Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bir Fare Spontan Otoimmün Tiroidit Modelinin Oluşturulması

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

NOD faresinde spontan otoimmün tiroidit olduğu gibi, Hashimoto tiroiditinin çeşitli hayvan modelleri oluşturulmuştur. H-2h4 fareler, HT indüksiyonu için basit ve güvenilir bir modeldir. Bu makalede SAT murin modelinin daha iyi anlaşılması için bu yaklaşım anlatılmakta ve patolojik süreç değerlendirilmektedir.

Abstract

Son yıllarda, Hashimoto tiroiditi (HT) en sık görülen otoimmün tiroid hastalığı haline gelmiştir. Lenfosit infiltrasyonu ve spesifik serum otoantikorlarının saptanması ile karakterizedir. Potansiyel mekanizma hala net olmasa da, Hashimoto tiroidit riski genetik ve çevresel faktörlerle ilişkilidir. Şu anda, deneysel otoimmün tiroidit (EAT) ve spontan otoimmün tiroidit (SAT) dahil olmak üzere çeşitli otoimmün tiroidit modelleri vardır.

Farelerde EAT, tiroglobulin (Tg) ile kombine edilmiş lipopolisakkarit (LPS) ile aşılanmış veya tam Freund adjuvanı (CFA) ile desteklenmiş HT için yaygın bir modeldir. EAT fare modeli, birçok fare türünde yaygın olarak kurulmuştur. Bununla birlikte, hastalığın ilerlemesi, farklı deneylerde değişebilen Tg antikor yanıtı ile daha olasıdır.

SAT, NOD'deki HT çalışmasında da yaygın olarak kullanılmaktadır. H-2h4 fare. BAŞINI SALLA. H2h4 fare, obez olmayan diyabetik (NOD) farenin B10 ile çaprazlanmasından elde edilen yeni bir türdür. A (4R), iyot beslenen veya beslenmeyen HT için önemli ölçüde indüklenir. İndüksiyon sırasında, NOD. H-2h4 fare, tiroid foliküler dokusunda lenfosit infiltrasyonunun eşlik ettiği yüksek bir TgAb seviyesine sahiptir. Bununla birlikte, bu tür fare modeli için, iyot indüksiyonu sırasında patolojik süreci kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için çok az çalışma vardır.

Bu çalışmada HT araştırması için bir SAT fare modeli oluşturulmuş ve uzun bir iyot indüksiyonu döneminden sonra patolojik değişim süreci değerlendirilmiştir. Bu model sayesinde, araştırmacılar HT'nin patolojik gelişimini daha iyi anlayabilir ve HT için yeni tedavi yöntemlerini tarayabilirler.

Introduction

Kronik lenfositik tiroidit veya otoimmün tiroidit olarak da bilinen Hashimoto tiroiditi (HT), ilk olarak 1912'de bildirilmiştir1. HT, lenfosit infiltrasyonu ve tiroid foliküler dokusunda hasar ile karakterizedir. Laboratuvar testleri temel olarak anti-tiroglobulin antikoru (TgAb) ve anti-tiroid peroksidaz antikoru (TPOAb)2 dahil olmak üzere tiroide özgü antikorların artması olarak kendini gösterir. HT insidansı %0.4-%1.5 aralığında olup, tüm tiroid hastalıklarının %20-25'ini oluşturmaktadır ve bu değer son yıllarda artmıştır3. Ek olarak, çok sayıda çalışma HT'nin papiller tiroid karsinomunun (PTC) onkogenezi ve nüksü ile ilişkili olduğunu bildirmiştir4,5; Potansiyel mekanizmalar hala tartışmalıdır. Otoimmün tiroidit de kadın infertilitesinde önemli bir faktördür6. Bu nedenle, HT'nin patogenezinin açık olması gerekir, bunun için kararlı ve basit bir hayvan modeli gereklidir.

HT'nin etiyolojisini incelemek için, bu çalışmalarda deneysel otoimmün tiroidit (EAT) ve spontan otoimmün tiroidit (SAT) olmak üzere iki ana tip murin modeli kullanılmıştır 7,8. Duyarlı fareler, EAT murin modelini oluşturmak için spesifik tiroid antijenleri (ham tiroid, saflaştırılmış tiroglobulin [TG], tiroid peroksidaz [TPO], rekombinant TPO ektodomaini ve seçilmiş TPO peptitleri dahil) ile aşılandı. Ek olarak, lipopolisakkarit (LPS), tam Freund adjuvanı (CFA) ve diğer olağandışı adjuvanlar da dahil olmak üzere adjuvanlar, bağışıklama sırasındabağışıklık toleransını parçalamak için kullanılır 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

