Summary
Detta protokoll beskriver kapaciteten och de väsentliga kulturmodaliteterna hos Open-Top Organ-Chip för framgångsrik etablering och mognad av organ-på-chip-kulturer i fulltjocklek av primära vävnader (hud, alveolus, luftvägar och tarm), vilket ger möjlighet att undersöka olika funktionella aspekter av det humana epiteliala / mesenkymala och vaskulära nischgränssnittet in vitro.
Abstract
Nästan alla mänskliga organ är fodrade med epitelvävnader, bestående av ett eller flera lager av tätt anslutna celler organiserade i tredimensionella (3D) strukturer. En av epitelens huvudfunktioner är bildandet av barriärer som skyddar de understrukna vävnaderna mot fysiska och kemiska förolämpningar och smittämnen. Dessutom förmedlar epitel transporten av näringsämnen, hormoner och andra signalmolekyler, vilket ofta skapar biokemiska gradienter som styr cellpositionering och uppdelning i organet. På grund av deras centrala roll för att bestämma organstruktur och funktion är epitel viktiga terapeutiska mål för många mänskliga sjukdomar som inte alltid fångas av djurmodeller. Förutom de uppenbara art-till-art-skillnaderna, är genomförandet av forskningsstudier om barriärfunktion och transportegenskaper hos epitel hos djur ytterligare förvärrat av svårigheten att komma åt dessa vävnader i ett levande system. Medan tvådimensionella (2D) humana cellkulturer är användbara för att svara på grundläggande vetenskapliga frågor, ger de ofta dåliga in vivo-förutsägelser . För att övervinna dessa begränsningar har under det senaste decenniet en uppsjö av mikrokonstruerade biomimetiska plattformar, kända som organ-on-a-chip, framstått som ett lovande alternativ till traditionella in vitro - och djurförsök. Här beskriver vi ett Open-Top Organ-Chip (eller Open-Top Chip), en plattform utformad för modellering av organspecifika epitelvävnader, inklusive hud, lungor och tarmar. Detta chip erbjuder nya möjligheter att rekonstruera den multicellulära arkitekturen och funktionen hos epitelvävnader, inklusive förmågan att återskapa en 3D-stromakomponent genom att införliva vävnadsspecifika fibroblaster och endotelceller i ett mekaniskt aktivt system. Detta Open-Top Chip ger ett oöverträffat verktyg för att studera epiteliala / mesenkymala och vaskulära interaktioner vid flera upplösningsskalor, från enstaka celler till flerskiktiga vävnadskonstruktioner, vilket möjliggör molekylär dissektion av den intercellulära överhörningen av epitelialiserade organ i hälsa och sjukdom.
Introduction
Historiskt sett har forskare förlitat sig på prekliniska djurförsök för läkemedelsupptäckt, men ett växande antal av dessa metoder har ifrågasatts på grund av dålig korrelation med mänskligt resultat1. Implementeringen av "3R" -principerna för att ersätta, minska och förfina djurförsök uppmanar forskare att hitta nya in vitro-alternativa metoder för att stödja preklinisk läkemedels- och kemisk toxikologisk riskbedömning2. Många in vitro-modeller som hittills utvecklats saknar dock den biologiska arkitektur, cellulära komplexitet och mekaniska miljö som krävs för att rekapitulera den dynamiska naturen hos mänskliga levande organ 3,4.
Konventionella in vitro prekliniska system använder vanligtvis 2D-monokulturer av mänskliga celler odlade på en styv plastyta. Dessa metoder ger ett verktyg för att genomföra enkla mekanistiska studier och möjliggör snabb screening av läkemedelskandidater. På grund av sin relativt låga kostnad och höga robusthet paras 2D-modeller ofta ihop med automatiska system med hög genomströmning och används för snabb identifiering av potentiella läkemedelskandidater under det tidiga skedet av läkemedelsutvecklingsprocessen 5,6. Sådana 2D-modeller tillhandahåller emellertid inte ett translationellt tillvägagångssätt för modellering av vävnadsnivå, organnivå eller systemiska svar på terapeutiska kandidater, vilket behövs för exakta förutsägelser av läkemedelssäkerhet och effekt under det prekliniska utvecklingsstadiet. Plancellskulturer rekapitulerar inte den naturliga vävnadsmikromiljön, inklusive det komplexa multicellulära samspelet, biomekaniska egenskaper och tredimensionell (3D) arkitektur hos mänskliga vävnader7. Celler som växer på en plan yta förvärvar ofta inte en mogen fenotyp och kan därför inte svara på farmakologiska stimuli som de skulle göra i den ursprungliga vävnaden. Till exempel uppvisar primära humana alveolära epitelceller som odlas in vitro en skivepitelfenotyp och förlorar viktiga fenotypiska markörer, inklusive ytaktiva proteiner C och B (SP-C och SP-B)8. Förutom otillräcklig differentiering blir primära celler ofta okänsliga för biologiska stressfaktorer in vitro, eftersom vissa biokemiska vägar associerade med vävnadsinflammation blir icke-funktionella9. Sådan förlust av cellfunktion verkar främst vara förknippad med användningen av styva substrat samt bristen på lösliga faktorer som naturligt frigörs av vävnadsspecifika stromaceller såsom lungfibroblaster och glattmuskelceller10,11.
Att förstå att bristen på kemo-fysisk och biologisk komplexitet begränsar cellernas fysiologiska beteende in vitro har främjat utvecklingen av mer sofistikerade multicellulära modeller, som har visat sig bättre fånga komplexiteten hos mänskliga vävnader utanför kroppen12,13. Sedan skapandet av de första samkulturmodellerna i början av 1970-talet14 har introduktionen av syntetiska och naturliga hydrogeler avsevärt förbättrat förmågan att efterlikna inhemska vävnadsmikromiljöer och har blivit ett ovärderligt verktyg för att driva celldifferentiering, styra självorganisationen av celler till vävnadsliknande strukturer och återställande av inhemska vävnadsfunktioner15,16. Till exempel, när de odlas i lämplig 3D-byggnadsställning, kan mänskliga celler självordna sig i funktionella strukturer som sfäroider eller organoider, uttrycka stamcellsmarkörer och kan självförnya17. Däremot åldras mänskliga celler (inklusive stamceller), när de odlas på traditionella 2D-substrat, snabbt och genomgår åldrande efter några passager18. Dessutom kan hydrogeler "skräddarsys" för att matcha specifika vävnadsegenskaper såsom porositet, porstorlek, fibertjocklek, viskoelasticitet, topografi och styvhet eller vidare konstruerade med vävnadshärledda cellulära komponenter och / eller bioaktiva molekyler som möjliggör emulering av fysiologiska eller patologiska tillstånd 19,20. Trots sin enorma potential för läkemedelstestning rekapitulerar 3D-hydrogelbaserade modeller som används i läkemedelsforskning inte fullständigt den komplexa cytoarkitekturen hos in vivo-vävnaderna och saknar viktiga hemodynamiska och mekaniska stimuli som normalt finns i människokroppen, inklusive hydrostatiskt tryck, cyklisk sträckning och vätskeskjuvning21.
Mikrofysiologiska system (MPS) såsom organ-on-chips (OOCs) har nyligen dykt upp som verktyg som kan fånga komplexa fysiologiska svar in vitro22,23. Dessa modeller använder ofta mikrofluidiska plattformar, som möjliggör modellering av den dynamiska mikromiljön hos levande organ.
Vi har kombinerat principerna för 3D-vävnadsbioteknik och mekanobiologi för att skapa en Open-Top Chip-modell av komplex human epitelvävnad. Detta gjorde det möjligt för oss att noggrant rekapitulera den multicellulära och dynamiska mikromiljön hos epitelvävnader. Detta inkluderar vävnadsspecifika biokemiska och biomekaniska signaler som finns naturligt i levande organ men ofta försummas av traditionella in vitro-modeller 24. Open-Top Chip innehåller två fack: ett kärlfack (figur 1A) och ett stromalt fack (figur 1B) åtskilda av ett poröst membran, vilket möjliggör diffusion av näringsämnen mellan de två kamrarna (figur 1C). Det vaskulära facket utsätts för kontinuerligt vätskeflöde för att rekapitulera fysiologisk skjuvspänning, medan stromakammarens töjbara design möjliggör modellering av den mekaniska belastningen i samband med andningsrörelser eller tarmperistaltik. Stromafacket rymmer den avstämbara 3D-hydrogelställningen som är utformad för att stödja den fysiologiska tillväxten av vävnadsspecifika fibroblaster. Den har ett avtagbart lock som underlättar upprättandet av ett luft-vätskegränssnitt, ett tillstånd som möjliggör större emulering av mänsklig fysiologi av slemhinnor samt direkt tillgång till vävnaden för administrering av läkemedel direkt på epitelskiktet. Kompletterande figur 1 fångar några av de viktigaste komponenterna i Open-Top Chip-designen, inklusive dimensioner och biologiska avdelningar (kompletterande figur 1A-D) samt de viktigaste tekniska stegen som beskrivs i detta protokoll (kompletterande figur 1E).
