Summary
Bu protokol, optik koherens tomografi kullanılarak murin koroidine melanomun implantasyonu ve değerlendirilmesini tanımlamaktadır.
Abstract
Deneysel koroidal melanom modellerinin oluşturulması, tümörleri doğru lokalizasyonda indükleme yeteneği açısından zordur. Ek olarak, posterior koroidal melanomun in vivo olarak gözlemlenmesindeki zorluklar, tümör lokalizasyonunu ve büyüme değerlendirmesini gerçek zamanlı olarak sınırlar. Burada açıklanan yaklaşım, çok aşamalı bir alt koroidal B16LS9 hücre enjeksiyon prosedürü ile farelerde koroidal melanom oluşturmak için teknikleri optimize eder. Fare uveasının küçük boyutlarına enjeksiyonda hassasiyet sağlamak için, tüm prosedür mikroskop altında gerçekleştirilir. İlk olarak, gözün dorsal-temporal bölgesinde konjonktival bir peritomi oluşur. Daha sonra, maruz kalan skleradan bir iğne sokularak alt koroidal boşluğa bir yol oluşturulur. Bunu künt bir iğnenin kanala sokulması ve melanom hücrelerinin koroide enjekte edilmesi izler. Enjeksiyondan hemen sonra, tümörün lokalizasyonunu ve ilerlemesini belirlemek için noninvaziv optik koherens tomografi (OCT) görüntüleme kullanılır. Retina dekolmanı, tümör yeri ve boyutunun belirleyicisi olarak değerlendirilir. Sunulan yöntem, farelerde koroid lokalize melanomun tekrarlanabilir indüksiyonunu ve tümör büyüme değerlendirmesinin canlı görüntülenmesini sağlar. Bu nedenle, göz içi tümörleri incelemek için değerli bir araç sağlar.
Introduction
Üveal melanom (UM) erişkinlerde en sık görülen göz içi primer malignitedir. Oküler melanomların yaklaşık% 90'ı üveal sistem1'in koroid bölgesindeki melanositlerden kaynaklanır. UM, morbidite ve mortalitenin önemli bir nedenidir, çünkü hastaların% 50'sine yakınının metastatik hastalık geliştirdiği ve karaciğerin metastaz2'nin ana bölgesi olduğu tahmin edilmektedir. Primer lezyonların erken tedavisi metastaz olasılığını azaltabilir, ancak etkili bir tedavi metastaz oluşumunu engellemez3.
Üveal melanomun standart tedavisi, optik nöropati, retinopati, kuru göz sendromu ve katarakt nedeniyle görme kaybı ile ilişkili ışınlama tedavisini içerir. Cerrahi rezeksiyon tipik olarak lezyonun büyümesi tanınana ve karakterize edilene kadar ertelenir. Bununla birlikte, böyle bir gecikme metastatik hastalık gelişimine izin verebilir4. Bazı durumlarda, boşuna enükleasyon gereklidir. Tabii ki, bu radikal prosedür vizyonu tehlikeye atar ve dramatik estetik bozulmaya neden olur.