SAT modeli, NOD'ye dayanan otoimmün tiroiditin spontan gelişimini incelemek için önemli bir modeldir. H-2h4 fareler. BAŞINI SALLA. H-2h4 fare, NOD ve B10 haçından elde edilen yeni bir türdür. A (4R) fareleri, ardından otoimmün tiroidit duyarlılık geniIAk 18,19 ile NOD'ye çoklu backcross'lar izledi. NOD. H-2h4 fareleri diyabet geliştirmez, ancak otoimmün tiroidit ve Sjögren sendromu (SS) insidansı yüksektir19. Çalışmalar, hücre içi adezyon molekülü-1'in (ICAM-1) NOD'un tiroid dokusunda yüksek oranda eksprese edildiğini bulmuştur. 3-4 haftalıkken H-2h4 fareleri. Ayrıca, iyot alımındaki artışla birlikte, tiroglobulin molekülünün immünojenisitesi artar, bu da monosit infiltrasyonu21 sürecinde önemli bir rol oynayan ICAM-1'in ekspresyonunu daha da düzenler. Bu model, iyot dozu ile hastalık şiddeti arasındaki ilişkiyi doğrularken otoimmün süreci simüle eder. Kurulan yöntem, başarı olasılığı yüksek olan kararlıdır. SAT modeli otoimmün tiroiditi indüklemek için uzun yıllardır uygulanmaktadır ve otoimmün tiroiditin patogenezini araştırmak için etkili bir yöntem olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, EAT modelinin mevcut inşaat yöntemi daha karmaşık ve pahalıdır; Farklı laboratuvarlar farklı bağışıklama yöntemleri ve enjeksiyon bölgeleri kullanır. Ayrıca, farklı genetik geçmişlere sahip fareler, güçlü mekanizmayı ortaya çıkarmak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyan farklı indüksiyon oranlarına sahiptir.

Bununla birlikte, SAT modelinde tiroidit gelişimi sodyum iyodür, cinsel dimorfizm ve yetiştirme koşulları ile ilişkilidir. SAT modelinde uygun otoimmün tiroidit prosedürünü ortaya koymak için, bu makalede farklı koşullarda otoimmün tiroidit indüksiyon yöntemi tanımlanmıştır. Ek olarak, bu hastalığın farklı aşamalarında otoimmün tiroiditin patogenezinin ve immünolojik ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Aşağıda açıklanan protokol, Sichuan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından oluşturulan bakım ve kullanım kılavuzları tarafından onaylanmıştır.

1. Hazırlık

  1. Tüm fareleri 12 saatlik açık-karanlık döngüleri altında belirli patojensiz koşullarda barındırın (sırasıyla 07:00 ve 19:00'da başlar). Oda sıcaklığını 22 °C'de tutun. Yatak malzemelerini her hafta değiştirin. Yeterli miktarda standart kemirgen chow ve su sağlayın.
  2. NaI'nin stok çözeltisini suda hazırlarken, 2.5 g bileşiği tartın ve% 5'lik bir stok çözeltisi vermek için vorteks altında 50 mL steril, saf su içinde çözün. Bu stok çözeltisini 4 ° C'lik bir dondurucuda, ışıktan kaçınarak 8 haftaya kadar saklayın.
  3. Çalışan bir NaI çözeltisi hazırlamak için, 2.5 mL stok çözeltisi çekin ve NOD için günlük içme suyu olarak 250 mL normal suda çözün. H-2h4 fareler,% 0.05'lik bir çalışma çözeltisi vermek için.

2. Tiroidit indüksiyonu

  1. SAT modeli
    1. NOD'u hazırlayın. H-2h4 fareleri (8 haftalık) çalışma için, tek bir cinsiyetteki (cinsel dimorfizm yok) tüm fareleri bariyer kafeslerinde (kafes başına beş hayvan) adım 1.1'de açıklanan beslenme koşullarıyla barındırarak.
    2. NOD'de otoimmün tiroidit indüklemek. H-2h4 fareler, tüm fareleri 8 hafta boyunca% 0.05 NaI ile besleyin. NaI suyunu her hafta değiştirin ve farelerin durumunu görünüm, ağırlık, iştah, zihinsel durum ve hareketlilik dahil olmak üzere haftalık olarak değerlendirin.
  2. EAT modeli
    1. BALB / c farelerini (8 haftalık) tek bir cinsiyetteki (cinsel dimorfizm olmayan) tüm fareleri bariyer kafeslerinde (kafes başına beş hayvan) adım 1.1'de açıklanan beslenme koşullarıyla barındırarak çalışmaya hazırlayın. Tüm fareleri 8 hafta boyunca% 0.05 NaI ile besleyin.
    2. İlk 2 hafta boyunca, haftada bir kez deri altından CFA ve Tg (200 μL) karışımı enjekte edin.
    3. Üçüncü haftadan itibaren, deri altından 3 hafta boyunca haftada bir kez IFA ve Tg (200 μL) karışımı enjekte edin.