Perfusion av Open-Top Chip uppnås med en programmerbar peristaltisk pump (figur 1D). Den peristaltiska pumpinstallationen gör att 12 Open-Top Chips kan perfuseras samtidigt. De flesta inkubatorer kan rymma två uppsättningar som möjliggör odling av upp till 24 chips per inkubator. Mekanisk sträckning uppnås med hjälp av en skräddarsydd programmerbar vakuumtrycksregulator (figur 1E). Den består av en elektropneumatisk vakuumregulator som styrs elektroniskt av en digital-till-analog-omvandlare. Med andra ord genererar den elektropneumatiska vakuumregulatorn en sinusformad vakuumprofil med en amplitud och frekvens som bestäms av användaren. Cyklisk töjning som sträcker sig från 0% till 15% genereras genom att applicera undertryck på vakuumkanalen hos Open-Top Chip vid en amplitud som sträcker sig från 0 till -90 kPa och en frekvens av 0,2 Hz. Det är ett skräddarsytt system som motsvarar den kommersiellt tillgängliga Flexcell-stamenheten som tidigare antagits och beskrivits i andra artiklar25. För att efterlikna den mekaniska vävnadsdeformation som till exempel associeras med lungans andningsrörelse eller tarmens peristaltik, applicerar det pneumatiska ställdonet sinusformade vakuum-/töjningsvågor vars storlek och amplitud kan justeras för att matcha den fysiologiska nivån av töjning och frekvens som mänskliga celler upplever i sin ursprungliga vävnad.
Här beskriver vi en effektiv och reproducerbar metod för att konstruera och odla organotypiska epitelekvivalenter på en prototyp Open-Top Chip-plattform. Det möjliggör generering av komplexa organmodeller som hud, alveol, luftvägar och tjocktarm samtidigt som det integrerar ett vaskulärt vätskeflöde och mekanisk sträckning. Vi kommer att beskriva viktiga tekniska aspekter som måste beaktas vid implementering av principer för vävnadsteknik för att generera komplexa epitelmodeller. Vi kommer att diskutera fördelarna och eventuella begränsningar med den nuvarande designen.
En översikt över de viktigaste stegen som används för att uppnå vävnads- och organmognad, inklusive flödes- och sträckparametrar, rapporteras i: Figur 2 för huden, Figur 3 för alveolen, Figur 4 för luftvägarna och Figur 5 för tarmen. Ytterligare information om mediernas sammansättning och de reagenser som används för odling av de olika organmodellerna finns i de kompletterande tabellerna (kompletterande tabell 1 för huden; Kompletterande tabell 2 för alveolen; Kompletterande tabell 3 för luftvägarna och kompletterande tabell 4 för tarmen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humana kolonoider erhölls från tarmresektioner i enlighet med riktlinjerna från den institutionella biosäkerhetskommittén vid Cincinnati Children's Hospital (IBC 2017-2011).
1. Aktivering av Surface
- Förberedelse av aktiveringsbuffert
- Placera tvärbindaren och lösningsmedelsbuffertreagenserna under biosäkerhetsskåpet (BSC) och låt dem balansera vid rumstemperatur (RT) i 10 minuter före användning.
- Bered 5 mg tvärbindare i 5 ml av lösningsmedelsbufferten med en steril ljusogenomtränglig behållare eller ett transparent 15 ml koniskt rör inslaget i aluminiumfolie för att skydda tvärbindarlösningen från direkt ljusexponering.
- Virvla lösningen i 1 minut för att avlägsna alla klumpar och pipettera sedan 50 μL av tvärbindningslösningen direkt in i chipets bottenkanal och 150 μL i den öppna kammaren.
- Ta bort eventuellt överskott av tvärbindningslösning från ytan av chipet med hjälp av en aspirator. Pipettera sedan ytterligare 50 μL av tvärbindningslösningen direkt in i chipets bottenkanal och 150 μL in i den öppna kammaren för att avlägsna eventuell kvarvarande luftbubbla.
- Aktivering med UV-tvärbindningsmaskin
- Ta försiktigt bort locket från chipet under BSC och förvara det i en steril behållare.
- Överför flisen som innehåller tvärbindningslösningen till en petriskål, stäng petriskålen för att undvika kontaminering och placera skålen med flisen under UV-tvärbindningsmaskinen.
OBS: Ta bort petriskålens lock för att maximera UV-exponeringen. - Ställ in UV-tvärbindningsmaskinen med en toppvåglängd på 365 nm med en intensitet på 100 μJ / cm2 och slå på UV-ljuset i 20 minuter.
OBS: Efter 20 minuters UV-behandling kommer tvärbindarlösningen att se mörkare ut (brun). - Ta tillbaka spånen under BSC och aspirera den oxiderade tvärbindningslösningen. Skölj sedan alla flisor tre gånger med lösningsmedelsbufferten och låt flisen torka under BSC i 5-10 minuter för att slutföra den kemiska funktionaliseringen av polydimetylsiloxanytan (PDMS).
2. Förberedelse stromaekvivalenten
- Förberedelse av 10x rekonstruktionsbuffert (100 ml)
- Lös 2,2 g natriumbikarbonat i 75 ml 0,067 M NaOH i dubbeldestillerat vatten.
- Tillsätt 4,76 g HEPES och bringa volymen till 100 ml med dubbeldestillerat vatten.
- Sterilfiltrera lösningen under BSC med ett sterilt engångsflaskfilter med ett 0,22 μm membran.
OBS: Lösningen är stabil i ca 6 månader vid förvaring vid 4 °C.
- Uppskattning av volymen av förgellösningen
- Multiplicera antalet chips som behövs för experimentet med 150 μL (inre volym i den centrala öppna kammaren) för att uppskatta mängden förgellösning som krävs för experimentet:
Volym som behövs = (Antal chips x 150) μL - Bered kollagenförgellösningen på is genom att blanda: 1 volym 10x EMEM innehållande de valda cellerna, 1 volym 10x rekonstruktionsbuffert (se steg 2.1), 8 volymdelar kollagen I-lösning (10 mg/ml) och 1 μl 1 N NaOH-lösning för varje mg kollagen I.
OBS: Det rekommenderas att förbereda en extra +15% volym för att ta hänsyn till experimentella fel; Exemplet som beskrivs i avsnitt 2.2 innehåller en detaljerad steg-för-steg-procedur för beredning av tillräckligt med förgellösning för 12 chips och en extra volym på 15 %.
- Multiplicera antalet chips som behövs för experimentet med 150 μL (inre volym i den centrala öppna kammaren) för att uppskatta mängden förgellösning som krävs för experimentet:
- Beredning av pre-gellösning för stromaekvivalenten (för 12 chips)
- Ta med följande lösningar under BSC på is: 10x EMEM; 10x Rekonstruktionsbuffert (se steg 2.1); Kollagen I-lösning (10 mg/ml); och steril 1 N NaOH-lösning.
- Odla vävnadsspecifika mesenkymala celler enligt instruktioner från leverantörerna tills 80% -90% sammanflytande, och dissociera sedan cellerna med trypsin eller andra metoder som rekommenderas av cellleverantören. Samla upp cellerna i en pellet genom centrifugering vid 250 x g i 5 minuter vid 24 °C.
- Återsuspendera cellpelleten i 225 μL iskall 10x EMEM och tillsätt 225 μL iskall 10x rekonstruktionsbuffert (se steg 2.1). Blanda lösningen genom att försiktigt pipettera upp och ner och tillsätt sedan 1 800 μL iskall kollagen I-lösning.
- Pipettera upp och ner 5-6 gånger, undvik bubblor för att blanda förgellösningen medan du är på is.
