Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בדיקת חיסון הקשורה לאנזים לכידת אנטיגן לזיהוי ספציפי של דלקת ריאות מיקופלסמה

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

בזיהום Mycoplasma pneumoniae, בדיקות סרולוגיות יכולות להניב תוצאות טובות, אך עם ספציפיות נמוכה בגלל תגובה צולבת אימונולוגית. ה- ELISA ללכידת אנטיגן פנימית, המתוארת במאמר זה, מבטיחה ספציפיות גבוהה של מינים והוכחה כבדיקת סינון אמינה לאבחון מדויק של M. pneumoniae.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae הוא פרוקריוט חסר דופן התא, הידוע בעיקר כדי ליישב את דרכי הנשימה האנושיות להיות אנדמי, עם שיאי מגיפה כל 6 שנים, אצל ילדים גדולים יותר ומבוגרים צעירים. אבחון של M. דלקת ריאות הוא מאתגר בגלל האופי המהיר של הפתוגן ואת האפשרות של הובלה אסימפטומטית. אבחון מעבדה של זיהום M. דלקת ריאות המבוססת על טיטרציה נוגדנים בדגימות סרום של חולים נשאר השיטה המתורגלת ביותר. בגלל הבעיה הפוטנציאלית של תגובתיות צולבת אימונולוגית עם שימוש בסרום פוליקלונלי עבור M. pneumoniae, פותחה בדיקה אימונוסורבנטית הקשורה לאנזים לכידת אנטיגן (ELISA) כדי לשפר את הספציפיות של אבחון סרולוגי. לוחות ELISA מצופים בנוגדנים פוליקלונליים של M. pneumoniae, מגודלים בארנבות ומעובדים ספציפית לאחר ספיחה כנגד פאנל של חיידקים הטרולוגיים החולקים אנטיגנים עם מיני M. pneumoniae ו / או ידועים כמתיישבים בדרכי הנשימה. האנטיגנים ההומולוגיים M. pneumoniae שהגיבו מזוהים באופן ספציפי על ידי הנוגדנים המתאימים להם בדגימות הסרום. אופטימיזציה נוספת של הפרמטרים הפיסיקוכימיים שאליהם נתונה ELISA ללכידת אנטיגן הובילה ל- ELISA ספציפי מאוד, רגיש וניתן לשחזור.

Introduction

מיקופלסמות הן בין הפרוקריוטים הקטנים והפשוטים ביותר הידועים. הם נבדלים בעיקר מחיידקים אחרים על ידי היעדר מבנה דופן התא. לפיכך, מיקופלסמות סווגו בכיתה נפרדת בשם Mollicutes1. מחסור בדופן התא מקנה עמידות פנימית למיקרואורגניזמים אלה נגד כמה חומרים אנטי מיקרוביאליים והוא אחראי במידה רבה לפולימורפיזם שלהם. למיקופלסמות יש גנום קטן וגודל מוקטן, מה שמגביל את היכולות המטבוליות והביוסינטטיות שלהן ומסביר את האופי הטפילי והספרופיטי שלהן1.

מיקופלסמה דלקת ריאות היא אחת המיקופלסמות שמדביקות את האדם ונחשבת לארסיתביותר 2. M. דלקת ריאות מאכלסת את דרכי הנשימה העליונות, מה שמוביל לדלקת ריאות לא טיפוסית אצל ילדים ומבוגרים צעירים. הסימנים הקליניים הנגרמים על ידי זיהום M. דלקת ריאות הם דמויי שפעת, עם כאבי ראש, חום ושיעול3. הציטדהרנות של M. pneumoniae לתאים מארחים מתווכת על ידי אברון התקשרות הכולל הידבקות P1 מז'ורית ומספר חלבונים נלווים 4,5. ביטויים קליניים נוספים עשויים להתרחש בגלל דלקת מקומית וגירוי של המערכת החיסונית המארחת הנובעת מהיצמדות אינטימית של M. דלקת ריאות לרירית דרכי הנשימה6. למרות שדלקת ריאות היא סימן היכר של זיהום M. pneumoniae, התגלה כי זיהום עם חיידק זה יכול גם להיות אחראי על ספקטרום רחב של ביטויים לא ריאתיים באתרים אנטומיים שונים כגון מערכת העצבים המרכזית, הלב, העור, המפרקים7.