3. Ölçümler

  1. Periferik kan örneklerinin hazırlanması
    1. İndüksiyondan sonra, intraperitoneal enjeksiyon ile 0.01 mL/g anestezik hacimli farelerin uyuşturulması. Midazolam (sedasyon için 40 μg / 100 μL), medetomidin (sedasyon için 7.5 μg / 100 μL) ve butorphanol tartarat (analjezi için 50 μg / 100 μL) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde karıştırılarak anesteziyi hazırlayın.
      NOT: Anestezi karışımındaki her bir bileşenin spesifik konsantrasyonları şunlardır: midazolam 13.33μg / 100μL, medetomidin 2.5μg / 100μL ve butorphanol 16.7μg / 100μL. Farelerde kullanılan spesifik dozajlar için dozlar şunlardır: midazolam 4μg / g, medetomidin 0.75μg / g ve butorphanol 1.67μg / g. Anestezi derinliği, farenin uzuv kasları gevşediğinde, bıyıkların dokunma tepkisi olmadığında ve pedal refleksi kaybı olduğunda doğrulandı.
    2. Fareler uyuşturulduktan sonra, fareyi bir elinizle sabitleyerek ve göz küresini çıkıntı yapmak için göz derisine bastırarak periferik kan örneklerini hazırlayın. Daha sonra, kılcal tüpü gözün iç köşesine yerleştirin ve burun deliğinin düzlemine 30-45 derecelik bir açıyla nüfuz edin. Kılcal boruyu hafifçe döndürürken basınç uygulayın. Kan, kılcal etki yoluyla tüpe akacaktır.
    3. Kanı 2 saat boyunca 4 ° C'lik bir buzdolabına koyun ve daha sonra numuneyi almak için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüj yapın. Daha fazla analiz için, numunenin geri kalanını -80 ° C'de saklayın.
  2. Tiroid doku örneklerinin hazırlanması
    1. Hayvanı kurumsal politikalara göre insancıl bir şekilde ötenazi yapın. Daha sonra, kalbi açığa çıkarmak için göğüs duvarını diseke edin, sağ atriyumu kesin ve doku beyazlaşana kadar 20 mL'lik bir şırıngaya tutturulmuş intravenöz bir infüzyon iğnesi ile sol ventriküle salin infüze edin.
    2. Fareyi diseksiyon masasına pimlerle sabitleyin. Boynu% 75 etanol ile sterilize edin. Boyun dokusunu tamamen açığa çıkarmak için farenin derisini boynun medyan çizgisi boyunca sternumun üstünden alt çeneye kadar doku makası ile kesin.
    3. Pembe bez çiftini, submandibuler bezleri, altında ön trakea kası olan gözlemleyin. Trakea ve tiroid kıkırdağını açığa çıkarmak için bezleri ve kasları oftalmik makas ve forseps ile ayırın.
    4. Kıkırdak ve trakeayı bir araya getirmek için kavisli forseps kullanarak kıkırdak altındaki dokuyu ayırın. Sırasıyla kıkırdak ve trakeanın distal ve proksimal uçlarını kesin ve tiroid bezini trakea ile birlikte çıkarın.
    5. Bezleri 12-24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içine batırın. Daha sonra, dokuyu% 70 etanol'e aktarın.
    6. Tiroid biyopsi materyalinin bireysel loblarını işleme kasetlerine yerleştirin ve aşağıdaki seri alkol gradyanı ile dehidratlayın:% 70,% 80,% 90,% 95,% 100,% 100,% 100, her biri 40 dakika boyunca etanol; 2 saat boyunca 1/2 ksilen + 1/2 mutlak etanol; 1.5 saat boyunca% 100 ksilen; 1.5 saat boyunca% 100 ksilen; 2 saat boyunca 1/2 ksilen + 1/2 parafin; 40 dakika boyunca 40 ° C'de fırın; 30 dakika boyunca parafin I; ve 30 dakika boyunca parafin II. Onları parafin balmumu bloklarına gömün.
    7. Boyamadan önce, 5 μm kalınlığındaki tiroid dokusu bölümlerini ksilen içinde (aşağıdaki gibi) balmumundan arındırın ve aşağıdaki azalan etanol konsantrasyonları yoluyla rehidratlayın: 10 dakika boyunca ksilen I; 10 dakika boyunca ksilen II; 10 dakika boyunca ksilen III; 5 dakika boyunca mutlak etanol I; 5 dakika boyunca mutlak etanol II; 5 dakika boyunca% 90 alkol; 5 dakika boyunca% 80 alkol; 5 dakika boyunca% 70 alkol; ve 5 dakika boyunca% 50 alkol.
    8. Dokuları hematoksilin ve eozin (H &E) ile lekeleyin. 15 dakika boyunca hematoksilin ile lekeleyin, 15 dakika boyunca musluk suyuyla durulayın, 10 s boyunca% 1 hidroklorik asit etanol ekleyin, akan suyla durulayın ve daha sonra% 50,% 70 ve% 80 etanol ile, her biri 3 dakika boyunca. 2 dakika boyunca% 0.5 eozin etanol boyama yapın ve akan su ile durulayın. Parafin bölümlerini 2 dakika boyunca %75 etanol, 2 dakika boyunca %85 etanol, 5 dakika boyunca mutlak etanol ve 5 dakika boyunca ksilen içine yerleştirin. Dilimleri nötr sakız ve cam slaytlarla sabitleyin.
    9. Lenfositik tiroiditin derecesini değerlendirmek için, tiroid bölümlerini aşağıdaki gibi puanlayın: 0: tiroid dokusunda çok az lenfosit infiltrasyonu veya hiç lenfosit infiltrasyonu; 1+: bezin 1 / 8'inden fazlası bir veya birkaç odakta sızar; 2+: bezin 1 / 4'ünden fazlası lenfositlerle infiltre edilmez; 3+: Bezin 1/4-1/2'si lenfositlerle infiltre edilir; 4+: Bezin 1/2'sinden fazlası yok olur.
      NOT: Trakeadan çıkarılamayacak kadar küçük olan fare tiroidinin tüm yapısını korumak için tiroid kıkırdağının çıkarılması önerilir.
  3. TPOAb Ölçümü