- Inkorporering av stromaekvivalenten på chip (för 12 marker)
- Neutralisera förgellösningen med 18 μl 1 N NaOH. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner 5-6 gånger och pipettera sedan 150 μL cellladdad hydrogel i den centrala kammaren i Open-Top Chip och undvik bubblor.
OBS: Om mikromönstring krävs, gå vidare till nästa steg (avsnitt 3). - Gruppera chipsen i separata petriskålar, inklusive ett centrifugrörslock fyllt med 2 ml steril ddH2O i varje petriskål, och inkubera petriskålarna i inkubatorn vid 37 °C, 5 %CO2.
OBS: Efter 90 minuter polymeriseras den cellbelastade hydrogelen fullständigt.
- Neutralisera förgellösningen med 18 μl 1 N NaOH. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner 5-6 gånger och pipettera sedan 150 μL cellladdad hydrogel i den centrala kammaren i Open-Top Chip och undvik bubblor.
3. Mikromönstring av ytor (tillval)
- Utför ytmikromönstring av stromahydrogelen efter pipettering av den neutraliserade kollagenhydrogelen (fortfarande i flytande tillstånd) med hjälp av 3D-tryckta stämplar.
OBS: De 3D-utskrivna frimärkena kan erhållas i olika anpassningsbara mönster, som tidigare beskrivits någon annanstans24. - Pipettera 20 μL neutraliserat kollagen I förgellösning på den mönstrade ytan av en steril 3D-tryckt stämpel och sätt in stämpeln inuti (ovanpå) den öppna kammaren medan stromahydrogelen fortfarande är i flytande form.
- Ta bort eventuella rester av hydrogelen som kan spillas från toppen av den öppna kammaren med hjälp av en sugare (eller en pipett). Gruppera alla chips i separata petriskålar och inkludera en centrifug 15 ml konisk rörlock fylld med 2 ml steril ddH2O i varje petriskål.
- Inkubera alla petriskålar vid 37 °C, 5 %CO2 i 90 minuter och ta sedan tillbaka flisorna under BSC och ta försiktigt bort stämplarna med en precisionpincett för att minska risken för att hydrogelen skadas.
4. Beläggning av epitel- och kärlytan med vävnadsspecifika ECM-proteiner
- Beläggning av den vaskulära mikrofluidiska kammaren med extracellulära matrisproteiner
- Multiplicera antalet chips som behövs för experimentet med 20 μL (volymen av kärlkanalen) för att uppskatta volymen vaskulär ECM-beläggningslösning som krävs för experimentet:
Volym som behövs = (Antal chips x 20) μL
OBS: Det rekommenderas att förbereda en extra volym på 15% för att ta hänsyn till experimentella fel. - Bered den vaskulära ECM-beläggningslösningen för alla flis (till exempel 300 μL per 12 flis) med iskall PBS eller HBSS.
Anmärkning: Se den särskilda organprotokolltabellen i avsnittet om kompletterande material (kompletterande tabell 1 för huden; Kompletterande tabell 2 för alveolen; Kompletterande tabell 2 för luftvägarna och kompletterande tabell 4 för tarmen) för att identifiera de specifika reagenserna och den rekommenderade ECM-sammansättningen. - Pipettera 20 μL vaskulär ECM-beläggningslösning i kärlkanalen på varje chip.
- Multiplicera antalet chips som behövs för experimentet med 20 μL (volymen av kärlkanalen) för att uppskatta volymen vaskulär ECM-beläggningslösning som krävs för experimentet:
- Beläggning av den apikala ytan av stromalekvivalenten med extracellulära matrisproteiner
- Multiplicera antalet chips som behövs för experimentet med 50 μL (volymen av kärlkanalen) för att uppskatta volymen epitelial ECM-beläggningslösning som krävs för experimentet:
Volym som behövs = (Antal chips x 50) μL
OBS: det rekommenderas att förbereda en extra volym på 15% för att ta hänsyn till experimentella fel. - Förbered tillräckligt med ECM-beläggningslösning för alla flis (till exempel 750 μL per 12 flis) i iskall PBS eller HBSS och överför 50 μL epitelial ECM-beläggningslösning direkt ovanpå hydrogelytan.
Anmärkning: Se den särskilda organprotokolltabellen i avsnittet om kompletterande material (kompletterande tabell 1 för huden; Kompletterande tabell 2 för alveolen; Kompletterande tabell 2 för luftvägarna och kompletterande tabell 4 för tarmen) för att identifiera de specifika reagenserna och den rekommenderade ECM-sammansättningen. - Gruppera flisen i separata petriskålar, inklusive ett centrifug 15 ml koniskt rörlock fyllt med 2 ml steril ddH 2 O i varje petriskål, och inkubera petriskålarna i inkubatorn vid 37 ° C, 5%CO2 i2timmar innan du fortsätter med epitelcellssådd.
- Multiplicera antalet chips som behövs för experimentet med 50 μL (volymen av kärlkanalen) för att uppskatta volymen epitelial ECM-beläggningslösning som krävs för experimentet:
5. Såddepitelceller på stromalekvivalenten
- Epitelial cellodling
- Odla vävnadsspecifika epitelceller enligt instruktioner från leverantörerna tills 80% -90% sammanflytande.
- Dissociera cellerna med hjälp av proteolytiska enzymprocedurer som rekommenderas av cellleverantören.
OBS: För bästa resultat, skörda epitelceller vid låg passage (P1-P2) under den aktiva tillväxtfasen när de når mellan 70% -90% sammanflöde. - När de är dissocierade, centrifugera cellerna och samla dem som en pellet.
- Resuspendera epitelcellerna till lämplig cell-/fragmentdensitet enligt vad som anges i tabellen över specifika organprotokoll.
OBS: I denna studie användes celllösning med en densitet av 3 x 10 6 celler / ml för huden, 1 x 10 6 celler / ml för alveolen, 6 x 10 6 celler / ml för luftvägarna och 8 x 10 6 fragment / ml för tarmen.
- Epitelial cell sådd
- Överför chipsen från inkubatorn till BSC. Aspirera beläggningslösningen från kärlkanalen och skölj den vaskulära mikrofluidiska kanalen tre gånger med 50 μL färskt endotelcellodlingsmedium.
- Aspirera beläggningslösningen från hydrogelytan och skölj stromaytan tre gånger med 100 μL färskt epitelcellodlingsmedium för att avlägsna överflödig beläggningslösning.
- Aspirera det stigande mediet och frö hydrogelytan med 50 μL av epitelcellsuspensionen med lämplig celldensitet, som anges i tilläggstabellerna, och överför sedan chipsen tillbaka till inkubatorn i 2 timmar (eller över natten för kolonoider).
- Skölj försiktigt hydrogelytan med cellodlingsmediet två gånger för att avlägsna cellulärt skräp. Slutligen uppdatera mediet genom autoklavering i förseglade autoklaverbara behållare och anslut chipsen till den peristaltiska pumpen.
6. Ansluta chips till flöde
- Förbereda de fluidiska delarna
- Skär 2 tum biokompatibel polypropenbaserad termoplastisk elastomer (TPE) överföringsslang (materialtabell) för att förbereda den korta mikrofluidiska slangen som krävs för att ansluta chipsen till mediebehållarna.
- Skär 7,5 tum biokompatibla TPE-överföringsslangar för att producera den långa mikrofluidiska slangen.
- Förbered tillräckligt med 18 G och 19 G metallkontakter (materialtabell).
OBS: Det rekommenderas att förbereda och sterilisera slangarna och kontaktdonen som beskrivs i steg 6.1.1 och 6.1.2 minst 1 dag innan Open-Top Chips ansluts till peristaltiska pumpar. - Pierce locket på varje medium reservoarer med en 4-tums hypodermisk nål (Materialtabell).
- Medium avgasning
- Låt cellodlingsmediet balansera till rumstemperatur (RT).
- Överför volymen medium som behövs till ett koniskt filtreringsrör.
- Applicera ett negativt vakuumtryck på -20 PSI för att avgasa mediet (vakuumdriven filtrering).
OBS: Om ett vakuum inte är tillgängligt kan cellodlingsmediet lämnas i jämvikt i inkubatorn över natten för att uppnå liknande resultat.
- Förbered det öppna chipet för vätskeflöde
- Ta med spånen och de sterila fluiddelarna under BSC och rikta in locket (övre delen) på Open-Top Chip för att försegla Open-Top Chip-prototypen innan vätskeflödet påbörjas.
