Summary
El presente protocolo describe la ecografía de alta frecuencia para visualizar toda la glándula tiroides del ratón y monitorear el crecimiento del carcinoma anaplásico de tiroides.
Abstract
El carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) se asocia con un pronóstico precario y una mediana de supervivencia corta, pero ningún tratamiento efectivo mejora significativamente los resultados. Los modelos murinos genéticamente modificados que imitan la progresión del ATC pueden ayudar a los investigadores a estudiar tratamientos para esta enfermedad. Cruzando tres genotipos diferentes de ratones, un TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Se desarrolló el modelo ATC transgénico Trp53 Δex2-10/Δex2-10. El modelo murino ATC fue inducido por una inyección intraperitoneal de tamoxifeno con sobreexpresión de BrafV600E y deleción de Trp53, y los tumores se generaron dentro de aproximadamente 1 mes. Se aplicó ultrasonido de alta resolución para investigar el inicio y la progresión del tumor, y la curva de crecimiento dinámico se obtuvo midiendo el tamaño del tumor. En comparación con la resonancia magnética (RM) y la tomografía computarizada, el ultrasonido tiene ventajas en la observación del modelo murino ATC, como ser no invasivo, portátil, en tiempo real y sin exposición a la radiación. El ultrasonido de alta resolución es adecuado para mediciones dinámicas y múltiples. Sin embargo, el examen ultrasonográfico de la tiroides en ratones requiere conocimientos anatómicos relevantes y experiencia. Este artículo proporciona un procedimiento detallado para utilizar ultrasonido de alta resolución para escanear tumores en el modelo ATC transgénico. Mientras tanto, se enumeran el ajuste de parámetros ultrasónicos, las habilidades de escaneo de ultrasonido, la anestesia y la recuperación de los animales, y otros elementos que necesitan atención durante el proceso.
Introduction
Aunque el carcinoma anaplásico de tiroides (ATC) representa menos del 2% de los cánceres de tiroides, causa más del 50% de las muertes relacionadas con el cáncer de tiroides anualmente. La mediana del tiempo de supervivencia después del diagnóstico con ATC es de sólo unos 6 meses, y no hay tratamientos disponibles que mejoren significativamente la supervivencia 1,2.
La rareza del ATC ha obstaculizado la investigación que estudia cómo comienza la enfermedad y progresa agresivamente. Recientemente se han puesto a disposición modelos de ratón genéticamente modificados que imitan la enfermedad, que proporcionan información sobre la enfermedad y sus respuestas a posibles tratamientos 3,4,5. Tales estudios requieren imágenes tumorales precisas para las mediciones y el monitoreo, que generalmente se realiza mediante imágenes por resonancia magnética, tomografía computarizada o ecografía de alta resolución 6,7. La ecografía ha sido ampliamente utilizada en órganos de ratón. Tiene ventajas sobre la resonancia magnética y la tomografía computarizada, ya que puede realizarse en tiempo real y no expone al sujeto a radiación, y el equipo necesario es lo suficientemente pequeño como para ser portátil 8,9. Sin embargo, los estudios sobre el monitoreo continuo del crecimiento de ATC mediante ultrasonido son raros; Por lo tanto, este trabajo explora la utilidad del ultrasonido en este contexto.
Aquí, se presenta un protocolo para usar ecografía de alta resolución para escanear, monitorear y medir tumores con precisión en un modelo de ratón de ATC.
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Protocol
El presente estudio se realizó con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Sichuan. TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 ratones transgénicos10 fueron utilizados en este estudio (ver Tabla de Materiales). Los pasos del protocolo se pueden modificar para diferentes especies animales si es necesario. Aquí se utilizaron doce ratones, incluidas seis hembras y seis machos, con una edad media de 93 días.
1. Preparación experimental
- Encienda el sistema de ecografía (consulte Tabla de materiales) y cree una nueva carpeta para capturar las imágenes y recopilar los datos. Seleccione la sonda de línea de 40 MHz y haga clic en el patrón de tejido superficial para activar el transductor de tejido superficial . Utilice el "modo B" para obtener imágenes de tiroides (Figura 1A).
NOTA: El modo B es el modo básico de imágenes de ultrasonido. La apariencia de las imágenes de ultrasonido se basa en las interacciones físicas del sonido con los tejidos del cuerpo. Las imágenes en modo B se producen como imágenes grises11,12. - Mantenga a los ratones en jaulas específicas con acceso gratuito a alimentos y agua. Coloque la jaula en un dispositivo de calentamiento suplementario (consulte la Tabla de materiales) para garantizar la termorregulación.