    NOT: Laboratuvarımızda fare TPO'sunu stabil olarak eksprese eden Çin hamster yumurtalık (CHO) hücreleri kurulmuştur. Fare TPO cDNA'sı XbaI ve NheI tarafından eksize edildi. Daha sonra, cDNA pcDNA5 / FRT'ye aktarıldı. Plazmid başarıyla inşa edildikten sonra, CHO hücrelerine transfekte edildi ve higromisin B (100 g / mL) ile seçildi.
    1. MTPO-CHO hücrelerinin yapımından sonra, fare serumlarını adım 3.1.3'ten (1:50) seyreltin ve mTPO-CHO hücreleri ile 2 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, propidyum iyodür (1 g / mL) ile hücre boyamasını hariç tutun ve numuneyi floresein izotiyosiyanat konjuge edilmiş, afinite saflaştırılmış keçi anti-fare IgG kullanarak akış sitometrisi ile analiz edin. FSC-A ve SSC-A kanallarına göre hayatta kalan tek hücreli popülasyonları tarayın ve tek hücreli popülasyonlardan FITC ve PI etiketli hücreleri seçin21.
    2. Negatif kontrol olarak IgG'ye bağlı bağışıklanmamış BALB / c veya C57BL / 6 farelerin serumunu dahil edin. İnsan TPO22'ye karşı fare monoklonal antikorlarını, fare TPO23'ü tanıyan pozitif kontroller olarak dahil edin. TPO bağlama verilerini geometrik araçlar olarak ifade edin.
  4. TgAb Ölçümü
    NOT: Üreticinin talimatlarını izleyerek tiroglobulini tespit etmek için bir ELISA kiti kullanın.
    1. Mikrosantrifüj tüpündeki standart numuneleri talimatlara göre seyreltin. Kiti buzdolabından çıkarın ve 30 dakika oda sıcaklığında saklayın.
    2. Standart kuyuları, boş kuyuları ve test kuyularını ayarlayın. Boş kuyular sadece tampon alırken, standart kuyucuklar standart çözümler alır. Test kuyucuklarına 10 μL numune ekleyin. Numuneleri eklerken, kuyucukların duvarlarına dokunmamaya çalışın ve numuneleri kuyucukların dibine taşımak için plakayı hafifçe sallayın.
    3. Tg, CFA ve IFA24 ile aşılanmış BALB / c farelerinden serum pozitif kontrol ve 8 haftalık NOD'den serum dahil edin. H-2h4 fareleri normal su üzerinde negatif kontrol olarak.
    4. Numuneleri 37 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin. Yıkama tamponunu damıtılmış suyla 1:30 oranında seyreltin. Ardından, sızdırmazlık filmini çıkarın, enzim plakasının içindeki sıvıyı çalkalayın ve emici kağıda kurutun ve 30 s boyunca 350 μL yıkama tamponu ekleyin. Bu prosedürü beş kez tekrarlayın ve ardından kuyucukları kurutun.
    5. Boş kuyucuklar hariç her bir kuyucuğa 50 μL enzim etiketleme reaktifi ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° 'lik bir su banyosunda inkübe edin. Sızdırmazlık filmini çıkarın, enzim plakasının içindeki sıvıyı çalkalayın ve emici kağıda kurutun.
    6. Her bir kuyucuğa 50 μL geliştirici A ekleyin ve ardından 50 μL geliştirici B ekleyin ve 5 dakika boyunca karıştırmak için kuyucukları hafifçe sallayın. Reaksiyonu durdurmak için her bir kuyucuğa 15 dakika boyunca 50 μL sonlandırma çözeltisi ekleyin. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun absorbansını (OD) 450 nm dalga boyunda ölçün. TgAb verilerini 490 nm'de optik yoğunluk (OD) olarak sunun.
  5. T4 ve tiroid stimüle edici hormon (TSH) ölçümü
    NOT: Üreticinin talimatlarını izleyerek ELISA tarafından T4 ve TSH seviyelerini (10 μL alikot cinsinden) ölçün.
    1. Enzim konjugatını tahlil seyreltici ile 1:11'e seyreltin; ölçülecek numuneleri (1:100) 0,01 M PBS kullanarak seyreltin.
    2. İlgili kuyucuklara 10 μL standart ve numune ekleyin, her bir kuyucuğa 100 μL enzim konjugatı ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
    3. Sıvıyı kuyucuklara atın ve üç kez yıkama tamponu ile temizleyin.
    4. 100 μL 3,3',5,5'-tetrametil benzidin (TMB) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
    5. 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve 15-20 s boyunca hafifçe karıştırın.
    6. 450 nm dalga boyunda bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı (OD) belirleyin ve numune konsantrasyonunu hesaplayın.
    7. T-testi veya rank sum testi yapmak için istatistiksel yazılım kullanın ve sonuçları çizin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Histolojik değişiklikler kadın ve erkeklerde, iyot alımının süresinde ve NaI çözeltisinde çarpıcı şekilde farklıydı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, NOD'nin ~% 10'u. H-2h4 fareleri, 24 haftalıkken iyot indüksiyonu olmadan bile SAT geliştirdi ve tüm fareler sonunda tiroidit geliştirdi. Düzenli su verildiğinde, erkekler ve kadınlar arasındaki histolojik değişikliklerde anlamlı bir fark yoktu. İçme suyuna NaI ilavesi tiroidit gelişimini hızlandırdı. % 0.005,% 0.05 ve% 0.5'lik çözeltilerde, SAT, NaI suyunu verdikten sonra sırasıyla 16, 8 ve 8. haftalarda maksimum şiddete ulaştı. Tiroidit indüklendikten sonra, lenfosit infiltrasyonu farenin hayatı boyunca devam etti. İndüksiyon sırasında, dişi farelerin aynı koşulda erkeklerden daha şiddetli tiroidit geliştirme eğilimi olduğu görülmüştür, ancak lenfositik infiltrasyonun şiddetinde, örnek sayısı ile sınırlı olabilecek anlamlı bir fark yoktu.