- Pipettera 200 μL av det avgasade cellodlingsmediet (se organspecifika tabeller) in i inloppsporten på både chipets övre och nedre kanaler samtidigt som man är uppmärksam på att undvika bubblor.
- Pipettera 300 μL av odlingsmediet i den korta mikrofluidiska slangen för att fylla rörens inre yta och ansluta den korta slangen till inloppen i chipets övre och nedre kanaler.
- Anslut och grunda de mikrofluidiska ytorna
- Placera mediumbehållarna i gårdsstället, anslut hypodermnålen till chipsens botteninlopp och slutligen rymma alla chips i husbäraren inuti inkubatorn.
- Anslut chipsen till peristaltisk pump och inspektera sedan alla kontakter för att se till att alla chips är ordentligt anslutna och att det inte finns något synligt läckage av cellodlingsmedia.
- Använd rensningsknappen på pumpen och håll den intryckt i cirka 15 sekunder eller tills dropparna i cellodlingsmediet visas i slutet av utflödesslangen.
- Använd pumpens styrsystem för att ställa in lämpligt organchipflöde (figur 2, figur 3, figur 4 och figur 5).
7. Underhåll av chips
- Underhåll av organchip
- Bered färskt cellodlingsmedium för epitel och/eller endotel och utför avgasningsstegen (som tidigare beskrivits i steg 6.2).
- Pausa den peristaltiska pumpen, koppla försiktigt bort spånen från pumpen och dra ut bäraren/bärarna för spånhuset. Överför chipsen från inkubatorn till BSC och ta bort volymen media kvar i behållarna.
- Byt ut cellodlingsmediet till de övre och nedre inloppsbehållarna med 5 ml färskt cellodlingsmedium och placera chiphusbäraren (-bärarna) tillbaka i inkubatorn. Anslut chipsen till den peristaltiska pumpen och starta om flödet.
OBS: Det rekommenderas att använda rensningsfunktionen för att snabbt uppdatera mediet till kärlfacket och minska risken för luftbubblor. - Upprepa steg 7.1.1-7.1.3 varannan dag, enligt figur 2, figur 3, figur 4 och figur 5.
- Upprättande av luft-vätskegränssnitt (ALI)
- Pausa den peristaltiska pumpen, koppla försiktigt bort spånen från pumpen och dra ut bäraren/bärarna för spånhuset. Överför flisen från inkubatorn till biosäkerhetsskåpet och ta bort volymen medium kvar i toppbehållaren.
- Aspirera försiktigt allt medium från den övre mikrofluidiska kanalen och kläm fast den korta mikrofluidiska slangen som är ansluten till de övre inloppen med bindemedelsklämmor för att minska mediaavdunstning och underhåll av ALI.
- Placera det öppna chipet på höljets bärare(n) tillbaka i inkubatorn och anslut chipsen till peristaltisk pump igen.
OBS: Det rekommenderas att använda rensningsfunktionen för att snabbt uppdatera mediet till kärlfacket och minska risken för luftbubblor. - Återuppta flödet genom att starta den peristaltiska pumpen.
- Stretching (valfritt)
- Pausa den peristaltiska pumpen och anslut chipsens vakuumportar till vakuummodulen med två långa mikrofluidiska rör per chip.
- Använd vakuummodulen för att justera stretchinställningen till det tillstånd som rekommenderas för varje organ enligt specifikationerna i organprotokolltabellerna: Kompletterande tabell 1 för huden; Kompletterande tabell 2 för alveolen; Kompletterande tabell 2 för luftvägarna. och kompletterande tabell 4 för tarmen.
- Inspektera röranslutningarna visuellt för att se till att alla chips är ordentligt anslutna och att det inte finns några synliga droppar av medium dropp.
- Återuppta flödet genom att starta den peristaltiska pumpen.
8. Sådd endotelceller i kärlfacket
- Förbered celler och chips för vaskulär cellsådd
- Odla de vävnadsspecifika endotelcellerna enligt instruktioner från leverantörerna tills 80% -90% sammanflytande. Dissociera cellerna med hjälp av en proteolytisk enzymprocedur (som rekommenderas av leverantören) och slutligen resuspendera endotelcellerna i en lösning av 3 x 106 celler / ml.
OBS: För bästa resultat, skörda endotelcellerna vid låg passage (P2-P4) under den aktiva tillväxtfasen när de når mellan 70% -90% sammanflöde. - Pausa den peristaltiska pumpen. Överför chipsen från inkubatorn till BSC, koppla bort chipsen från mediebehållarna och eventuella anslutna slangar och gruppera sedan chipsen i separata petriskålar.
- Uppdatera cellodlingsmediet i epitelfacket med färskt epitelcellodlingsmedium. Skölj kärlkanalen med färskt endotelcellodlingsmedium två gånger och aspirera sedan mediet från kärlkammaren.
- Odla de vävnadsspecifika endotelcellerna enligt instruktioner från leverantörerna tills 80% -90% sammanflytande. Dissociera cellerna med hjälp av en proteolytisk enzymprocedur (som rekommenderas av leverantören) och slutligen resuspendera endotelcellerna i en lösning av 3 x 106 celler / ml.
- Endotelcell sådd
- Frö den nedre (vaskulära) kanalen med 25 μL endotelcellssuspension (3 x 106 celler / ml), vänd chipsen upp och ner så att endotelceller kan fästa på den övre ytan av mikrofluidikkammaren.
Tillsätt 50 μL av cellsuspensionen per chip (600 μL per 12 chips). - Gruppera chipsen i petriskålar. Sätt tillbaka dem i inkubatorn vid 37 °C, 5%CO2, och låt endotelcellerna fästa i 1 timme.
- Efter 1 h, överför chipsen från inkubatorn till BSC. Skölj kärlkanalen med endotelcellodlingsmedium två gånger för att avlägsna cellulärt skräp.
- Upprepa steg 8.2.1-8.2.2 för att fröa kärlkanalen igen med endotelceller och lägga flisorna platt för att underlätta vidhäftningen av endotelcellerna till kärlkanalens bottenyta.
- Frö den nedre (vaskulära) kanalen med 25 μL endotelcellssuspension (3 x 106 celler / ml), vänd chipsen upp och ner så att endotelceller kan fästa på den övre ytan av mikrofluidikkammaren.
- Återanslut chipet till flödet
- Fyll upp kärlmediets behållare med det avgasade vaskulära cellodlingsmediet under BSC.
- Placera spånorna tillbaka inuti spånhusbäraren/-bärarna och återanslut spånorna till mediumbehållarna i ena änden till den peristaltiska pumpen i den andra änden.
OBS: Det rekommenderas att använda rensningsfunktionen för att snabbt uppdatera mediet till kärlfacket och minska risken för luftbubblor. - Inspektera mikrofluidanslutningarna visuellt för att se till att alla chips är ordentligt anslutna och att det inte finns några synliga droppar av medium droppande. Återuppta sedan vätskeflödet genom att starta den peristaltiska pumpen.
9. Vanliga slutpunktsanalyser
- Koppla bort chips för slutpunktsanalyser
- Pausa den peristaltiska pumpen, koppla försiktigt bort spånen från pumpen och dra ut bäraren/bärarna för spånhuset. Överför chiphusbäraren/-bärarna från inkubatorn till BSC och släpp loss chipsen.
- Tvätta försiktigt den centrala kammaren i Open-Top Chip med epitelcellodlingsmediet och kärlkanalen med endotelodlingsmediet två gånger för att avlägsna cellulärt skräp.
- Ta bort locket på Open-Top Chip för att komma åt chipets apikala fack med pincett.
- Immunfärgning för fluorescensmikroskopi
- Fortsätt med konventionell provfixering, permeabilisering och blockering.
OBS: I denna studie fixerades proverna i 200 μL 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 h följt av sköljning med PBS, permeabilisering i 0,1% Triton X-100 i 40 min och blockering i 1% bovint serumalbumin i 1 h. - Inkubera chipsen med primära antikroppar (Table of Materials) vid 4 °C över natten. och tvätta sedan både epitel- och endotelfacken på chipsen med 200 μL PBS två gånger. Fortsätt sedan med lämpliga sekundära antikroppar i 2 timmar.
OBS: Späd de primära antikropparna och sekundära antikropparna i PBS + 1% BSA vid en utspädning av 1:100 (primär antikropp) och 1:200 (sekundär antikropp).