באשר לכל מיני Mycoplasma, האבחנה של M. דלקת ריאות היא מאתגרת. הסימנים הקליניים המעוררים מיקופלסמוזיס הם לרוב בלתי נראים ולא אופייניים8. מכיוון שקשה מאוד לאבחן זיהום M. דלקת ריאות על ידי הסתמכות רק על ביטויים ותסמינים קליניים, בדיקת מעבדה מעניינת במיוחד9. איתור מושבות M. דלקת ריאות לפי תרבית הוא שיטת תקן הזהב לאבחון נכון. עם זאת, דרישות הצמיחה המהירות והזמן הארוך הדרוש למתן תוצאות סופיות (1-2 שבועות) מסבכים את התרבית, ולכן פירושה שהיא משמשת לעתים נדירות לאבחון שגרתי10. טכנולוגיות הגברה של חומצות גרעין אומתו במונחים של מהירות ויעילות, אם כי בגלל העלות הגבוהה יחסית שלהן וחוסר הזמינות בחלק ממתקני הבריאות, טכניקות מולקולריות אלה אינן נחשבות לבדיקות אבחון קו ראשון. זה נכון כי בדיקות PCR מסחריות נמצאים בשימוש נרחב כדי לאבחן זיהומים M. דלקת ריאות, אבל הם עדיין לא יכולים להחליף סרולוגיה. כמו כן, המופע התכוף של תוצאות חיוביות כוזבות ותוצאות חיוביות כוזבות הגביל את השימוש ב- PCR9. באופן שגרתי, סרולוגיה נשארת המיושמת ביותר במעבדות לאבחון של זיהום M. דלקת ריאות. מספר גישות סרולוגיות דווחו במשך עשרות שנים, כגון המגלוטינינים קרים, מבחן קיבוע משלים 11, מבחן המגלוטינציה עקיף 12, אימונופלואורסצנציה13, והטכנולוגיה של ELISA, אשר יושמה לראשונה על מיקופלסמה סרולוגיה בתחילת שנות השמונים14,15,16. אחת הבעיות העיקריות נתקלו בעת ביצוע ELISA serodiagnosis של זיהום M. דלקת ריאות היא תגובות צולבות, אשר מוריד במידה ניכרת את הספציפיות של הטכניקה. ספיחה לא ספציפית של סרה אנושית עם אנטיגנים של דלקת ריאות M. דווחה בעבר; למעשה, רבים מהנוגדנים שזוהו על ידי ELISA בסרה אנושית לא תמיד קשורים לאנטיגנים מיקופלסמליים 17, בשל המשותף של M. דלקת ריאות עם כמה חיידקים18,19 וכמה רקמות בעלי חיים ובני אדם20.

בגלל קריאות הרקע הגבוהות שנצפו במבחן ELISA הקונבנציונלי שהיה נהוג במעבדה, פרשנות התוצאות הייתה לעתים קרובות מסובכת, ולכן מתן אבחנה נכונה של M. דלקת ריאות הייתה משימה קשה. בעודנו מתמודדים עם בעיה זו, בחרנו לשפר את M. pneumoniae ELISA על ידי הסרת תגובות לא ספציפיות של אנטיגנים של M. דלקת ריאות עם נוגדנים להיבדק. לשם כך, עבדנו על דלדול סלקטיבי של האנטיגנים הלא ספציפיים של M. pneumoniae באמצעות טכניקת הספיגה. למעשה, המטרה העיקרית של לכידת אנטיגן ELISA היא לזהות באופן ספציפי M. דלקת ריאות אימונוגלובולין (Ig) G בדגימות סרום אנושי. הרעיון של ELISA זה מורכב בעיקר מלכידה סלקטיבית של אנטיגנים ספציפיים לדלקת ריאות M, לפני הוספת דגימות הסרום האנושיות. סלקטיביות זו מבוטחת על ידי דגירה של אנטיגן גולמי M. pneumoniae עם אנטיסרום פוליקלונלי M. pneumoniae, המיוצר בארנבות במעבדה והפיכתו למין ספציפי על ידי ספיחה נגד פאנל של חיידקים הטרולוגיים, השייכים או לא שייכים למעמד Mollicutes, חולקים אנטיגנים עם M. pneumoniae מינים ו/או ידועים כמתיישבים בדרכי הנשימה. הליך הספיחה חזר על עצמו שלוש פעמים, ויעילותו לביטול תגובתיות צולבת נבדקה על ידי אימונובלוטציה. מבחן ELISA שפותח הוא שילוב של סנדוויץ' ואליזה עקיפה. בקצרה, הבארות של צלחת ELISA מצופים תחילה עם אנטיסרום פוליקלונלי ספציפי M. דלקת ריאות. לאחר מכן, M. דלקת ריאות אנטיגן הוא הוסיף ולכוד בין antiserum ואת הנוגדנים הנמצאים בדגימת הסרום להיבדק. הקומפלקס האימונולוגי שנוצר מזוהה על ידי נוגדן מצומד אנזים משני (IgG מצומד פרוקסידאז). התגובות מוצגות על ידי תוספת של מצע כרומוגני, והספיגה נמדדת ספקטרופוטומטרית. ELISA פנימית זו מוצגת באופן סכמטי באיור 1. ה- ELISA הביתית הוכיחה את עצמה כיעילה באיתור ספציפי של זיהום M. pneumoniae והיא כיום אחת הבדיקות המתורגלות ביותר בפעילות אבחון שגרתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

המחקר הנוכחי נערך בהתאם להיבטים אתיים שנקבעו על ידי הוועדה האתית של מכון פסטר בתוניס.