Üveal melanomu incelemek için deneysel modeller geliştirmeye adanmış birçok çaba gösterilmiştir. Bu malignitenin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan preklinik hayvan modelleri, üveal melanom için yeni tanı ve tedavi stratejilerinin araştırılmasında anahtardır. Oküler melanomun deneysel hayvan modelleri esas olarak farelerde, sıçanlarda ve tavşanlarda tümör hücrelerinin aşılanmasına dayanmaktadır 5,6. Fare modelleri uygun maliyetlidir ve hızlı üreme hızları ve insanlara yüksek genom benzerlikleri nedeniyle melanom çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Murin kutanöz melanom hücre hattı B16, C57BL6 farelerini aşılamak ve sinjenik tümörleri indüklemek için yaygın olarak kullanılır. Üveal melanomu indüklemek için bu modeli kullanırken, tümör taşıyan gözlerin tipik olarak aşılamadan 7-14 gün sonra enükleasyona tabi tutulması gerekir. Ayrıca, B16 oldukça invaziv bir modeldir. Gözün bağışıklık ayrıcalıklı doğası metastazı destekler ve metastazlar tipik olarak tümör hücresi aşılamasından 3-4 hafta sonra tespit edilebilir. Orijinal B16 çizgisinin alt kültürleri farklı metastatik özellikler gösterir6. Örneğin, Queens melanom hattı yüksek bir metastatik orana sahiptir 7,8. B16LS9 hücre hattı dendritik hücre morfolojisine sahiptir ve ebeveyn kutanöz melanom hattı B16F19 ile enjekte edilen C57BL / 6 farelerin karaciğer metastazlarından türetilmiştir. Gözün arka bölmesine enjekte edildiğinde, bu hücrelerin histolojik olarak insan üveal melanomuna benzeyen ve C57BL / 6'da karaciğere özgü metastazlar oluşturan, ancak Balb / C'de değil, fareler10,11,12'de karaciğere özgü metastazlar oluşturan göz içi tümörler oluşturduğu gösterilmiştir. Genetik olarak, hücreler, hepatosit büyüme faktörü13 için hücresel bir reseptör görevi gören c-met proto-onkogeninin daha yüksek ekspresyonu ile karakterize edilir. Buna karşılık, ebeveyn B16'nın 10. geçişi olan B16F10, göz içinden aşılandığında öncelikle akciğerlere metastaz yapar14. Hem B16F10 hem de B16LS9 pigmentlidir12.
Bazı önemli zorluklar murin üveal melanom modellerinin başarısını sınırlamaktadır. İlk olarak, tümör hücresi reflüsü ekstraoküler veya subkonjonktival melanoma yol açabilir. İkincisi, melanom hücrelerinin göz içi aşılamasından sonra tümör büyümesi genellikle oldukça değişkendir ve tedavi ve ilerlemeyi değerlendirmede zorluklar doğurur. Bir diğer önemli zorluk, tümör büyümesini in vivo olarak takip etme yeteneğinin sınırlı olmasıdır. Lusiferaz eksprese eden tümörler gibi biyolüminesan görüntüleme, oküler tümör büyümesini izlemek için yaygın olarak kullanılır15,16, tümörün göz içi yerleşimi hakkında bilgi sağlayamaz. Bu nedenle, tümörün değerlendirilmesi tipik olarak gözün enükleasyonunu takiben yapılır10,17. Bu, tümör progresyonunu ve tedavilere yanıtı kapsamlı bir şekilde karakterize etme yeteneğini büyük ölçüde sınırlar. Üveal melanomun incelenmesindeki bir diğer önemli engel, pigmentli farelerde lezyonların izlenmesindeki zorluktur. Bu zorlukların üstesinden gelen yeni yaklaşımlar, hayvan modellerinde üveal melanom araştırmalarını teşvik etmek için gereklidir.
Optik koherens tomografi (OCT), gözün farklı bölümlerine yüksek çözünürlükte derinlemesine görüntü vermek için ayırt edici yetenekler sağlar, bu da ultrason18,19 dahil olmak üzere diğer metodolojilerle benzersizdir. OCT görüntüleme, çeşitli oküler hastalıkları incelemek için hayvan modellerinde kullanılmıştır20. Son zamanlarda, OKT görüntülemenin göz içi tümör büyümesini değerlendirmek için noninvaziv bir araç olduğu gösterilmiştir21. Burada tarif edilen protokol, melanom hücrelerinin murin koroidine implantasyonunu ve hücre aşılaması sırasında göz içi tümör lokalizasyonunu ve boyutunu tahmin etmek için OCT'nin kullanımını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoldeki deneyler İsrail Ulusal Hayvan Deneyleri Konseyi tarafından onaylandı ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanılması için ARVO Beyanı'na uygun. Bu çalışma için 8-10 haftalık dişi C57BL/6 fareler kullanılmış ve 12/12 saatlik aydınlık-karanlık döngülerine maruz bırakılmıştır. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Hücre kültürü
- RPMI 1640 ortamındaki kültür B16LS9 hücreleri,% 10 fetal sığır serumu, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 25 mM HEPES,% 1 esansiyel vitamin karışımı,% 200 U / mL penisilin ve 200 mg / mL streptomisin ile desteklenmiştir (bakınız Malzeme Tablosu), % 5 CO2 ile nemlendirilmiş 37 ° C inkübatörde.