- Fortsätt med konventionell provfixering, permeabilisering och blockering.
- Immunhistokemi
- Extrahera stromaekvivalenterna från huvudkammaren i Open-Top Chip med pincett, samla dem i ett 1,5 ml rör fyllt med 10% neutralt buffrat formalin och inkubera i minst 24 timmar.
- Överför den fasta stromaekvivalenten till vävnadsprocessorn och följ stegen nedan för att uppnå optimal provuttorkning.
- Sänk ner hydrogelen i 70% etanol i 90 minuter.
- Ta bort 70% etanol och sänk ner hydrogelen i 80% etanol i 90 minuter.
- Ta bort 80% etanol och sänk ner hydrogelen i 95% etanol i 90 minuter.
- Ta bort 95% etanol och sänk ner hydrogelen i 100% etanol i 90 minuter två gånger.
- Ta bort 100% etanol och sänk ner hydrogelen i en lösning av xylen i 120 minuter två gånger.
- Ta bort xylenlösningen och infiltrera de bearbetade stromaekvivalenterna i paraffinvax i 120 minuter (~2 timmar) två gånger.
- Bädda in de infiltrerade stromaekvivalenterna i sektionerande paraffinblock.
- Vid denna tidpunkt kan stromaekvivalenterna snittas som paraffinblock med hjälp av en mikrotom och bearbetas enligt konventionella histologiska tekniker26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikromönstring av ytor
Mikromönstring av den extracellulära matrisen (ECM) kan användas för att replikera den rumsliga konfigurationen av tarmkryptgränssnittet. Open-Top Chip-konfigurationen kan modifieras för att integrera mikromönstrade frimärken speciellt utformade för att efterlikna den naturliga topografin i kolonepitel-stroma-gränssnittet (figur 6A, B) och tarmkrypterna på mikrometerskala (figur 6C-E). Observera att vi använde en plan (inte mönstrad) yta för hud-, luftvägs- och alveolusmodellerna. Stämpeln användes i detta fall för att erhålla en enhetlig hydrogelyta till fröepitelceller. Vi valde en design som kunde efterlikna den naturliga arkitekturen i den mänskliga tarmslemhinnan, bestående av växlingen av positiva och negativa kupoler som efterliknar tarmkrypterna.
Orgel-modeller
Vi odlade och differentierade fyra olika epitel (hud, alveolus, luftvägar och tarm) med hjälp av Open-Top Chip-prototypen för att bevisa denna biomimetiska plattforms mångsidighet. Histologiska sektioner av organchipsen bekräftar närvaron av epitelceller som är fenotypiskt distinkta och representativa för: ett stratifierat epitel när det gäller huden (figur 7), pseudostratifierat kolonnepitel när det gäller luftvägarna (figur 8 och kompletterande video 1), enkelt skivepitel när det gäller alveolen (figur 9), och enkelt kolumnarepitel när det gäller tarmen (figur 10). Hud-, luftvägs- och alveolära celler erhölls alla från kommersiellt tillgängliga leverantörer (som anges i materialförteckningen).
Figur 1: Schematisk bild av Open-Top Chip och den mikrofluidiska uppställningen som användes i denna studie. (A-C) Ovanifrån, lager-för-lager-projektion och 3D-rendering som visar prototypen Open-Top Chip-design bestående av det avtagbara övre locket med innesluten mikrofluidisk kanal (blå), de två halvmånvakuumkanalerna längs kulturkammaren (grå) och de nedre spiraliserade endotelmikrofluidiska kanalerna (magenta). (D) Skräddarsydd spånhållare (även kallad "Farm system") inklusive chiphusbäraren (röd pil), den peristaltiska pumpen och reservoarerna (gul pil) arrangerade i en konfiguration som passar in i en gemensam cellodlingsinkubator. € Pneumatiskt ställdon, instrumentet som styr det negativa trycket som appliceras på chipsens vakuumkanal, som används för att generera den cykliska mekaniska kraften som celler upplever under andning eller peristaltisk rörelse (stretch). Denna siffra har anpassats med tillstånd från Varone et al.24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Teknisk översikt över protokollet med öppna hudchip . (A) Schematisk som visar åtgärdssekvensen för beredningen av öppna hudflisor och (B) som utgör det viktigaste biologiska steget i den öppna hudchipskulturen. I den inledande fasen av chipberedningen är mesenkymala celler (fibroblaster) inbäddade i gelén och laddade i Open-Top Chip för att bilda stromaskiktet, som är belagt i 2-4 timmar och utsäde med epitelceller. När epitelcellerna har bildat ett kompakt monolager utsätts de för luft (ALI). Det biologiska systemet hålls under ALI-regimen tills det offras för analys på dag 14. Mekanisk sträckning kan appliceras medan systemet är under flöde och vid ALI. Sträckningen hålls tills vävnaderna offras för analys. Ytterligare information om mediesammansättning, specifika reagenser och celltyper finns i kompletterande tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Teknisk översikt över det öppna alveolus-chip-protokollet. (A) Schematisk som visar åtgärdssekvensen för prepareringen av alveolus-chip med öppen topp och (B) som tillhandahåller det viktigaste biologiska steget i den öppna alveolus-chipkulturen. I den inledande fasen av chipberedningen inbäddas mesenkymala celler (fibroblaster) i gelén och laddas i Open-Top Chip för att bilda stromaskiktet, som beläggs i 2-4 timmar och ympas med luftvägsepitelceller i ett medium kompletterat med KIAD (se kompletterande tabell 2). EGF-kompletterat medium bibehålls i ~ 4 dagar för att stödja epitelcelltillväxt. Epitelet utsätts sedan för luft (ALI) i ~ 10 dagar för att uppnå fullständig vävnadsmognad. Pulmonella mikrovaskulära endotelceller såddas på dag 14, och det biologiska systemet hålls under ALI och flödesregim tills de offras för analys på dag 21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Teknisk översikt över protokollet för luftvägschip med öppen topp . (A) Schematisk bild som visar åtgärdssekvensen för preparering av luftvägschipet med öppet tak och (B) som utgör det viktigaste biologiska steget i den öppna luftvägschipkulturen. I den inledande fasen av chipberedningen bäddas mesenkymala celler (fibroblaster och/eller glatta muskelceller) in i gelén och laddas i Open-Top Chip för att bilda stromaskiktet, som beläggs i 2-4 timmar och ympas med epitelceller i medium kompletterat med EGF (se kompletterande tabell 3). EGF-kompletterat medium bibehålls i ~ 4 dagar för att stödja epitelcelltillväxt. Epitelet utsätts sedan för luft (ALI) i ~ 10 dagar för att uppnå fullständig vävnadsmognad. Pulmonella mikrovaskulära endotelceller såddas på dag 14, och det biologiska systemet hålls under ALI och flödesregim tills de offras för analys på dag 21. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Teknisk översikt över det öppna tarmchipprotokollet. (A) Schematisk som visar sekvensen av åtgärder för det öppna tarmchippreparatet och (B) som tillhandahåller det viktigaste biologiska steget i den öppna tarmchipkulturen. I den inledande fasen av chipberedningen inbäddas mesenkymala celler (kolonfibroblaster) i gelén och laddas i Open-Top Chip för att bilda stromaskiktet, som är belagt i 2-4 timmar och utsäde med fragment av epitelkolonioider erhållna från kliniska resektioner. Cellodlingsmedium, inklusive tillskott (ROCK och CHIR, se kompletterande tabell 4) krävs under såddsteget för att bibehålla kolonoidcellviabilitet och fysiologisk morfologi. Olika medier används sedan för att driva expansionen (dag 1 till 6) och mognad (dag 6 till 9) av kolonepitelet. Kolonmikrovaskulära endotelceller såddas på dag 6 med användning av ett endotelcellodlingsmedium (EGM2 MV) och odlas sedan under flöde med ett epitelexpansionsmedium i upp till 10 dagar till. Epitelet exponeras för ALI från dag 10 för att ytterligare främja epitelcellmognad. Mekanisk sträckning kan appliceras på systemet från dag 13 och bibehållas till dag 16, då organmodellen offras för slutpunktsanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Stämpling av mikromönster . (A) Stämpelns laterala och övre vy som visar mikroskalig textur (500 μm i höjd och 250 μm bred pelarmatris) används för att återskapa gränssnittet för kolonkryptvävnad och topp- och sidovy av stämpelchipenheten, som visar monteringen av de två elementen när de används för att gjuta gelytan. (B) Vinklad sidovy som visar stämpeln och chipgränssnittet. (C–E) Bilder av den mikromönstrade gelytan med och utan celler. Skalstänger: 200 μm. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Varone et al.24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Representativa data som erhållits med det öppna hudchipet . a) Schema som visar åtgärdssekvensen för beredningen av öppna hudflisor och som anger de viktigaste biologiska stegen i den öppna skinnchipskulturen. (B) PCNA Cytokeratin 14, Cytokeratin10, Involucrin och Fillagrin fluorescensfärgning och H&E som visar mogen flerskiktad stratifierad epidermis differentierad on-Chip. Skalstänger: 100 μm. (C) Ovanifrån bild av hudspånet (skalstänger: 5 mm) och H&E-tvärsnittet (skalstänger: 100 μm) som visar närvaron av fibroblasterna inuti hudskiktet. d) PECAM-1, VE-Cadherin och Von Willebrand fluorescensfärgning som visar differentiering av humana mikrovaskulära endotelceller som samodlats i det öppna hudchipet. Skalstänger: 20 μm. (E) 3D Cartoon-konceptrendering av det öppna hudchipet. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Varone et al.24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Representativa data som erhållits med det öppna luftvägschipet. (A) Schematisk som visar åtgärdssekvensen för preparering av luftvägschip med öppet tak och som utgör det viktigaste biologiska steget i Open-Top Airway-Chip-kulturen. (B) MUC5AC (bägare), α och β-tubulin (cilierade celler), Claracellprotein 16 (klubbceller), p63 (basal-/stamceller) och ZO-1 fluorescensfärgning som visar moget luftvägsepitel. Skalstreck: 20 μm. (C) Video/bild med faskontrast som visar närvaron av slående cilier. Skalstänger: 50 μm. (D) H&E-färgning (skalstapeler: 20 μm) och TEM-bild (skalstapeler: 5 μm) som visar moget pseudostratifierat epitel differentierat på chip. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Representativa data erhållna med det öppna alveoluschipet. (A) Schematisk som visar verkningssekvensen för prepareringen av alveolus-chip med öppet topp och som utgör det viktigaste biologiska steget i den öppna alveoluschipkulturen. b) Typ I (HTI-56, AT1-α), typ II (HTII-280, LAMP3, ABCA3, ytaktivt ämne (C) och E-kadherinfluorescensfärgning som visar närvaron av mogna pneumocyter på chip. Skalstänger: 20 μm. (C) SEM- och TEM-bild som visar närvaron av mikrovilli och lysosomala vesiklar som tyder på mogen alveolär fenotyp. Skalstänger: 5 μm. (D) H&E-tvärsnitt (skalstänger: 5 μm) som bekräftar förekomsten av plana skivepitelceller som överensstämmer med typ I-fenotyp och kuboidala, kullerstensliknande celler som överensstämmer med typ II-fenotypen, och (E) som visar närvaron av fibroblasterna inuti det dermala skiktet (skalstänger: 10 μm). (F) 3D-tecknad konceptrendering av det öppna alveoluschipet. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Varone et al.24. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Representativa data erhållna med det öppna tarmchipet. (A) Schematisk som visar verkningssekvensen för Open-Top Intestine-Chip-preparatet och ger det viktigaste biologiska steget i Open-Top Intestine-Chip-kulturen. (B) Vinklad sidovy som visar stämpel- och chipsammansättningen under gelgjutningsfasen, det tecknade konceptet med den mikromönstrade gelen och faskontrastbilder av en kryptliknande struktur mikromönstrad på gelytan och sådd med kolonioider i två olika höjder. Skalstänger: 200 μm. (C) Mucin 2 och E-Cadherin fluorescensfärgning som visar närvaron av enterocyter och mogna bägarceller on-Chip. Skalstänger: 200 μm. (D) H&E-tvärsnitt av en kryptliknande struktur som visar närvaron av fibroblasterna inuti dermalskiktet och bekräftar närvaron av ett enkelt kolonnepitel. Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande video 1: Faskontrastvideo som visar att slå cilia. Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 1: Öppen spånmontering. (A) Schematiskt som visar den tredimensionella återgivningen av Open-Top Chip-enheten och den tecknade återgivningen av det öppna hudchipet med de olika biologiska avdelningarna markerade och inklusive epitel (blå), dermal (gul) och vaskulär (röd). (B) Den monterade mikrofluidiska plattformen har ett format på 35 mm x 17 mm, en vävnadsodlingsarea på 0,32 cm2, en bottenspiralformad mikrofluidisk kanal och ett kammarlock med en mikrofluidisk kanal. (C) Plattformen består av en kammare med en 5-graders vinklad vägg, som har en diameter på 6 mm i membrannivå och 5,7 mm på toppen av PDMS-kammarväggen och en höjd på 4 mm och bredd. Det porösa membranet är 50 μm tjockt och porerna är 7 μm i diameter. (D) Den nedre spiralformade mikrofluidiska kanalen har tvärsnittsdimensioner på 400 μm (höjd) x 600 μm (bredd). (E) En översikt över experimentets tidslinje och de steg som krävs för att förbereda Open-Top Organ-Chip. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 1: Skinn. Tabellen ger en sammanfattning av de viktigaste dagliga stegen och stretch- och flödesparametrarna som används under de tre faserna av Open-Top Skin-Chip-kulturen (tillväxt, spridning och differentiering). Tabellen innehåller också en lista över material, medieformuleringar och instruktioner om hur man förbereder det medium som är nödvändigt för detta protokoll. Sammansättningen av de tre medierna är optimerad för protokollets olika faser. Specifikt är Medium I optimerad för sådd och tidig keratinocytodlingsfas. Medium II är optimerad för spridning och tidig differentiering (bildning av ett stratifierat epitel). ALI-mediet är optimerat för att upprätthålla keratinocyter vid ett luft-vätskegränssnitt tills en helt differentierad epidermis produceras. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 2: Alveolus. Tabellen ger en sammanfattning av de viktigaste dagliga stegen och sträcknings- och flödesparametrarna som används under de tre faserna av den öppna alveolus-chipkulturen (tillväxt, spridning och differentiering). Tabellen innehåller också en lista över material, medieformuleringar och instruktioner om hur man förbereder det medium som är nödvändigt för detta protokoll. Sammansättningen av de två medierna är optimerad för protokollets olika faser. Observera att tillsats av kosttillskott (KIAD) till cellodlingsmediet är avgörande för att uppnå optimal differentiering av pneumocyterna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 3: Luftvägar. Tabellen ger en sammanfattning av de viktigaste dagliga stegen och de sträcknings- och flödesparametrar som används under de tre faserna av den öppna luftvägschipkulturen (tillväxt, spridning och differentiering). Tabellen innehåller också en lista över material, medieformuleringen och instruktioner om hur man förbereder det medium som är nödvändigt för detta protokoll. Mediets sammansättning är optimerad för att upprätthålla luftvägsceller vid luft-vätskegränssnittet, vilket i sin tur inducerar terminal differentiering och stimulerar produktionen av slem. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 4: Tarm. Tabellen ger en sammanfattning av de viktigaste dagliga stegen och de sträcknings- och flödesparametrar som används under de tre faserna av den öppna tarmchipkulturen (tillväxt, proliferation och differentiering). Tabellen innehåller också en lista över material, medieformuleringar och instruktioner om hur man förbereder det medium som är nödvändigt för detta protokoll. Kompositionerna av båda medierna är optimerade för protokollets olika faser. Specifikt är expansionsmediet kompletterat med CHIR och ROCK-hämmare optimerat för sådd och tidig fas av odling eftersom det främjar överlevnad och tillväxt av kolonorganoidfragmentet som ett monolager. Expansionsmediet är optimerat för spridning och tidig differentiering av epitelmonolager. Differentieringsmediet är optimerat för terminal differentiering av epitelmonoskiktet före exponering för luft-vätskegränssnittet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Open-Top Chip representerar en möjliggörande plattform för att undersöka det komplexa cellulära samspelet som uppstår mellan endotel, stroma och epitel i en kontrollerad mikromiljö, i realtid. Denna teknik erbjuder kritiska fördelar jämfört med konventionella organotypiska och organoida kulturer, såsom integration av fysiska och biokemiska signaler som är relevanta för att rekonstruera den mänskliga vävnadsmikromiljön, inklusive fluidisk skjuvning (flöde), cyklisk sträckning och rekonstruktion av epitelytans topografi uppnådd via mikromönstring. Mänskliga celler som växer inom denna plattform verkar i synergi för att rekapitulera vävnadsspecifika funktioner som kan analyseras via konventionella tekniker, inklusive immunhistokemi och biokemiska analyser med hjälp av utflödesvätskor (eller avloppsvatten) från de övre och / eller nedre facken. Den nuvarande designen möjliggör enkel åtkomst till epitelskiktet, där celler växer i direkt kontakt med vävnadsspecifika fibroblaster och andra stromaceller, vilket efterliknar den multicellulära arkitekturen hos epitelvävnader. I synnerhet erbjuder Open-Top Chip-prototypen en livskraftig lösning på vanliga utmaningar i samband med användningen av andra organ-on-chip-plattformar. Medan det möjliggör införlivande av flera olika celltyper i ett stromalt fack som leder till skapandet av mycket komplexa 3D-vävnader, möjliggör det också enkel extraktion av de etablerade vävnadskonstruktionerna från chipanordningen för nedströmsanalys, inklusive konventionell H&E-färgning.