1. שלבי טרום ELISA: תנאים מוקדמים ועיבוד מקדים

  1. זני חיידקים ומדיית גדילה
    הערה: מינים של מוליקוטים והחיידקים בעלי הקירות המשמשים במחקר הנוכחי ואמצעי הגדילה שלהם מפורטים בטבלה 1.
    1. גידול מינים של מוליקוטים
      1. לחסן 200 μL ממלאי הגליצרול של כל מין ב-1,800 μL של המדיה.
      2. לגדל מינים Mollicutes באופן סטטי ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 במשך2-4 ימים עד שינוי pH נצפה (מחוון pH הוא פנול אדום).
      3. הגדילו את התרבויות ל-10 מ"ל על ידי הוספת דילול של 1/10מהתרבות לתקשורת ואפשרו להן לצמוח שוב באותם תנאים.
        הערה: על פי חילוף החומרים, כמה מינים של Mollicutes אנושיים (M. דלקת ריאות, M. genitalium, ו- M. fermentans) חומציים את המדיום עקב תסיסת גלוקוז, וכמה אחרים (M. hominis ו Ureaplasma) אלקליניזציה של המדיום על ידי הידרוליזה של ארגינין או הידרוליזה של אוריאה, בהתאמה. לגבי מיקופלסמות של עופות, החמצה של המדיום של פריי מדגימה את נוכחותו של M. gallisepticum, בעוד אלקליניזציה שלה מוכיח את הצמיחה של M. imitans.
      4. להפיץ 50 μL של תרביות על צלחות אגר כדי לאשר את הצמיחה של החיידקים. שמרו על צלחות האגר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 וצפו בהן באופן קבוע מתחת למיקרוסקופ להופעת מושבות ביצים מטוגנות טיפוסיות (מיקופלסמות) ומושבות דמויות קיפודים כהים (Ureaplasmas).
    2. גידול מינים שאינם מוליקוטים
      1. תרבית את החיידקים שאינם מוליקוטים ב-3 מ"ל של המדיה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה (רועדת ב-200 סל"ד).
      2. השווה את העכירות של התרבויות עם אמצעי הבקרה כדי לאשר צמיחה.
      3. הגדל את התרבויות ל -10 מ"ל על ידי הוספת דילול של 1/100של התרבות לתקשורת ואפשר להן לצמוח שוב באותם תנאים.
  2. הכנת אנטיגן
    1. הכנת אנטיגן של מינים Mollicutes
      1. קציר החלבונים המלאים (הנמצאים בתרביות מאושרות של M. pneumoniae ושאר מיני Mollicutes) על ידי צנטריפוגה ב 40,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
      2. יש להשליך את הסופר-נאטנט ולשטוף את הכדורים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x מלח אפוץ פוספט (PBS, pH 7.4) על ידי סדרה של שלוש צנטריפוגות עם אותם תנאים.
      3. יש להשעות כל אנטיגן ב-500 μL של PBS.
    2. הכנת אנטיגן של מינים שאינם מוליקוטים
      1. צנטריפוגה של תרביות הלילה של חיידקים שאינם Mollicutes ב 1,500 x גרם במשך 15 דקות.
      2. יש להשהות כל כדור חיידקי ב-500 מיקרו-ליטר של PBS.
        הערה: ריכוז החלבון נקבע בשיטת הכמות הקלאסית של ברדפורד עם אלבומין בסרום בקר כסטנדרט21. ריכוז החלבון של מיני Mollicutes נע בדרך כלל בין 0.7-4.8 מ"ג/מ"ל. עבור זני החיידקים האחרים, ריכוז החלבון יכול להגיע ל-20 מ"ג/מ"ל. כל האנטיגנים מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס עד השימוש הבא שלהם.
  3. בדיקת תגובתיות צולבת על ידי אימונובלוטינג