Ek iyot olmadan düzenli su verildiğinde, TgAb seviyesi 16 haftalıkken önemli ölçüde artmadı ve erkekler ve kadınlar arasında anlamlı bir fark bulunmadı. NOD'de TgAb seviyeleri. H-2h4 fareleri, cinsiyetler arasında fark olmaksızın 24 haftada yükselmeye başladı ve TgAb seviyeleri 72 haftaya kadar yükselmeye devam etti (Şekil 2A). İçme suyuna NaI eklenmesiyle, TgAb seviyeleri sırasıyla% 0.005,% 0.05 ve% 0.5 NaI'lik çözeltilerle 16, 8 ve 8. haftalarda yükselmeye başladı. Bununla birlikte, TgAb seviyeleri, çözeltilerin hiçbirinde erkekler ve dişiler arasında fark göstermedi (Şekil 2B-D). NaI suyunun verilip verilmediğine bakılmaksızın, TgAb seviyeleri 72 haftalıkken (veya NaI suyunun ilk verilmesinden 64 hafta sonra) en yüksek seviyelerine ulaştı.

TPOAb düzeylerinin saptanabilirliğinde TgAb'ye kıyasla daha uzun bir gecikme vardı. Bu antikorlar NOD'de nadiren tespit edildi. 24 haftalıkken düzenli su ile H-2h4 fareleri. Düzenli su ile beslendiğinde, dişiler 72 haftada erkeklerden çok daha yüksek TPOAb seviyeleri sergiledi (Şekil 2E). Aynı interseks farklılığı eğilimi NOD'de de ortaya çıkıyordu. H-2h4 farelere 16, 8 ve 8 hafta boyunca sırasıyla %0.005, %0.05 ve %0.5 NaI suyu verildiğinde (Şekil 2F-H) Bununla birlikte, dikkat çekici bir şekilde, indüksiyon sırasında NaI konsantrasyonu% 0.05'in üzerinde olduğunda, TPOAb seviyeleri, NaI suyunun ilk verilmesinden 64 hafta sonra en yüksek seviyelerine ulaştı ve erkekler ile dişiler arasında bir fark yoktu (Şekil 2G, H).

Ek olarak, erkek NOD'de serum TSH düzeyleri. H-2h4 fareleri, NAI suyunun verilip verilmediğine bakılmaksızın, farklı beslenme aşamalarındaki dişilerden önemli ölçüde daha yüksekti. Düzenli su verildiğinde, NOD TSH seviyeleri. H-2h4 fareleri 24 haftalıkken artmaya başladı ve iyot diyet gruplarında, iyot ayrı ayrı verildikten sonra, 16, 8 ve 8 haftalarda sırasıyla% 0.005,% 0.05 ve% 0.5 konsantrasyonlarında benzer bir eğilim gözlendi. TSH seviyeleri indüksiyon dönemi boyunca yükselmeye devam etti ve 64 haftada zirveye ulaştı. Ayrıca, NOD'un geri kalanında erkekler ve kadınlar arasında TSH düzeylerinde anlamlı bir fark vardı. H-2h4 fareler (Şekil 3A-D). NOD. H-2h4 fareleri, iyot alımından sonra guatr veya hipotiroidizm yaşamadı. İyot ajanlarının uygulanıp uygulanmadığına bakılmaksızın, NOD'de T4 düzeylerinde cinsiyete bağlı bir fark yoktu. H-2h4 fareler. Bununla birlikte, indüksiyon süresi arttıkça, T4 seviyeleri, iyot suyu gruplarında her iki cinsiyette de azalma eğilimindeydi (anlamlı bir fark yok) (Şekil 3E-H).

NOD soyunda patolojik süreçte cinsel dimorfizm ve TPOAb düzeyleri bulundu. H-2h4 fareler, ancak TgAb değil. Diğer çalışmalara benzer şekilde25,26, TPOAb düzeyleri 2-4 ay boyunca diyet iyodür aldıktan sonra model farelerde anlamlı olarak artmıştır ve cinsiyete bağlı bir fark vardı. Ek olarak, TSH düzeyleri erkeklerde kadın NOD'den daha yüksekti. Diğer fare suşlarına benzeyen diyet iyodür takviyesi olan veya olmayan H-2h4 fareleri. Bu fark, TPOAb veya TgAb seviyelerinden etkilenmeyen hayvanların yaşamları boyunca kalmıştır.% 0.05 NaI'ye maruz kaldığında, farelerin çoğu, 8 hafta içinde% 0.5 NaI ile benzer bir etkiye sahip olan tiroidit geliştirdi. % 0.005 NaI, NOD üzerinde benzer bir etkiye sahipti. Düzenli su ile beslenen H-2h4 fareleri,% 0.05 NaI konsantrasyonu (8 haftalık indüksiyondan sonra) otoimmün tiroiditi indüklemek için tercih edilen durum olabilir. NOD'de T4 seviyeleri. H-2h4 farelerinin cinsiyete bağlı farklılıkları yoktu ve diğer çalışmalarla tutarlı olan iyot ajanlarından etkilenmediler27,28. Bu, hastalığın nispeten kısa başlangıç süresinden ve farelerin telafi edici tiroid fonksiyonundan kaynaklanabilir ve bu da farelerde subklinik hipotiroidizme benzer bir fenomene neden olabilir. Farelerin TSH ekseninin sonunda dekompanse olacağını ve zamanla farklılıklar üreteceğini tahmin ediyoruz.