- Asegúrese de que haya suficiente isoflurano en el vaporizador yO2 en el tanque. Si los suministros son insuficientes, cambie los tanques por otros nuevos.
- Limpie la plataforma de imágenes de animales con solución salina estéril y encienda el botón de calefacción. Verifique que la temperatura sea de 38-40 °C antes de colocar al animal en la plataforma (Figura 1C).
2. Preparación del animal para la obtención de imágenes
- Encienda el vaporizador de isoflurano. Transfiera el ratón de la jaula a la caja de anestesia.
- Anestesiar al animal usando una mezcla de 1% -2% de isoflurano del vaporizador y oxígeno que fluye a 0.8 L / min.
- Aplique crema depilatoria desde el pecho hasta el cuello, espere 30 segundos y luego limpie la crema y el pelaje por completo. Enjuague bien el área y el pelaje circundante con solución salina estéril tibia.
- Coloque al animal anestesiado en la plataforma calentada. Cubra el hocico con un cono nasal conectado a la salida de anestesia (Figura 2A, B).
NOTA: El ratón debe estar completamente sedado en 1-2 minutos. Si el animal todavía está activo, realice una inducción prolongada de isoflurano hasta que el animal ya no muestre un reflejo de retirada del pedal. Asegúrese de que el animal respire de manera estable. - Durante la toma de imágenes, controle la frecuencia cardíaca del ratón a través de la plataforma calentada.
NOTA: El sistema de imágenes de ecografía está equipado con un monitor de frecuencia cardíaca. - Use cinta adhesiva para fijar las extremidades del ratón a la plataforma calentada, con el animal en posición supina. Asegúrese de que el cono nasal esté colocado de forma estable con un flujo de gas anestésico constante (1,5 L/min).
- Proteger los ojos aplicando ungüento oftálmico.
3. Imágenes tumorales
- Ajuste el sistema de imágenes para optimizar la resolución. Configure los siguientes parámetros: ganancia bidimensional, 25-30 dB; profundidad de imagen, 10 mm; número de zonas focales, 3; y centro, 3-6 mm.
NOTA: Para el presente estudio, se utilizó una sonda de 40 MHz. El modo B se especificó para la adquisición de datos. - Aplique generosamente gel de ultrasonido (consulte la Tabla de materiales) en el área de la piel desnuda.
- Sostenga la sonda y colóquela en contacto con el gel de ultrasonido en el tórax, y luego escanee desde el tórax hacia el cuello para localizar la tiroides (Figura 2C).
NOTA: Aplique presión suavemente mientras escanea; La presión excesiva sobre el cuello del animal puede causar jadeo o apnea. Este protocolo se desarrolló en base al escaneo manual, pero el escaneo mecanizado también se puede realizar utilizando una máquina para guiar la sonda, como una plataforma de imágenes de animales que se mueve a lo largo de los ejes x e y. - Escanee hacia arriba y hacia abajo para identificar los límites del tumor y evaluar su tamaño y forma.
NOTA: Una tiroides sana generalmente aparece como una estructura homogénea hipoecogénica delante de la tráquea. Los tumores anaplásicos hacen que la tiroides parezca mucho más grande, lo que se puede identificar fácilmente mediante la exploración del cuello (Figura 3). - Identificar los tumores ATC de la tráquea y los músculos de la correa dependiendo de la ubicación anatómica y el eco ecográfico.
NOTA: Los músculos de la correa se encuentran delante de la tiroides y la tráquea, así como detrás de la tiroides. El eco ecográfico de los músculos de la correa parece más alto que el del ATC, mientras que existe atenuación detrás de la tráquea13.- Según la impresión del tumor total, confirme la sección de imagen con el diámetro tumoral más grande de izquierda a derecha. Presione el botón de congelación y mida los diámetros del tumor anteroposterior y de izquierda a derecha con el calibrador de ultrasonido.
NOTA: El diámetro anteroposterior debe medirse perpendicularmente al diámetro tumoral de izquierda a derecha (Figura 4). El tamaño tumoral del ATC se calculó multiplicando el diámetro anteroposterior por el diámetro tumoral de izquierda a derecha14. Como el tamaño de los tumores en los lados izquierdo y derecho era inconsistente, cada lado de los tumores se calculó por separado. El tamaño total de los tumores se obtuvo mediante la adición de los tumores bilaterales. Los tamaños se registraron para observar la curva de crecimiento del ATC.
