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Behavior

Saggio spot del vuoto in tempo reale

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

Questo articolo descrive un nuovo metodo per studiare il comportamento di minzione del topo incorporando il monitoraggio video nel test convenzionale del punto vuoto. Questo approccio fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento e sui dettagli del comportamento del mouse durante le fasi di luce e buio del giorno.

Abstract

Il normale comportamento minzionale è il risultato della funzione coordinata della vescica, dell'uretra e degli sfinteri uretrali sotto il corretto controllo del sistema nervoso. Per studiare il comportamento di minzione volontaria nei modelli murini, i ricercatori hanno sviluppato il void spot assay (VSA), un metodo che misura il numero e l'area di macchie di urina depositate su una carta da filtro che riveste il pavimento della gabbia di un animale. Sebbene tecnicamente semplice e poco costoso, questo test presenta dei limiti quando viene utilizzato come test end-point, tra cui la mancanza di risoluzione temporale degli eventi minzionali e le difficoltà nel quantificare le macchie di urina sovrapposte. Per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato un VSA video-monitorato, che chiamiamo VSA IN TEMPO REALE (RT-VSA), e che ci consente di determinare la frequenza di svuotamento, valutare il volume vuoto e i modelli di svuotamento ed effettuare misurazioni su finestre temporali di 6 ore durante le fasi buie e chiare del giorno. Il metodo descritto in questo rapporto può essere applicato a un'ampia varietà di studi basati sui topi che esplorano gli aspetti fisiologici e neurocomportamentali della minzione volontaria negli stati di salute e malattia.

Introduction

La conservazione delle urine e la minzione sono coordinate da un circuito centrale (sistema nervoso centrale) che riceve informazioni sullo stato di riempimento della vescica attraverso i nervi pelvico e ipogastrico. L'urotelio, l'epitelio che riveste il tratto urinario dalla pelvi renale all'uretra prossimale, forma una stretta barriera ai prodotti di scarto metabolici e agli agenti patogeni presenti nelle urine. È parte integrante di una rete sensoriale, che rileva e comunica lo stato di riempimento della vescica ai tessuti sottostanti e ai nervi afferenti 1,2. La rottura della barriera uroteliale, o alterazioni nelle vie di meccanotrasduzione uroteliale, possono portare a disfunzioni minzionali insieme a sintomi del tratto urinario inferiore come frequenza, urgenza, nicturia e incontinenza 3,4,5,6,7. Allo stesso modo, l'invecchiamento, il diabete, le infezioni del tratto urinario inferiore, la cistite interstiziale e altri processi patologici che colpiscono la vescica urinaria o i circuiti associati che controllano la sua funzione, sono noti per causare disfunzione della vescica 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Una migliore comprensione del comportamento minzionale normale e anormale dipende dallo sviluppo di metodi che possono discriminare in modo affidabile tra diversi modelli di minzione.

Tradizionalmente, il comportamento di minzione volontaria dei topi è stato studiato utilizzando il void spot assay (VSA), sviluppato da Desjardins e colleghi20, e ampiamente adottato grazie alla sua semplicità, basso costo e approccio non invasivo 8,21,22,23,24. Questo test viene tipicamente eseguito come test finale, in cui un topo trascorre una quantità definita di tempo in una gabbia rivestita da una carta da filtro, che viene successivamente analizzata contando il numero e valutando la dimensione delle macchie di urina quando la carta da filtro viene posta sotto luce ultravioletta (UV) (le macchie di urina sono fluorescenti in queste condizioni)20. Nonostante questi numerosi vantaggi, il VSA tradizionale presenta alcune importanti limitazioni. Poiché i topi spesso urinano nelle stesse aree, i ricercatori devono limitare la durata del test a un periodo di tempo relativamente breve (≤4 ore)25. Anche quando il VSA viene eseguito su periodi di tempo più brevi, è quasi impossibile risolvere piccoli punti vuoti (SVS) che cadono su grandi macchie vuote o, per discriminare le SVS dal trascinamento di urina aderente alla coda o alle zampe. È anche molto difficile distinguere se le SVS sono una conseguenza di frequenti ma singoli eventi minzionali (un fenotipo che si osserva spesso in risposta alla cistite 4,26), o a causa del dribbling post-minzione (un fenotipo associato all'ostruzione dello sbocco della vescica27). Inoltre, il desiderio di completare il test durante l'orario di lavoro, unito alle difficoltà di accesso alle strutture abitative quando le luci sono spente, spesso limita questi test al periodo di luce del ciclo circadiano di 24 ore. Pertanto, questi vincoli temporali impediscono la valutazione del comportamento minzionale del topo durante la loro fase notturna attiva, diminuendo la capacità di analizzare geni o trattamenti specifici che sono governati dai ritmi circadiani.

Per superare alcune di queste limitazioni, i ricercatori hanno sviluppato metodi alternativi per valutare il comportamento minzionale in tempo reale 26,28,29,30,31,32. Alcuni di questi approcci prevedono l'uso di attrezzature costose come le gabbie metaboliche26,28,29 o l'uso di telecamere termiche30; Tuttavia, anche questi hanno dei limiti. Ad esempio, nelle gabbie metaboliche, l'urina tende ad aderire ai fili del pavimento della rete e alle pareti dell'imbuto, riducendo la quantità di urina che viene raccolta e misurata. Pertanto, può essere difficile raccogliere con precisione dati su piccoli vuoti. Inoltre, le gabbie metaboliche non forniscono informazioni sulla distribuzione spaziale degli eventi di minzione (cioè la minzione negli angoli rispetto al centro della camera). Dato che la radiazione infrarossa a lunga lunghezza d'onda utilizzata dalle telecamere termografiche non penetra i solidi, l'attività di svuotamento valutata dalla videotermografia deve essere eseguita in un sistema aperto, che può essere difficile con i topi attivi, in quanto possono saltare diversi centimetri nell'aria. Un altro sistema è l'approccio automatizzato aVSOP (automated voided stain on paper)33, che consiste in carta da filtro arrotolata che si avvolge a velocità costante sotto il pavimento in rete metallica di una gabbia per topi. Questo approccio previene i danni alla carta e la sovrapposizione di macchie di urina che si verificano nel VSA classico e la sua implementazione consente allo sperimentatore di eseguire esperimenti per diversi giorni. Tuttavia, non fornisce allo sperimentatore una tempistica precisa degli eventi di minzione e non vi è alcuna capacità di esaminare il comportamento e come si correla con lo spotting. Per ottenere queste informazioni, i ricercatori hanno incorporato il video-monitoraggio ai saggi di minzione, un approccio che consente la valutazione simultanea dell'attività del topo e degli eventi di minzione31,32. Un approccio consiste nel posizionare un diodo a emissione di luce blu (LED) e una videocamera con un filtro proteico a fluorescenza verde posto sotto la gabbia sperimentale per visualizzare gli eventi di svuotamento, e un LED a infrarossi e una videocamera sopra la gabbia per catturare la posizione del mouse32. Questa configurazione è stata utilizzata per monitorare il comportamento dello svuotamento durante l'esecuzione della fotometria delle fibre; Tuttavia, l'ambiente illuminato di questo sistema ha richiesto ai ricercatori di trattare i loro topi con un agente diuretico per stimolare la minzione. In un altro progetto sperimentale, le telecamere grandangolari sono state posizionate sopra e sotto la gabbia sperimentale per visualizzare rispettivamente l'attività motoria del topo e gli eventi di minzione. In questo caso, le macchie di urina depositate su una carta da filtro che riveste il pavimento della gabbia sono state rivelate illuminando la carta da filtro con luci UV poste sotto la gabbia31. Questa configurazione è stata utilizzata in saggi brevi, della durata di 4 minuti, durante la fase luminosa del giorno per studiare i neuroni del tronco cerebrale coinvolti nel comportamento di minzione volontaria31. L'idoneità di questo sistema per il suo utilizzo durante la fase di buio o per periodi di tempo >4 minuti non è stata riportata.