Figure 1
Şekil 1: NOD'de tiroid bezlerinin patolojik değişiklikleri ve lenfosit infiltrasyon inflamatuar skorları. İyot diyeti olan / olmayan H-2h4 fareleri. (A,C,E,G) İyot diyeti altında tiroid bezinin HE boyama ile% 0,% 0.005,% 0.05 ve% 0.5'lik patolojik değişiklikleri; 200x büyütme, N = 10/grup. (B,D,F,G) Tiroid inflamasyonu lenfosit infiltrasyon alanına göre belirlendi; lenfosit infiltrasyon derecesinin derecelendirilmesi: 0: neredeyse hiç lenfosit infiltrasyonu; 1+: bezin sekizde birinden fazlası istila edilir; 2+: bezin dörtte biri istila edilir; 3+: bezin dörtte biri ila yarısı istila edilir; 4+: Bezin yarısından fazlası yok olur. N = 10/grup. Önemli farklılıklar: *p < 0,05; **p < 0.01. Kısaltmalar: F = kadın; M = erkek; NW = N hafta. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: NOD'deki otoantikorlar. Düzenli ve iyodür içeren su üzerinde H-2h4 fareler. (A-D) NOD'de Tg'ye karşı otoantikorlar. Düzenli su üzerinde H-2h4 fareleri (ayrı ayrı 8, 16, 24 ve 72 haftalıkken) ve iyodür suyu-% 0.005,% 0.05 ve% 0.5 (iyot suyu başladıktan 0, 8, 16 ve 64 haftalarda). (E-H) NOD'de TPO'ya karşı otoantikorlar. Düzenli su üzerinde H-2h4 fareleri (ayrı ayrı 8, 16, 24 ve 72 haftalıkken) ve iyodür suyu-% 0.005,% 0.05 ve% 0.5 (iyot suyu başladıktan 0, 8, 16 ve 64 haftalarda). TgAb değerleri ELISA optik yoğunluğu (OD) 490 nm (ortalama SEM'in ortalama ± standart hatası) ve TPOAb değerleri akış sitometrisinde geometrik ortalama olarak rapor edilir. N = 8/grup. Önemli farklılıklar: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0.001. Kısaltmalar: Tg = tiroglobulin; TgAb = Tg'ye karşı otoantikorlar; TPO = tiroid peroksidaz; TPOAb = TPO'ya karşı otoantikorlar; F = kadın; M = erkek; NW = N hafta. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: NOD'deki TSH ve T4 seviyeleri. Düzenli ve iyodür içeren su üzerinde H-2h4 fareler. (A-D) Düzenli sudaki TSH ve (E-H) T4 seviyeleri (ayrı ayrı 8, 16, 24 ve 72 haftalıkken) ve iyodür suyu-% 0.005,% 0.05 ve% 0.5 (iyot suyu başladıktan 0, 8, 16 ve 64 haftalarda). TSH değerleri radyoimmünoassay (mU/L, ortalama SEM'in ortalama ± standart hatası) ile ölçüldü. N = 8/grup. Önemli farklılıklar: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; *p < 0.0001. Kısaltmalar: TSH = tiroid uyarıcı hormon; F = kadın; M = erkek; NW = N hafta. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HT, tiroid bezine sızan lenfositlerin neden olduğu, tiroide özgü antikorlar üretirken tiroid fonksiyonunu daha da bozan otoimmün sistem bozukluğuna bağlı olarak ortaya çıkar. HT hastalarında serum TSH, TgAb ve TPOAb düzeyleri anlamlı olarak yüksektir27. Şu anda, otoimmün tiroiditin etiyolojisini incelemek için iki ana murin modeli yaygın olarak kullanılmaktadır: EAT ve SAT29. EAT fareleri çoğunlukla in vivo anormal bir bağışıklık ortamı oluşturmak için proteinler ve adjuvanlar kullanılarak bağışıklanır. Bu yaklaşım uzun yıllardır kullanılmaktadır ve30,31 etkili olmaya devam etmektedir. Ek olarak, tiroiditi indüklemek için yeni yaklaşımlar arasında Tg32 ile darbeli dendrik hücrelerin (DC'ler) enjekte edilmesi, Tg veya TPO'nun adenoviral vektörler veya plazmidler31 tarafından in vivo ekspresyonu, allojenik farelerin tiroid bezinin nakledilmesi ve LPS'nin enjekte edilmesi yer almaktadır. Bununla birlikte, tiroidit modelinin başarılı bir şekilde inşası genellikle deneysel murin modelinin genetik arka planı, sinjenik antijenler ve hücre biyolojisi teknolojileri ile daha sınırlıdır. Ayrıca, spesifik adjuvanlar daha karmaşık bir bağışıklık ortamına neden olabilir ve bu da otoimmün tiroiditin immünolojik sürecini araştırmayı zorlaştırır. Bu nedenle, NOD'un SAT'ı olduğuna inanıyoruz. H-2h4 fareleri, Hashimoto tiroiditinin patogenezini EAT modeline kıyasla daha iyi gösterebilir. Spesifik olarak, SAT33 için güçlü adjuvanlar ve tiroglobulin ile bağışıklama gerekli değildir. SAT'ın ilerlemesini hızlandırmak için, NOD'un içme suyuna iyot eklenir. H-2h4 fareler. Ortaya çıkan tiroidit, insanlarda tiroiditin meydana geldiği mekanizmayı paylaşmasa da, iyot gerçekten de tiroiditin önemli bir etkileyen faktörüdür. Ayrıca, bu modelde, iyot ajanları NOD'de tiroiditi hızla indükleyebilir. H-2h4 fareler ve NOD. İyot almayan H-2h4 fareleri sonunda tiroidit de gelişebilir. Çoğu laboratuvardaki deney protokolü farklı olduğundan, NOD'ye daha kapsamlı bir değerlendirme yaptık. Tiroidit indüksiyonu sırasında H-2h4 fareleri.