- Según la impresión del tumor total, confirme la sección de imagen con el diámetro tumoral más grande de izquierda a derecha. Presione el botón de congelación y mida los diámetros del tumor anteroposterior y de izquierda a derecha con el calibrador de ultrasonido.
- Guarde la grabación como un bucle de cine, lo que facilita la revisión de las imágenes seleccionadas.
4. Recuperación animal
- Después de escanear, limpie el gel de ultrasonido y retire la cinta de sujeción de las extremidades del animal.
- Coloque el ratón sobre el dispositivo de calentamiento suplementario (paso 1.2). Coloque al animal de lado (Figura 2D).
- Después de que el ratón se recupere (~5 min), transfiéralo de nuevo a la jaula.
- Limpie el sistema de ecografía, la sonda y la plataforma con un paño suave y alcohol isopropílico o toallitas de glutaraldehído.
- Apague el sistema de imágenes.
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Representative Results
El tamaño promedio del ATC derecho al comienzo del estudio fue de 4,867 mm 2, y el tamaño promedio del ATC izquierdo fue de 5,189 mm2. En la cuarta medición, el tamaño promedio del ATC derecho había crecido a 11.844 mm 2, mientras que el tamaño del tumor del lóbulo izquierdo había crecido a 9.280 mm2. El tamaño total del ATC aumentó de 10.057 mm 2 a 15.843 mm2. En la etapa posterior del estudio, el ATC creció rápidamente. En términos del ratón etiquetado como "P92" (Tabla 1), el tamaño del tumor en la cuarta medición había crecido a casi cuatro veces más grande que el tamaño en la medición inicial. Las medidas representativas de cuatro ratones y las curvas de crecimiento se muestran en la Figura 5.
La ecografía de alta frecuencia es la modalidad de imagen más utilizada para examinar las glándulas tiroides en humanos, y la técnica también parece adecuada para ratones. Puede visualizar toda la glándula tiroides del ratón y los detalles del crecimiento de la lesión tiroidea. Este protocolo de aplicación del método de ecografía de alta frecuencia podría usarse para escanear, monitorear y medir tumores con precisión en un modelo de ratón genéticamente modificado de ATC.
Figura 1: Equipo utilizado en el presente estudio . (A) El sistema de ecografía de alta frecuencia. (B) Suministros de laboratorio: (1) Manta calefactora eléctrica. (2) Toallas de papel. (3) Gel de ultrasonido. (4) Vaporizador de isoflurano. (5) Crema depilatoria. (6) Hisopos de algodón. (7) Tijeras. (8) Cinta adhesiva. (9) Guantes médicos. (10) Cámara para inducción de anestesia. (11) Sistema de anestesia. (C) Un sistema de escaneo mecanizado para imágenes de ultrasonido. El ratón completamente sedado se colocó en la plataforma calentada (que se muestra en verde), y la sonda de escaneo se conectó a un brazo móvil de precisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Preparación del ratón y ecografía . (A) Inducción de anestesia. (B) Fijación del animal en la plataforma calentada y mantenimiento de la anestesia. (C) Ecografía con un método a mano alzada. (D) Recuperación del animal en la manta calefactora eléctrica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes ecográficas de un modelo ortotópico de ratón con tumor ATC. La línea verde demarca la tráquea, la línea roja demarca el tumor ATC y la línea amarilla demarca el músculo de la correa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cálculo del tamaño del tumor. El tamaño del tumor se calculó multiplicando el diámetro anteroposterior (línea naranja) por el diámetro tumoral de izquierda a derecha (línea blanca). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis longitudinal del crecimiento ortotópico de ATC en el modelo de ratón . (A) Lóbulo tiroideo derecho. (B) Lóbulo tiroideo izquierdo. (C) Toda la tiroides. Cada curva corresponde a un animal medido cuatro veces. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Fecha | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| Etiqueta | Ubicación | Tamaño del tumor (mm2) | |||
| P71 | Derecha | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| Izquierda | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| total | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| P85 | Derecha | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| Izquierda | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| total | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| P89 | Derecha | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| Izquierda | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| total | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| P92 | Derecha | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| Izquierda | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| total | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
Tabla 1: Datos sobre la medición del tamaño del tumor. "P71", "P85", "P89" y "P92" representan las etiquetas de los ratones. Derecha: el tamaño del tumor del lado derecho. Izquierda: el tamaño del tumor del lado izquierdo. Total: el tamaño total del tumor mediante la adición de los tumores bilaterales. La primera línea incluye el tamaño del tumor (mm2: milímetros cuadrados) y la fecha de las mediciones.