- Enjeksiyon için hücreleri% 70-80 birleşimde toplayın.
2. Hayvan hazırlama
- Ketamin (75 mg / kg vücut ağırlığı) ve medetomidin (0.5 mg / kg vücut ağırlığı) anestezik bir karışımı hazırlayın. Anestezik karışımı tek bir enjeksiyonda intraperitoneal olarak enjekte ederek fareleri uyuşturun.
- Her iki göze topikal oftalmik anestezik oksibuprokain (% 0.4) uygulayın.
- Topikal olarak tropikamid uygulayarak fare gözbebeklerini genişletin (% 0.5).
3. Subkoroidal boşluğa konjonktival peritomi ve skleral trakt oluşturulması
- Kurumayı önlemek için her iki göze de yağlayıcı olarak% 1.4 hidroksietilselüloz ( Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın. Sağ göze% 0.5 tropikamid uygulayın.
- Farenin çalışan gözünü bir çalışma mikroskobu altında gözlemleyin (bkz. Göz kapaklarını steril göz içi forseps ile açık tutun.
- Göz içi forseps kullanarak, süpero-temporal limbal konjonktivayı tutun ve infra-nazal pozisyona doğru çekin22. Bu pozisyonu tüm prosedür boyunca tutarak güvence altına alın (Şekil 1A).
- 30 G'lik bir iğne ucu kullanarak, dorsal-temporal bölgede, limbusun yaklaşık 1-2 mm arka tarafında küçük (1-2 mm) bir konjonktival peritomi yapın.
NOT: Daha ince iğnelerin kullanılması aşırı delinmeyi önleyebilir ve tümör yerinin daha iyi kesinleştirilmesini sağlayabilir. - Fazla Tenon kapsülünü peritominin açıklığından çıkarın.
NOT: Tenon kapsülü, göz küresini çevreleyen yoğun bir bağ dokusu tabakasıdır22. - Bu konumda, skleraya nüfuz etmek için iğne ucunu yerleştirin. Koroidin kahverengi rengi skleranın maruz kalan beyaz maddesinden görünene kadar alt koroidal boşluğa bir yol oluşturmak için bir eksizyon yapın (Şekil 1B).
Şekil 1: Tümör hücre aşılaması . (A) Süpero-temporal limbal konjonktiva, göz içi forseps kullanılarak tutulur ve burun altı pozisyona doğru çekilir. (B) 30 G'lik bir iğnenin ucu, skleraya nüfuz etmek için yerleştirilir ve alt koroidal boşluğa bir iz oluşturmak için eksizyon yapılır. (C) Hücrelerle yüklü ve 32 G'lik bir iğne ile monte edilmiş bir şırınga raya yerleştirilir ve hücreler enjekte edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
4. Melanom hücrelerinin aşılanması
- 2 μL PBS'de 70.000 B16LS9 hücresini yeniden askıya alın. Bu miktar göz başına tahmin edilir.
- Hücreleri, 45° açıyla bükülmüş 32 G künt iğne ile monte edilmiş steril bir 10 μL cam Hamilton şırıngasına (bkz. Malzeme Tablosu) yükleyin.
- Yüklenen şırınga iğnesini adım 3'te oluşturulan parçaya yaklaşık 2 mm yerleştirin.
- 2 μL hücre süspansiyonu enjekte edin.
- Enjeksiyondan sonra iğneyi tüm sıvı temizlenene kadar 2-3 saniye boyunca yerinde tutun.
- İzden sızıntıyı önlemek için iğneyi yavaşça ve yavaşça çekerek çıkarın (Şekil 1C).
NOTLAR: Enjeksiyonun hızını ve kuvvetini ayarlamak, tümör gelişim modelini etkileyebilir. Bu parametrelerin, uygulanan doğru kuvveti ve hızı belirlemek için deney yapan bireyler tarafından kalibre edilmesi önerilmektedir. Ön deneylerde toplam 70.000 hücre belirlendi. Bununla birlikte, hücre kültürü tiplerinde veya partilerinde veya fare suşları arasında farklılıklar olabileceğinden, bu sayının kalibrasyonu gereklidir.
