 오븐; 30분 동안 파라핀 I; 및 파라핀 II를 30분 동안 투여합니다. 파라핀 왁스 블록에 삽입하십시오.
- 염색 전에 5μm 두께의 갑상선 조직 절편을 크실렌(다음과 같이)으로 탈왁스하고 다음과 같은 감소된 농도의 에탄올을 통해 재수화합니다. 10분 동안 크실렌 II; 10분 동안 크실렌 III; 5분 동안 무수 에탄올 I; 5분 동안 무수 에탄올 II; 5 분 동안 90 % 알코올; 5 분 동안 80 % 알코올; 5 분 동안 70 % 알코올; 5 분 동안 50 % 알코올.
- 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 조직을 얼룩지게 합니다. 헤마톡실린으로 15분간 얼룩지게 하고 수돗물로 15분간 헹구고 1% 염산 에탄올을 10초 동안 넣고 흐르는 물로 헹군 다음 50%, 70%, 80% 에탄올로 각각 3분간 헹굽니다. 0.5% 에오신 에탄올 염색을 2분 동안 수행하고 흐르는 물로 헹굽니다. 파라핀 절편을 75% 에탄올에 2분, 85% 에탄올에 2분, 무수 에탄올에 5분, 자일렌에 5분 동안 연속적으로 놓습니다. 중성 껌과 유리 슬라이드로 슬라이스를 고정하십시오.
- 림프구성 갑상선염의 정도를 평가하기 위해, 갑상선 절편을 다음과 같이 점수화한다: 0: 갑상선 조직에 림프구 침윤이 거의 또는 전혀 없음; 1+ : 샘의 1/8 이상이 하나 또는 여러 개의 병소에 침투합니다. 2+ : 샘의 1/4 이상이 림프구로 침윤되지 않습니다. 3+: 샘의 1/4-1/2에 림프구가 침윤됩니다. 4+: 샘의 1/2 이상이 파괴됩니다.
참고: 기관에서 제거하기에는 너무 작은 마우스 갑상선의 전체 구조를 유지하기 위해 갑상선 연골을 제거하는 것이 좋습니다.
- TPOAb 측정
참고: 마우스 TPO를 안정적으로 발현하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포가 우리 연구실에서 확립되었습니다. 마우스 TPO cDNA는 XbaI 및 NheI에 의해 절제되었다. 그런 다음 cDNA를 pcDNA5/FRT로 옮겼습니다. 플라스미드가 성공적으로 구축된 후 CHO 세포에 형질감염시키고 하이그로마이신 B(100g/mL)로 선택했습니다.- mTPO-CHO 세포를 구축한 후 3.1.3단계(1:50)에서 마우스 혈청을 희석하고 mTPO-CHO 세포와 함께 2시간 동안 배양합니다. 배양 후 프로피듐 요오드화물(1g/mL)로 세포 염색을 제외하고 플루오레세인 이소티오시아네이트 접합, 친화성 정제 염소 항-마우스 IgG를 사용하여 유세포 분석으로 샘플을 분석합니다. FSC-A 및 SSC-A 채널로 생존한 단세포 집단을 스크리닝하고 단일세포 집단에서 FITC 및 PI 태그가 부착된 세포를 선택한다21.
- IgG에 결합된 면역되지 않은 BALB/c 또는 C57BL/6 마우스의 혈청을 음성 대조군으로 포함합니다. 마우스 TPO23을 인식하는 양성 대조군으로 인간 TPO22에 대한 마우스 단클론 항체를 포함합니다. TPO 바인딩 데이터를 기하학적 평균으로 표현합니다.
- TgAb 측정
알림: ELISA 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 티로글로불린을 검출하십시오.- 표준 샘플을 희석하십시오.amp지침에 따라 미세 원심분리기 튜브에 있습니다. 냉장고에서 키트를 꺼내 실온에서 30분 동안 보관하세요.
- 표준 웰, 블랭크 웰 및 테스트 웰을 설정합니다. 블랭크 웰은 버퍼만 얻는 반면 표준 웰은 표준 용액을 얻습니다. 10 μL의 샘플을 테스트 웰에 추가합니다. 샘플을 추가 할 때 웰 벽을 만지지 말고 플레이트를 부드럽게 흔들어 샘플을 웰 바닥으로 옮깁니다.
- 양성 대조군으로 Tg, CFA 및 IFA24 로 면역화된 BALB/c 마우스의 혈청과 8주령 NOD의 혈청을 포함합니다. H-2h4 마우스는 음성 대조군으로 일반 물에 있습니다.
