Summary
本协议描述了用于可视化整个小鼠甲状腺和监测间变性甲状腺癌生长的高频超声检查。
Abstract
间变性甲状腺癌（ATC）与预后不良和中位生存时间短有关，但没有有效的治疗方法可显著改善结局。模仿ATC进展的基因工程小鼠模型可能有助于研究人员研究这种疾病的治疗方法。杂交三种不同基因型的小鼠， TPO-cre / ERT2;布拉夫CA/wt;建立了Trp53 Δex2-10/Δex2-10转基因ATC模型。腹腔注射他莫昔芬，过表达BrafV600E ，Trp53缺失诱导ATC小鼠模型，约1个月内产生肿瘤。应用高分辨率超声研究肿瘤的发生和发展，通过测量肿瘤大小获得动态生长曲线。与磁共振成像（MRI）和计算机断层扫描相比，超声在观察ATC鼠模型方面具有无创，便携，实时和无辐射暴露的优势。高分辨率超声适用于动态和多重测量。然而，小鼠甲状腺的超声检查需要相关的解剖学知识和经验。本文提供了利用高分辨率超声扫描转基因ATC模型中肿瘤的详细程序。同时，列出了超声参数调整、超声扫描技巧、动物的麻醉和恢复以及其他过程中需要注意的要素。
Introduction
虽然间变性甲状腺癌（ATC）占甲状腺癌的不到2%，但它每年导致超过50%的甲状腺癌相关死亡。诊断为 ATC 后的中位生存时间仅为约 6 个月，并且没有可显著提高生存率的治疗方法1，2。
ATC的罕见性阻碍了研究疾病如何开始和积极进展的研究。最近出现了模仿该疾病的基因工程小鼠模型，这些模型提供了对该疾病及其对可能治疗方法的反应的见解3，4，5。此类研究需要精确的肿瘤成像进行测量和监测，这通常使用磁共振成像、计算机断层扫描或高分辨率超声检查进行6，7。超声检查已广泛用于小鼠器官。它比磁共振成像和计算机断层扫描具有优势，因为它可以实时进行并且不会使受试者暴露于辐射中，并且必要的设备足够小，可以携带8，9。然而，使用超声连续监测ATC生长的研究很少;因此，这项工作探讨了超声在这种情况下的效用。
在这里，提出了一种使用高分辨率超声检查在ATC小鼠模型中准确扫描，监测和测量肿瘤的方案。
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Protocol
本研究经四川大学动物护理与利用委员会批准进行。 TPO-cre/ERT2;布拉夫CA/wt;本研究使用Trp53 Δex2-10/ Δex2-10 转基因小鼠10 （见 材料表）。如有必要，可以针对不同的动物物种修改协议步骤。这里使用了12只小鼠，包括6只雌性和6只雄性，平均年龄为93天。
1. 实验准备
- 打开超声检查系统（参见 材料表）并创建一个新文件夹来捕获图像和收集数据。选择 40 MHz 线探头并单击浅表组织模式以激活浅 表组织 换能器。使用“B模式”进行甲状腺成像（图1A）。
注意：B模式是基本的超声成像模式。超声图像的出现依赖于声音与体内组织的物理相互作用。B模式图像以灰色图像11，12的形式产生。 - 将小鼠放在特定的笼子里，可以自由获取食物和水。将笼子放在补充加热装置上（见 材料表）以确保温度调节。
- 确保汽化器中有足够的异氟醚，罐中有足够的O2 。如果补给不足，请将坦克换成新坦克。
- 用无菌盐水清洁动物成像平台并打开加热按钮。在将动物放在平台上之前，验证温度是否为38-40°C（图1C）。
2. 用于成像的动物准备
- 打开异氟烷蒸发器。将鼠标从笼子转移到麻醉盒。
- 使用来自蒸发器的1%-2%异氟醚和以0.8L / min流动的氧气的混合物麻醉动物。
- 从胸部涂抹脱毛膏到颈部，等待 30 秒，然后完全擦去乳霜和皮毛。用温热的无菌盐水彻底冲洗该区域和周围的毛皮。
- 将麻醉的动物放在加热的平台上。用连接到麻醉出口的鼻锥覆盖鼻子（图2A，B）。
注意：鼠标必须在1-2分钟内完全镇静。如果动物仍然活跃，进行长时间的异氟醚诱导，直到动物不再表现出踏板撤退反射。确保动物呼吸稳定。 - 在成像过程中，通过加热平台监测鼠标的心率。
注意：超声成像系统配有心率监测器。 - 使用胶带将鼠标的四肢固定在加热的平台上，动物处于仰卧位。确保鼻锥以恒定的麻醉气流（1.5 L/min）稳定定位。
- 使用眼药膏保护眼睛。
3. 肿瘤影像学检查
- 调整成像系统以优化分辨率。设置以下参数：二维增益，25-30 dB;图像深度，10 毫米;重点区域数量，3个;和中心，3-6 毫米。
注意：对于本研究，使用了40 MHz探头。B模式被指定用于数据采集。 - 将超声波凝胶（见 材料表）大量涂抹在裸露的皮肤区域。