5. Enjeksiyonun yerinin değerlendirilmesi
- Vitreus23'te retina dekolmanı (RD), retina hasarı ve / veya hücrelerin görünümünü tanımlamak için melanom hücre aşılamasından hemen sonra enjekte edilen gözü OCT taramalarıyla gözlemleyin.
NOTLAR: Tropikamid, oksibuprokain ve etilselülozu gerektiği gibi tekrar uygulayın. - Adım 5.1'deki OCT taramalarına dayanarak, RD desenleri21'i aşağıdakilere göre sınıflandırın: (1) RD'nin yerel RD-one bölgesi; (2) vitreustaki vitreus gözlemleyen hücre materyaline sızıntı; (3) RD'nin genişletilmiş RD-çoklu siteleri.
- Tümör lokalizasyonunu aşağıdakilere dayanarak tahmin edin: (1) lokal RD beklenen koroidal tümörler; (2) vitreustaki vitreus beklenen tümörlere sızıntı; (3) uzamış RD beklenen değişken ve dağınık tümörler (Şekil 2).
NOT: Sadece lokal RD'li farelerin (yaklaşık% 50) koroid ile sınırlı tümörler geliştirmesi beklenir.
6. RD yüksekliğine göre tümör boyutunu tahmin etme
- OCT segmentasyon/analiz yazılımı kullanarak OCT taramalarında yerel RD'nin yüksekliğini ölçün (bkz. Malzeme Tablosu) ve aşağıdaki gruplara göre sınıflandırın: küçük = <300 μm; orta = 300-400 μm; büyük = >400 μm.
- Tümörlerin enjeksiyondan sonraki 5 gün içinde ulaşması beklenen hacmi aşağıdaki kriterlere göre değerlendirin:
Küçük boyutlu tümörlerde tipik olarak küçük bir RD yüksekliği gözlenir (tümör hacmi 0.0059 mm 3 ila 0.07 mm3 arasında değişir ve ortalama hacim 0.027 ± 0.005 mm3'tür).
Hem küçük hem de orta büyüklükteki tümörlerde orta RD yüksekliği bulunur (tümör hacmi 0.015 mm 3 ila 0.15 mm 3 arasında değişir ve ortalama hacim 0.056 ± 0.016 mm 3'tür).
Büyük bir RD yüksekliği, 0.36 mm3'e kadar çok çeşitli tümör hacimleri ile ilişkilidir.
NOT: Beklenen tümör boyutları aralığı önceki sonuçlardan elde edildi ve küçük, orta ve büyük tümörlerden oluşan üç gruba ayrıldı.
7. Postoperatif işlemler
- Topikal olarak% 0.3 oftalmik ofloksasin uygulayın.
- Deri altına atipamezol hidroklorür (3 mg/kg) enjekte ederek anesteziyi tersine çevirin.
- Hayvanların ağrı ve ıstırabını azaltmak için 3 gün boyunca günde iki kez deri altından buprenorfin (0.05 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin.
- Melanom hücresi enjeksiyonundan 5 gün sonra, aşağıdaki adımları izleyerek tümör boyutunu değerlendirin.
- Fareleri adım 2.1'de açıklandığı gibi uyuşturun. Tropikamid uygulayın (% 0.5).
- Gözleri uzunlamasına ve sagital OCT taramaları ile inceleyin ve tümör hacmini ve lokalizasyonunu ölçmek için OCT segmentasyon / analiz yazılımı kullanın.
- 24 formülünü kullanarak tümör hacmini hesaplayın: V = a * b * c * 6 / π (sırasıyla a, b ve c = uzunluk, genişlik ve yükseklik).
- Tümör boyutunu her 2-3 günde bir 7.4.1-7.4.3 adımlarında açıklandığı gibi inceleyin.