    1. נטרול חלבוני החיידקים על ידי ערבוב של 8 μL מכל אנטיגן עם נפח שווה של מאגר דגימה (0.5 M Tris-HCl; pH 6.8, 10% גליצרול [v/v], 10% SDS [w/v], ו-0.2% ברומופנול כחול), דגירה של התערובת בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      הערה: דנטורציה מבוצעת כדי לכסות את החלבונים עם מטען שלילי ולשבור את המבנים המשניים שלהם, מה שמאפשר להם לרוץ על פני ג'ל פוליאקרילאמיד ולהיות מופרדים על פי משקלם המולקולרי.
    2. הכפיף את החלבונים שעברו דנטורציה (100 מיקרוגרם חלבון/באר) לנתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) בשיטה של Laemmli22 עם 12 % ג'ל הפרדה וג'ל ערימה של 5%. לאחר מכן, העבירו את החלבונים באופן אלקטרופורטי לקרום הניטרוצלולוז בשיטה של Towbin et al.23.
    3. יש לטבול את קרום הניטרוצלולוז בחלב רזה 5% ב-PBS למשך 30 דקות כדי לחסום את המשטחים הפנויים. דגירה של כתמי החלבון בטמפרטורת החדר למשך שעתיים עם ארנב פוליקלונלי M. pneumoniae antiserum (המיוצר במכון פסטר של תוניס) מדולל ל 1/200 ב PBS-Tween 20, ולאחר מכן עם חזרת peroxidase (HRP) מצומד נגד ארנב IgG מדולל ל 1/2,000 ב PBS-Tween 20 במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
    4. שטפו את הנוגדנים הלא מאוגדים עם PBS וקבלו את התוצאות על ידי חשיפת יריעת הניטרוצלולוז לתמיסת המצע (4-כלורו-1-נפתול, H 2 O2). עצור את התגובה על ידי הוספת מים לאחר 5-15 דקות.
  4. הליך ספיחה
    הערה: כדי למנוע תגובות צולבות בין אנטי-סרום חיידקי M. דלקת ריאות פוליקלונלית לבין אנטיגנים של חיידקים הטרולוגיים, נעשה שימוש בהליך ספיחה שתואר קודם לכן על ידי בן עבד אלמומן ורועי24 .
    1. הכינו מאגר אנטיגן של 12 חיידקים הטרולוגיים (החשודים כחולקים אנטיגנים עם M. pneumoniae), ערבבו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה, והתאימו את ריכוז החלבון המתאים למחצית מהאנטי-סרום שייספג בניסוי.
      הערה: עוצמת הקול והריכוז משתנים בין המבחנים השונים. שלב זה תלוי בעיקר בריכוז הנוגדן שיש לספוח. לדוגמה, אם ריכוז הנוגדנים = 3.56 מ"ג/מ"ל, ריכוז מאגר האנטיגנים (המורכב מ-12 חיידקים הטרולוגיים) צריך להיות 1.78 מ"ג/מ"ל (לכן, כ-0.148 מ"ג מכל אנטיגן).
    2. צנטריפוגה תערובת אנטיגן ב 14,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, לאסוף את הכדור pooled, ולדגור אותו עם אנטי שבטי מטוהרים אנטי M. דלקת ריאות IgG במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה איטית.
    3. לאחר הדגירה, צנטריפוגה ההשעיה ב 14,000 x g במשך 10 דקות ב 4 °C ולשחזר את supernatant (אשר מתאים פוליקלונלי ספציפי M. דלקת ריאות antiserum).
      הערה: כדי להבטיח ספציפיות של אנטיסרום M. דלקת ריאות פוליקלונלית , חזור על הליך ספיחה שלוש פעמים. לפני שניתן יהיה להשתמש בו במבחן ELISA, יש לבדוק את האנטיסרום הפוליקלונלי M. pneumoniae על ידי immunoblotting על היעדר תגובות צולבות נגד קבוצת החיידקים הכלולה.