- 샘플을 37°C 수조에서 30분 동안 인큐베이션합니다. 세척 완충액을 증류수로 1:30의 비율로 희석한다. 그런 다음 밀봉 필름을 제거하고 효소 플레이트 내부의 액체를 털어내고 흡수지에서 두드려 건조시킨 다음 350μL의 세척 완충액을 30초 동안 추가합니다. 이 과정을 다섯 번 반복한 다음 우물을 두드려 말립니다.
- 블랭크 웰을 제외한 각 웰에 효소 표지 시약 50μL를 첨가하고 37° 수조에서 30분 동안 배양합니다. 밀봉 필름을 제거하고 효소 플레이트 내부의 액체를 털어내고 흡수성 종이에 두드려 말립니다.
- 50 μL의 현상액 A를 각 웰에 첨가한 후 50 μL의 현상액 B를 첨가하고 웰을 부드럽게 흔들어 5분 동안 혼합합니다. 종결 용액 50μL를 각 웰에 15분 동안 첨가하여 반응을 중지합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm의 파장에서 각 웰의 흡광도(OD)를 측정합니다. TgAb 데이터를 490 nm에서의 광학 밀도(OD)로 제시합니다.
- T4 및 갑상선 자극 호르몬(TSH) 측정
참고: 제조업체의 지침에 따라 ELISA로 T4 및 TSH 수준(10μL 분취량)을 측정합니다.- 효소 접합체를 분석 희석제로 1:11로 희석합니다. 측정할 샘플을 0.01 M PBS를 사용하여 희석(1:100)합니다.
- 표준물질과 시료 10μL를 해당 웰에 추가하고, 효소 접합체 100μL를 각 웰에 추가하고, 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 우물에 액체를 버리고 세척 완충액으로 세 번 세척하십시오.
- 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 100μL를 넣고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
- 정지 용액 50 μL를 넣고 15-20 초 동안 부드럽게 혼합합니다.
- 450nm 파장에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 흡광도(OD)를 측정하고 샘플 농도를 계산합니다.
- 통계 소프트웨어를 사용하여 t-검정 또는 순위 합계 검정을 수행하고 결과를 플로팅합니다.
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Representative Results
조직학적 변화는 여성과 남성, 요오드 섭취 기간, NaI 용액에서 현저하게 달랐습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 NOD의 ~10%. H-2h4 마우스는 24주령에 요오드 유도 없이도 SAT가 발생했고, 결국 모든 마우스에서 갑상선염이 발생했다. 일반 물을 투여했을 때 남성과 여성의 조직학적 변화에는 큰 차이가 없었습니다. 식수에 NaI를 추가하면 갑상선염의 발병이 가속화되었습니다. 0.005%, 0.05% 및 0.5%의 용액에서 SAT는 NaI 물을 제공한 후 각각 16주, 8주 및 8주에 최대 중증도에 도달했습니다. 갑상선염이 유발되면 림프구 침윤은 마우스의 일생 동안 계속되었습니다. 유도 동안, 암컷 마우스는 동일한 조건에서 수컷보다 더 심한 갑상선염이 발생하는 경향이 있는 것으로 보였지만, 림프구 침윤의 중증도에는 유의한 차이가 없었으며, 이는 샘플 수에 의해 제한될 수 있습니다.
추가 요오드가 없는 일반 물을 투여했을 때 TgAb 수치는 16주령에 크게 상승하지 않았으며 남성과 여성 간에 유의미한 차이가 발견되지 않았습니다. NOD의 TgAb 수준. H-2h4 마우스는 24주에 상승하기 시작했고, 성별에 차이가 없었고, TgAb 수치는 72주까지 계속 상승했다(그림 2A). 식수에 NaI를 첨가하면 TgAb 수치가 각각 0.005%, 0.05% 및 0.5% NaI의 용액으로 16주, 8주 및 8주에 상승하기 시작했습니다. 그러나, TgAb의 수준은 어떤 용액에서도 남성과 여성 사이에 차이를 나타내지 않았다(도 2B-D). NaI 물의 투여 여부에 관계없이 TgAb 수치는 72주(또는 NaI 물을 처음 투여한 후 64주)에 최고치에 도달했습니다.