NOT: Farklı fare suşları veya hücre çizgileri kullanılıyorsa yordam en iyi duruma getirilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gözler, B16LS9 hücrelerinin enjeksiyonundan hemen sonra OCT ile incelendi. Enjeksiyon sonrası lokal retina dekolmanı gözlendi. Fareler üç RD paterni sergiledi: fokal (Şekil 2, üst panel), vitreusa sızıntı (Şekil 2, orta panel) ve genişletilmiş RD (Şekil 2, alt panel). Uzatılmış RD muhtemelen enjeksiyondan kaynaklanan hasardan kaynaklanır. Enjeksiyondan hemen sonra RD paterni ile enjeksiyondan 5-7 gün sonra tümörlerin lokalizasyonu arasında bir ilişki vardı. Şekil 2'de gösterildiği gibi, fokal RD, koroid ile sınırlı olan tümör hücresi büyümesi ile ilişkiliydi. Bununla birlikte, fokal RD gösteren hayvanlarda enjeksiyondan sonra vitreustaki hücrelerin gözlenmesi, koroide ek olarak vitreal boşlukta tümör büyümesini göstermiştir. Son olarak, enjeksiyondan sonra uzamış RD veya birden fazla bölgede RD gözlendiğinde, tümörler 5 gün sonra koroid ve vitreus boyunca dağıldı. Önceki çalışmalar, tümörlerin OKT ile karakterizasyonunun histolojik inceleme ile tam olarak ilişkili olduğunu göstermiştir21.
Şekil 2: Subkoroidal hücre enjeksiyonunu takiben tümör büyümesinin OCT tabanlı tahmini. 2 μL PBS'de toplam 7 × 104 B16LS9 hücresi, fare gözlerinin alt koroid boşluğuna enjekte edildi. Enjeksiyon bölgesi hücre enjeksiyonundan hemen sonra OCT ve fundus görüntüleme ile görüntülendi (solda). Kesikli çizgiler, fokal RD'nin (üstte), vitreustaki hücre materyalinin (ortada) ve genişletilmiş RD'nin (altta) algılanmasını gösterir. Sağda, kesikli çizgiler enjeksiyondan 5 gün sonra tümör kütlesini gösterir. Bu rakam Zaks ve ark.21'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Bu modelde indüklenen tümör boyutlarının aralığı küçük, orta ve büyük olarak ayrılabilir (Şekil 3). Enjeksiyondan sonra RD'nin yüksekliği, yatay ve dikey OCT taramaları ile ölçüldüğü gibi, enjeksiyondan sonraki 5 gün içinde tümör boyutu ile ilişkiliydi (Şekil 4). Tümör boyutları ile ilişkili RD yükseklikleri Tablo 1'de gösterilmiştir.
Şekil 3: Tümör boyutunun belirlenmesi. Tümör büyümesi OCT taramaları (solda) ve aşılamadan 5-7 gün sonra fundusun gerçek zamanlı kamera görüntüsü (sağda) ile değerlendirildi. Küçük, orta ve büyük tümörlerin temsili görüntüleri gösterilmektedir. Bu rakam Zaks ve ark.21'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: OCT canlı görüntülemeye göre tümör boyutunun sınıflandırılması. Tümörler 7 × 104 B16LS9 hücresinin subkoroidal enjeksiyonu ile indüklendi. Tümör büyümesi canlı OKT görüntülemede enjeksiyondan hemen sonra ve 5 gün sonra değerlendirildi. (A) Enjeksiyondan sonra RD yüksekliğinin temsili bir OCT ölçümü (gün 0, sol, sarı çizgi yüksekliği gösterir), yatay bir OCT taramasında tümör yüksekliği ve genişliği (5. gün, orta, sarı çizgiler yükseklik ve genişliği gösterir) ve H&E lekeli göz bölümünün (sağ) ölçülmesi. Giriş: RD alanının fundus görüntüsü. (B) İndüklenen tümör boyutlarının aralığı üç gruba ayrıldı. Hücre enjeksiyonundan hemen sonra küçük (S, n = 15), orta (M, n = 9) veya büyük (L, n = 7) RD sunan farelerin tümör hacmi ölçümleri temsil edilir. *p < 0.05. Bu rakam Zaks ve ark.21'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| RD yüksekliği | Tümör hacmi |