2. צעדי עליזה: הבדיקה עצמה

  1. ציפוי מיקרו-פלטה עם נוגדן הלכידה
    1. יש לדלל את נוגדן הלכידה (M. pneumoniae טרום-ספיחה פוליקלונלית אנטיסרום) לריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל בחיץ קרבונט-ביקרבונט 0.1 M (pH 9.6).
    2. מצפים את צלחת ELISA בעלת 96 הבארות על ידי הוספת 100 μL של נוגדן הלכידה המדולל לכל באר.
    3. לאחר דגירה של לילה ב -4 מעלות צלזיוס, הסר את תמיסת הציפוי ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ הכביסה (הרכב [לכל L]: 146.29 גרם של NaCl, 39.4 גרם של Tris-HCl, 0.2 גרם של Thimerosal, ו 0.5 mL של Tween 20; pH 7.3).
  2. חסימת
    1. חסום את משטחי הקשירה הנותרים של הבארות המצופות על ידי הוספת 100 μL של תמיסת החסימה (0.5% קזאין ב- PBS) לכל באר.
    2. לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    3. הסר את הפתרון החוסם עם פיפטה ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם מאגר הכביסה.
  3. יישום של האנטיגן
    1. הוסיפו כמות שווה של חלבונים מלאים מדלקת ריאות M. לכל הבארות המצופות (10 ננוגרם/באר).
    2. אפשרו לתגובה להתרחש במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
    3. הסר את עודף של תמיסת אנטיגן ולשטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ כביסה.
  4. יישום דגימות הבדיקה והבקרות
    1. לדלל את דגימות הבדיקה (סרה אנושית) ובקרות (הפניה חיובית ושלילית) ל 1/200, 1/400, ו 1/800 ב- PBS-Tween 20.
    2. הוסף 100 μL של דגימות מדולל ובקרות לתוך הבארות המתאימות. בצע כל תגובה בשכפול. סמן את הבארות שאינן מכילות לא אנטיגן ולא סרה כריקות.
    3. לאחר דגירה של הצלחת במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר, הסר את תמיסות הסרום ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ הכביסה.
  5. יישום נוגדן זיהוי מצומד אנזים
    1. דלל את נוגדני הזיהוי המצומדים לאנזימים, נוגדנים מצומדים נגד ארנב HRP ו- IgG אנטי-אנושי ל-1/10,000 ב- PBS-Tween 20.
    2. פיפטה 100 μL של נוגדן זיהוי מדולל כראוי לכל באר.
    3. לאחר דגירה של הצלחת במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בחושך, הסר את נוגדני הזיהוי הבלתי מאוגדים ושטוף את הצלחת חמש פעמים עם חיץ הכביסה.
  6. איתור וניתוח נתונים
    1. הוסף 100 μL מתמיסת הכרומוגן Tetramethyl-benzidine (TMB) בגודל 3,3', 5,5' כדי להמחיש את קשירת האנטיגן-נוגדנים.
    2. אפשרו לצלחת להתפתח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר מתמיסת העצירה (7.5% H2SO4) כדי לעצור את התגובה האנזימטית.
    3. קרא את הספיגה באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא המיקרו-פלטות ומיין את התוצאות על סמך חישוב מדד החיוביות (IP).
      IP = ספיגת הסרום הנבדק / ספיגת החתך
      IP < 0.7: תוצאה שלילית
      IP = 0.7: יש לחזור על הבדיקה תוך שבועיים
      IP > 0.7: תוצאה חיובית
      הערה: נוסחת ה- IP נתפסת במעבדה והערך 0.7 מוגדר לאחר מיטוב. עבור תגובות כפולות, מחושב הערך הממוצע של הספיגה. דילול אופטימלי בסרום וריכוז אנטיגן נקבעים בשיטת טיטרציה של לוח משבצות ELISA (הנתונים אינם מוצגים). ערך חיתוך = OD (צפיפות אופטית) של סרום חיובי ייחוס (מדולל באותו דילול כמו הדגימה). OD זה צריך להיות גבוה לפחות פי שלושה מערך ה- OD של הפקד השלילי.

3. שלבים לאחר ELISA: הערכת תוצאות ואימות בדיקות

  1. היכולת של ELISA הפנימית לאבחן באופן ספציפי זיהום M. דלקת ריאות בחולים שנבדקו מוערכת באמצעות אימונובלוטים משלימים באמצעות אנטיגנים של M. pneumoniae והחיידקים ההטרולוגיים כדי לאשר את החיוביות של sera האדם הנבדק בנוגדנים לדלקת ריאות M. ואת השליליות שלהם בחיידקים חשודים אחרים (הנתונים לא מוצגים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפעילות החיסונית של מיקופלסמה אנטי-סרום פוליקלונלית שאינה נספגת לחיידקים הטרולוגיים
תגובתיות צולבת אכן קיימת כפי שמוצג בתוצאות האימונובלוטינג (איור 2) ובהשוואה לבקרה החיובית (נתיב 1), חלק מהאנטיגנים של M. pneumoniae משותפים לחיידקים המוקרנים. עוצמת התגובות הצולבות הללו הייתה משתנה. לדוגמה, אנטיגנים M. gallisepticum ו- M. imitans הראו את התגובה החזקה ביותר עם M. pneumoniae antiserum (נתיבים 9 ו -10), מלבד היותם מיקופלסמות עופות. בניגוד לכך, אף אחד משני המבודדים הקליניים האנושיים של אוריפלסמה אוריאליטיקום לא הראה תגובתיות כלשהי (נתיבים 7 ו-8). עם זאת, אנטיגנים של שאר מיני המין Mycoplasma האנושיים M. hominis, M. fermentans, ו- M. genitalium הניבו תגובות צולבות ניכרות עם M . pneumoniae antiserum (נתיבים 11, 12, ו -13, בהתאמה). Escherichia coli (נתיב 2), Pseudomonas aeruginosa (נתיב 4) ו - Klebsiella pneumoniae (נתיב 6) הגיבו גם הם עם נוגדנים פוליקלונליים M. דלקת ריאות , ודפוס הפרופיל האנטיגני שלהם היה דומה מאוד. פרופיל זה היה שונה במקצת מזה של שני מיני חיידקי הקוקסי סטרפטוקוקוס דלקת ריאות וסטפילוקוקוסאורוס; התגובה הייתה פחות עם S. דלקת ריאות (נתיב 3) ועוד פחות עם S.aureus (נתיב 5).