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Discussion
Este protocolo utiliza ecografía de alta resolución para analizar tumores ATC ortotópicos en un modelo de ratón modificado genéticamente. El modelo transgénico, con un genotipo de TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10, fue desarrollado en nuestro laboratorio. Los animales sobreexpresan BrafV600E y carecen de Trp53; La inyección de tamoxifeno por vía intraperitoneal a los animales conduce al crecimiento del tumor después de aproximadamente 1 mes10. Los tumores crecen rápidamente y alcanzan un tamaño medible en 50 días. Este protocolo se utilizó para monitorear el crecimiento del tumor durante 4 meses.
La ecografía ha demostrado ser confiable en ratones para obtener imágenes de tejidos que ocupan ubicaciones corporales similares a las de los tejidos humanos, incluidos el hígado, la tiroides y el feto9. Al igual que en los humanos, la tiroides del ratón se encuentra a cada lado del cartílago tiroideo y la tráquea13. El protocolo presentado permite el análisis de tumores ATC en la tiroides, permitiendo el estudio del inicio, progresión y respuesta tumoral a los tratamientos. Los tumores tiroideos en el modelo de ratón crecieron bastante y ocuparon el espacio alrededor de la tráquea y los músculos de la correa. Mostraron características sólidas-quísticas en ultrasonido, similares a las estructuras foliculares. La no invasividad, la corta duración y la conveniencia de la ecografía pueden hacerla más atractiva para muchos grupos de investigación que la resonancia magnética o la tomografía computarizada8. Dado que los períodos prolongados de sedación o anestesia son innecesarios, las ventajas de la ecografía podrían facilitar los estudios longitudinales.
La aplicación de suficiente gel de ultrasonido durante la exploración es crucial para eliminar las bolsas de aire que podrían afectar las imágenes y para evitar la compresión excesiva que podría conducir a la apnea. Este protocolo se realiza rutinariamente en nuestro laboratorio por especialistas en ecografía experimentados que realizan escaneo a mano alzada. Se prefiere el escaneo a mano alzada a una plataforma mecanizada porque permite flexibilidad para ajustar la posición de la sonda de ultrasonido de acuerdo con el estado del animal. Cuando se utiliza una plataforma mecanizada, las coordenadas x e y deben ajustarse para evitar una compresión excesiva en el animal. Los resultados mostraron que los tumores crecieron lentamente en el período temprano, pero a partir del día 60, los tumores se desarrollaron dramáticamente más rápido, y el tamaño máximo del tumor fue de 38.188 mm2. La principal causa de muerte fue la asfixia en la etapa tardía. En los ensayos clínicos, debido a la rareza de los tumores ATC, es difícil recolectar suficientes muestras para observar el proceso y el mecanismo de desarrollo. El método de las lesiones ATC podría observarse mejor en el modelo murino. En el futuro, estas muestras pueden proporcionar más información para los tratamientos clínicos.
Una limitación de las imágenes por ultrasonido es que la ecogenicidad de los tumores ATC puede parecerse a la de los tejidos circundantes, oscureciendo así los márgenes tumorales, especialmente en una imagen fija. Sin embargo, estos márgenes se pueden identificar mediante el uso de contraste dinámico, por lo que las imágenes dinámicas se guardaron en este estudio para su posterior análisis. Para garantizar los resultados más precisos y confiables, la sonda debe colocarse de varias maneras para visualizar toda la tiroides y el tumor desde diferentes ángulos. En este estudio, solo un ultrasonógrafo realizó todas las mediciones, por lo que no se evaluaron las mediciones de confiabilidad entre diferentes examinadores.
Este protocolo puede facilitar el uso de la ecografía de alta resolución para localizar y medir tumores ATC en animales, allanando así el camino para estudios detallados de inicio, progresión y tratamiento del cáncer.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de agencias de financiación públicas, comerciales o sin fines de lucro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
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