| <300 μm (küçük) | 0,0059 mm 3 ila 0,07 mm 3 (ortalama 0,027 ± 0,005 mm3) |
| 300-400 μm (orta) | 0,015 mm 3 ila 0,15 mm 3 (ortalama 0,056 ± 0,016 mm3) |
| > 400 μm (büyük) | 0,05 mm 3 ila 0,36 mm 3 (ortalama 0,017 ± 0,06 mm3) |
Tablo 1: Tümör boyutu ile ilişkili RD yükseklikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Üveal melanom, yeni terapötik yaklaşımlara büyük ihtiyaç duyulan yıkıcı bir hastalıktır. Bununla birlikte, üveal melanom ve potansiyel tedaviler üzerine yapılan araştırmalar, üveal melanom hayvan modellerinin teknik zorlukları ile sınırlıdır 1,25. Kanser hücrelerinin göz içi enjeksiyonu ile indüklenen oküler tümörler, muhtemelen fare gözünün küçük boyutları nedeniyle, hem lokalizasyon hem de boyut bakımından oldukça değişkendir. Bu değişkenlik, tümör progresyonunun kapsamlı bir şekilde değerlendirilmesinin önünde bir engeldir. Burada açıklanan deneysel yaklaşım, canlı OCT görüntülemeye dayanarak subkoroidal B16LS9 melanom hücresi enjeksiyonundan hemen sonra göz içi tümör lokalizasyonunu ve tahmin edilen boyutu değerlendirmeye olanak tanır21. Yıllar geçtikçe, canlı görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi, sadece önceden tanımlanmış son noktalarda değil, deneyler boyunca tümör ilerlemesini takip etmeyi sağlayarak kanser araştırmalarında avantajlar sağlamıştır. Bu yöntemler, örneğin, oküler tümörlerin tanımlanması da dahil olmak üzere canlı hayvanlarda tümörlerin ve metastazların yerinin izlenmesini sağlayan muhabir hücreleri kullanan biyolüminesan görüntülemeyi içerir16. Bir diğer sofistike yöntem ise hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlayan ve melanom hücrelerini sağlıklı hücrelerden ayırt eden fotoakustik görüntülemedir26,27. Bununla birlikte, OKT'nin belirgin avantajı, tümörlerin göz içi lokalizasyonunu belirleme ve canlı hayvanlarda boyutlarını değerlendirme yeteneğidir.
Burada tarif edilen protokol, melanom hücrelerinin bir peritomi ve alt koroidal boşluğa bir yol oluşturarak göz içi aşılamasını, ardından künt bir iğnenin kanalın ucuna nazikçe sokulmasını ve hücre enjeksiyonunu göstermektedir. Bu, aşırı delinmeyi ortadan kaldırır ve hücre aşılamasının yerini yönlendirir. Enjeksiyon, geliştirilecek tümörün lokalizasyonunu ve boyutunu yansıtan retina dekolmanı indükler. Gözlemlerimiz, lokal bir RD pozisyonunda oluşan tümörlerin fokal olma eğiliminde olduğunu ve boyutlarının enjeksiyondan sonra RD'nin yüksekliğine karşılık geldiğini göstermektedir. Buna karşılık, çoklu RD'ler veya enjeksiyondan sonra vitreustaki hücrelerin tespit edilmesi, tipik olarak dağınık tümörlerle sonuçlanır21.
Fokal RD'nin, enjeksiyonun çoğu hücreyi belirli bir yerde sıkıştırdığını ve lokalize bir tümörün oluşumuna izin verdiğini yansıtması akla yatkındır. Öte yandan, birden fazla RD bölgesi, enjeksiyonun retina boyunca çeşitli yerlere ulaştığını ve tümör hücrelerinin çok sayıda bölgeye implante edilme ve dağınık tümörler oluşturma olasılığını artırdığını ima eder.