Den nuvarande designen presenterar några begränsningar. Till exempel är det elastiska membranet mellan den vaskulära mikrokanalen och stromafacket (hydrogelen) i prototypen Open-Top Chip betydligt tjockare (≈ 50 μm mot ≈ 1 μm) än det interstitiella utrymmet som skiljer endotelvävnader från stroma i de inhemska mänskliga organen. Även om det elastiska membranet inte representerar en fysisk barriär mot diffusion av stora molekyler, såsom hormoner och andra parakrina faktorer som förmedlar den intercellulära överhörningen mellan vävnader, kan det begränsa direkta, cell-cellinteraktioner och migrering av celler från kärlet till stromafacket. Slutligen är prototypen Open-Top Chip tillverkad av PDMS, som är känt för att absorbera ett stort antal hydrofoba föreningar. Denna begränsning delas av många PDMS-baserade plattformar som kan vara ett allvarligt hinder i tillämpningar avsedda för testning av farmakodynamik och farmakokinetik för små terapeutiska föreningar27.
En av de största utmaningarna med att integrera 3D-hydrogeler i en mikrofluidisk enhet som Open-Top Chip är att PDMS inte ger ett optimalt substrat för bindning av humana proteiner eller celler. Kemisk funktionalisering av PDMS-ytan är därför ett kritiskt steg i detta protokoll som krävs för att säkerställa korrekt ECM-beläggning och hydrogelvidhäftning till gelkammaren i Open-Top Chip-modellen. För att uppnå optimala resultat måste tvärbindningsmedlet i ER1-lösningen alltid skyddas från direkt exponering för ljus. En viktig indikator på tvärbindarens reaktiva status är dess färg. Tvärbindaren i ER1 genomgår faktiskt en färgövergång från lysande orange till mörkbrun när den oxiderar. Färgövergången kan användas som en indikator efter UV-aktiveringssteget för att kontrollera om lösningen effektivt har reagerat med PDMS-ytan. Under beredningen av tvärbindningslösningen bör färgövergången övervakas för att säkerställa att en oavsiktlig exponering för direkt ljus inte fotobleker den kemiska föreningen i lösningen. För att skydda tvärbindarlösningen och undvika oönskad fotoblekning föreslår vi att du lindar in aluminiumfolie, cirka 15 cm x 15 cm, runt ett 15 ml koniskt rör eller använder ett bärnstensfärgat rör som finns på marknaden. Användningen av ER1 möjliggör en enkel och effektiv metod för att uppnå snabb funktionalisering av PDMS-ytorna; Det finns dock andra molekyler som kan användas i stället för ER1. Till exempel är de kemiska tvärbindarna 3-aminopropyl-trimetoxisilan (APTMES) inte lika ljuskänsliga som ER1 och det kan användas för att uppnå liknande resultat med några ytterligare steg som vi tidigare har beskrivit någon annanstans28,29. Oberoende av vilken molekyl som valts är en av de viktigaste begränsningarna för att arbeta med en kemisk tvärbindare närvaron av kvarvarande rester, vilket kan inducera cytotoxicitet. Efter aktiveringsreaktionen är det viktigt att skölja de mikrofluidiska ytorna med rikliga mängder tvättlösning.
Eftersom luftbubblor tenderar att bildas och växa inom de hydrofoba gränssnitten mellan chips, slangar och kontakter är det viktigt att bedöma om den mikrofluidiska vägen är fri från luftbubblor innan vätskeflödet startas. Bubblor kan verkligen störa flödet och till och med döda cellerna när chips är anslutna till flödet. Grundning av mikrofluidikkomponenterna innan vätskeflödet påbörjas minskar risken för att luftbubblor genereras och hjälper till att uppnå optimala och reproducerbara resultat. Om primingcykeln som beskrivs i detta protokoll inte var tillräcklig, kommer sköljning av mikrofluidrören med etanol (5 min) och sedan med HBSS (20 min) att ytterligare minska risken för att generera luftbubblor inuti fluidkontakterna.
Trots sina begränsningar har PDMS en sällsynt kombination av kemiska egenskaper som har möjliggjort tillverkning av mycket biokompatibla, transparenta och elastiska mikrofluidiska enheter. Alla dessa egenskaper har gjort PDMS till det mest använda materialet för konstruktion av Organ-on-Chip-modellerna under det senaste decenniet. De senaste framstegen inom materialvetenskap och kemiteknik30,31 tyder på att PDMS-komponenten i denna plattform kan ersättas inom en snar framtid med nya syntetiska polymerer eller biomaterial. Om det uppnås framgångsrikt kan det möjliggöra rekapitulation av vävnadsspecifika egenskaper, inklusive porositet, ECM-sammansättning av det interstitiella utrymmet som ger närmare efterlikning till mänskliga inhemska vävnader och mer avancerade modeller för farmakologistudier. Vi förväntar oss att den framtida utvecklingen av Open-Top Chip-designen kommer att möjliggöra modellering av mänskliga vävnader och organ med en aldrig tidigare skådad detaljnivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar följande ekonomiska intressen / personliga relationer, som kan betraktas som potentiella konkurrerande intressen: Varone Antonio är en tidigare anställd i Emulate Inc. och kan inneha aktieintresse i Emulate.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x EMEM | Lonza | 12-684F | Medium; Stroma |
| 18 Gauge needle | MicroGroup | 316H18RW | Tube stainless steel 316 welded, 18RW Full Hard |
| 19 Gauge needle | MicroGroup | 316H19RW | Tube stainless steel 316 welded, 19RW Full Hard |
| 2-Stop PharMed BPT | Cole-Palmer | EW-95723-12 | Tube, 0.25 mm, 12/pack |
| 70% ethanol and wipes | - | - | For surface sterilization |
| 8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt (8-Br-cAMP) | Sigma | B7880 | Medium supplement |
| A-83-01 | Tocris | 2939 | |
| Adenine | Sigma | A9795 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634010 | |
| Airway Epithelial Cells | Lifeline Cell Technology | FC-0016 | |
| Aluminum foil | - | - | - |
| Alveolar cells | Cell Biologics | H6621 | |
| Anti-ABCA3 | ABCAM | ab24751 | Mouse monoclonal antibody [3C9] |
| Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 | ABCAM | ab215225 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-Aquaporin5 | ABCAM | ab92320 | Rabbit monoclonal antibody [EPR3747] |
| Anti-beta IV Tubulin | ABCAM | ab11315 | Mouse monoclonal antibody [ONS.1A6] |
| Anti-CD31 (PECAM-1) | ABCAM | ab9498 | Mouse monoclonal [JC/70A] antibody |
| Anti-CK5 | ABCAM | ab75869 | Rabbit recombinant monoclonal [AY1E6] |
| Anti-Cytokeratin 10 | ThermoFisher | MA5-13705 | Mouse monoclonal antibody (DE-K10) |
| Anti-Cytokeratin 14 | ABCAM | ab7800 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-E-Cadherin | ABCAM | ab1416 | Mouse monoclonal antibody |
| Anti-Filaggrin | ThermoFisher | PA5-79267 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-HTI-56 | Terrace Biotech | TB-29AHT1-56 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | Mouse monoclonal antibody (IgM) |
| Anti-Involucrin | ThermoFisher | MA5-11803 | Mouse monoclonal antibody (SY5) |
| Anti-Isoforms TA p63-α, -β, -γ | Biolengend | 618902 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Ki67 | ABCAM | ab8191 | Mouse monoclonal antibody [B126.1] |
| Anti-LAMP3 | ABCAM | ab111090 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mature SP-B | Seven Hill | WRAB-48604 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-MUC5AC | ThermoFisher | PA5-34612 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Mucin-2 | SantaCruz Biotechnology | sc-7314 | Mouse monoclonal antibody (IgG1) |
| Anti-p63 | Dako | GA662 | Mouse monoclonal antibody p63 Protein (Dako Omnis) Clone DAK-p63 |
| Anti-PCNA | ThermoFisher | PA5-32541 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Podoplanin (AT-1α) | ABCAM | ab128994 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Pro + Mature Surfactant Protein B | ABCAM | ab40876 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Surfactant C | Seven Hill | WRAB-9337 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-Uteroglobin/SCGB1A1 | Hycult Biotech | HM2178 | Mouse monoclonal antibody [AY1E6] |
| Anti-VE-cadherin | ABCAM | ab33168 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-ZO-1 | ThermoFisher | 33-9100 | Mouse monoclonal antibody [1A12] |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | - | Sterile (autoclaved) |
| B27 | Thermo | 17504044 | |
| Blocker BSA (10X) in PBS solution | ThermoFisher | 37525 | Blocker agent |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| Collagen I | Advanced Biomatrix | 5133 | 10 mg/mL (Stroma) |