TgAb에 비해 TPOAb 수준의 검출 가능성에 더 긴 지연이 있었습니다. 이러한 항체는 NOD에서 거의 검출되지 않았습니다. 24 주령에 규칙적인 물을 가진 H-2h4 마우스. 일반 물을 먹였을 때 암컷은 72주에 수컷보다 훨씬 더 높은 TPOAb 수치를 나타냈습니다(그림 2E). 간성 차이의 동일한 추세가 NOD에서도 나타났습니다. 각각 0.005%, 0.05% 및 0.5%의 NaI 물을 투여했을 때 16주, 8주 및 8주 동안 H-2h4 마우스(그림 2F-H) 그러나 현저하게도 유도 동안 NaI 농도가 0.05% 이상이었을 때 TPOAb 수준은 NaI 물을 처음 투여한 후 64주에 최고치에 도달했으며 수컷과 암컷 사이에 차이가 없었습니다(그림 2G, H)입니다.
또한, 남성 NOD의 혈청 TSH 수치. H-2h4 마우스는 NAI 물의 공급 여부에 관계없이 다른 섭식 단계의 암컷보다 유의하게 높았습니다. 일반 물을 주면 TSH 수치가 NOD. H-2h4 마우스는 24주령부터 증가하기 시작했으며, 요오드를 별도로 투여한 후 16주, 8주, 8주에 각각 0.005%, 0.05%, 0.5% 농도의 요오드 식이군에서도 유사한 경향이 관찰되었다. TSH 수치는 유도 기간 동안 계속 상승하여 64주에 정점을 찍었습니다. 또한, 나머지 NOD에서 남성과 여성 간의 TSH 수치에 상당한 차이가 있었습니다. H-2H4 마우스 (그림 3A-D). 끄덕이다. H-2h4 마우스는 요오드 섭취 후 갑상선종이나 갑상선 기능 저하증을 경험하지 않았습니다. 요오드 제제 투여 여부에 관계없이 NOD에서 T4 수치에는 성별 관련 차이가 없었습니다. H-2h4 마우스. 그러나, 유도 기간이 증가함에 따라, T4의 수준은 요오드 물 그룹에서 남녀 모두에서 감소하는 경향을 보였다(유의한 차이 없음)(그림 3E-H).
병리학적 과정에서의 성적 이형성 및 TPOAb 수준은 NOD의 자손에서 발견되었다. H-2h4 마우스, 그러나 TgAb는 아닙니다. 다른 연구와 유사하게25,26, TPOAb 수치는 2-4개월 동안 식이 요오드화물을 투여받은 후 모델 마우스에서 유의하게 증가했으며 성별과 관련된 차이가 있었습니다. 또한 TSH 수치는 여성보다 남성에서 더 높았다. 식이 요오드화물 보충 유무에 관계없이 H-2h4 마우스는 다른 마우스 균주와 유사합니다. 이 차이는 TPOAb 또는 TgAb의 수준에 영향을받지 않을 수있는 동물의 일생 동안 유지되었으며, 0.05 % NaI에 노출되었을 때 대부분의 마우스는 8 주 만에 갑상선염을 일으켰으며 이는 0.5 % NaI와 유사한 효과를 나타 냈습니다. 반면 0.005% NaI는 NOD에 유사한 영향을 미쳤다. H-2h4 마우스에 일반 물을 공급하면 0.05% NaI(유도 8주 후)의 농도가 자가면역 갑상선염을 유발하는 바람직한 조건이 될 수 있습니다. NOD의 T4 수준. H-2h4 마우스는 성별과 관련된 차이가 없었으며 요오드 제제의 영향을 받지 않았으며 이는 다른 연구와 일치합니다27,28. 이것은 질병의 비교적 짧은 발병 시간과 마우스의 보상 갑상선 기능으로 인해 마우스의 무증상 갑상선 기능 저하증과 유사한 현상을 일으킬 수 있습니다. 우리는 생쥐의 TSH 축이 결국 보상되지 않고 시간이 지남에 따라 차이를 일으킬 것이라고 추측합니다.