Enjeksiyondan hemen sonra lokalizasyonun ve tahmin edilen tümör boyutunun değerlendirilmesi, spesifik faktörlerin veya potansiyel tedavilerin etkisini incelemek gibi tümör progresyonlarını değerlendirirken özellikle önemlidir. Erken belirleme, homojen bir çalışma grubunun dahil edilmesine izin verebilir, modelin tekrarlanabilirliğini artırabilir, böylece çalışmanın doğruluğunu artırabilir ve değerli zaman ve maliyetlerden tasarruf sağlayabilir. Ayrıca, göz içi tümörlerin OCT görüntülemesi, canlı hayvanlardaki tümörlerin hem yeri hem de büyüklüğü hakkında doğru bilgi sağladığından, fareler, örneğin metastazları değerlendirmek için uzun süreli deneyler için izlenebilir. Melanomun fare modellerindeki bir diğer zorluk, C57BL / 6 farelerde olduğu gibi fare pigmentasyonunun genellikle pigmentli tümörlerin analizini kısıtlamasıdır. Bu nedenle, OCT görüntülemenin bir diğer avantajı, pigmentasyondan bağımsız olması ve pigmentli farelere veya lezyonlara uygulanabilmesidir.
Fare suşu, hücre hattı veya enjeksiyon tekniği gibi çeşitli parametrelerin tümör başlangıcını ve büyümesini etkileyebileceği unutulmamalıdır. Bu nedenle, modelin belirli suşlar veya hücreler için optimizasyonu önerilir. Sekonder kataraktın zamanlagelişebileceği de düşünülmelidir 1 ve OCT kullanma yeteneğini sınırlayabilir. Bunun burada açıklanan kısa zaman diliminde gerçekleşmesi muhtemel olmasa da, katarakt gözlerinin dışlanmasına izin vermek için daha uzun deneyler yapıyorsanız, grup büyüklüğünü arttırmayı düşünmelisiniz.
Özetle, açıklanan protokol, canlı hayvanlarda koroidal tümörleri değerlendirmek için tekrarlanabilir bir model geliştirmek için canlı OCT görüntüleme ile değerlendirilen ortak bir B16LS9 melanom modelini kullanmaktadır. Bu yaklaşım, üveal melanomun altında yatan mekanizmaları, yeni deneysel modelleri ve potansiyel yeni tedavileri araştıran gelecekteki çalışmalar için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Marcovich A.L.: Steba Biotech (P), Yeda Weizmann (P), EyeYon Medical (C, P), Mor Isum (P). (C) = Danışman; (P) = Patent. Diğer tüm yazarların birbiriyle çelişen çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Arie Marcovich için İsrail'deki İsrail Bilim Vakfı'ndan (ISF) 1304/20 hibe ile desteklenmiştir. Histoloji analizi için İsrail, Rehovot, Kaplan Tıp Merkezi, Patoloji Bölümü'nden Shahar Ish-Shalom ve Ady Yosipovich'e teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) | Hamilton | 721711 | |
| 30 G needles | BD Microbalance | 2025-01 | |
| Atipamezole hydrochloride | Orion Phrma | ||
| B16LS9 cells | from Hans Grossniklaus USA | ||
| Buprenorphine | richter pharma | 102047 | |
| C57BL/6 female mice | Envigo | ||
| Essential vitamin mixture | satorius | 01-025-1A | |
| Fetal bovine serum | rhenium | 10270106 | |
| HEPES | satorius | 03-025-1B | |
| Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops | Fisher Pharmaceutical | 390862 | |
| InSight OCT segmentation software | Phoenix Micron, Inc | ||
| Ketamine | bremer pharma GMBH (medimarket) | 17889 | |
| L-glutamine | satorius | 03-020-1B | |
| Medetomidine | zoetis (vetmarket) | 102532 | |
| Ofloxacin 0.3% eye drops | allergan | E92170 | |
| Optical coherence tomography | Phoenix Micron, Inc | ||
| Oxybuprocaine 0.4% | Fisher Pharmaceutical | 393050 | |
| Penicillin-streptomycin-amphoteracin | satorius | 03-033-1B | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | satorius | 02-023-1a | |
| RPMI cell media | satorius | 01-104-1A | |
| Sodium pyruvate | satorius | 03-042-1B | |
| Surgical microscope | Zeiss | OPMI-6 CFC | |
| Tropicamide 0.5% | Fisher Pharmaceutical | 390723 |
References
- Jager, M. J., et al.
- Bustamante, P., Piquet, L., Landreville, S., Burnier, J. V. Uveal melanoma pathobiology: Metastasis to the liver. Seminars in Cancer Biology. 71, Academic Press. 65-85 (2021).