ספציפיות של נוגדנים לדלקת ריאות Mycoplasma מובטחת על ידי הליך ספיחה
לאחר ספיחה של אנטי-סרום פוליקלונלי של M. pneumoniae כנגד האנטיגנים החיידקיים ההטרולוגיים, הספציפיות נבדקה על-ידי אימונובלוטינג (איור 3). מלבד כמה חלבונים של אנטיגן M. pneumoniae שנחשפו בנתיב 1 (בקרה חיובית), האנטיגנים האחרים כמעט ולא זוהו לחלוטין (נתיבים 2-13). החלבונים שנחשפו בנתיב 1 הם למעשה החלבונים הספציפיים שזוהו על ידי נוגדני M. דלקת ריאות ספציפיים שנותרו לאחר ספיחה. בהתבסס על תוצאה זו, היעילות של הליך ספיחה הוכחה, שכן נתקל תגובות לא ספציפיות של M. דלקת ריאות polyclonal antiserum עם אנטיגנים הטרולוגיים, שתוארו לעיל, בוטלו. M. pneumoniae antiserum שניתנה ספציפית שימשה אז בכל הבדיקות הסרולוגיות והאימונובלוטיות הבאות.

לכידה-אנטיגן ELISA: בדיקה תקפה לפעילות סרודיאגנוסטית שגרתית במעבדה
מאחר שכל הסרות נבדקו בבארות כפולות עבור הדילולים השונים, חושבו ערכי ממוצע OD וגרף עמודות המתאם את ערכי הספיגה האלה לדילולי הסרום המתאימים להן (איור 4). בהתבסס על חישוב IP, קבוצה של sera אנושי נבדק והוצג במאמר זה הוכיח חיובי עבור M. דלקת ריאות IgG. מספר סטים אחרים של סרום נבדקו גם הם באמצעות ELISA תוצרת בית זה, ובכל פעם הבדיקה הוכיחה יעילות בזיהוי ספציפי של M. pneumoniae IgG ובכך להבחין בין החולים הנגועים בדלקת ריאות M. לבין אלה שאינם נגועים (נתונים לא מוצגים).

תוצאות ELISA אושרו תמיד על ידי מספר ניתוחי אימונובלוט בו זמנית שהראו את החיוביות ב- M. pneumoniae ואת השליליות בכל החיידקים האחרים של כל סרום נבדק שנמצא חיובי על ידי אנטיגן הלכידה הפנימית M. דלקת ריאות ELISA (הנתונים לא מוצגים).