Model yapımı sürecinde, bazı noktalara dikkat edilmesi gerekir. Düzenli olarak içme suyu eklemek ve farelerin genel durumunu değerlendirmek, kazara fare ölümlerini önler. Her fareye yeterli NaI beslemesi sağlamak için indüksiyon sırasında kafes başına beşten fazla fare tutulmaması önerilir. Bununla birlikte, farelerin sayısı, belirli bir kurumun hayvanlarla ilgili kural ve düzenlemelerini takiben de değişebilir. Laboratuvarımızda cinsel dimorfizm bulunduğundan, deney için tek cinsiyetli fareler önerilmektedir (tiroide özgü antikorların tespiti için özel gereksinimleri olan deneyler için dişi önerilir). 8 haftalık farelerin seçilmesi önerilir, çünkü farelerin% 10'u 16 haftalıkken spontan tiroidit geliştirir ve tüm fareler sonunda NaI suyu olmadan tiroidit geliştirir. Tiroid lezyonları farelerin yaşamları boyunca devam eder ve yeni nesil doğduğunda tiroidit geliştirir. Bu nedenle, farelerin korunması için 8 haftalık farelerin kullanılması önerilir. NOD kullanırken TPOAb'nin bir algılama göstergesi olarak TgAb'den daha uygun olduğuna dikkat etmek önemlidir. Tiroiditi taklit etmek için H-2h4 fareler. Bununla birlikte, TPOAb seviyelerini ölçerken, indüksiyon süresinin TgAb'den daha gecikmesi gerekir.

Sonuç olarak, bu yazıda NOD ile SAT modelinin kurulması anlatılmaktadır. H-2h4 fareleri ve farklı faktörlerin bu model üzerindeki etkisinin araştırılması. Otoimmün tiroid hastalığının patogenezini ve mekanizmasını mükemmel bir şekilde simüle etmese de, NOD. H-2h4 fare, otoimmün tiroid hastalığı alanında büyük potansiyele sahip kararlı bir hayvan modelidir. Bunun inşa edilmesi kolay bir hayvan modeli olduğu ve yüksek oranda tekrarlanabilir olduğu göz önüne alındığında, bu yöntemin SAT murin modellerinin farklı araştırma kurumlarında uygulamalarını geliştirmeye yardımcı olacağı umulmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar birbiriyle çelişen çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

İnsan TPO'suna karşı fare monoklonal antikorları (pozitif kontrol olarak kullanılır) Dr. P. Carayon ve Dr. J. Ruf (Marsilya, Fransa) tarafından sağlanmıştır. Yazarlar bu çalışmadaki tüm katılımcılara ve araştırma ekibimizin üyelerine teşekkür eder. Bu çalışma kısmen Batı Çin Hastanesi Doktora Sonrası Askıya Alma Fonu, Sichuan Üniversitesi, Çin (2020HXBH057) ve Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (Proje No. 2021YFS0166) tarafından desteklenmiştir