- 握住探头并将其与胸部的超声凝胶接触，然后从胸部向颈部扫描以定位甲状腺（图2C）。
注意：扫描时轻轻按压;对动物颈部的过度压力可能会导致喘息或呼吸暂停。该协议是基于手持扫描开发的，但也可以使用机器来引导探针进行机械化扫描，例如沿x轴和y轴移动的动物成像平台。 - 上下扫描以识别肿瘤的边界并评估其大小和形状。
注意：健康的甲状腺通常表现为气管前的低回声均匀结构。间变性肿瘤导致甲状腺看起来更大，这可以通过颈部扫描轻松识别（图3）。 - 根据解剖位置和超声回声从气管和绑带肌肉中识别 ATC 肿瘤。
注意：带状肌位于甲状腺和气管前面，以及甲状腺后面。带状肌的超声回波似乎高于ATC的超声回波，而气管13后面存在衰减。- 根据总肿瘤的印象，确认肿瘤从左到右直径最大的图像切片。按下 冻结 按钮，使用超声卡尺测量前后和从左到右的肿瘤直径。
注意：前后直径必须垂直于从左到右的肿瘤直径进行测量（图4）。通过将前后直径乘以从左到右的肿瘤直径14来计算ATC的肿瘤大小。由于左右两侧肿瘤的大小不一致，因此分别计算肿瘤的每一侧。通过添加双侧肿瘤获得肿瘤的总大小。记录尺寸以观察ATC的生长曲线。
- 根据总肿瘤的印象，确认肿瘤从左到右直径最大的图像切片。按下 冻结 按钮，使用超声卡尺测量前后和从左到右的肿瘤直径。
- 将记录另存为电影循环，这有助于查看所选图像。
4. 动物恢复
- 扫描后，擦拭超声波凝胶并从动物的四肢上取下约束胶带。
- 将鼠标放在补充加热装置上（步骤1.2）。将动物侧躺（图2D）。
- 小鼠恢复（~5分钟）后，将其转移回笼子。
- 使用软布和异丙醇或戊二醛湿巾清洁超声系统、探头和平台。
- 关闭成像系统。
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Representative Results
研究开始时的平均右侧ATC尺寸为4.867 mm 2，平均左侧ATC尺寸为5.189 mm2。在第四次测量中，平均右侧ATC大小已增长到11.844mm 2，而左叶的肿瘤大小已增长到9.280mm2。总 ATC 尺寸从 10.057 mm 2 增加到 15.843 mm2。在研究的后期，ATC迅速增长。就标记为“P92”的小鼠（表1）而言，第四次测量的肿瘤大小几乎是初始测量的四倍。四只小鼠的代表性测量值和生长曲线如图5所示。
高频超声检查是最常用于检查人类甲状腺的成像方式，该技术似乎也非常适合小鼠。它可以可视化整个小鼠甲状腺和甲状腺病变生长的细节。这种应用高频超声方法的协议可用于准确扫描，监测和测量ATC基因工程小鼠模型中的肿瘤。
图1：本研究中使用的设备 。 （A）高频超声检查系统。（二）实验室用品：（1）电热毯。（2）纸巾。（3）超声凝胶。（4）异氟烷汽化器。（5）脱毛膏。（6）棉签。（7）剪刀。（8）胶带。（9）医用手套。（10）麻醉诱导室。（11）麻醉系统。（C） 用于超声成像的机械化扫描系统。将完全镇静的鼠标放置在加热平台上（以绿色显示），并将扫描探针连接到精密可移动臂上。 请点击此处查看此图的大图。
图2：小鼠准备和超声扫描 。 （A）麻醉诱导。（B）将动物固定在加热平台上并进行麻醉维护。（C）徒手法超声扫描。（四）回收动物在电加热毯上。 请点击此处查看此图的大图。
图3：原位ATC肿瘤小鼠模型的超声图像。 绿线划定气管，红线划定ATC肿瘤，黄线划定带肌。 请点击此处查看此图的大图。
图4：肿瘤大小的计算。 通过将前后直径（橙色线）乘以从左到右的肿瘤直径（白线）来计算肿瘤大小。 请点击此处查看此图的大图。
图5：小鼠模型中原位ATC生长的纵向分析 。 （A）右甲状腺叶。（B）左甲状腺叶。（C）整个甲状腺。每条曲线对应于一只动物测量四次。 请点击此处查看此图的大图。
| 日期 | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| 标签 | 位置 | 肿瘤大小（mm2） | |||