| Collagen I | Advanced BioMatrix | 5005 | 3 mg/mL (Vascular ECM) |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | |
| Collagen-IV | Sigma | C5533-5MG | Collagen from human placenta, 5 mg powder, reconstitute to 1 mg/mL |
| Colonic Fibroblasts | Cell Biologics | H6231 | |
| Colonic microvascular endothelial cells | Cell Biologics | H6203 | |
| Conical tubes | - | - | 15 mL and 50 mL polypropylene, sterile |
| Crosslinker (ER-1) | Emulate | 10461 | 5 mg powder |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | ThermoFisher | D3571 | DNA probe |
| Dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-010 | |
| Dermal microvascular endothelial cells | ATCC | CRL-3243 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11054020 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320082 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | GIBCO | 10565-018 | Basal medium for ALI medium |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150105 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175472 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150107 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | ABCAM | ab150073 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | ABCAM | ab175470 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150075 | Donkey Anti-Mouse secondary antibody |
| Dulbecco’s PBS (DPBS-/-) (without Ca2+, Mg2+) | Corning | 21-031-CV | 1x |
| Epidermal Growth Factor (EGF) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-60170 | Medium supplement |
| F-12 Ham’s | Invitrogen | 21700-108 | For vascular ECM |
| FibriCol | Advanced BioMatrix | 5133-20ML | Collagen-I solution (10 mg/mL) |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| Fibronectin, Human, Natural, | Corning | 47743-654 | human plasma fibronectin |
| Fine-tip precision tweezers | Aven | 18056USA | Technik Style 5B-SA Precision Stainless Steel Tweezers |
| Glutamax | Invitrogen | 21700-108 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050061 | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 594) | ABCAM | ab150080 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | ABCAM | ab150115 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (FITC) | ABCAM | ab6785 | Goat Anti-Mouse secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgG1 Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-21124 | Goat Anti-Mouse IgG1 secondary antibody |
| Goat Anti-Mouse IgM Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21042 | Goat Anti-Mouse IgM secondary antibody |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Heat Inactivated HyClone FetalClone II Serum (FCS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30066.03 | |
| Hemocytometer | - | - | - |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Thermo | 15630080 | |
| Human [Leu15] - Gastrin | Sigma | G9145 | |
| Human colonoids | Obtained from clinical resections | Obtained from clinical resections | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo | PHG0311L | |
| human epithelial growth factor | Thermo | PHG0311 | |
| HyClone FetalClone II Serum (U.S.) | GE Healthcare | SH30066.02HI | Sterile FBS heat-inactivated |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma | H4881 | |
| Hydrocortisone | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Ice bucket | - | - | - |
| Ismatec IPC-N | Cole-Palmer | EW-78000-41 | Low-Speed Digital Peristaltic Pump; q24-Channel (1 per 12 Chips) |
| ITES | BioWhittaker | 17-839Z | |
| Keratinocyte Growth Factor (KGF), also known as Basic Fibroblast Growth Factor 7 (FGF-7), human, recombinant in HEK | PromoCell | C-63821 | |
| Keratinocytes | ATCC | PCS-200-010 | |
| Laminin | Biolamina | CT521-0501 | |
| Laminin, 521 CTG (CT521) | Biolamina | CT521-0501 | human recombinant laminin 521 |
| Lung Fibroblast | Cell Biologics | H6013 | |
| Lung Fibroblast | Lifeline Cell Technology | FC-0049 | |
| Lung microvascular endothelial cells | Lonza | CC-2527 | |
| Lung smooth muscle cells | Lifeline Cell Technology | FC-0046 | |
| Manual counter | - | - | - |
| Masterflex (TPE) Transfer Tubing | Cole-Palmer | FV-96880-02 | PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD |
| Medium 199, no phenol red | Thermo | 11043023 | |
| Microcentrifuge tube | - | - | 1.5 mL, sterile |
| Microscope (with camera) | - | - | For bright-field imaging |
| N2 | Sigma | 17502001 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | A5099 | |
| Noggin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | N17001 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher | 50062Z | Blocking solution |
| O-phosphosrylethanolamine | Sigma | P0503 | |
| Paraformaldehyde (4% wt/vol) | EMS | 15710 | Fixing agent |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma | P4333 | 10,000 U/mL; 10 mg/mL |
| Pipette tips | - | - | P20, P200, and P1000 sterile, low adhesion |
| Pipette | Gilson | F167380 | P20, P200, and P1000 |
| PluriQ Serum Replacement (or alternatively KO Serum replacement) | AMSBIO (or Thermo) | N/A (or C1910828010) | |
| Poly-L-Lysine coated microscope glass slides | Sigma | P0425 | Glass slides |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| ProLong Gold | ThermoFisher | P36931 | Antifade Mountant with DAPI |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Tocris | TB1254-GMP/10 | |
| R-spondin (HEK293T conditioned medium) | Sigma | SCC111 | |
| SAGM SingleQuots supplements | Lonza | CC-4124 | |
| SAGMTM Small Airway Epithelial Cell Growth medium BulletKitTM | Lonza | CC-4124 | Medium supplements |
| SB2001190 | Tocris | 1264/10 | |
| Serological pipettes | - | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile |
| Small Airway Epithelial Cell Growth medium (SAGM) | Lonza | CC-4124 | |
| Solvent Buffer (ER-2) | Emulate | 10462 | 25 mL bottle |
| Steriflip-HV | Millipore | SE1M003M00 | Sterile filtering conical tube |
| Sterilin 100 mm Square Petri Dishes | Thermo | 103 | Sterile, 1 per 6 chips |
| T25 flasks | - | - | - |
| T75 flasks | - | - | - |
| Tri-iodothyronine | Sigma | T5516 | |
| Triton X-100 (0.3% (vol/vol) | Sigma | T8787 | Permeabilization agent |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | 0.4% solution |
| TrypEE solution | Sigma | 12604013 | Cell detaching solution |
| TWEEN-20 | Sigma | P2287 | Permeabilization agent |
| UV Light Oven (peak frequency 365nm, intensity of 100 µJ/cm2) | VWR | 21474-598 | UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L |
| Vacuum set-up | - | - | Minimum pressure: -70 kPa |
| Vascular Endothelial Growth Factor 165 (VEGF-165) human, recombinant in E. coli | PromoCell | C-64420 | |
| VEGF-165 | PromoCell | C-64420 | Medium supplement |
| Von Willebrand Factor conjugated FITC | ABCAM | ab8822 | Sheep polyclonal antibody |
| Water bath (or beads) | - | - | Set to 37 °C |
| Wnt3A (L-Wnt3A conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 |
References
- Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
- Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953 (2021).
- Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
- Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
- MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L.
- Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322 (2020).
- Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288 (2015).
- Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
- Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
- Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
- Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
- Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323 (2019).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
- Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139 (2021).
- Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
- Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957 (2021).
- Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Sadeghipour, A., Babaheidarian, P.
- Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
- Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
- Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
- Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
- Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250 (2021).