Figure 1
איור 1: הצגה סכמטית של ELISA ללכידת אנטיגן שפותחה במעבדה לזיהוי ספציפי של דלקת ריאות מיקופלסמה IgG. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: ניתוח אימונובלוט של תגובות צולבות בין דלקת ריאות מיקופלסמה לבין קבוצה של חיידקים הטרולוגיים. התגובה של M. pneumoniae non-adsorbed polyclonal antiserum נבדקה נגד אנטיגנים של Escherichia coli (נתיב 2), סטרפטוקוקוס דלקת ריאות (נתיב 3), Pseudomonas aeruginosa (נתיב 4), Staphylococcus aureus (נתיב 5), דלקת ריאות קלבסיאלה (נתיב 6), שני אוריפלסמה אוריאלמציה אוריאליטיקום מבודדים (נתיבים 7 ו -8), M. imitans (נתיב 9), M. gallisepticum (נתיב 10), M. hominis (נתיב 11), M. fermentans (נתיב 12), ו - M. genitalium (נתיב 13). נתיב 1: M. דלקת ריאות (שליטה חיובית). משקלים מולקולריים של כמה חלבונים עיקריים של M. דלקת ריאות ניתנו בצד שמאל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אישור אימונובלוט ליעילות הליך הספיחה כדי למנוע תגובות צולבות. תגובתיות של כל החיידקים ההטרולוגיים שנבחרו; Escherichia coli, סטרפטוקוקוס דלקת ריאות, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, קלבסיאלה דלקת ריאות, שני אוריפלסמה urealyticum מבודדים, M . imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans, ו- M. genitalium (נתיבים 2-13 , בהתאמה) נבדקו כנגד האנטיסרום הפוליקלונלי M. pneumoniae הנספג. אנטיגן M. pneumoniae נטען בנתיב 1 כבקרה חיובית (רק חלבונים ספציפיים נחשפו). נתיב MW: סולם חלבון מוכתם מראש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: תוצאות של ELISA ללכידת אנטיגן. ה- ELISA בוצע באמצעות האנטיסרום הפוליקלונלי Mycoplasma pneumonia הספיח כחומר ציפוי. תרשימי עמודות 1 ו-2 מתארים בקרות שליליות וחיוביות, בהתאמה. גרפים של עמודות 3-13 מתארים את הסרה של קבוצת חולים שנבדקו. כל סרום נבדק בשלושה דילולים שונים: 1/200 (פסים סגולים), 1/400 (פסים כתומים) ו-1/800 (פסים כחולים). ערכי OD שימשו לחישוב מדד החיוביות. כל תגובה בוצעה בשכפול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

מיקרואורגניזם זן* בינוני הפניה
מיקופלסמה ואורפלסמה מינים מיקופלסמה דלקת ריאות ATCC 160 20030 SP4 [35]
מיקופלסמה גניטליום CIP 103767T SP4
מיקופלסמה פרמנטנים ATCC 160 20026 SP4
מיקופלסמה הומיניס CIP 103715T SP4 בתוספת ארגינין
אוריפלסמה אוריאליטיקום 2 מבודדים קליניים** SP4 בתוספת אוריאה
מיקופלסמה גליספטיקום CIP S6 15302 פריי [36]
מיקופלסמה אימיטנים ATCC 160 20037 פריי
חיידקים אחרים Escherichia coli ATCC 25922 מרק ק"ג [37]
קלבסיאלה דלקת ריאות בידוד קליני*** מרק ק"ג
פסאודומונס ארוגינוסה ATCC 27853 מרק ק"ג
סטפילוקוקוס אאורוס ATCC 25923 מרק ק"ג
סטרפטוקוקוס דלקת ריאות בידוד קליני*** מרק דם
* ATCC: אוסף תרבות מסוג אמריקאי, CIP: אוסף מכון פסטר
** מבודדים נאספו מדגימות קליניות שנשלחו מרצון למעבדה של מיקופלסמות (מכון פסטר של תוניס) לאבחון שגרתי
מבודדים נאספו מדגימות קליניות שנשלחו מרצון למעבדה לבקטריולוגיה (מכון פסטר של תוניס) לאבחון שגרתי