In questo articolo viene descritto un metodo che migliora il VSA tradizionale consentendo il monitoraggio video a lungo termine del comportamento di svuotamento del mouse. Questo approccio economico fornisce informazioni temporali, spaziali e volumetriche sugli eventi di svuotamento per lunghi periodi di tempo durante le fasi di luce e buio del giorno, insieme a dettagli relativi al comportamento del mouse 3,4,34. Vengono fornite informazioni dettagliate per la costruzione delle camere di svuotamento, l'implementazione di un VSA (RT-VSA) in tempo reale e l'analisi dei dati. L'RT-VSA è prezioso per i ricercatori che cercano di comprendere i meccanismi fisiologici che controllano la funzione del sistema urinario, per sviluppare approcci farmacologici per controllare la minzione e per definire le basi molecolari dei processi patologici che colpiscono il tratto urinario inferiore.

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Protocol

Topi uroteliali piezoelettrici a doppio knockout (Pz1/2-KO, genotipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) e controlli (Pz1/2-C, genotipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) sono stati generati internamente da ceppi parentali ottenuti dai laboratori Jax (ceppo # 029213 Piezo1 fl/fl ; Ceppo Piezo2 fl/fl # 027720; Upk2CRE+/- ceppo # 029281). Negli esperimenti sono stati utilizzati topi sia femmine (1,5-3 mesi e 17-20 g di peso) che maschi (2-4 mesi e 23-29 g di peso). Per esperimenti di cistite indotta da ciclofosfamide, sono state utilizzate femmine selvatiche C57Bl / 6J (3 mesi e ~ 20 g di peso) (i laboratori Jackson, ceppo # 000664). Gli animali sono stati ospitati e gli esperimenti sono stati eseguiti presso l'Università di Pittsburgh Animal Care Facility sotto l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Pittsburgh. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti della politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio e della legge sul benessere degli animali.

1. Assemblaggio di gabbie per il test del punto vuoto in tempo reale (RT-VSA)

  1. Il rig RT-VSA è costituito da un supporto UV che contiene due lampadine UV e due telecamere grandangolari (telecamere inferiori), che vengono utilizzate per registrare l'attività di svuotamento durante la fase luminosa del giorno. Disporre due camere per il mouse per riposare sul supporto. Collegare le telecamere grandangolari (fotocamere superiori) al coperchio di ciascuna camera del mouse, utilizzate per registrare l'attività di svuotamento durante la fase buia del giorno (Figura 1A).
  2. Costruisci il telaio del supporto UV e delle camere del mouse da 1 in x 1 nei profili in alluminio con scanalatura a T. Vedere la Tabella 1 per un elenco dei componenti utilizzati per costruire due camere per mouse e il supporto UV e la Figura 1B-D per le diverse viste dei componenti e delle dimensioni assemblati.
  3. Costruisci ogni camera del mouse con otto profili in alluminio con scanalatura a T tagliati a 10 pollici e quattro tagli a 14,75 pollici. Iniziare assemblando la parte inferiore della camera del mouse e utilizzare elementi di fissaggio standard (Tabella 1) per assemblare i profili con scanalatura a T secondo la Figura 1. Montare l'acrilico trasmissore UV 38,5 cm x 26,5 cm nel canale interno dei profili per costruire il pavimento delle camere del mouse.
    NOTA: per informazioni dettagliate su come assemblare i profili con scanalatura a T con elementi di fissaggio standard, visitare la pagina Web dell'azienda.
  4. Costruisci le pareti della camera del mouse con il resto dei profili. Montare i pannelli in policarbonato resistente all'abrasione (AR) da 38,5 cm x 21,5 cm e 26,5 cm x 21,5 cm nei profili per assemblare le pareti esterne della camera del mouse. Utilizzare i pannelli in policarbonato AR da 37,5 cm x 23,9 cm e 24,4 cm x 23,9 cm per costruire l'interno della camera del mouse.
  5. Fissare i pannelli in policarbonato AR con chiusura standard 1/4-20 battistrada. Vedere le istruzioni su come montare i pannelli nei profili sulla pagina web nella NOTA del punto 1.3. Utilizzare il silicone commerciale calafataggio per sigillare le giunzioni tra i pannelli interni.
  6. Utilizzare due profili con fessura a T da 12 pollici e due da 14,75 pollici per assemblare il coperchio della gabbia come indicato nella figura 1B. Montare un pannello in policarbonato AR da 38,5 cm x 26,5 cm nel canale interno dei profili per completare il coperchio.
  7. Montare il supporto del profilo della telecamera da 12 pollici perpendicolare agli assi lunghi della parte superiore della gabbia e fissarlo con due passaggi leggeri all'interno delle staffe angolari (contrassegnato 3 nella Figura 1B). Utilizzare una piastra piana diritta (contrassegnata con 2) come supporto per il montaggio della webcam e montarla come mostrato nella Figura 1B. Collegare la fotocamera al supporto con la vite di montaggio della fotocamera.
  8. Utilizzare il gruppo cerniera di sollevamento standard serie 10 a destra per fissare il coperchio al corpo della camera del mouse (contrassegnato 1 nella Figura 1B).
  9. Costruire il supporto UV con quattro profili con scanalatura a T tagliati a 40 pollici, quattro profili con fessura a T tagliati a 32 pollici e quattro profili con fessura a T tagliati a 10 pollici, secondo la Figura 1C, D. Montare una lastra a specchio acrilico di 82,5 cm x 26,5 cm nei profili per costruire il fondo della camera UV.
  10. Utilizzare la lastra di specchio acrilico da 82,5 cm x 30,5 cm e 26,5 cm x 30,5 cm per costruire la parete del supporto UV.
  11. Fissare le piastre piatte a T a cinque fori serie 10 (contrassegnate 2 nella Figura 1 C), le piastre piatte L a cinque fori della serie 10 (contrassegnate con 3 nella Figura 1 C) e le piastre piatte a T a cinque fori della serie 10 (contrassegnate 1 nella Figura 1C) per fissare il supporto UV.
  12. Montare le telecamere inferiori in un profilo con scanalatura a T tagliato a 32 pollici e fissarle sul fondo del supporto con due staffe angolari di transizione lite come mostrato nella Figura 1D. Utilizzare piastre piatte dritte per collegare le webcam al profilo con scanalatura a T.
  13. Montare le lampade UV all'interno, sul fronte e sul retro e fissarle alle piastre piane diritte come mostrato nella Figura 1D.
  14. Collegare le quattro webcam alle porte USB di un computer che esegue un software di videosorveglianza.

2. Stabulazione degli animali prima della sperimentazione

  1. Topi sperimentali domestici, allevati appositamente o ottenuti da un sito esterno, in gruppi di quattro. Quando possibile, utilizzare topi femmina o maschio di pari età per questi esperimenti. Se gli animali sono ottenuti da una fonte esterna, consentire loro di acclimatarsi per almeno 7 giorni prima di condurre qualsiasi procedura sperimentale.
  2. Durante tutto il loro tempo nella struttura per animali, ospitano gli animali in gabbie standard contenenti lettiera e arricchimento (ad esempio, igloo di plastica, ruota, pezzo di carta per la triturazione) e tenerli sotto un ciclo giorno / notte di 12 ore, con accesso all'acqua e al chow secco del topo ad libitum.

3. Registrazioni RT-VSA durante le fasi chiare e scure del giorno

NOTA: il protocollo seguente descrive l'uso di RT-VSA per valutare il comportamento di svuotamento del mouse durante le fasi di luce e buio della giornata. Gli animali sono tenuti su un ciclo di 12 ore di luce e 12 ore di buio con Zeitgeber time (ZT) = 0 alle 07:00 a.m. Le registrazioni iniziano tra le 10:30 e le 11:00 (ZT = 3,5-4,0) per gli esperimenti in fase luminosa e tra le 18:00 e le 18:30 (ZT = 11,0-11,5) per gli esperimenti in fase oscura. Quando gli animali vengono testati in entrambe le condizioni, gli esperimenti vengono in genere eseguiti in due giorni separati, con almeno 5 giorni consecutivi tra i test di luce e buio. Gli esperimenti non dovrebbero essere eseguiti nei giorni in cui le stanze degli animali vengono pulite o le gabbie vengono cambiate, poiché possono causare stress che influenzano il comportamento svuotante. Tutti i passaggi devono essere eseguiti in condizioni di stress minimo per i topi.

  1. Trasportare gli animali da esperimento dalla loro posizione di stabulazione alla sala operatoria in cui si trovano le camere di registrazione RT-VSA.
  2. Preparazione della camera di registrazione RT-VSA
    1. Posizionare un pezzo di carta da filtro (24,3 cm x 36,3 cm) nella parte inferiore di ogni gabbia di registrazione RT-VSA. A seconda dell'ora del giorno, utilizzare carta da filtro sottile (esperimenti in fase leggera) o spessa (esperimenti in fase scura).
      NOTA: la carta da filtro spessa viene utilizzata durante la fase di buio attivo in quanto è più resistente alla triturazione rispetto alla carta da filtro sottile. Le fotocamere superiori vengono utilizzate per visualizzare le macchie di urina depositate su carta da filtro spessa durante la fase scura. Al contrario, durante la fase di luce, le telecamere inferiori vengono utilizzate perché la luce ambientale impedisce alle telecamere superiori di rilevare le macchie di urina depositate sulla carta da filtro. In questo caso, viene utilizzata carta da filtro sottile. Abbiamo scoperto che le telecamere inferiori sono inefficaci nel rilevare piccoli eventi di svuotamento depositati su carta da filtro spessa.
    2. Sopra la carta da filtro, posizionare i seguenti elementi: un igloo di plastica (che offre uno spazio per dormire), una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml per scopi di arricchimento e una capsula di plastica da 60 x 15 mm contenente due o tre pezzi di chow secco di topo e 14-16 g di acqua sotto forma di gel-pack (gel d'acqua non bagnante; Figura 2).
      NOTA: L'uso di provette da microcentrifuga da 1,5 ml per scopi di arricchimento era specifico per l'involucro utilizzato in questo studio.
    3. Una volta che le camere di registrazione sono pronte, posizionare delicatamente i topi sperimentali all'interno stendendoli delicatamente sulla carta da filtro. Assicurarsi che il trasferimento degli animali dalla gabbia dell'alloggiamento alle gabbie di registrazione avvenga con il minimo stress.
    4. Una volta che tutti gli animali da esperimento sono all'interno delle loro gabbie di registrazione, con i coperchi chiusi, coprire la parte superiore dei coperchi con un bluepad assorbente da banco per ridurre al minimo i riflessi diretti della luce ambientale sulla superficie del coperchio in plexiglass.
    5. Accendere le luci UV nella camera inferiore.
      NOTA: Gli animali non hanno alcun contatto diretto con la luce UV. La luce UV consigliata è dettagliata nella sezione materiali.
  3. Registrazioni RT-VSA
    1. Per registrare video dalle telecamere superiore e inferiore, utilizzare un software di registrazione di videosorveglianza, che può essere configurato per registrare da più webcam o telecamere di rete contemporaneamente.
    2. All'apertura del programma, avviare la registrazione premendo Comando e R nella finestra del programma. Esegui registrazioni video a una velocità di 1 fotogramma per s.
    3. Subito dopo aver avviato le registrazioni, esci dalla stanza, chiudendo delicatamente la porta. Assicurati che la stanza rimanga silenziosa per l'intera durata dell'esperimento.
  4. Termina le registrazioni RT-VSA
    1. Tornare nella sala operatoria dopo 7 ore (esperimenti in fase di luce) o la mattina successiva (esperimenti di fase oscura).
    2. Interrompi le registrazioni premendo Comando e T. Spegnere le luci UV.
    3. Dopo aver interrotto la registrazione, il software genera automaticamente un file filmato (in formato .m4v) per ogni telecamera e lo salva sotto il nome della fotocamera in una cartella di destinazione precedentemente selezionata. Verificare che, all'interno di ogni cartella della fotocamera, gli esperimenti siano organizzati in cartelle per data.
    4. In ogni cartella data/esperimento, verificate che esista un file di .m4v e tutti i singoli file di .jpeg corrispondenti a ciascuno dei fotogrammi del filmato.
    5. NOTA: i file .jpeg possono essere utilizzati per recuperare l'esperimento nel caso in cui i file del filmato vengano danneggiati.
    6. Crea una cartella sul desktop con il nome e la data dell'esperimento e trasferisci tutti i file .m4v in questa cartella. Se necessario, eliminare i file .jpeg una volta salvati e sottoposti a backup i file del filmato.
    7. NOTA: per gli esperimenti in fase di luce, il software genererà un filmato per telecamera, mentre per gli esperimenti in fase scura, genererà due filmati per ogni telecamera. Questo perché un nuovo file .m4v viene generato dopo la mezzanotte quando la data cambia.
    8. Copiare la cartella contenente i filmati in un'unità flash per l'analisi in un computer esterno. Questo passaggio può richiedere alcuni minuti e può essere eseguito in parallelo ai passaggi da 3.5.1 a 3.5.3.
  5. Pulizia delle gabbie di registrazione e trasferimento dei topi sperimentali nella loro posizione di alloggiamento
    1. Rimuovere il bluepad che copre i coperchi delle gabbie. Trasferire gli animali dalle gabbie di registrazione alla loro gabbia di alloggiamento.
    2. Rimuovere gli accessori e gli alimenti nelle camere di registrazione (ad esempio, igloo di plastica, tubi di plastica, piatto con resti di chow e gel d'acqua e carta da filtro) e smaltirli nei rifiuti biopericolosi.
    3. Pulire le gabbie utilizzando un aspirapolvere a mano, rimuovendo il chow e i pellet fecali presenti sul fondo della gabbia. Quindi, spruzzare il pavimento e le pareti interne della gabbia con etanolo al 70% e pulire l'interno con un pezzo di panno morbido. Lasciare il coperchio delle gabbie aperto per consentire loro di asciugare all'aria.
    4. Collocare la gabbia di alloggiamento con gli animali in un contenitore secondario e trasportare gli animali nella loro posizione di stabulazione.

4. Generazione di curve di calibrazione

NOTA: è necessaria una curva di calibrazione per convertire le aree spot vuote in volumi di urina. Se si eseguono esperimenti durante le fasi di luce e buio della giornata, è necessario generare due curve di calibrazione, una per ogni tipo di carta da filtro utilizzata (carta da filtro sottile e spessa). Le curve di calibrazione vengono generate in duplicato. Ogni replica viene eseguita su una carta da filtro posta in una camera di registrazione RT-VSA. Data la sua composizione complessa e l'eccitabilità UV, utilizzare l'urina di topo per effettuare le curve di calibrazione.