| P71 | 右 | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| 左 | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| 总 | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| P85 | 右 | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| 左 | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| 总 | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| P89 | 右 | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| 左 | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| 总 | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| P92 | 右 | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| 左 | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| 总 | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
表1：肿瘤大小测量数据。 “P71”、“P85”、“P89”和“P92”代表小鼠的标签。右：右侧的肿瘤大小。左：左侧的肿瘤大小。总肿瘤：通过添加双侧肿瘤的总肿瘤大小。第一行包括肿瘤大小（mm 2：平方毫米）和测量日期。
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Discussion
该协议使用高分辨率超声检查来分析基因工程小鼠模型中的原位ATC肿瘤。转基因模型，基因型为 TPO-cre/ERT2; 布拉夫CA/wt;Trp53 Δex2-10/Δex2-10，由我们的实验室开发。动物过度表达BrafV600E 而缺乏Trp53;腹膜内注射他莫昔芬导致肿瘤生长约1个月10。肿瘤生长迅速，并在50天内达到可测量的大小。该方案用于监测肿瘤生长4个月。
超声检查已被证明在小鼠中可靠地成像占据与人体组织相似的身体位置的组织，包括肝脏、甲状腺和胎儿9。与人类一样，小鼠甲状腺位于甲状腺软骨和气管两侧13。所提出的协议允许分析甲状腺中的ATC肿瘤，从而能够研究肿瘤的发生，进展和对治疗的反应。小鼠模型中的甲状腺肿瘤变得相当大，占据了气管和带状肌肉周围的空间。他们在超声中显示出固体囊性特征，类似于滤泡结构。超声检查的无创性、持续时间短和便利性可能使其比磁共振成像或计算机断层扫描对许多研究小组更具吸引力8。由于不需要长时间的镇静或麻醉，超声检查的优势可以促进纵向研究。
在扫描过程中使用足够的超声凝胶对于消除可能影响成像的气穴和避免可能导致呼吸暂停的过度压迫至关重要。该方案在我们的实验室中由经验丰富的超声专家进行徒手扫描。徒手扫描优于机械化平台，因为它可以根据动物的状态灵活地调整超声探头的位置。使用机械化平台时，必须调整 x 和 y 坐标以防止对动物过度压缩。结果表明，肿瘤早期生长缓慢，但从第60天开始，肿瘤发展明显加快，最大肿瘤大小为38.188 mm2。导致死亡的主要原因是晚期窒息。在临床试验中，由于ATC肿瘤的罕见性，收集足够的样本来观察发展的过程和机制是困难的。在小鼠模型中可以更好地观察到ATC病变的方法。将来，这些样本可能会为临床治疗提供更多的信息。
超声成像的一个局限性是ATC肿瘤的回声性可能与周围组织的回声相似，从而掩盖了肿瘤边缘，特别是在一个静止图像中。但是，可以使用动态对比度来识别这些边缘，因此将动态图像保存在本研究中以供后续分析。为了确保最准确和可靠的结果，探头必须以各种方式定位，以便从不同角度观察整个甲状腺和肿瘤。在这项研究中，只有一名超声医师进行了所有测量，因此没有评估不同检查者之间的可靠性测量。
该协议可以促进使用高分辨率超声检查来定位和测量动物中的ATC肿瘤，从而为癌症发作，进展和治疗的详细研究铺平道路。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
这项研究没有获得公共、商业或非营利资助机构的具体资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
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