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ralli, M., et al. Hashimoto's thyroiditis: An update on pathogenic mechanisms, diagnostic protocols, therapeutic strategies, and potential malignant transformation. Autoimmunity Reviews. 19 (10), 102649 (2020).
  2. Zhang, Q. Y., et al. Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto's thyroiditis. Nature Communications. 13 (1), 775 (2022).
  3. Ruggeri, R. M., et al. Autoimmune comorbidities in Hashimoto's thyroiditis: different patterns of association in adulthood and childhood/adolescence. European Journal of Endocrinology. 176 (2), 133-141 (2017).
  4. Resende de Paiva, C., Grønhøj, C., Feldt-Rasmussen, U., von Buchwald, C. Association between Hashimoto's thyroiditis and thyroid cancer in 64,628 patients. Frontiers in Oncology. 7, 53 (2017).
  5. Ehlers, M., Schott, M. Hashimoto's thyroiditis and papillary thyroid cancer: are they immunologically linked. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (12), 656-664 (2014).
  6. Medenica, S., et al. The role of cell and gene therapies in the treatment of infertility in patients with thyroid autoimmunity. International Journal of Endocrinology. 2022, 4842316 (2022).
  7. Rose, N. R. The genetics of autoimmune thyroiditis: the first decade. Journal of Autoimmunity. 37 (2), 88-94 (2011).
  8. Kolypetri, P., King, J., Larijani, M., Carayanniotis, G. Genes and environment as predisposing factors in autoimmunity: acceleration of spontaneous thyroiditis by dietary iodide in NOD.H2(h4) mice. International Reviews of Immunology. 34 (6), 542-556 (2015).
  9. Terplan, K. L., Witebsky, E., Rose, N. R., Paine, J. R., Egan, R. W. Experimental thyroiditis in rabbits, guinea pigs and dogs, following immunization with thyroid extracts of their own and of heterologous species. The American Journal of Pathology. 36 (2), 213-239 (1960).
  10. Alexopoulos, H., Dalakas, M. C. The immunobiology of autoimmune encephalitides. Journal of Autoimmunity. 104, 102339 (2019).
  11. Noviello, C. M., Kreye, J., Teng, J., Prüss, H., Hibbs, R. E. Structural mechanisms of GABA receptor autoimmune encephalitis. Cell. 185 (14), 2469-2477 (2022).
  12. Pudifin, D. J., Duursma, J., Brain, P. Experimental autoimmune thyroiditis in the vervet monkey. Clinical and Experimental Immunology. 29 (2), 256-260 (1977).
  13. Esquivel, P. S., Rose, N. R., Kong, Y. C. Induction of autoimmunity in good and poor responder mice with mouse thyroglobulin and lipopolysaccharide. The Journal of Experimental Medicine. 145 (5), 1250-1263 (1977).
  14. Kong, Y. C., et al. HLA-DRB1 polymorphism determines susceptibility to autoimmune thyroiditis in transgenic mice: definitive association with HLA-DRB1*0301 (DR3) gene. The Journal of Experimental Medicine. 184 (3), 1167-1172 (1996).
  15. Kotani, T., Umeki, K., Hirai, K., Ohtakia, S. Experimental murine thyroiditis induced by porcine thyroid peroxidase and its transfer by the antigen-specific T cell line. Clinical and Experimental Immunology. 80 (1), 11-18 (1990).
  16. Ng, H. P., Banga, J. P., Kung, A. W. C. Development of a murine model of autoimmune thyroiditis induced with homologous mouse thyroid peroxidase. Endocrinology. 145 (2), 809-816 (2004).
  17. Ng, H. P., Kung, A. W. C. Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T cell epitope of thyroid peroxidase. Endocrinology. 147 (6), 3085-3092 (2006).
  18. Ellis, J. S., Braley-Mullen, H. Mechanisms by which B cells and regulatory T Cells influence development of murine organ-specific autoimmune diseases. Journal of Clinical Medicine. 6 (2), 13 (2017).
  19. Fang, Y., Yu, S., Braley-Mullen, H. Contrasting roles of IFN-gamma in murine models of autoimmune thyroid diseases. Thyroid. 17 (10), 989-994 (2007).
  20. Fang, Y., Zhao, L., Yan, F. Chemokines as novel therapeutic targets in autoimmune thyroiditis. Recent Patents on DNA & Gene Sequences. 4 (1), 52-57 (2010).
  21. Chen, C. R., et al. Antibodies to thyroid peroxidase arise spontaneously with age in NOD.H-2h4 mice and appear after thyroglobulin antibodies. Endocrinology. 151 (9), 4583-4593 (2010).
  22. Ruf, J., et al. Relationship between immunological structure and biochemical properties of human thyroid peroxidase. Endocrinology. 125 (3), 1211-1218 (1989).
  23. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., Chong, G., Rapoport, B. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword'. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  24. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., et al. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword’[J]. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  25. Hutchings, P. R., et al. Both CD4(+) T cells and CD8(+) T cells are required for iodine accelerated thyroiditis in NOD mice. Cellular Immunology. 192 (2), 113-121 (1999).
  26. Xue, H., et al. Dynamic changes of CD4+CD25 + regulatory T cells in NOD.H-2h4 mice with iodine-induced autoimmune thyroiditis. Biological Trace Element Research. 143 (1), 292-301 (2011).
  27. Hou, X., et al. Effect of halofuginone on the pathogenesis of autoimmune thyroid disease in different mice models. Endocrine, Metabolic & Immune Disorders Drug Targets. 17 (2), 141-148 (2017).
  28. McLachlan, S. M., et al. Dissociation between iodide-induced thyroiditis and antibody-mediated hyperthyroidism in NOD.H-2h4 mice. Endocrinology. 146 (1), 294-300 (2005).
  29. Danailova, Y., et al. Nutritional management of thyroiditis of hashimoto. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 5144 (2022).
  30. Carayanniotis, G. Molecular parameters linking thyroglobulin iodination with autoimmune thyroiditis. Hormones. 10 (1), 27-35 (2011).
  31. Verginis, P., Li, H. S., Carayanniotis, G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+ T cells. Journal of Immunology. 174 (11), 7433-7439 (2005).
  32. Flynn, J. C., et al. Superiority of thyroid peroxidase DNA over protein immunization in replicating human thyroid autoimmunity in HLA-DRB1*0301 (DR3) transgenic mice. Clinical and Experimental Immunology. 137 (3), 503-512 (2004).
  33. Akeno, N., et al. IFN-α mediates the development of autoimmunity both by direct tissue toxicity and through immune cell recruitment mechanisms. Journal of Immunology. 186 (8), 4693-4706 (2011).

Tags

Geri Çekme Sayı 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Bir Fare Spontan Otoimmün Tiroidit Modelinin Oluşturulması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter