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Behavior

Ensaio de ponto vazio em tempo real

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64621
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,2
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

Summary

Este artigo descreve um novo método para estudar o comportamento miccional de camundongos incorporando o monitoramento de vídeo no ensaio convencional de ponto vazio. Essa abordagem fornece informações temporais, espaciais e volumétricas sobre os eventos miccionais e detalhes do comportamento do camundongo durante as fases clara e escura do dia.

Abstract

O comportamento miccional normal é o resultado da função coordenada da bexiga, da uretra e dos esfíncteres uretrais sob o controle adequado do sistema nervoso. Para estudar o comportamento miccional voluntário em modelos de camundongos, os pesquisadores desenvolveram o void spot assay (VSA), um método que mede o número e a área de manchas de urina depositadas em um papel de filtro que reveste o chão da gaiola de um animal. Embora tecnicamente simples e barato, este ensaio apresenta limitações quando usado como um ensaio de desfecho, incluindo a falta de resolução temporal dos eventos miccionais e dificuldades em quantificar manchas de urina sobrepostas. Para superar essas limitações, desenvolvemos um VSA videomonitorado, que chamamos de VSA em tempo real (RT-VSA), e que nos permite determinar a frequência miccional, avaliar o volume miccional e os padrões miccionais e fazer medições ao longo de janelas de tempo de 6 h durante as fases escura e clara do dia. O método descrito neste relato pode ser aplicado a uma ampla variedade de estudos baseados em camundongos que exploram os aspectos fisiológicos e neurocomportamentais da micção voluntária em estados de saúde e doença.

Introduction

O armazenamento de urina e a micção são coordenados por um circuito central (sistema nervoso central) que recebe informações sobre o estado de enchimento vesical através dos nervos pélvico e hipogástrico. O urotélio, o epitélio que reveste o trato urinário da pelve renal até a uretra proximal, forma uma barreira apertada aos resíduos metabólicos e patógenos presentes na urina. É um componente integrante de uma teia sensorial, que detecta e comunica o estado de enchimento da bexiga aos tecidos subjacentes e nervos aferentes 1,2. A ruptura da barreira urotelial ou alterações nas vias de mecanotransdução urotelial podem levar à disfunção miccional associada a sintomas do trato urinário inferior, como frequência, urgência, noctúria e incontinência 3,4,5,6,7. Da mesma forma, sabe-se que o envelhecimento, o diabetes, as infecções do trato urinário inferior, a cistite intersticial e outros processos patológicos que afetam a bexiga urinária, ou o circuito associado que controla sua função, causam disfunção vesical 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Uma melhor compreensão do comportamento miccional normal e anormal depende do desenvolvimento de métodos que possam discriminar de forma confiável entre os diferentes padrões de micção.

Tradicionalmente, o comportamento miccional voluntário de camundongos tem sido estudado por meio do void spot assay (VSA), desenvolvido por Desjardins e colaboradores20, e amplamente adotado devido à sua simplicidade, baixo custo e abordagem não invasiva8,21,22,23,24. Esse ensaio é tipicamente realizado como um ensaio final, no qual um camundongo passa um tempo definido em uma gaiola forrada por um papel de filtro, que é posteriormente analisado contando o número e avaliando o tamanho das manchas de urina quando o papel de filtro é colocado sob luz ultravioleta (UV) (as manchas de urina fluorescem nessas condições)20. Apesar dessas muitas vantagens, a ASV tradicional apresenta algumas limitações importantes. Como os camundongos frequentemente urinam nas mesmas áreas, os investigadores têm que restringir a duração do ensaio a um período de tempo relativamente curto (≤4 h)25. Mesmo quando a VSA é realizada em períodos de tempo mais curtos, é quase impossível resolver pequenas manchas miccionais (SVSs) que caem sobre grandes manchas vazias ou, discriminar SVSs do transporte de urina aderida à cauda ou patas. Também é muito difícil distinguir se as SVS são consequência de eventos miccionais frequentes, mas individuais (fenótipo frequentemente observado em resposta à cistite4,26), ou devido ao gotejamento pós-miccional (fenótipo associado à obstrução vesical 27). Além disso, o desejo de completar o ensaio durante o horário de trabalho, juntamente com as dificuldades de acesso às instalações habitacionais quando as luzes são apagadas, muitas vezes limita esses ensaios ao período de luz do ciclo circadiano de 24 horas. Assim, essas restrições de tempo impedem a avaliação do comportamento miccional de camundongos durante sua fase noturna ativa, diminuindo a capacidade de analisar genes específicos ou tratamentos que são governados por ritmos circadianos.

Para superar algumas dessas limitações, pesquisadores desenvolveram métodos alternativos para avaliar o comportamento miccional em tempo real 26,28,29,30,31,32. Algumas dessas abordagens envolvem o uso de equipamentos de alto custo, como gaiolas metabólicas26,28,29, ou o uso de câmeras térmicas30; no entanto, estes também têm limitações. Por exemplo, em gaiolas metabólicas, a urina tende a aderir aos fios do chão de malha e às paredes do funil, reduzindo a quantidade de urina que é coletada e medida. Assim, pode ser difícil coletar dados com precisão sobre pequenos vazios. Além disso, as gaiolas metabólicas não fornecem informações sobre a distribuição espacial dos eventos miccionais (i.e., micção nos cantos vs. no centro da câmara). Dado que a radiação infravermelha de comprimento de onda longo utilizada pelas câmeras termográficas não penetra nos sólidos, a atividade miccional avaliada pela videotermografia deve ser realizada em um sistema aberto, o que pode ser desafiador com camundongos ativos, pois eles podem saltar vários centímetros no ar. Outro sistema é a abordagem automatizada de mancha anulada sobre papel (aVSOP)33, que consiste em papel de filtro enrolado que enrola a uma velocidade constante abaixo do piso de malha de arame de uma gaiola de mouse. Essa abordagem evita danos no papel e a sobreposição de manchas de urina que ocorrem no VSA clássico, e sua implementação permite que o investigador realize experimentos ao longo de vários dias. No entanto, não fornece ao investigador o momento preciso dos eventos miccionais, e não há capacidade de examinar o comportamento e como ele se correlaciona com a mancha. Para obter essas informações, pesquisadores incorporaram o videomonitoramento aos ensaios miccionais, uma abordagem que permite a avaliação simultânea da atividade do camundongo e dos eventos miccionais31,32. Uma abordagem consiste na colocação de um diodo emissor de luz azul (LED) e uma câmera de vídeo com um filtro de proteína de fluorescência verde sob a gaiola experimental para visualizar os eventos miccionais, e um LED infravermelho e uma câmera de vídeo acima da gaiola para capturar a posição do mouse32. Esta configuração tem sido usada para monitorar o comportamento miccional durante a realização de fotometria de fibra; No entanto, o ambiente iluminado desse sistema exigiu que os pesquisadores tratassem seus camundongos com um agente diurético para estimular a micção. Em outro desenho experimental, câmeras grande angulares foram colocadas acima e abaixo da gaiola experimental para visualizar eventos de atividade motora e micção de camundongos, respectivamente. Nesse caso, manchas de urina depositadas em um papel de filtro que reveste o chão da gaiola foram reveladas iluminando o papel filtro com luzes UV colocadas sob a gaiola31. Essa configuração foi utilizada em ensaios curtos, com 4 min de duração, durante a fase leve do dia, para estudar os neurônios do tronco encefálico envolvidos no comportamento miccional voluntário31. A adequação deste sistema para seu uso durante a fase escura ou por períodos de tempo >4 min não foi relatada.

Neste artigo, é descrito um método que aprimora o VSA tradicional, permitindo o monitoramento de vídeo de longo prazo do comportamento miccional do mouse. Essa abordagem custo-efetiva fornece informações temporais, espaciais e volumétricas sobre eventos miccionais por longos períodos de tempo durante as fases clara e escura do dia, juntamente com detalhes relacionados ao comportamento do camundongo 3,4,34. São fornecidas informações detalhadas para a construção das câmaras de micção, a implementação de um VSA em tempo real (RT-VSA) e a análise dos dados. O RT-VAR é valioso para pesquisadores que buscam compreender os mecanismos fisiológicos que controlam a função do sistema urinário, desenvolver abordagens farmacológicas para o controle da micção e definir as bases moleculares dos processos patológicos que afetam o trato urinário inferior.

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Protocol

Camundongos uroteliais Piezo1/2 double knockout (Pz1/2-KO, genótipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE+/-) e controles (Pz1/2-C, genótipo: Piezo1 fl/fl; Piezo2 fl/fl; Upk2CRE-/-) foram gerados internamente a partir de cepas parentais obtidas dos laboratórios Jax (cepa Piezo1 fl/fl # 029213; Piezo2 fl/fl cepa # 027720; Upk2CRE+/- cepa # 029281). Camundongos fêmeas (1,5–3 meses de idade e 17–20 g de peso) e machos (2–4 meses de idade e 23–29 g de peso) foram utilizados nos experimentos. Para os experimentos de cistite induzida por ciclofosfamida, foram utilizadas fêmeas selvagens C57Bl/6J (3 meses de idade e ~20 g de peso) (laboratórios Jackson, cepa # 000664). Os animais foram alojados e os experimentos foram realizados no Centro de Cuidados com Animais da Universidade de Pittsburgh sob a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Pittsburgh. Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes da Política do Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório e da Lei de Bem-Estar Animal.

1. Montagem de gaiolas para ensaio de ponto vazio em tempo real (RT-VSA)

  1. O equipamento RT-VSA consiste em um suporte UV que contém duas lâmpadas UV e duas câmeras grande angular (câmeras inferiores), que são usadas para registrar a atividade miccional durante a fase de luz do dia. Organize duas câmaras de mouse para descansar no suporte. Conecte câmeras grande angular (câmeras superiores) à tampa de cada câmara do mouse, usada para registrar a atividade miccional durante a fase escura do dia (Figura 1A).
  2. Construa a estrutura do suporte UV e das câmaras do mouse de 1 em x 1 em perfis de alumínio com fenda em T. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista dos componentes usados para construir duas câmaras de mouse e o suporte UV e a Figura 1B–D para obter as diferentes visualizações dos componentes e dimensões montados.
  3. Construa cada câmara de rato com oito perfis de alumínio com fenda em T cortados a 10 pol e quatro cortados a 14,75 pol. Comece montando o fundo da câmara do mouse e use fixadores de extremidade padrão (Tabela 1) para montar os perfis com fenda em T de acordo com a Figura 1. Monte o acrílico transmissor UV de 38,5 cm x 26,5 cm no canal interno dos perfis para construir o piso das câmaras do mouse.
    NOTA: Para obter informações detalhadas sobre como montar os perfis com fenda em T com fixadores de extremidade padrão, visite a página da empresa.
  4. Construa as paredes da câmara do mouse com o resto dos perfis. Monte os painéis de policarbonato resistente à abrasão (AR) de 38,5 cm x 21,5 cm e 26,5 cm x 21,5 cm nos perfis para montar as paredes externas da câmara do mouse. Use os painéis de policarbonato AR de 37,5 cm x 23,9 cm e 24,4 cm x 23,9 cm para construir o interior da câmara do mouse.
  5. Fixe os painéis de policarbonato AR com o fixador de extremidade padrão 1/4-20 da banda de rodagem. Consulte as instruções de como montar os painéis nos perfis na página da Web na NOTA da etapa 1.3. Utilize calafetagem de silicone comercial para vedar as junções entre os painéis internos.
  6. Utilizar dois perfis de 12 polegadas e dois perfis de 14,75 polegadas em T para montar a tampa da gaiola, conforme indicado na Figura 1B. Monte um painel de policarbonato AR de 38,5 cm x 26,5 cm no canal interno dos perfis para completar a tampa.
  7. Monte o suporte de perfil da câmera 12 em perpendicular aos eixos longos da parte superior da gaiola e fixe com dois suportes de transição leve dentro dos suportes de canto (marcados como 3 na Figura 1B). Use uma placa plana reta (marcada como 2) como suporte de montagem da webcam e monte-a como mostrado na Figura 1B. Conecte a câmera ao suporte com o parafuso de montagem da câmera.
  8. Use o conjunto da dobradiça de elevação padrão da série 10 para fixar a tampa ao corpo da câmara do mouse (marcado como 1 na Figura 1B).
  9. Construa o suporte UV com quatro perfis com fenda em T cortados para 40 pol, quatro perfis com fenda em T cortados para 32 polegadas e quatro perfis com fendas em T cortados para 10 pol, de acordo com a Figura 1C,D. Monte uma folha espelhada de acrílico de 82,5 cm x 26,5 cm nos perfis para construir o fundo da câmara UV.
  10. Use a folha espelhada de acrílico de 82,5 cm x 30,5 cm e 26,5 cm x 30,5 cm para construir a parede do suporte UV.
  11. Conecte as placas planas T de cinco furos da série 10 (marcadas com 2 na Figura 1 C), as placas planas de cinco furos L da série 10 (marcadas com 3 na Figura 1 C) e as placas planas de cinco furos da série 10 (marcadas com 1 na Figura 1C) para fixar o suporte UV.
  12. Monte as câmeras inferiores em um perfil com fenda em T cortado para 32 polegadas e afixe na parte inferior do suporte com dois suportes de canto de transição leves, conforme mostrado na Figura 1D. Use placas planas retas para conectar as webcams ao perfil com fenda em T.
  13. Monte as lâmpadas UV nos perfis interno, frontal e traseiro e fixe nas placas planas retas como mostrado na Figura 1D.
  14. Conecte as quatro webcams às portas USB de um computador executando um software de vigilância por vídeo.

2. Alojamento de animais antes da experimentação

  1. Camundongos experimentais domésticos, criados propositalmente ou obtidos de um sítio externo, em grupos de quatro. Quando possível, use camundongos fêmeas ou machos compatíveis com a idade para esses experimentos. Se os animais forem obtidos de uma fonte externa, deixe-os aclimatar-se durante pelo menos 7 dias antes de realizar quaisquer procedimentos experimentais.
  2. Durante todo o tempo em que permanecerem no biotério, alojar os animais em gaiolas padrão contendo cama e enriquecimento (por exemplo, iglu plástico, roda, pedaço de papel para trituração) e mantê-los sob um ciclo dia/noite de 12 horas, com acesso a água e ração seca ad libitum.

3. Registros de RT-VSA durante as fases clara e escura do dia

NOTA: O protocolo abaixo descreve o uso do RT-VSA para avaliar o comportamento miccional do camundongo durante as fases clara e escura do dia. Os animais são mantidos em um ciclo claro de 12 h e escuro de 12 h com tempo de Zeitgeber (ZT) = 0 às 07:00 h. As gravações iniciam-se entre 10:30h e 11:00h (ZT = 3,5–4,0) para os experimentos da fase clara e entre 18:00h e 18:30h (ZT = 11,0–11,5) para os experimentos da fase escura. Quando os animais são testados em ambas as condições, os experimentos são tipicamente realizados em dois dias separados, com pelo menos 5 dias consecutivos entre os testes claro e escuro. Os experimentos não devem ser realizados em dias em que os biotérios são limpos ou as gaiolas são trocadas, pois podem resultar em estresses que afetam o comportamento miccional. Todas as etapas devem ser realizadas em condições de estresse mínimo para os camundongos.

  1. Transportar os animais experimentais de seu alojamento para a sala de procedimentos onde estão localizadas as câmaras de registro RT-VSA.
  2. Preparação da câmara de gravação RT-VSA
    1. Coloque um pedaço de papel de filtro (24,3 cm x 36,3 cm) no fundo de cada gaiola de gravação RT-VSA. Dependendo da hora do dia, use papel de filtro fino (experimentos de fase clara) ou grosso (experimentos de fase escura).
      NOTA: O papel de filtro espesso é usado durante a fase escura ativa, pois é mais resistente à trituração do que o papel de filtro fino. As câmeras superiores são usadas para visualizar manchas de urina depositadas em papel de filtro espesso durante a fase escura. Em contraste, durante a fase de luz, as câmeras inferiores são usadas porque a luz ambiente impede que as câmeras superiores detectem manchas de urina depositadas no papel de filtro. Neste caso, utiliza-se papel de filtro fino. Descobrimos que as câmeras inferiores são ineficazes na detecção de pequenos eventos miccionais depositados em papel de filtro espesso.
    2. Em cima do papel de filtro, coloque os seguintes itens: um iglu de plástico (que oferece um espaço para dormir), um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL para fins de enriquecimento e um prato plástico de 60 mm x 15 mm contendo dois ou três pedaços de ração seca de camundongo e 14 a 16 g de água na forma de um pacote de gel (gel de água não umectante; Gráfico 2).
      OBS: O uso de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para fins de enriquecimento foi específico para o invólucro utilizado neste estudo.
    3. Quando as câmaras de gravação estiverem prontas, coloque delicadamente os ratos experimentais dentro deitando-os suavemente sobre o papel de filtro. Certifique-se de que a transferência dos animais da gaiola de alojamento para as gaiolas de gravação ocorra com o mínimo de estresse.
    4. Uma vez que todos os animais experimentais estejam dentro de suas gaiolas de registro, com suas tampas fechadas, cubra a parte superior das tampas com um bluepad de bancada absorvente para minimizar os reflexos diretos da luz ambiente na superfície da tampa de plexiglass.
    5. Acenda as luzes UV na câmara inferior.
      OBS: Os animais não têm contato direto com a luz UV. A luz UV recomendada é detalhada na seção de materiais.
  3. Gravações RT-VSA
    1. Para gravar vídeo das câmeras superior e inferior, use um software de gravação de vigilância por vídeo, que pode ser configurado para gravar a partir de várias webcams ou câmeras em rede ao mesmo tempo.
    2. Ao abrir o programa, inicie a gravação pressionando Command e R na janela do programa. Execute gravações de vídeo a uma taxa de 1 quadro por s.
    3. Imediatamente após iniciar as gravações, saia da sala, fechando a porta suavemente. Certifique-se de que a sala permaneça silenciosa durante toda a duração do experimento.
  4. Concluir gravações RT-VSA
    1. Retornar à sala de procedimentos após 7 h (experimentos de fase clara) ou na manhã seguinte (experimentos de fase escura).
    2. Pare as gravações pressionando Command e T. Desligue as luzes UV.
    3. Depois de interromper a gravação, o software gera automaticamente um arquivo de filme (em formato .m4v) para cada câmera e o salva sob o nome da câmera em uma pasta de destino selecionada anteriormente. Verifique se, dentro de cada pasta da câmera, os experimentos estão organizados em pastas por data.
    4. Em cada pasta de data/experimento, verifique se há um arquivo .m4v e todos os arquivos .jpeg individuais que correspondem a cada um dos quadros de filme.
    5. Observação : os arquivos .jpeg podem ser usados para recuperar o experimento no caso de arquivos de filme ficar corrompido.
    6. Crie uma pasta na área de trabalho com o nome e a data do experimento e transfira todos os arquivos .m4v para essa pasta. Se necessário, exclua os arquivos de .jpeg depois que os arquivos de filme forem salvos e copiados.
    7. NOTA: Para experimentos de fase clara, o software gerará um filme por câmera, enquanto para experimentos de fase escura, ele gerará dois filmes para cada câmera. Isso ocorre porque um novo arquivo .m4v é gerado após a meia-noite, quando a data é alterada.
    8. Copie a pasta que contém os filmes em uma unidade flash para análise em um computador externo. Esta etapa pode levar vários minutos e pode ser executada em paralelo com as etapas 3.5.1 a 3.5.3.
  5. Limpeza das gaiolas de gravação e transferência de camundongos experimentais de volta ao local de alojamento
    1. Retire o bluepad que cobre as tampas das gaiolas. Transfira os animais das gaiolas de gravação para a gaiola de alojamento.
    2. Remova os acessórios e alimentos nas câmaras de gravação (por exemplo, iglus de plástico, tubos de plástico, prato com restos de ração e gel de água e papel de filtro) e elimine-os em resíduos bioperigosos.
    3. Limpe as gaiolas usando um aspirador de mãos, removendo ração e pellets fecais presentes no fundo da gaiola. Em seguida, borrife o piso e as paredes internas da gaiola com etanol 70% e limpe o interior com um pedaço de pano macio. Deixe a tampa das gaiolas aberta para deixá-las secar ao ar.
    4. Coloque a gaiola de alojamento com os animais em um recipiente secundário e transporte os animais de volta ao seu local de alojamento.

4. Geração de curvas de calibração

NOTA: Uma curva de calibração é necessária para converter áreas de pontos miccionais em volumes de urina. Se realizar experimentos durante as fases clara e escura do dia, então duas curvas de calibração devem ser geradas, uma para cada tipo de papel de filtro usado (papéis de filtro finos e grossos). As curvas de calibração são geradas em duplicata. Cada réplica é executada em um papel de filtro colocado em uma câmara de gravação RT-VSA. Dada a sua composição complexa, e excitabilidade UV, use urina de rato para fazer as curvas de calibração.

  1. Coleta de urina de camundongo
    1. Pegue um pedaço de filme transparente flexível (10 cm x 15 cm) e coloque-o em um banco.
    2. Escolha um rato pelo rabo e aperte-o. Massageie suavemente o abdômen inferior para induzir a micção. Coletar urina na superfície da folha de plástico de filme transparente.
    3. Solte o animal suavemente dentro de sua gaiola. Usando uma pipeta, transfira a urina da superfície do filme transparente para um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL. Repita o procedimento com vários ratos até que ~10 mL de urina de camundongo sejam coletados, agrupe a urina e armazene a -20 °C.
      NOTA: Um total de ~10 mL de urina de camundongo é necessário para gerar curvas de calibração duplicadas para as fases clara e escura. Para evitar estresse em camundongos experimentais, não utilize camundongos que serão submetidos a experimentos de RT-VSA para coleta de urina.
  2. Gravações de curvas de calibração
    1. Descongele a urina coletada na etapa 4.1 e misture-a suavemente por 10 a 15 s.
    2. Coloque um pedaço de papel de filtro fino (24,3 cm x 36,3 cm) em cada uma das duas gaiolas de gravação RT-VSA.
    3. Pipetar os seguintes volumes de urina (em μL) em cada um dos papéis-filtro: 2, 5, 10, 25, 50, 80, 100, 200, 300, 400, 500 e 750. Para evitar a sobreposição de pontos como resultado da difusão, aloque os pontos a uma distância suficiente uns dos outros.
    4. Feche a tampa das gaiolas e cubra-as com almofadas.
    5. Inicie a gravação pressionando Command e R, aplicando os mesmos parâmetros de software usados para gravar os experimentos (passo 3.3.).
    6. Registrar a curva de calibração por 1 h para permitir a máxima difusão dos pontos urinários. Pressione Command e T para interromper a gravação.
    7. Crie uma nova pasta na área de trabalho, coloque os arquivos .m4v nela e transfira os dados para uma unidade flash para análise subsequente.
    8. Execute um procedimento semelhante para gerar curvas duplicadas com papel de filtro grosso. Neste caso, adicione camadas extras de almofadas para escurecer o interior e simular condições de fase escura.
  3. Análise dos registros da curva de calibração
    1. Abra os arquivos .m4v em um software de player de filme, maximizando a janela para preencher a tela. Para analisar as curvas de calibração realizadas em papel filtro grosso, utilize os arquivos obtidos com as câmeras superiores (Figura 3A). Para analisar as curvas de calibração realizadas em papel filtro fino, utilize os arquivos obtidos com as câmeras inferiores (Figura 3B).
    2. Reproduza o arquivo .m4v, movendo o controle deslizante de tempo para frente e para trás para obter uma visão geral do filme completo da curva de calibração de 1 h.
    3. Identifique o intervalo de tempo em que as manchas de urina menores (<25 μL) têm maior intensidade e se espalharam ao máximo. Tire uma captura de tela dentro desse intervalo de tempo. Nomeie o arquivo de captura de tela e salve-o como um arquivo .png (Figura 3A, painel superior).
      NOTA: As capturas de tela são feitas pressionando a tecla F6. Para configurar F6 para aquisição de capturas de tela, selecione: Preferências do Sistema > Atalhos de > de Teclado e escreva F6 na caixa localizada à direita da opção Salvar Imagem da Tela como Arquivo .
    4. Identifique o intervalo de tempo em que as manchas de urina médias e grandes (>50 μL) têm área máxima e faça uma captura de tela. É possível que algumas das manchas de urina menores não sejam visíveis no momento em que as manchas maiores de urina exibem difusão máxima. Nomeie o arquivo e salve a captura de tela como um arquivo .png (Figura 3A, painel inferior).
    5. Abra o software ImageJ (NIH) e arraste e solte o ícone de arquivo .png obtido na etapa 4.3.3 para abrir o arquivo de imagem (Figura 4A).
    6. Na barra de ferramentas, selecione o ícone Seleções de Polígono e delineie a borda do papel de filtro.
    7. Em seguida, selecione Analisar na barra de menus, escolha Definir medidas no menu expandido e, na janela exibida, selecione Área. Clique em OK. Isso permite obter valores de área quando a etapa 4.3.8 é executada.
    8. Em seguida, selecione Analisar novamente na barra de menus e escolha Medir nas opções expandidas. Uma janela de resultados aparece contendo uma área de coluna que mostra os valores de área no pixel2 (Figura 4B–D).
    9. Selecione o ícone Seleções à mão livre na barra de ferramentas e use-o para desenhar uma linha ao redor do perímetro de um ponto vazio individual. Meça a área como na etapa 4.3.8. O software atualiza a tabela de resultados à medida que novas medições são realizadas. O novo conjunto de números aparece abaixo dos anteriores. Registre o número que aparece sob a área da coluna da janela de resultados para cada ponto analisado (Figura 4E–G).
    10. Repita as etapas 4.3.5 a 4.3.7 para cada um dos pontos de replicação.
    11. Defina a área total do papel de filtro como 100% e calcule a porcentagem de área (% área) para cada ponto de urina. Essa normalização corrigirá erros que podem ocorrer como consequência de diferenças no zoom ou posicionamento das câmeras.
    12. Crie uma nova tabela XY em um programa gráfico e insira os valores de volume de urina (em μL) na coluna X e os valores duplicados de % de área na coluna Y.
    13. Em seguida, selecione Análise > Análise > análise XY > Regressão não linear (ajuste de curva). Na janela de parâmetros exibida, selecione Modelo > Polinômio > Polinômio de Segunda Ordem (quadrático).
    14. Em seguida, na guia método, clique para marcar as seguintes seleções: Regressão de Mínimos Quadrados, Sem Ponderação e Considere cada valor Y de Replicação como um ponto individual.
    15. Na guia restrição, selecione B0, Tipo de restrição > Constante igual a e digite 0 na coluna Valor. Clique em OK.

5. Análise dos registros experimentais de camundongos

  1. Abra um arquivo de filme coletado durante a fase clara (câmera inferior) ou escura (câmera superior) para análise.
  2. Avalie a qualidade do arquivo de filme movendo o rolador de tempo para frente e para trás, confirmando que o papel filtro permanece intacto (sem rasgar ou mastigar) durante a janela de tempo de 6 horas a ser analisada. Se o papel estiver rasgado, não faça análise adicional, pois o camundongo pode ter urinado no plástico exposto, o que não pode ser quantificado (Figura 5).
  3. Para analisar experimentos coletados nas fases clara ou escura, use o comando de avanço rápido ou o controle deslizante da barra de tempo para mover para a janela de tempo desejada. A atividade miccional durante a fase clara é registrada entre 11:00 e 17:00 horas (ZT = 4,0–10,0) e durante a fase escura entre meia-noite e 06:00 horas (ZT = 17,0–23,0).
  4. Reproduza o filme no modo de avanço rápido clicando no ícone de >> (ou role manualmente pelo filme), procurando evidências de que o mouse está anulando. A maneira mais fácil de saber que isso está ocorrendo é procurar o aparecimento repentino de pontos brilhantes de urina no papel de filtro. Outro indicador é procurar mudanças comportamentais, incluindo movimento para os cantos da gaiola e um breve período de inatividade quando o mouse está miccionando.
    NOTA: À medida que se torna melhor na detecção de vazios, pode-se aumentar a velocidade de rolagem ou encaminhamento rápido. No entanto, em camundongos com cistite bacteriana e quimicamente induzida, que têm um número muito grande de pequenos vazios 4,34, pode-se perder eventos miccionais se nos movermos muito rapidamente pelo filme.
  5. Registre o horário em que cada vazio ocorre. Como convenção, o tempo da micção é registrado ao primeiro sinal de que a urina é detectada (Figura 6A,B).
  6. Para fazer medições do vazio, primeiro use a barra de rolagem para avançar (ou retroceder) no tempo, procurando o ponto no tempo em que ocorreu a difusão máxima do ponto de urina. Pause o filme neste ponto e faça uma captura de tela conforme descrito na etapa 4.3.3. Coloque a seta do mouse do computador no ponto sob análise, para que o ponto de interesse seja marcado na captura de tela (Figura 6C,D).
  7. Nomeie o arquivo de captura de tela usando números correlativos para explicar a ordem de aparição no filme.
  8. Continue analisando o arquivo, repetindo as etapas 5.5 e 5.7 para cada ponto vazio no filme. Uma vez que todos os pontos vazios tenham sido analisados, meça a área total do papel filtro capturando uma captura de tela e usando os passos descritos em 4.3.6.
  9. Calcular a % de área de cada uma das manchas de urina, conforme descrito no passo 4.3.9. Transformar os valores de % de área em volume de urina (μL) para cada ponto de urina utilizando as curvas de calibração geradas na etapa 4 e a função de interpolação no software gráfico.
    1. No software gráfico, abra a tabela XY contendo os dados da curva de calibração e insira os valores de área % na coluna Y abaixo do último valor da curva de calibração (Figura 7A).
    2. Clique na guia Tabela de Resultados e, na guia modelo, clique para selecionar Interpolar Desconhecidos da Curva Padrão e pressione OK. Uma guia chamada valores médios X interpolados aparece ao lado da guia tabela de resultados. Esta guia contém uma tabela com os valores interpolados que correspondem ao volume de urina em μL para cada ponto de micção. (Figura 7A,B).
  10. Repita as etapas 5.1 a 5.9 para analisar todos os camundongos experimentais.
  11. Crie um arquivo de pasta de trabalho que contenha os dados obtidos das etapas 5.5 a 5.10, usando uma planilha por mouse (Figura 7C). Crie um arquivo para os experimentos de fase clara e outro para os experimentos de fase escura. Esses arquivos mestre contêm todos os dados brutos e cálculos necessários usados em análises posteriores.

6. Análise do padrão urinário de camundongos experimentais

  1. Gere perfis de pontos vazios primários e secundários (Figura 8A,B e Figura 9).
    OBS: De acordo com estudos de distribuição defrequência23, as manchas miccionais ≥20 μL tipicamente representam >95% do volume miccional total e são consideradas manchas miccionais primárias (SVPs)8,23,35. As manchas vazias com ≤20 μL são consideradas manchas secundárias ou pequenas manchas (SVSs). A discriminação entre SVPs e SVSs tem se mostrado uma abordagem útil para caracterizar fenótipos miccionais. Um número elevado de SVS indica disfunção miccional35.
    1. A partir do arquivo mestre contendo dados de pontos miccionais de interesse (fase clara ou fase escura), classifique as manchas com base em seu volume como PVSs quando seu volume é ≥20 μL, ou SVSs quando seu volume é <20 μL.
    2. Conte o número e calcule o volume médio esvaziado e o volume total para os PVSs. Conte o número e calcule o volume total para os SVSs.
    3. Gere uma barra gráfica que compare o controle com os camundongos tratados para cada um dos parâmetros calculados: número de PVSs, volume miccional de PVSs, volume total de PVSs, número de SVSs, volume total de SVSs.
  2. Opcional: Gere um gráfico de volume vazio cumulativo (função escada) para mostrar o comportamento miccional ao longo do tempo (Figura 10 e Figura 11).
    1. Abra o arquivo mestre da pasta de trabalho e converta o tempo de anulação, que é expresso em horas, minutos e segundos, na forma decimal. Calcular o volume cumulativo de urina (em μL) para cada ponto de tempo.
    2. Gere uma tabela XY no software gráfico com o tempo em forma decimal na coluna X e volumes de urina acumulados na coluna Y. Copie os dados de tempo e volume de urina para a tabela. Adicione (0; 0) e (6; valor máximo) pontos de dados. Esses pontos são necessários para completar as linhas horizontais do gráfico no início do experimento (tempo: 0 h), quando o volume miccionado é zero (0; 0), e no final do experimento (tempo: 6 h), quando o valor cumulativo da urina miccionada é igual ao valor obtido para o último evento miccional (6; valor máximo).
    3. Clique duas vezes no gráfico; A janela Formatar gráfico deve aparecer. Selecione a guia Aparência , clique para desmarcar o botão para Mostrar símbolos e clique para selecionar Mostrar linha/curva de conexão. Clique na opção Estilo e selecione Sobrevivência.

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Representative Results

Comportamento miccional de camundongos knockout uroteliais Piezo1/2

Durante a fase de armazenamento do ciclo miccional, hipotetiza-se o urotélio para detectar a tensão exercida pela urina acumulada na bexiga e transduzir esse estímulo mecânico em respostas celulares, como a liberação serosa de ATP 1,3. Demonstramos anteriormente que os canais de PIEZO1 e PIEZO2 ativados mecanicamente são expressos no urotélio de camundongos 3,36. Para determinar se os canais uroteliais PIEZO são importantes para o comportamento miccional normal, realizamos RT-VSA em camundongos urotelial-condicionais Piezo1/2 double knockout (Pz1/2-KO) e controles pareados por idade e sexo (Pz1/2-C; Gráfico 9). Testamos camundongos fêmeas e machos por 6 h durante as fases escura e clara do dia, e analisamos os dados conforme descrito na etapa 6.1. Quando comparamos a atividade miccional entre as fases clara e escura do dia para os grupos controle, notou-se que tanto fêmeas quanto machos apresentaram aumento no número e volume total de SVPs durante o período ativo. Essa observação indica que, embora os camundongos estivessem em um ambiente estranho, a natureza circadiana do comportamento miccional dos camundongos (mais alto durante sua fase escura ativa) foi preservada. Durante a fase de luz inativa, não observamos diferenças significativas em nenhum dos parâmetros analisados para camundongos Pz1/2-KO fêmeas ou machos quando comparados aos controles (Pz1/2-C). No entanto, quando testamos os animais durante a fase escura ativa, camundongos Pz1/2-KO fêmeas e machos apresentaram fenótipo miccional alterado, caracterizado por um aumento significativo no número e no volume total de SVSs (Figura 9). Não houve diferenças significativas no número de PVS, volume médio por PVS ou volume total de PVS em fêmeas ou machos Pz1/2-KO em comparação com seus controles correspondentes. Estes resultados indicam que os canais uroteliais PIEZO1/2 não desempenham um papel significativo na função miccional durante a fase de luz inativa em camundongos, mas são importantes na prevenção de manchas frequentes durante sua fase escura ativa.

Os resultados apresentados na Figura 9 ilustram duas das vantagens do emprego do VSA-TR em relação ao VSA final. Primeiro, se a análise fosse realizada apenas durante a fase leve, teríamos concluído erroneamente que os canais uroteliais de PIEZO1/2 não tinham nenhum papel na função miccional. Em segundo lugar, na maioria dos estudos de AVE de desfecho, as SVSs foram tratadas como ruído experimental e, em alguns casos, excluídas da análise subsequente23. No TR-VSA, pudemos determinar que as SVSs eram eventos individuais, não secundários aos SVPs (carryover ou end miction, driblamento) e eram voluntárias, no sentido de que os animais se deslocavam para a periferia da gaiola, esvaziavam e depois saíam. Essa observação nos forneceu informações valiosas sobre o fenótipo de camundongos Pz1/2-KO que, de outra forma, teriam sido perdidas.

Comportamento miccional de camundongos fêmeas sob condições basais e após tratamento com ciclofosfamida

Neste experimento piloto, testamos os efeitos da ciclofosfamida (CYP) no comportamento miccional voluntário de camundongos. Sabe-se que a ciclofosfamida, droga utilizada no tratamento de algumas formas de câncer ou distúrbios imunológicos, causa cistite em pacientes e animais de experimentação, resultando em um fenótipo vesical hiperativo caracterizado por múltiplos e pequenos eventos miccionais 26,37,38. Para determinar o comportamento miccional basal, colocamos uma rata fêmea não tratada no VSA-TR durante a fase escura. O mesmo camundongo foi injetado intraperitonealmente com uma dose de CYP (150 mg/kg) 5 dias depois para causar cistite aguda. Imediatamente após a injeção, o camundongo foi colocado em uma gaiola RT-VSA para gravação. O comportamento miccional é representado em um step plot (Figura 11), com as linhas verticais representando o volume de urina miccionada e as linhas horizontais representando o tempo. Comparando-se aos resultados obtidos em condições basais, fica evidente que a quantidade de urina liberada por micção é menor após o tratamento com CYP e que os eventos miccionais são muito mais frequentes. Isso pode ser melhor apreciado no inset do gráfico, onde os primeiros 30 min do período analisado (correspondendo à meia-noite às 00:30 [7,0 a 7,5 h após a injeção]) são ampliados.

Figure 1
Figura 1: Câmara de gravação RT-VSA. (A) O sistema de gravação RT-VSA inclui uma porção superior, que é composta por duas câmaras de acrílico transparentes lado a lado e câmeras superiores associadas. A metade inferior do dispositivo é um suporte de unidade única que mantém as câmaras superiores do mouse e contém as câmeras inferiores e luzes UV. O interior das paredes do suporte é feito de painéis de espelho que refletem a luz UV para fornecer iluminação uniforme para o fundo das gaiolas. Não é retratado um computador que recebe um feed de vídeo das câmeras e grava os dados. (B) Modelo da câmara do mouse com componentes e dimensões. 1) dobradiça de decolagem padrão; 2) suporte de montagem da câmera; e 3) suporte de canto de transição leve. Vista frontal (C) e superior (D) do suporte UV com componentes e dimensões. As luzes UV são montadas no interior dos perfis dianteiro e traseiro com placas planas retas. Um perfil de 32 polegadas preso ao quadro principal do suporte com dois suportes de canto de transição leve é usado para montar as câmeras. Placas planas retas são usadas para fixar as câmeras ao perfil de 32 polegadas. Um painel espelhado é montado no interior do suporte (não mostrado). 1) placa plana de tee de cinco furos; 2) placa plana em T de cinco furos; e 3) placas planas em L de cinco furos. Todos os valores apresentados são em polegadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Câmara do mouse RT-VSA. Antes dos procedimentos experimentais, cada câmara experimental do rato é preparada forrando-a com um pedaço de papel de filtro (numerado 1). Dependendo do período do dia em que o experimento é realizado, o papel de filtro utilizado é espesso (fase escura) ou fino (fase clara). Uma cúpula de plástico é colocada no centro da câmara (numerada 2), um prato de plástico com água (na forma de gel de água não umectante) e ração é colocado em um lado da cúpula (numerado 3), e um tubo de microcentrífuga de plástico de 1,5 mL, uma forma de enriquecimento, é colocado no lado oposto (numerado 4). A disposição inicial dos elementos dentro da gaiola é mantida consistente em todos os experimentos. Observe que um pedaço de papel filtro é colocado entre as duas gaiolas vizinhas e é marcado na figura com um asterisco. Isso é para evitar a influência de pistas visuais decorrentes do rato vizinho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Curva de calibração. Imagens representativas de papéis de filtro espessos (A, painéis esquerdos) e finos (B, painel esquerdo) detectados com quantidades conhecidas de urina de camundongo. As imagens são capturas de tela de gravações de vídeo obtidas usando as câmeras superior (A, painel esquerdo) ou inferior (B, painel esquerdo). As setas vermelhas apontam para as manchas de urina de 2 μL, e os números abaixo das manchas são os valores de volume do ponto em μL. Observe que as pequenas manchas de urina (<50 μL) na imagem superior do painel A que são visíveis logo após a detecção da urina (5 min) não são mais perceptíveis após 30 min (painel inferior). Painéis à direita: Gráfico da área do ponto vazio (expressa como a porcentagem da área total do papel de filtro) em função do volume de urina. Como observado por outros, os dados da área do ponto miccional em função do volume urinário não seguem uma relação linear30. Assim, ajustamos os dados a um polinômio de segunda ordem usando regressão não linear. Os dados foram restritos de tal forma que X = 0 a Y = 0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Determinação das áreas de papel de filtro e manchas na urina usando o ImageJ. (A) Uma captura de tela da curva de calibração mostrada na Figura 3A foi aberta no ImageJ. A região encaixotada em (A) é mostrada em mais detalhes em (B). (B) O ícone de seleções de polígonos é selecionado (circulado em vermelho) para desenhar um polígono ao longo do perímetro do papel de filtro (visualização parcial; linha amarela com setas vermelhas apontando para os nós gerados pela ferramenta de seleções). (C) A área do polígono reflete a área total do papel de filtro e é medida selecionando Analisar > Medir (círculo vermelho). (D) O valor da área (em pixels) aparece em uma janela de resultados (círculo vermelho). (E) Para medir a área de um ponto vazio individual, a ferramenta de seleções à mão livre é escolhida (círculo vermelho) e em (F) é usada para desenhar uma linha em torno da borda do ponto (a seta vermelha aponta para o ponto). Usando o mesmo comando de (C), a área do ponto vazio é medida, com o resultado aparecendo como um novo valor na janela de resultados, imediatamente abaixo da última medição realizada (painel G, círculo vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Avaliação do estado do papel de filtro após o término dos experimentos de RT-VSA. Imagens representativas da câmara do rato mostrando diferentes condições do papel de filtro durante ou após um experimento RT-VSA. O papel de filtro que permaneceu intacto até o final do período de teste é mostrado em (A) e representa a situação mais comum e a condição sob a qual um experimento pode ser analisado posteriormente (marca de verificação verde). Exemplos de papel de filtro danificado são mostrados em (B) e (C) e são representativos de experimentos que não devem ser analisados mais adiante (X vermelho). Em (B), o papel filtro foi triturado pelo mouse (seta vermelha) em um dos cantos. A linha amarela tracejada marca a borda do chão da gaiola. A região encaixotada é ampliada na imagem à direita. Em (C), a integridade do experimento foi comprometida como resultado do gel de água não umectante (seta vermelha) ser movido pelo mouse para o canto, deixando três grandes manchas de água (asteriscos vermelhos). Esses movimentos foram confirmados assistindo ao vídeo. As imagens são capturas de tela de arquivos de filmes obtidos durante a fase escura, usando a câmera superior e com a gaiola forrada com papel de filtro grosso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Determinação do tempo de micção e aquisição de screenshots para medidas da área do ponto vazio. (A,B) Captura de tela de um mouse em um canto de sua câmara, com um ponto vazio que acaba de se tornar visível. O tempo deste quadro é anotado como o tempo da micção. (C,D) Uma vez que o ponto vazio atinge a difusão máxima, uma captura de tela é feita para determinar o volume do vazio. As imagens são capturas de tela de arquivos de filme obtidos com a câmera superior, usando papel de filtro grosso e durante a fase escura. O período de análise foi da meia-noite às 06h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Transformação da área do ponto miccional em volume urinário e geração de um arquivo de planilha com dados brutos experimentais. (A) Captura de tela da janela do software gráfico mostrando os valores para pontos vazios expressos como a porcentagem da área total do papel de filtro (dados descritos em verde). A planilha (seta verde) é salva na seção de tabelas de dados. (B) Conversão da porcentagem da área total em volume urinário (dados descritos em vermelho). Estes últimos valores são mostrados na seção de resultados (seta vermelha) e são calculados a partir da curva de calibração usando incógnitas interpoladas da função de curva padrão. (C) Captura de tela de uma planilha com dados brutos e calculados compilados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Classificação dos pontos vazios em SVSs e SVSs e sua análise. Capturas de tela de planilhas (geradas como mostrado na Figura 7C) de um mouse em condições basais (A) e 7 h após receber uma dose de ciclofosfamida (150 mg/kg) (B). Os pontos vazios são classificados como pontos vazios primários (SVSs) se o volume for ≥20 μL, ou como pequenos pontos vazios (SVSs) se o volume for <20 μL. Note que no camundongo não tratado (A), todos os eventos miccionais são SVPs, enquanto no animal tratado com ciclofosfamida, a maioria dos vazios são SVSs. A tabela circular em cada painel (contorno vermelho) inclui as seguintes estatísticas de resumo: número de vazios, volume médio de micções e volume total de vazios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Comportamento miccional de camundongos Piezo1/2 knockout e controle. O comportamento miccional de camundongos fêmeas (A) e machos (B) Piezo1/2 knockout (Pz1/2-KO) e controles ( Pz1/2-C ) foi registrado durante uma janela de tempo de 6 h durante a fase escura ou clara do dia, e os resultados analisados conforme descrito na etapa 6.1. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (S.E.M.). Os dados foram comparados pelo teste de Mann-Whitney. Abreviações: PVSs = manchas vazias primárias; SVSs = pequenos pontos vazios; NS = não significante; * p < 0,05; ** p < 0,01. Este valor foi modificado de3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 10
Figura 10: Planilhas para o cálculo e representação gráfica do volume anulado acumulado em função do tempo. (A) Captura de tela da planilha gerada na Figura 7C exibindo os cálculos necessários para gerar um gráfico de função de escada do volume acumulado de urina miccionada em função do tempo. A hora deve ser inserida em formato decimal (coluna G, quadrado vermelho). Para transformar o tempo em formato decimal, três colunas (setas vermelhas) foram adicionadas à direita da hora de micção da coluna para anotar separadamente os valores de horas (coluna D), minutos (coluna E) e segundos (coluna F), e o resultado final do tempo em formato decimal (coluna G). Para transformar a micção de tempo em um formato decimal, use a seguinte função: (h) + (min/60) + (s/3.600). Uma coluna foi adicionada à direita da coluna de volume urinário, para exibir o volume cumulativo de urina (retângulo azul), que é calculado como a soma de todos os volumes urinários (coluna J) obtidos até o momento de um novo evento miccional (incluindo o novo valor do evento). (B) Captura de tela mostrando dados copiados da planilha no painel A e colados na coluna X (tempo em formato decimal) e coluna Y (volumes cumulativos de urina) em um projeto de software gráfico. O primeiro e o último ponto do gráfico são definidos como 0 e 6 (valor máximo) linhas, conforme indicado pelas setas vermelhas. (C) Para gerar um gráfico de passos, o gráfico é formatado desmarcando o campo mostrar símbolos, ativando a opção mostrar a linha de conexão/curva e selecionando o estilo de sobrevivência, como mostrado nos campos circundados em vermelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 11
Figura 11: Resultados representativos do comportamento miccional de camundongos em condições basais ou após a administração de ciclofosfamida. O comportamento miccional voluntário de camundongos foi avaliado por RT-VSA durante a fase escura antes (basal) e 7 h após a administração de ciclofosfamida (CYP), conforme descrito nos Resultados Representativos. O tempo e o volume dos eventos miccionais são representados em um gráfico de etapas que foi gerado conforme descrito na etapa 6.2. O inset do gráfico representa a área do gráfico marcada com um retângulo verde e corresponde aos primeiros 30 min do período analisado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 12
Figura 12: Identificação de manchas urinárias sobrepostas por RT-VSA. Capturas de tela de quadros de vídeo capturados com a câmera superior na fase escura de um experimento RT-VSA (imagens 1 e 2). A região in a box na imagem 2 é ampliada na imagem 3. O mouse foi esvaziado no mesmo canto superior direito duas vezes adicionais durante as horas seguintes (imagens 4–6). Apesar da sobreposição de manchas vazias, os eventos miccionais individuais foram prontamente detectados usando RT-VSA. Para visualizar como esses eventos apareceriam como um ensaio de endpoint, expomos o canto do papel de filtro a diferentes condições de iluminação. Sob luz ambiente visível, apenas um único grande ponto vazio pôde ser identificado (imagem 7). Da mesma forma, se essa mesma região fosse examinada sob luz UV, apenas uma única mancha escura era distinguível (imagem 8). Assim, múltiplos vazios em uma mesma região são prontamente detectados pelo RT-VSA, mas tal discriminação não é possível se a análise for realizada como um ensaio de desfecho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A incorporação da videomonitoração é uma modificação custo-efetiva que apresenta diversas vantagens em relação à VSA clássica. No VSA clássico, que é tipicamente usado como um ensaio de ponto final, é difícil distinguir pontos vazios sobrepostos. Esta não é uma preocupação trivial, pois os ratos tendem a urinar várias vezes na mesma área quando o ensaio é prolongado por várias horas, normalmente nos cantos de sua gaiola. Assim, a primeira vantagem do RT-VSA é que o examinador pode facilmente identificar pontos individuais que foram depositados parcial ou totalmente uns sobre os outros. Isso é bem ilustrado no experimento mostrado na Figura 12. Neste caso, a gravação de vídeo confirma que o mouse vaciou três vezes no mesmo canto, depositando pontos vazios sobrepostos. Se o papel-filtro fosse analisado apenas ao final do experimento, da maneira típica de um VSA, apenas um ponto poderia ser distinguido. Assim, embora o VSA clássico possa ser útil na identificação de grandes diferenças no comportamento miccional, ele pode falhar em discriminar fenótipos mais sutis. Com os avanços atuais na genética e na geração de animais transgênicos, o desenvolvimento de métodos que possam avaliar com precisão o comportamento miccional é essencial.

Em segundo lugar, o RT-VSA fornece ao examinador informações temporais sobre os eventos miccionais. Assim, pode-se determinar as verdadeiras frequências miccionais, bem como estabelecer relações entre os eventos miccionais. Por exemplo, em uma situação em que um aglomerado de SVSs é observado ao lado de um único PVS grande, no VSA clássico, não se pode facilmente discriminar se o camundongo miccionou várias vezes durante o experimento (com três pequenos e um grande vazio) ou se o animal depositou um grande volume de urina, e os três pontos menores são resultado de gotejamento pós-micção ou carryover de pelos.

Terceiro, o RT-VSA permite analisar o comportamento de um camundongo antes, durante e após o evento miccional. O investigador também pode monitorar o perfil de atividade geral do mouse analisando gravações RT-VSA com software disponível gratuitamente, como o Mouse Behavior Tracker39. Além disso, pode-se discriminar se um animal para para para urinar (comportamento típico das fêmeas), se o animal está em movimento durante a micção (o que nos machos pode resultar no rastreamento de manchas vazias) ou se ele urina durante sua fase de sono/repouso. Observamos este último comportamento, embora normalmente seja raro. Assim, se adequadamente validado e interpretado, observar o comportamento miccional pode fornecer ao investigador informações valiosas sobre a disfunção miccional, incluindo, por exemplo, nictúria ou incontinência. O RT-VSA (e o VSA) permite que os investigadores determinem a fração de eventos vazios que ocorrem na área central de uma gaiola, em oposição aos cantos. Normalmente, a micção central é rara, e o aumento do número desses eventos é um sinal de disfunção vesical 8,22. A única exceção são os machos-alfa dominantes, que urinam com frequência e em todos os seus recintos20. Para realizar uma análise da micção central usando RT-VSA, deve-se considerar mover a placa de alimento para uma parede lateral e remover a cúpula (ou fixá-la em uma região específica da gaiola), para que os padrões espaciais de micção possam ser mais prontamente estabelecidos.

Quarto, o RT-VSA permite gerenciar de forma mais eficaz as tensões associadas à troca de gaiolas em comparação com o VSA clássico. Os camundongos são esquisitos por natureza e manuseá-los ou transferi-los para um novo ambiente causa estresse, que é conhecido por afetar o comportamento miccional35. Por sua natureza, é difícil incorporar um período de aclimatação ao VSA padrão. Em contraste, no TR-VSA, um período de aclimatização pode ser facilmente incorporado em cada experimento, e quaisquer eventos miccionais durante esse período foram desconsiderados durante a análise. Um aspecto adicional de alívio de estresse do RT-VSA implementado neste protocolo é a duplicação das condições sob as quais os camundongos são normalmente alojados (ou seja, acesso a comida e água ad libitum, uma cúpula e um brinquedo). Este é, até onde sabemos, um dos ambientes mais ricos descritos para esse tipo de experimento. Em um desfecho típico VSA, camundongos são privados de água (e às vezes também de comida)8,22, que fornecemos ad libitum.

Em quinto lugar, além do efeito positivo que esse ambiente enriquecido pode ter sobre os níveis de estresse de camundongos, permite que o pesquisador realize RT-VSA por longos períodos de tempo, tipicamente em janelas de tempo de 6 h; no entanto, mais recentemente, temos realizado experimentos que duram 24 h (dados não mostrados). Isso é ideal ao avaliar os efeitos da ritmicidade circadiana ou ao estudar camundongos que podem apresentar um fenótipo de bexiga hipoativa e, portanto, urinar com pouca frequência.

Para monitoramento de vídeo 24 horas, recomendamos o uso de papel de filtro fino e análise dos experimentos usando as câmeras inferiores. Essa combinação de tipo de papel e câmera é a melhor opção que permite a sensibilidade de detecção nas fases escura e clara. Como mencionado anteriormente, as câmeras inferiores não podem detectar facilmente pontos vazios no papel de filtro espesso e as câmeras superiores não detectam de forma confiável pontos vazios durante a fase de luz. Caso sejam realizadas essas análises prolongadas, sugere-se a colocação dos animais nas gaiolas de registro às 17:00 horas, análise a partir das 18:00 horas do dia 1 e conclusão do experimento às 18:00 horas do dia seguinte.

Embora o RT-VSA tenha muitos aspectos positivos, há algumas ressalvas que merecem ser observadas. Embora façamos todos os esforços para limitar o estresse ao realizar essas análises, não podemos replicar completamente o habitat do rato, pois os animais normalmente são alojados em grupo. Eles também bebem água de uma garrafa em vez de obter água de gel de água não umectante. No entanto, nossa observação de que camundongos têm menos vazios durante sua fase de luz inativa versus sua fase escura ativa nos indica que os camundongos mantêm seus padrões normais de comportamento miccional circadiano40. Refletindo sua natureza facilmente estressada, descobrimos que os ratos exibem comportamento miccional interrompido nos dias de limpeza da gaiola. Assim, deve-se limitar a análise a períodos de tempo em que os animais serão menos impactados pela criação rotineira de animais. Um fator importante a considerar é se a luz UV tem algum impacto na função miccional. Como nossos achados mostram uma diferença circadiana distinta nos parâmetros da ASV entre as fases clara e escura, que são consistentes com outras técnicas que descrevem um fenômeno semelhante, mas não usando luz UV40, concluímos que a iluminação da luz UV não afeta a função miccional. Observe que o papel de filtro impede que a luz passe da câmara inferior para a câmara superior.

Uma ressalva adicional é que quanto mais tempo se mantém os ratos na câmara, maior a probabilidade de mastigar ou danificar o papel de filtro (independentemente da espessura do papel). Embora nenhum dos animais tenha interrompido o papel durante a fase clara, quase 30% dos camundongos danificaram o papel durante a fase ativa escura. Na análise dos experimentos de 24 h, observamos que uma proporção semelhante (um terço) dos experimentos não pôde ser analisada devido a danos no papel, o que significa que não só a quantidade de tempo, mas também a fase do dia afeta o comportamento de trituração do animal. Infelizmente, em nossa experiência, notamos que um animal que interrompe o papel da gaiola continuará a fazê-lo mesmo após novos testes. Como observado acima, ratos às vezes urinam no chão de acrílico nu e, portanto, a perda do papel torna a análise incompleta e de valor limitado.

Além disso, a análise do comportamento miccional masculino pode ser mais difícil, pois eles tendem a urinar com mais frequência, podem driblar após a micção e há uma população de homens (20%) com um fenótipo alfa-masculino mais agressivo, caracterizado por um grande número de pequenos vazios que se distribuem pela gaiola, como discutido em uma publicação anterior3. Como esse comportamento do macho-alfa pode constituir um fator de confusão para o estabelecimento de fenótipos miccionais, excluímos da análise animais com ≥50 (experimentos em fase clara) ou ≥100 (experimentos em fase escura).

Há situações em que a discriminação de vazios com base em seu volume (ou seja, PVS vs SVS) não é necessariamente justificada. Por exemplo, em nossa experiência, camundongos com cistite bacteriana ou química tendem a esvaziar volumes menores do que os controles 4,34. No entanto, existem grandes diferenças no volume miccionado entre camundongos individuais; em alguns, a maioria dos vazios tem um volume ≤20 μL, enquanto em outros a maioria é de >20 μL. Consequentemente, a discriminação do volume miccional não traz nenhuma vantagem para a caracterização desses fenótipos.

Em suma, o RT-VSA é uma ferramenta fácil de implementar para analisar o comportamento miccional do mouse em camundongos livremente móveis. Ao contrário de ferramentas como a cistometria, não requer implante cirúrgico de um cateter ou taxas não fisiológicas de enchimento vesical. Permite a determinação do comportamento miccional em ambos os sexos de camundongos, durante longos períodos de tempo e durante as fases clara e escura do ciclo diurno. Também é relativamente acessível, especialmente quando comparado a dispositivos mais especializados e caros, como gaiolas metabólicas. Embora existam ressalvas associadas a essa ferramenta, elas geralmente são fáceis de gerenciar. Finalmente, esta técnica pode ser facilmente adaptada a outras espécies animais, incluindo outros roedores.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma R01DK119183 de concessão do NIH (para G.A. e M.D.C.), um prêmio de projeto piloto através do P30DK079307 (para M.G.D.), um prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Associação Americana de Urologia e uma concessão da Fundação Winters (para N.M.), e pelo Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 10 inches 80/20 1010 Amount: 20
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 12 inches 80/20 1010 Amount: 6
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots –  cut to 40 inches 80/20 1010 Amount: 4
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches 80/20 1010 Amount: 12
1.00” X 1.00” T-Slotted Profile - Four Open T-Slots – cut to 32 inches 80/20 1010 Amount: 5
1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut 80/20 3280 Amount: 16
1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut 80/20 3287 Amount: 18
10 & 25 Series 2 Hole - 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support 80/20 14061 Amount: 6
10 Series 3 Hole - Straight Flat Plate 80/20 4118 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "L" Flat Plate 80/20 4081 Amount: 8
10 Series 5 Hole - "T" Flat Plate 80/20 4080 Amount: 8
10 Series 5 Hole - Tee Flat Plate 80/20 4140 Amount: 2
10 Series Standard Lift-Off Hinge - Right Hand Assembly 80/20 2064 Amount: 2
10 to 15 Series 2 Hole - Lite Transition Inside Corner Bracket 80/20 4509 Amount: 6
24”-long UV tube lights ADJ Products LLC T8-F20BLB24 Amount: 2
20W bulb – 24” Wavelength: 365nm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 1
82.5 cm x 26.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
26.5 cm X 30.5 cm
Acrylic Mirror Sheet Profesional Plastics Amount: 2
82.5 cm x 30.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 2
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm
AR polycarbonate (UV resistance) 80/20 65-2641 Amount: 4
4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm
Chromatography paper (thin paper)  Thermo Fisher Scientific 57144
Cosmos blotting paper (thick paper) Blick Art Materials 10422-1005
Excel Microsoft Corporation
GraphPad Prism GraphPad Software Version 9.4.0 graphing and statistics software
ImageJ FIJI NIH
Parafilm Merck transparent film
Quick Time Player 10.5 software  Apple multimedia player
Security spy Ben software video surveillance software system
Standard End Fastener, 1/4-20 80/20 3381 Amount: 80
UV transmitting acrylic Spartech Polycast Solacryl SUVT Amount: 2
38.5 cm x 26.5 cm 
Water gel: HydroGel ClearH2O   70-01-5022 (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam Logitech C930e Amount: 4

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References

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Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Wheeler, T. B., Apodaca, G., Carattino, M. D. Real-Time Void Spot Assay. J. Vis. Exp. (192), e64621, doi:10.3791/64621 (2023).

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