  1. Raccolta delle urine del topo
    1. Prendi un pezzo di pellicola trasparente flessibile (10 cm x 15 cm) e posizionalo su una panca.
    2. Scegli un topo per la coda e collottola. Massaggiare delicatamente l'addome inferiore per indurre la minzione. Raccogliere l'urina sulla superficie del foglio di plastica del film trasparente.
    3. Rilascia delicatamente l'animale all'interno della sua gabbia. Utilizzando una pipetta, trasferire l'urina dalla superficie del film trasparente a una provetta sterile da 1,5 mL di microcentrifuga. Ripetere la procedura con più topi fino a raccogliere ~ 10 ml di urina di topo, raggruppare l'urina e conservare a -20 ° C.
      NOTA: è necessario un totale di ~ 10 ml di urina di topo per generare curve di calibrazione duplicate per le fasi di luce e buio. Per evitare di stressare i topi sperimentali, non utilizzare topi che saranno sottoposti a esperimenti RT-VSA per la raccolta delle urine.
  2. Registrazioni della curva di calibrazione
    1. Scongelare l'urina raccolta nel passaggio 4.1 e mescolarla vorticando delicatamente per 10-15 s.
    2. Posizionare un pezzo di carta da filtro sottile (24,3 cm x 36,3 cm) in ciascuna delle due gabbie di registrazione RT-VSA.
    3. Pipettare i seguenti volumi di urina (in μL) su ciascuna carta da filtro: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 e 750. Per evitare la sovrapposizione delle macchie a seguito della diffusione, allocare i punti a una distanza sufficiente l'uno dall'altro.
    4. Chiudere il coperchio delle gabbie e coprirle con cuscinetti
    5. Avviare la registrazione premendo Comando e R, applicando gli stessi parametri software utilizzati per registrare gli esperimenti (passaggio 3.3.).
    6. Registrare la curva di calibrazione per 1 ora per consentire la massima diffusione delle macchie di urina. Premere Comando e T per interrompere la registrazione.
    7. Creare una nuova cartella nel desktop, inserire i file .m4v al suo interno, quindi trasferire i dati su un'unità flash per l'analisi successiva.
    8. Eseguire una procedura simile per generare curve duplicate con carta da filtro spessa. In questo caso, aggiungi ulteriori strati di pad per scurire l'interno e simulare le condizioni di fase scura.
  3. Analisi delle registrazioni della curva di calibrazione
    1. Apri i file .m4v in un software di riproduzione di film, ingrandendo la finestra per riempire lo schermo. Per analizzare le curve di calibrazione eseguite su carta da filtro spessa, utilizzare i file ottenuti con le fotocamere superiori (Figura 3A). Per analizzare le curve di calibrazione eseguite su carta da filtro sottile, utilizzare i file ottenuti con le fotocamere inferiori (Figura 3B).
    2. Riproduci il file .m4v, spostando il cursore temporale avanti e indietro per ottenere una panoramica del filmato completo della curva di calibrazione di 1 ora.
    3. Identificare l'intervallo di tempo in cui le macchie di urina più piccole (<25 μL) hanno la massima intensità e si sono diffuse al massimo. Fai uno screenshot entro questo intervallo di tempo. Assegnare un nome al file di screenshot e salvarlo come file di .png (Figura 3A, pannello superiore).
      NOTA: le schermate vengono acquisite premendo il tasto F6. Per impostare F6 per l'acquisizione di screenshot, seleziona: Preferenze di Sistema > Tastiera > Scorciatoie e scrivi F6 nella casella che si trova a destra dell'opzione Salva immagine dello schermo come file .
    4. Identificare l'intervallo di tempo in cui le macchie di urina medie e grandi (>50 μL) hanno un'area massima e fare uno screenshot. È possibile che alcune delle macchie di urina più piccole non siano visibili nel momento in cui le macchie di urina più grandi mostrano la massima diffusione. Assegna un nome al file e salva lo screenshot come file di .png (Figura 3A, pannello inferiore).
    5. Aprire il software ImageJ (NIH) e quindi trascinare e rilasciare l'icona del file .png ottenuta nel passaggio 4.3.3 per aprire il file di immagine (Figura 4A).
    6. Dalla barra degli strumenti, selezionare l'icona Selezioni poligonali e delineare il bordo della carta da filtro.
    7. Quindi, seleziona Analizza dalla barra dei menu, scegli Imposta misure dal menu espanso e dalla finestra che si apre seleziona Area. Fare clic su OK. Ciò consente di ottenere valori di area quando viene eseguito il passaggio 4.3.8.
    8. Quindi, seleziona di nuovo Analizza dalla barra dei menu e scegli Misura dalle opzioni espanse. Viene visualizzata una finestra dei risultati contenente un'area di colonna che mostra i valori dell'area in pixel2 (Figura 4B-D).
    9. Selezionate l'icona Selezioni a mano libera (Freehand Selections) dalla barra degli strumenti e utilizzatela per tracciare una linea attorno al perimetro di un singolo punto vuoto. Misurare l'area come al punto 4.3.8. Il software aggiorna la tabella dei risultati man mano che vengono eseguite nuove misurazioni. Il nuovo set di numeri appare sotto i precedenti. Registrare il numero visualizzato sotto l'area della colonna della finestra dei risultati per ogni punto analizzato (Figura 4E-G).
    10. Ripetere i passaggi da 4.3.5 a 4.3.7 per ciascuno degli spot replicati.
    11. Impostare l'area totale della carta da filtro come 100% e calcolare la percentuale di area (area %) per ogni punto urinario. Questa normalizzazione correggerà gli errori che potrebbero verificarsi come conseguenza delle differenze nello zoom o nel posizionamento delle telecamere.
    12. Creare una nuova tabella XY in un programma grafico e inserire i valori del volume urinario (in μL) nella colonna X e i valori duplicati dell'area % nella colonna Y.
    13. Quindi, selezionate Analisi > Analizza > Analisi XY > Regressione non lineare (adattamento curva). Dalla finestra dei parametri visualizzata, selezionate Polinomio > modello > Polinomio del secondo ordine (quadratico).
    14. Quindi, dalla scheda metodo, fare clic per contrassegnare le seguenti selezioni: Regressione dei minimi quadrati, Nessuna ponderazione e considerare ogni replica del valore Y come un singolo punto.
    15. Nella scheda Vincolo selezionare B0, Tipo vincolo > Costante uguale a e digitare 0 nella colonna Valore. Fare clic su OK.

5. Analisi delle registrazioni sperimentali dei topi

  1. Aprire un filmato raccolto durante la fase di luce (fotocamera inferiore) o la fase scura (fotocamera superiore) per l'analisi.
  2. Valutare la qualità del file filmato spostando lo scorrimento temporale avanti e indietro, confermando che la carta da filtro rimanga intatta (senza strappi o masticazioni) durante la finestra temporale di 6 ore da analizzare. Se la carta è strappata, non eseguire ulteriori analisi, poiché il topo potrebbe aver urinato sulla plastica esposta che non può essere quantificata (Figura 5).
  3. Per analizzare gli esperimenti raccolti nelle fasi di luce o buio, utilizzare il comando di avanzamento rapido o il dispositivo di scorrimento della barra temporale per passare alla finestra temporale desiderata. L'attività di svuotamento durante la fase luminosa viene registrata tra le 11:00 e le 17:00 (ZT = 4,0-10,0) e durante la fase oscura tra mezzanotte e le 06:00 (ZT = 17,0-23,0).
  4. Riproduci il filmato in modalità di avanzamento rapido facendo clic sull'icona >> (o scorri manualmente il filmato), cercando la prova che il mouse si sta annullando. Il modo più semplice per dire che ciò sta accadendo è cercare l'improvvisa comparsa di macchie luminose di urina sulla carta da filtro. Un altro indicatore è quello di cercare cambiamenti comportamentali tra cui il movimento agli angoli della gabbia e un breve periodo di inattività quando il topo sta svuotando.
    NOTA: Man mano che si migliora il rilevamento dei vuoti, è possibile aumentare la velocità di scorrimento o avanzamento rapido. Tuttavia, nei topi con cistite batterica e indotta chimicamente, che hanno un numero molto elevato di piccoli vuoti 4,34, si possono perdere eventi svuotanti se ci si muove troppo velocemente attraverso il film.
  5. Registra l'ora in cui si verifica ogni vuoto. Come convenzione, il tempo del vuoto viene registrato al primo segno che viene rilevata l'urina (Figura 6A,B).
  6. Per effettuare misurazioni del vuoto, utilizzare prima la barra di scorrimento per spostarsi avanti (o indietro) nel tempo, cercando il punto nel tempo in cui si è verificata la massima diffusione della macchia urinaria. Mettere in pausa il filmato a questo punto e fare uno screenshot come descritto nel passaggio 4.3.3. Posizionare la freccia del mouse del computer nel punto in analisi, in modo che il punto di interesse sia contrassegnato nello screenshot (Figura 6C,D).
  7. Assegna un nome al file dello screenshot utilizzando numeri correlati per tenere conto dell'ordine di apparizione nel filmato.
  8. Continuare ad analizzare il file, ripetendo i passaggi 5.5 e 5.7 per ogni punto vuoto sul filmato. Una volta analizzati tutti i punti vuoti, misurare l'area totale della carta da filtro catturando uno screenshot e utilizzando i passaggi descritti al punto 4.3.6.
  9. Calcolare l'area % di ciascuna delle macchie di urina come descritto al punto 4.3.9. Trasformare i valori dell'area % in volume di urina (μL) per ogni punto vuoto utilizzando le curve di calibrazione generate nel passaggio 4 e la funzione di interpolazione nel software grafico.
    1. Nel software grafico, aprire la tabella XY contenente i dati della curva di calibrazione e inserire i valori dell'area % nella colonna Y sotto l'ultimo valore della curva di calibrazione (Figura 7A).
    2. Fate clic sulla scheda Tabella dei risultati e, nella scheda Modello, fate clic su per selezionare Interpola incognite (Interpolate Unknowns) da Curva standard (Standard Curve ), quindi premete OK. Una scheda denominata valori medi X interpolati viene visualizzata accanto alla scheda della tabella dei risultati. Questa scheda contiene una tabella con i valori interpolati che corrispondono al volume di urina in μL per ogni punto vuoto. (Figura 7A,B).
  10. Ripetere i passaggi da 5.1 a 5.9 per analizzare tutti i topi sperimentali.
  11. Creare un file di cartella di lavoro contenente i dati ottenuti dai passaggi da 5.5 a 5.10, utilizzando un foglio di calcolo per mouse (Figura 7C). Creare un file per gli esperimenti della fase di luce e un altro per quelli della fase oscura. Questi file master contengono tutti i dati grezzi e i calcoli necessari utilizzati in ulteriori analisi.

6. Analisi del pattern di minzione di topi sperimentali

  1. Generare profili spot vuoti primari e secondari (Figura 8A,B e Figura 9).
    NOTA: Secondo gli studi sulla distribuzione di frequenza 23, i punti vuoti che sono ≥20 μL rappresentano tipicamente il >95% del volume totale vuoto e sono considerati punti vuoti primari (PVS)8,23,35. Le macchie vuote che sono ≤20 μL sono considerate macchie vuote secondarie o piccole (SVS). La discriminazione tra PVS e SVS ha dimostrato di essere un approccio utile per caratterizzare i fenotipi minzionali. Un numero elevato di SVS indica una disfunzione minzionale35.
    1. Dal file master contenente i dati spot di minzione di interesse (fase chiara o fase oscura), classificare gli spot in base al loro volume come PVS quando il loro volume è ≥20 μL o SVS quando il loro volume è <20 μL.
    2. Contare il numero e calcolare il volume medio vuoto e il volume totale per i PVS. Contare il numero e calcolare il volume totale per gli SVS.
    3. Generare una barra grafica che confronta il controllo con i topi trattati per ciascuno dei parametri calcolati: numero di PVS, volume vuoto di PVS, volume totale di PVS, numero di SVS, volume totale di SVS.
  2. Facoltativo: genera un grafico cumulativo del volume vuoto (funzione scala) per mostrare il comportamento dello svuotamento nel tempo (Figura 10 e Figura 11).
    1. Aprire il file master della cartella di lavoro e convertire il tempo di annullamento, espresso in ore, minuti e secondi, nel formato decimale. Calcolare il volume cumulativo di urina (in μL) per ogni punto temporale.
    2. Genera una tabella XY nel software grafico con il tempo in forma decimale nella colonna X e i volumi cumulativi di urina nella colonna Y. Copiare i dati relativi al tempo e al volume delle urine nella tabella. Aggiungere punti dati (0; 0) e (6; valore massimo). Questi punti sono necessari per completare le linee orizzontali del grafico all'inizio dell'esperimento (tempo: 0 h) quando il volume vuoto è zero (0; 0), e alla fine dell'esperimento (tempo: 6 h) quando il valore cumulativo dell'urina vuota è uguale al valore ottenuto per l'ultimo evento di svuotamento (6; valore massimo).
    3. Fare doppio clic sul grafico; Dovrebbe apparire la finestra Formato grafico. Selezionate la scheda Aspetto (Appearance ), fate clic su per deselezionare il pulsante Mostra simboli (Show Symbols ), quindi fate clic su Mostra linea di connessione/curva (Show Connecting Line/Curve). Fai clic sull'opzione Stile e seleziona Sopravvivenza.

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Representative Results

Comportamento minzionale dei topi knockout uroteliali piezo1/2

Durante la fase di conservazione del ciclo di minzione, si ipotizza che l'urotelio percepisca la tensione esercitata dall'urina accumulata nella vescica e trasduca questo stimolo meccanico in risposte cellulari come il rilascio sieroso di ATP 1,3. Abbiamo precedentemente dimostrato che i canali PIEZO1 e PIEZO2 attivati meccanicamente sono espressi nell'urotelio di topo 3,36. Per determinare se i canali uroteliali PIEZO sono importanti per il normale comportamento minzionale, abbiamo eseguito RT-VSA su topi Piezo1/2 doppi knockout uroteliali condizionali (Pz1/2-KO) e controlli abbinati per età e sesso (Pz1/2-C; Figura 9). Abbiamo testato topi femmina e maschio per 6 ore durante le fasi buie e chiare del giorno e abbiamo analizzato i dati come descritto nel passaggio 6.1. Quando abbiamo confrontato l'attività di svuotamento tra le fasi chiare e scure del giorno per i gruppi di controllo, è stato notato che sia le femmine che i maschi hanno mostrato un aumento del numero e del volume totale di PVS durante il loro periodo attivo. Questa osservazione indica che, anche se i topi si trovavano in un ambiente estraneo, la natura circadiana del comportamento minzionale del topo (più alta durante la loro fase oscura attiva) è stata preservata. Durante la loro fase di luce inattiva, non abbiamo osservato differenze significative in nessuno dei parametri analizzati per topi Pz1/2-KO femmina o maschio rispetto alle controparti di controllo (Pz1/2-C). Tuttavia, quando abbiamo testato gli animali durante la fase oscura attiva, sia i topi Pz1/2-KO femmine che quelli maschi hanno mostrato un fenotipo minzionale alterato, caratterizzato da un aumento significativo del numero e del volume totale di SVS (Figura 9). Non ci sono state differenze significative nel numero di PVS, nel volume medio per PVS o nel volume totale di PVS in Pz1/2-KO femminile o maschile rispetto ai controlli corrispondenti. Questi risultati indicano che i canali uroteliali PIEZO1/2 non svolgono un ruolo significativo nella funzione minzionale durante la fase di luce inattiva del topo, ma sono importanti nel prevenire frequenti spotting durante la loro fase scura attiva.

I risultati presentati nella Figura 9 illustrano due dei vantaggi dell'impiego di RT-VSA rispetto all'endpoint VSA. In primo luogo, se l'analisi fosse stata eseguita solo durante la fase di luce, avremmo erroneamente concluso che i canali uroteliali PIEZO1/2 non avevano alcun ruolo nella funzione minzionale. In secondo luogo, nella maggior parte degli studi VSA sugli endpoint, le SVS sono state trattate come rumore sperimentale e in alcuni casi escluse dall'analisi successiva23. Nell'RT-VSA, abbiamo potuto determinare che gli SVS erano eventi individuali, non secondari ai PVS (carryover o end micturition dribbling) ed erano volontari nel senso che gli animali si spostavano alla periferia della gabbia, svuotati e poi lasciati. Questa osservazione ci ha fornito preziose informazioni sul fenotipo dei topi Pz1/2-KO che altrimenti sarebbero stati persi.

Comportamento minzionale di topi femmina in condizioni basali e dopo trattamento con ciclofosfamide

In questo esperimento pilota, abbiamo testato gli effetti della ciclofosfamide (CYP) sul comportamento di minzione volontaria del topo. La ciclofosfamide, un farmaco usato per trattare alcune forme di cancro o disturbi immunologici, è nota per causare cistite nei pazienti e negli animali da esperimento, con conseguente fenotipo della vescica iperattiva caratterizzato da multipli, piccoli eventi minzionali 26,37,38. Per determinare il comportamento minzionale di base, abbiamo posizionato un topo femmina non trattato nell'RT-VSA durante la fase oscura. Lo stesso topo è stato iniettato per via intraperitoneale con una dose di CYP (150 mg/kg) 5 giorni dopo per causare cistite acuta. Immediatamente dopo l'iniezione, il mouse è stato posto in una gabbia RT-VSA per la registrazione. Il comportamento dello svuotamento è rappresentato in un grafico a gradini (Figura 11), con le linee verticali che rappresentano il volume di urina svuotata e le linee orizzontali che rappresentano il tempo. Rispetto ai risultati ottenuti in condizioni basali, è evidente che la quantità di urina rilasciata per vuoto è minore dopo il trattamento con CYP e che gli eventi di minzione sono molto più frequenti. Questo può essere meglio apprezzato nell'inserto del grafico, dove i primi 30 minuti del periodo analizzato (corrispondenti a mezzanotte alle 00:30 [da 7,0 a 7,5 h dopo l'iniezione]) sono ingranditi.

Figure 1
Figura 1: La camera di registrazione RT-VSA. (A) Il sistema di registrazione RT-VSA comprende una parte superiore, che comprende due camere acriliche trasparenti affiancate e telecamere superiori associate. La metà inferiore del dispositivo è un supporto a singola unità che contiene le camere superiori del mouse e contiene le telecamere inferiori e le luci UV. L'interno delle pareti dello stand è costituito da pannelli a specchio che riflettono la luce UV per fornire un'illuminazione uniforme sul fondo delle gabbie. Non raffigurato è un computer che riceve un feed video dalle telecamere e registra i dati. (B) Modello della camera del mouse con componenti e dimensioni. 1) cerniera di sollevamento standard; 2) staffa di montaggio della telecamera; e 3) staffa angolare di transizione leggera. Vista frontale (C) e superiore (D) del supporto UV con componenti e dimensioni. Le luci UV sono montate all'interno dei profili anteriore e posteriore con piastre piane dritte. Per montare le telecamere viene utilizzato un profilo da 32 pollici fissato al telaio principale del supporto con due staffe angolari di transizione lite. Le piastre piane dritte vengono utilizzate per collegare le telecamere al profilo da 32 pollici. Un pannello a specchio è montato all'interno del supporto (non mostrato). 1) piastra piana a T a cinque fori; 2) piastra piana a T a cinque fori; e 3) piastre piane L a cinque fori. Tutti i valori presentati sono espressi in pollici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Camera del mouse RT-VSA. Prima delle procedure sperimentali, ogni camera sperimentale del topo viene preparata foderandola con un pezzo di carta da filtro (numerato 1). A seconda del periodo della giornata in cui viene eseguito l'esperimento, la carta da filtro utilizzata è spessa (fase scura) o sottile (fase chiara). Una cupola di plastica è posta al centro della camera (numerata 2), un piatto di plastica con acqua (sotto forma di gel d'acqua non bagnante) e chow è posto su un lato della cupola (numerato 3), e un tubo di micro-centrifuga di plastica da 1,5 ml, una forma di arricchimento, è posto sul lato opposto (numerato 4). La disposizione iniziale degli elementi all'interno della gabbia è mantenuta coerente in tutti gli esperimenti. Si noti che un pezzo di carta da filtro è posto tra le due gabbie vicine ed è contrassegnato nella figura con un asterisco. Questo per prevenire l'influenza di segnali visivi derivanti dal mouse vicino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Curva di calibrazione. Immagini rappresentative di carte da filtro spesse (A, pannelli di sinistra) e sottili (B, pannello di sinistra) macchiate con quantità note di urina di topo. Le immagini sono schermate di registrazioni video ottenute utilizzando le fotocamere superiore (A, pannelli di sinistra) o inferiore (B, pannello di sinistra). Le frecce rosse indicano le macchie di urina da 2 μL e i numeri sotto le macchie sono i valori del volume spot in μL. Si noti che le piccole macchie di urina (<50 μL) nell'immagine superiore del pannello A che sono visibili poco dopo la macchia di urina (5 min) non sono più visibili dopo 30 minuti (pannello inferiore). Pannelli di destra: grafico dell'area spot vuota (espressa come percentuale dell'area totale della carta da filtro) in funzione del volume di urina. Come notato da altri, i dati dell'area spot vuota in funzione del volume di urina non seguono una relazione lineare30. Quindi, adattiamo i dati a un polinomio del secondo ordine usando la regressione non lineare. I dati sono stati vincolati in modo tale che X = 0 a Y = 0. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Determinazione della carta da filtro e delle aree spot urinarie utilizzando ImageJ. (A) Uno screenshot della curva di taratura mostrata nella figura 3A aperta nell'immagine J. La regione ricasella in (A) è mostrata più dettagliatamente in (B). (B) L'icona delle selezioni dei poligoni è selezionata (cerchiata in rosso) per disegnare un poligono lungo il perimetro della carta da filtro (vista parziale; linea gialla con frecce rosse che puntano ai nodi generati dallo strumento selezioni). (C) L'area del poligono riflette l'area totale della carta da filtro e viene misurata selezionando Analizza > Misura (cerchio rosso). (D) Il valore dell'area (in pixel) appare in una finestra dei risultati (cerchio rosso). (E) Per misurare l'area di un singolo punto vuoto, viene scelto lo strumento di selezione a mano libera (cerchio rosso) e in (F) viene utilizzato per tracciare una linea attorno al bordo del punto (la freccia rossa punta al punto). Utilizzando lo stesso comando di (C), viene misurata l'area del punto vuoto, con il risultato che appare come un nuovo valore nella finestra dei risultati, immediatamente sotto l'ultima misurazione effettuata (pannello G, cerchio rosso). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Valutazione dello stato della carta da filtro dopo aver terminato gli esperimenti RT-VSA. Immagini rappresentative della camera del topo che mostrano diverse condizioni della carta da filtro durante o dopo un esperimento RT-VSA. La carta da filtro rimasta intatta fino alla fine del periodo di prova è indicata in (A) e rappresenta la situazione più comune e la condizione in cui un esperimento può essere ulteriormente analizzato (segno di spunta verde). Esempi di carta da filtro danneggiata sono mostrati in (B) e (C) e sono rappresentativi di esperimenti che non devono essere ulteriormente analizzati (X rossa). In (B), la carta da filtro è stata triturata dal mouse (freccia rossa) in uno degli angoli. La linea gialla tratteggiata segna il bordo del pavimento della gabbia. L'area riposta viene ingrandita nell'immagine a destra. In (C), l'integrità dell'esperimento è stata compromessa a causa del fatto che il gel d'acqua non bagnante (freccia rossa) è stato spostato dal topo nell'angolo, lasciando tre grandi macchie d'acqua (asterischi rossi). Questi movimenti sono stati confermati guardando il video. Le immagini sono screenshot di file di filmati ottenuti durante la fase oscura, utilizzando la fotocamera superiore e con la gabbia rivestita con carta da filtro spessa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Determinazione del tempo di svuotamento e acquisizione di schermate per le misurazioni dell'area spot vuota. (A,B) Screenshot di un mouse in un angolo della sua camera, con un punto vuoto che è appena diventato visibile. L'ora di questo fotogramma è annotata come tempo di annullamento. (C,D) Una volta che il punto vuoto raggiunge la massima diffusione, viene fatto uno screenshot per determinare il volume del vuoto. Le immagini sono schermate da file di filmati ottenuti con la fotocamera superiore, utilizzando carta da filtro spessa e durante la fase oscura. Il periodo di analisi è stato da mezzanotte alle 06:00. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Trasformazione dell'area del punto vuoto in volume di urina e generazione di un file del foglio di lavoro con dati grezzi sperimentali. (A) Schermata della finestra del software grafico che mostra i valori per i punti vuoti espressi come percentuale dell'area totale della carta da filtro (dati indicati in verde). Il foglio di lavoro (freccia verde) viene salvato nella sezione tabelle dati. (B) Conversione della percentuale di superficie totale in volume di urina (dati riportati in rosso). Questi ultimi valori sono mostrati nella sezione dei risultati (freccia rossa) e sono calcolati dalla curva di calibrazione utilizzando le incognite interpolate dalla funzione curva standard. (C) Screenshot di un foglio di lavoro con dati grezzi e calcolati compilati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Classificazione dei punti vuoti in PVS e SVS e loro analisi. Schermate di fogli di lavoro (generati come mostrato nella Figura 7C) da un topo in condizioni basali (A) e 7 ore dopo aver ricevuto una dose di ciclofosfamide (150 mg/kg) (B). Le macchie vuote sono classificate come macchie vuote primarie (PVS) se il volume è ≥20 μL, o come piccole macchie vuote (SVS) se il volume è <20 μL. Si noti che nel topo non trattato (A), tutti gli eventi di minzione sono PVS, mentre nell'animale trattato con ciclofosfamide, la maggior parte dei vuoti sono SVS. La tabella cerchiata in ogni pannello (contorno rosso) include le seguenti statistiche di riepilogo: numero di vuoti, volume medio annullato e volume totale vuoto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Comportamento svuotante dei topi knockout e di controllo Piezo1/2 . Il comportamento minzionale dei topi femmina (A) e maschio (B) Piezo1/2 knockout (Pz1/2-KO) e delle controparti di controllo ( Pz1/2-C ) è stato registrato durante una finestra temporale di 6 ore durante la fase buia o chiara del giorno e i risultati sono stati analizzati come descritto nella fase 6.1. I dati sono indicati come media ± errore standard della media (S.E.M.). I dati sono stati confrontati utilizzando un test di Mann-Whitney. Abbreviazioni: PVS = punti vuoti primari; SVS = piccole macchie vuote; NS = non significativo; * p < 0,05; ** p < 0,01. Questa cifra è stata modificata da3. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 10
Figura 10: Fogli di lavoro per il calcolo e la rappresentazione grafica del volume cumulativo annullato in funzione del tempo. (A) Screenshot del foglio di lavoro generato nella figura 7C che mostra i calcoli necessari per generare un grafico della funzione scala del volume cumulativo di urina svuotata in funzione del tempo. L'ora deve essere inserita in formato decimale (colonna G, quadrato rosso). Per trasformare l'ora in formato decimale, sono state aggiunte tre colonne (frecce rosse) a destra della colonna dell'ora di svuotamento per annotare separatamente i valori di ore (colonna D), minuti (colonna E) e secondi (colonna F) e il risultato finale del tempo in formato decimale (colonna G). Per trasformare l'annullamento del tempo in un formato decimale, utilizzare la seguente funzione: (h) + (min/60) + (s/3.600). È stata aggiunta una colonna a destra della colonna del volume di urina, per visualizzare il volume cumulativo di urina (rettangolo blu), calcolato come la somma di tutti i volumi di urina (colonna J) ottenuti fino al momento di un nuovo evento di svuotamento (incluso il nuovo valore dell'evento). (B) Screenshot che mostra i dati copiati dal foglio di lavoro nel pannello A e incollati nella colonna X (ora in formato decimale) e nella colonna Y (volumi cumulativi di urina) in un progetto software grafico. Il primo e l'ultimo punto temporale del grafico sono impostati su 0 e 6 (valore massimo) righe come indicato dalle frecce rosse. (C) Per generare un grafico a passi, il grafico viene formattato deselezionando il campo Mostra simboli, abilitando l'opzione Mostra linea/curva di collegamento e selezionando lo stile di sopravvivenza, come mostrato nei campi cerchiati in rosso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 11
Figura 11: Risultati rappresentativi del comportamento minzionale del topo in condizioni basali o dopo somministrazione di ciclofosfamide. Il comportamento di minzione volontaria di un topo è stato valutato da RT-VSA durante la fase oscura prima (basale) e 7 ore dopo la somministrazione di ciclofosfamide (CYP), come descritto nei risultati rappresentativi. L'ora e il volume degli eventi di svuotamento sono rappresentati in un grafico a passi generato come descritto nel passaggio 6.2. L'inserto del grafico rappresenta l'area del grafico contrassegnata da un rettangolo verde e corrisponde ai primi 30 minuti del periodo analizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 12
Figura 12: Identificazione di macchie urinarie sovrapposte mediante RT-VSA. Screenshot di fotogrammi video catturati con la fotocamera superiore nella fase oscura di un esperimento RT-VSA (immagini 1 e 2). La regione riposta nell'immagine 2 è ingrandita nell'immagine 3. Il mouse si è svuotato nello stesso angolo in alto a destra altre due volte durante le ore successive (immagini 4-6). Nonostante la sovrapposizione di punti vuoti, i singoli eventi di svuotamento sono stati prontamente rilevati utilizzando RT-VSA. Per visualizzare come questi eventi apparirebbero come un test finale, abbiamo esposto l'angolo della carta da filtro a diverse condizioni di illuminazione. Sotto la luce ambientale visibile, è stato possibile identificare solo un singolo, grande punto vuoto (immagine 7). Allo stesso modo, se questa stessa regione è stata esaminata sotto luce UV, solo una singola macchia scura era distinguibile (immagine 8). Pertanto, più vuoti nella stessa regione sono prontamente rilevati da RT-VSA, ma tale discriminazione non è possibile se l'analisi viene eseguita come test end-point. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

L'incorporazione del video-monitoraggio è una modifica economica che presenta diversi vantaggi rispetto al VSA classico. Nel VSA classico, che viene tipicamente utilizzato come test end-point, è difficile distinguere punti vuoti sovrapposti. Questa non è una preoccupazione banale, poiché i topi tendono a urinare più volte nella stessa area quando il test viene prolungato per diverse ore, in genere negli angoli della loro gabbia. Pertanto, il primo vantaggio di RT-VSA è che lo sperimentatore può facilmente identificare i singoli punti che sono stati depositati parzialmente o totalmente uno sopra l'altro. Questo è ben illustrato nell'esperimento mostrato nella Figura 12. In questo caso, la registrazione video conferma che il mouse si è svuotato tre volte nello stesso angolo, depositando punti vuoti sovrapposti. Se la carta da filtro veniva analizzata solo alla fine dell'esperimento, nel modo tipico di un VSA, si poteva distinguere un solo punto. Quindi, mentre il classico VSA endpoint può essere utile per identificare grandi differenze nel comportamento minzionale, potrebbe non riuscire a discriminare tra fenotipi più sottili. Con gli attuali progressi della genetica e la generazione di animali transgenici, lo sviluppo di metodi in grado di valutare con precisione il comportamento minzionale è essenziale.

In secondo luogo, RT-VSA fornisce allo sperimentatore informazioni temporali sugli eventi di svuotamento. Pertanto, è possibile determinare le vere frequenze di minzione, nonché stabilire relazioni tra eventi di minzione. Ad esempio, in una situazione in cui un gruppo di SVS è osservato accanto a un singolo grande PVS, nel VSA classico, non si può facilmente discriminare se il topo ha svuotato più volte durante l'esperimento (con tre piccoli e un grande vuoto) o se l'animale ha depositato un grande volume di urina, e le tre macchie più piccole sono il risultato di dribbling post-minzione o trascinamento dalla pelliccia. RT-VSA può essere utilizzato per rispondere a queste domande.

In terzo luogo, RT-VSA consente di analizzare il comportamento di un mouse prima, durante e dopo l'evento di minzione. Lo sperimentatore può anche monitorare il profilo di attività complessivo del mouse analizzando le registrazioni RT-VSA con software liberamente disponibili come Mouse Behavior Tracker39. Inoltre, si può discriminare se un animale si ferma a urinare (comportamento tipico delle femmine), se l'animale è in movimento durante lo svuotamento (che nei maschi può provocare la scia di punti vuoti), o se si svuota durante la sua fase di sonno / riposo. Abbiamo osservato quest'ultimo comportamento, anche se normalmente è raro. Pertanto, se adeguatamente convalidato e interpretato, osservare il comportamento minzionale può fornire allo sperimentatore preziose informazioni sulla disfunzione minzionale, tra cui, ad esempio, la nicturia o l'incontinenza. RT-VSA (e VSA) consente agli investigatori di determinare la frazione di eventi vuoti che si verificano nell'area centrale di una gabbia, rispetto agli angoli. Normalmente, lo svuotamento del centro è raro e l'aumento del numero di tali eventi è un segno di disfunzione della vescica 8,22. L'unica eccezione sono i maschi alfa dominanti, che urinano frequentemente e attraverso l'intero recinto20. Per eseguire un'analisi dello svuotamento centrale utilizzando RT-VSA, si dovrebbe considerare di spostare il piatto di cibo su una parete laterale e rimuovere la cupola (o fissarla in una particolare regione della gabbia), in modo che i modelli spaziali di minzione possano essere stabiliti più facilmente.

In quarto luogo, RT-VSA consente di gestire in modo più efficace le sollecitazioni associate allo scambio di gabbie rispetto al VSA classico. I topi sono schivi per natura e maneggiarli o trasferirli in un nuovo ambiente provoca stress, che è noto per influenzare il comportamento minzionale35. Per sua natura, è difficile incorporare un periodo di acclimatazione nello standard VSA. Al contrario, in RT-VSA, un periodo di acclimatazione può essere facilmente incorporato in ogni esperimento e qualsiasi evento di minzione durante questo periodo ignorato durante l'analisi. Un ulteriore aspetto antistress di RT-VSA implementato in questo protocollo è la duplicazione delle condizioni in cui i topi sono normalmente alloggiati (cioè l'accesso a cibo e acqua ad libitum, una cupola e un giocattolo). Questo è, per quanto ne sappiamo, uno degli ambienti più ricchi descritti per questo tipo di esperimento. In un tipico endpoint VSA, i topi sono privati dell'acqua (e talvolta anche del cibo)8,22, che forniamo ad libitum.

In quinto luogo, oltre all'effetto positivo che questo ambiente arricchito può avere sui livelli di stress dei topi, consente allo sperimentatore di eseguire RT-VSA per lunghi periodi di tempo, tipicamente in finestre temporali di 6 ore; Tuttavia, più recentemente abbiamo eseguito esperimenti che funzionano per 24 ore (dati non mostrati). Questo è ideale quando si valutano gli effetti della ritmicità circadiana o quando si studiano topi che possono mostrare un fenotipo della vescica iperattiva e quindi urinare raramente.

Per il monitoraggio video 24 ore su 24, si consiglia di utilizzare carta da filtro sottile e analizzare gli esperimenti utilizzando le telecamere inferiori. Questa combinazione di tipo di carta e fotocamera è l'opzione migliore che consente la sensibilità del rilevamento nelle fasi di buio e luce. Come accennato in precedenza, le telecamere inferiori non sono in grado di rilevare facilmente i punti vuoti sulla spessa carta da filtro e le fotocamere superiori non rilevano in modo affidabile i punti vuoti durante la fase luminosa. Se si eseguono queste analisi estese, suggeriamo di posizionare gli animali nelle gabbie di registrazione alle 17:00, analizzando dalle 18:00 del giorno 1 e completando l'esperimento alle 18:00 del giorno successivo.

Mentre RT-VSA ha molti aspetti positivi, ci sono alcuni avvertimenti degni di nota. Mentre facciamo ogni sforzo per limitare lo stress quando eseguiamo queste analisi, non possiamo replicare completamente l'habitat del topo, poiché gli animali sono normalmente ospitati in gruppo. Bevono anche acqua da una bottiglia invece di ottenere acqua da gel d'acqua non bagnante. Tuttavia, la nostra osservazione che i topi hanno meno vuoti durante la loro fase di luce inattiva rispetto alla loro fase oscura attiva ci indica che i topi mantengono i loro normali modelli di comportamento minzionale circadiano40. Riflettendo la loro natura facilmente stressata, abbiamo scoperto che i topi mostrano un comportamento svuotante interrotto nei giorni di pulizia della gabbia. Pertanto, è necessario limitare l'analisi ai periodi di tempo in cui gli animali saranno meno influenzati dalla zootecnia di routine. Un fattore importante da considerare è se la luce UV ha un impatto sulla funzione di svuotamento. Poiché i nostri risultati mostrano una netta differenza circadiana nei parametri VSA tra fasi chiare e scure, che sono coerenti con altre tecniche che descrivono un fenomeno simile ma non utilizzano la luce UV40, concludiamo che l'illuminazione della luce UV non influisce sulla funzione di svuotamento. Si noti che la carta da filtro impedisce alla luce di passare dalla camera inferiore alla camera superiore.

Un ulteriore avvertimento è che più a lungo si tengono i topi nella camera, più è probabile che mastichino o danneggino la carta da filtro (indipendentemente dallo spessore della carta). Mentre nessuno degli animali ha interrotto la carta durante la fase di luce, quasi il 30% dei topi ha danneggiato la carta durante la fase attiva scura. Nell'analisi degli esperimenti di 24 ore, abbiamo osservato che una proporzione simile (un terzo) degli esperimenti non poteva essere analizzata a causa di danni alla carta, il che significa che non solo la quantità di tempo, ma anche la fase del giorno influisce sul comportamento di triturazione dell'animale. Sfortunatamente, nella nostra esperienza, abbiamo notato che un animale che distrugge la carta della gabbia continuerà a farlo anche dopo aver ri-testato. Come notato sopra, i topi a volte urinano sul pavimento acrilico nudo, e quindi la perdita della carta rende l'analisi incompleta e di valore limitato.

Inoltre, l'analisi del comportamento minzionale maschile può essere più difficile in quanto tendono a svuotarsi più frequentemente, possono dribblare dopo svuotare e c'è una popolazione di maschi (20%) con un fenotipo alfa-maschio più aggressivo caratterizzato da un gran numero di piccoli vuoti che sono distribuiti attraverso la gabbia, come discusso in una precedente pubblicazione3. Poiché questo comportamento del maschio alfa può costituire un fattore confondente per stabilire fenotipi minzionali, escludiamo dall'analisi gli animali con ≥50 (esperimenti in fase luminosa) o ≥100 (esperimenti in fase oscura).

Ci sono situazioni in cui la discriminazione dei vuoti in base al loro volume (ad esempio, PVS vs SVS) non è necessariamente giustificata. Ad esempio, nella nostra esperienza, i topi con cistite batterica o chimica tendono a svuotare volumi più piccoli rispetto ai controlli 4,34. Tuttavia, ci sono grandi differenze nel volume vuoto tra i singoli topi; in alcuni, la maggior parte dei vuoti ha un volume ≤20 μL, mentre in altri la maggior parte è >20 μL. Di conseguenza, la discriminazione del volume annullato non fornisce alcun vantaggio per la caratterizzazione di questi fenotipi.

In sintesi, RT-VSA è uno strumento facile da implementare per analizzare il comportamento di minzione del mouse in mouse liberamente mobili. A differenza di strumenti come la cistometria, non richiede l'impianto chirurgico di un catetere o tassi non fisiologici di riempimento della vescica. Consente la determinazione del comportamento minzionale in entrambi i sessi di topi, per lunghi periodi di tempo e durante le fasi chiare e oscure del ciclo diurno. È anche relativamente conveniente, soprattutto se confrontato con dispositivi più specializzati e costosi come le gabbie metaboliche. Mentre ci sono avvertimenti associati a questo strumento, sono generalmente facili da gestire. Infine, questa tecnica potrebbe essere facilmente adattata ad altre specie animali, compresi altri roditori.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NIH R01DK119183 (a G.A. e MDC), un premio per un progetto pilota attraverso P30DK079307 (a M.G.D.), un premio per lo sviluppo della carriera dell'American Urology Association e una sovvenzione della Winters Foundation (a NM), e dal Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores del Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

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References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621 (2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327 (2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1 (2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070 (2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509 (2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160 (2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111 (2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230 (2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314 (2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450 (2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1 (2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79 (2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89 (2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26 (2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128 (2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939 (1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548 (2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31 (2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653 (2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101 (2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170 (2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449 (2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73 (2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303 (2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

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Retrazione Numero 192 Void spot assay Vescica urinaria funzione minzionale minzione cistometria
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Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

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