그림 1: NOD에서 갑상선의 병리학적 변화 및 림프구 침윤 염증 점수. 요오드 식단이 있거나 없는 H-2h4 마우스. (A,C,E,G) HE 염색에 의한 0%, 0.005%, 0.05% 및 0.5%의 요오드 식이요법 하에서 갑상선의 병리학적 변화; 200x 배율, N = 10/그룹. (B, D, F, G) 갑상선 염증은 림프구 침윤 면적에 따라 결정되었습니다. 림프구 침윤 정도의 등급: 0: 림프구 침윤이 거의 없음; 1+: 샘의 1/8 이상이 침범당했습니다. 2+: 샘의 1/4이 침범됩니다. 3+: 샘의 1/4에서 1/2이 침범됩니다. 4+: 샘의 절반 이상이 파괴됩니다. N = 10/그룹. 유의한 차이: *p < 0.05; **p < 0.01입니다. 약어: F = 여성; M = 남성; NW = N 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: NOD의 자가항체. H-2h4 마우스는 일반 및 요오드화물 함유 물에. (A-D) NOD에서 Tg에 대한 자가항체. H-2h4 마우스는 일반 물(8, 16, 24 및 72주령에 별도로) 및 요오드화물 물-0.005%, 0.05% 및 0.5%(요오드 물이 시작된 후 0, 8, 16 및 64주)에 있습니다. (E-H) NOD에서 TPO에 대한 자가항체. H-2h4 마우스는 일반 물(8, 16, 24 및 72주령에 별도로) 및 요오드화물 물-0.005%, 0.05% 및 0.5%(요오드 물이 시작된 후 0, 8, 16 및 64주)에 있습니다. TgAb에 대한 값은 ELISA 광학 밀도(OD) 490nm(평균 SEM의 평균 ± 표준 오차)로 보고되고 TPOAb에 대한 값은 유세포 분석에서 기하 평균으로 보고됩니다. N = 8/그룹. 유의한 차이: *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001. 약어: Tg = 티로글로불린; TgAb = Tg에 대한 자가항체; TPO = 갑상선 과산화효소; TPOAb = TPO에 대한 자가항체; F = 여성; M = 남성; NW = N 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: NOD의 TSH 및 T4 수준. H-2h4 마우스는 일반 및 요오드화물 함유 물에. (A-D) TSH 및 (EH) T4 일반 물 (8, 16, 24 및 72 주 별도) 및 요오드화물 물 -0.005 %, 0.05 % 및 0.5 % (0, 8, 16 및 64 주) 요오드 물이 시작된 후). TSH 값은 방사선 면역 측정법(mU/L, 평균 SEM의 평균 ± 표준 오차)으로 측정되었습니다. N = 8/그룹. 유의한 차이: *p < 0.05; **p < 0.01; p < 0.001; *p < 0.0001입니다. 약어: TSH = 갑상선 자극 호르몬; F = 여성; M = 남성; NW = N 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
HT는 갑상선에 침투한 림프구로 인한 자가면역계 장애로 인해 발생하며, 갑상선 기능을 더욱 손상시키면서 갑상선 특이적 항체를 생성합니다. HT 환자의 혈청 TSH, TgAb 및 TPOAb 수치는 유의하게 상승했다27. 현재 자가면역 갑상선염의 병인을 연구하기 위해 두 가지 주요 종류의 쥐 모델이 널리 사용됩니다: EAT와 SAT29. EAT 마우스는 생체 내에서 비정상적인 면역 환경을 조성하기 위해 대부분 단백질과 보조제를 사용하여 면역화됩니다. 이 접근법은 수년 동안 사용되어 왔으며 계속해서 효과적입니다30,31. 또한, 갑상선염을 유도하는 새로운 접근법은 Tg32로 펄스된 아덴드릭 세포(DC) 주입, 아데노바이러스 벡터 또는 플라스미드31에 의한 생체 내 Tg 또는 TPO 발현, 동종 마우스의 갑상선 이식 및 LPS 주입을 포함한다. 그러나 갑상선염 모델의 성공적인 구축은 일반적으로 실험적 쥐 모델, syngeneic antigens 및 세포 생물학 기술의 유전적 배경에 의해 더 제한됩니다. 또한, 특정 보조제는 보다 복잡한 면역 환경을 유도하여 자가면역 갑상선염의 면역학적 과정을 조사하기 어렵게 만들 수 있습니다. 따라서 우리는 NOD의 SAT가 있다고 믿습니다. H-2h4 마우스는 EAT 모델과 비교하여 하시모토 갑상선염의 발병기전을 더 잘 설명할 수 있습니다. 특히, 강력한 보조제와 티로글로불린을 사용한 예방 접종은 SAT33에 필요하지 않습니다. SAT의 진행 속도를 높이기 위해 NOD의 식수에 요오드가 첨가됩니다. H-2h4 마우스. 결과 갑상선염은 갑상선염이 인간에서 발생하는 것과 동일한 메커니즘을 공유하지 않지만 요오드는 실제로 갑상선염의 중요한 영향 인자입니다. 또한, 이 모델에서 요오드 제제는 NOD에서 갑상선염을 빠르게 유도할 수 있습니다. H-2h4 마우스 및 NOD. 요오드를 섭취하지 않은 H-2h4 마우스는 결국 갑상선염도 발생할 수 있습니다. 대부분의 실험실에서 실험 프로토콜이 다르기 때문에 NOD에 대해 보다 포괄적인 평가를 수행했습니다. 갑상선염 유도 중 H-2h4 마우스.
모델 구축 과정에서 몇 가지 사항에 세심한주의가 필요합니다. 정기적으로 식수를 추가하고 생쥐의 일반적인 상태를 평가하면 우발적 인 생쥐 사망을 피할 수 있습니다. 각 마우스에 충분한 NaI 공급을 제공하기 위해 유도 동안 케이지 당 5 마리 이하의 마우스를 유지하는 것이 좋습니다. 그러나 생쥐의 수는 동물에 대한 특정 기관의 규칙 및 규정에 따라 변경될 수도 있습니다. 우리 실험실에서 성적 이형성이 발견됨에 따라 실험을 위해 단일 성별 마우스가 제안됩니다 (갑상선 특이 항체 검출에 대한 특별한 요구 사항이있는 실험의 경우 암컷이 권장됨). 생쥐의 10%가 16주령까지 자발성 갑상선염을 일으키고 모든 생쥐가 결국 NaI 물 없이 갑상선염을 일으키기 때문에 8주령 생쥐를 선택하는 것이 좋습니다. 갑상선 병변은 생쥐의 일생 동안 지속되며 다음 세대는 태어날 때 갑상선염이 발생합니다. 따라서 생쥐의 보존을 위해 8 주 된 생쥐를 사용하는 것이 좋습니다. NOD를 사용할 때 TPOAb가 TgAb보다 검출 지표로 더 적합하다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 갑상선염을 모방하는 H-2h4 마우스. 그러나 TPOAb 수준을 측정할 때 유도 기간은 TgAb보다 더 지연되어야 합니다.
결론적으로 본 논문은 NOD를 이용한 SAT 모델의 확립에 대해 설명한다. H-2h4 마우스와 이 모델에 대한 다양한 요인의 영향 탐색. 자가면역 갑상선 질환의 발병기전과 기전을 완벽하게 시뮬레이션하지는 못하지만, NOD. H-2h4 마우스는 자가면역 갑상선 질환 분야에서 큰 잠재력을 가진 안정적인 동물 모델입니다. 이것이 구성하기 쉬운 동물 모델이고 재현성이 높다는 점을 감안할 때 이 방법이 다양한 연구 기관에서 SAT 쥐 모델의 적용을 개선하는 데 도움이 될 것으로 기대됩니다.
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Disclosures
모든 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
인간 TPO에 대한 마우스 단일클론 항체(양성 대조군으로 사용됨)는 Dr. P. Carayon 및 Dr. J. Ruf(프랑스 마르세유)에 의해 제공되었습니다. 저자는이 연구의 모든 참가자와 우리 연구팀 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 중국 쓰촨 대학교 서중국 병원의 박사후 유지 기금(2020HXBH057) 및 쓰촨성 과학 기술 지원 프로그램(프로젝트 번호 2021YFS0166)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Butorphanol tartrate | Supelco | L-044 | |
| Dexmedetomidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 145108-58-3 | |
| Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well | Sigma-Aldrich | M9410-1CS | |
| Ethanol | macklin | 64-17-5 | |
| Freund’s Adjuvant, Complete | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Freund’s Adjuvant, Incomplete | Sigma-Aldrich | F5506 | |
| Goat anti-Mouse IgG | invitrogen | SA5-10275 | |
| Midazolam solution | Supelco | M-908 | |
| Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA | Calbiotech | DKO045 | |
| Paraformaldehyde | macklin | 30525-89-4 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| Sodium Iodine | Sigma-Aldrich | 7681-82-5 | |
| Thyroglobulin | Sigma-Aldrich | T1126 | |
| Thyroglobulin ELISA Kit | Thermo Scientific | EHTGX5 | |
| TSH ELISA | Calbiotech | DKO200 | |
| Xylene | macklin | 1330-20-7 |
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철회 문제 193Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.
Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:
After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
to
After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of pedal reflex.
Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:
After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.
to
After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.
Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:
Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.
to
Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.