- Damato, B. Ocular treatment of choroidal melanoma in relation to the prevention of metastatic death-A personal view. Progress in Retinal and Eye Research. 66, 187-199 (2018).
- Jouhi, S., et al. The small fatal choroidal melanoma study. A survey by the European Ophthalmic Oncology Group. American Journal of Ophthalmology. 202, 100-108 (2019).
- Cao, J., Jager, M. J. Animal eye models for uveal melanoma. Ocular Oncology and Pathology. 1 (3), 141-150 (2015).
- Uner, O. E., Gandrakota, N., Azarcon, C. P., Grossniklaus, H. E.
- Yang, H., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. Interferon alpha 2b decreases hepatic micrometastasis in a murine model of ocular melanoma by activation of intrinsic hepatic natural killer cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (7), 2056-2064 (2004).
- Yang, H., Grossniklaus, H. E. Combined immunologic and anti-angiogenic therapy reduces hepatic micrometastases in a murine ocular melanoma model. Current Eye Research. 31 (6), 557-562 (2006).
- Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M.
- Diaz, C. E., Rusciano, D., Dithmar, S., Grossniklaus, H. E. B16LS9 melanoma cells spread to the liver from the murine ocular posterior compartment (PC). Current Eye Research. 18 (2), 125-129 (1999).
- Rusciano, D., Lorenzoni, P., Burger, M. M.
- Ashur-Fabian, O., et al. Tetrac delayed the onset of ocular melanoma in an orthotopic mouse model. Frontiers in Endocrinology. 12, 632335 (2019).
- Elia, G., et al. Mechanisms regulating c-met overexpression in liver-metastatic B16-LS9 melanoma cells. Journal of Cellular Biochemistry. 81 (3), 477-487 (2001).
- Harning, R., Szalay, Z. Ocular metastasis of in vivo and in vitro derived syngeneic murine melanoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (9), 1599-1604 (1987).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Notting, I. C., et al. Whole-body bioluminescent imaging of human uveal melanoma in a new mouse model of local tumor growth and metastasis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (5), 1581-1587 (2005).
- Yang, H., et al. In-vivo xenograft murine human uveal melanoma model develops hepatic micrometastases. Melanoma Research. 18 (2), 95-103 (2008).
- Murthy, R. K., Haji, S., Sambhav, K., Grover, S., Chalam, K. V. Clinical applications of spectral domain optical coherence tomography in retinal diseases. Biomedical Journal. 39 (2), 107-120 (2016).
- Drexler, W., et al. Ultrahigh-resolution ophthalmic optical coherence tomography. Nature Medicine. 7 (4), 502-507 (2001).
- Ochakovski, G. A., Fischer, M. D. Phenotyping of mouse models with OCT. Methods in Molecular Biology. 1834, 285-291 (2019).
- Zaks, O., et al. In-vivo imaging for assessing tumor growth in mouse models of ocular melanoma. Experimental Eye Research. 204, 108431 (2021).
- Brar, V. S. American Academy of Ophthalmology 2022-2023 BCSC. 2. Fundamentals and principles of ophthalmology. , (2022).
- Duker, J. S., Waheed, N. K., Goldman, D. Handbook of Retinal OCT: Optical Coherence Tomography, 2nd Edition. , Elsevier Health Sciences. (2021).
- Tomayko, M. M., Reynolds, C. P. Determination of subcutaneous tumor size in athymic (nude) mice. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 24 (3), 148-154 (1989).
- Richards, J. R., Yoo, J. H., Shin, D., Odelberg, S. J. Mouse models of uveal melanoma: Strengths, weaknesses, and future directions. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (2), 264 (2020).
- Chen, R., et al. Photoacoustic molecular imaging-escorted adipose photodynamic-browning synergy for fighting obesity with virus-like complexes. Nature Nanotechnology. 16 (4), 455-465 (2021).
- Yu, Q., et al. Label-free visualization of early cancer hepatic micrometastasis and intraoperative image-guided surgery by photoacoustic imaging. Journal of Nuclear Medicine. 61 (7), 1079-1085 (2020).