טבלה 1: רשימת זני החיידקים ששימשו במחקר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מציג תיאור כללי של ELISA פנימי שפותח בעיקר כדי להבטיח סינון ספציפי של M. pneumoniae זיהום. הפרטים על הפרוטוקול של מבחן ELISA עצמו, כמו גם כמה שלבים לפני ואחרי העיבוד מסופקים. הספציפיות של בדיקה זו מובטחת על ידי טכניקת ספיחה. הליך זה תואר בעבר בבדיקות ELISA שפותחו לאבחון בני אדם ועופות Mycoplasmas17,24. הוא שימש גם במבחני ELISA לאבחון זיהומים חיידקיים אחרים כגון מחלת ליים25. בשלושת המאמרים הללו, ספיחה הוכחה כמסייעת בהגברת הספציפיות של ELISA מבלי להפחיד או להקטין את הרגישות17,24,25. במקרה של בדיקת ELISA הנוכחית, ניתן לחלק את מיני החיידקים המתאימים שנבחרו לספיחה לשתי קבוצות: הקבוצה הראשונה מכילה כמה מינים פתוגניים של בני אדם ועופות (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumו M. imitans), ואילו השני מכיל את החיידקים השכיחים ביותר הידועים כמדביקים בני אדם (E. coli, P. aeruginosaו S. aureus) ואלה הידועים לשמצה בטרופיזם שלהם לדרכי הנשימה (K. pneumoniae ו S. pneumoniae). המבחר הרחב של חיידקים הטרולוגיים התבסס על העובדה שהדוגמה של מינים וספציפיות איברים אינה מכובדת עוד. דיווחים רבים על איתור מיקרואורגניזמים בבתי גידול לא מוכרים פורסמו בעבר. לדוגמה, M. pneumoniae בודדה מאתרים חוץ-ריאתיים רבים ונמצאה קשורה למגוון רחב של סיבוכים חוץ-ריאתיים עם תסמינים קלים עד חמורים, אם כי ההנחה הייתה שהיא ספציפית לדרכי הנשימה6,7. המקרה ההפוך (בידוד איברי המין Mycoplasma מינים מדרכי הנשימה) היה מסומן עבור M. hominis ו M. fermentans26,27. הכללת העופות Mycoplasma SPP. במבחן serodiagnosis של זיהום אנושי התבסס על מחקרים קודמים שדיווחו על אפשרות של הידבקות בבני אדם (בעיקר אנשים מדוכאי חיסון ווטרינרים) עם Mycoplasma spp. מקורו בחיות בית28,29,30. נכון שעד כה לא נמצא נייר המעורר את בידודו של M. gallisepticum ו M. imitans (שני המינים הכלולים בהליך הספיחה במאמר זה) מבני אדם. למרות זאת, שום דבר אינו בלתי אפשרי, במיוחד מכיוון שמינים אלה הם בין המינים המטופלים באופן קבוע ביותר על ידי וטרינרים והם קרובים מדי מבחינה פילוגנטית ל M. pneumoniae. למעשה, שני העופות האלה Mycoplasma spp. הראו את התגובה החזקה ביותר עם M. pneumoniae אנטיסרום (כפי שמודגם ב תרשים 2). בקצרה, בעת תכנון הליך הספיגה, ספקטרום גדול יחסית של חיידקים חשודים שיכולים לחלוק אנטיגנים עם M. pneumoniae נכלל. הבחירות שנעשו התבססו על קרבה פילוגנטית וטרופיזם לדרכי הנשימה. עם זאת, בשל מגוון הצומח האנושי והשונות האנטיגנית, אי אפשר לחזות ולכלול את כל מיני החיידקים והזנים ההטרולוגיים האפשריים שיכולים להגיב עם M. pneumoniae נוגדנים. לפיכך, האפשרות של תגובה צולבת בין M. pneumoniae antiserum, גם לאחר ספיחה, וחיידקים אחרים נשאר סביר. יתר על כן, מאז M. pneumoniae ידוע בדרך כלל להדביק ילדים ומבוגרים צעירים, הליך ספיחה יכול להשתפר עוד יותר בעתיד על ידי תוספת של פתוגנים נשימתיים אחרים לילדים כגון Haemophilus influenzae31 ו Streptococcus pyogenes32 לתוך הרשימה הקצרה של חיידקי הספיגה.

מטרת ELISA זה היא לזהות את נוכחותו של נוגדן המטרה (ספציפי M. דלקת ריאות-IgG) בסרה האנושית. לכן, כדי להיות מסוגל הן להשתמש בסרום כמדגם (שכן הוא הכי קל לאסוף פחות כואב עבור המטופלים) וכדי להבטיח ספציפיות, ELISA בתוך הבית מבוסס על העיקרון של שני סוגים ELISA: עקיף כריך ELISA. דגימת הסרום (נוגדן ראשוני) קשורה בין נוגדן הזיהוי (המסומן כנוגדן שני) לבין אנטיגן הלכידה, אשר נקשר באופן ספציפי לנוגדן הלכידה (לפני כן הפך ספציפי על ידי ספיחה ומשותק על משטח המיקרופלטה). בהתחשב במאפיינים ייחודיים אלה, הוא האמין כי ELISA זה יעיל ומיוחד. עם זאת, מבחן זה אינו מושלם, וצרות יכולות להתרחש. עדיין ניתן להיתקל בתוצאות חיוביות כוזבות ושליליות שגויות, לעיתים בגלל איכות הסרום או שלב ההדבקה, ולעיתים בגלל טעויות במהלך יישום הפרוטוקול במעבדה. לדוגמה, תוצאות ELISA serodiagnosis יכול להיות מושפע גם אם הבארות אינן נשטפות מספיק. כמו כן, הדגירה (טמפרטורה וזמן) יכולה להשפיע על תוצאות הבדיקה. כמו כן, דווח כי בחירת מיקרו-פלטות וחומרי חסימה היא צעד קריטי במהלך פיתוחELISA 33,34. מכל הסיבות הללו, חשוב לפעול ללא הרף לשיפור בדיקת ELISA זו על מנת לקבוע את הפרמטרים והתנאים האופטימליים, כגון דילול הנוגדנים השונים (דגימות סרום, נוגדן לכידה, זיהוי נוגדנים), שלבי הדגירה והכביסה, והכללת הבקרות השליליות והחיוביות המתאימות.

תרבית החיידקים וייצור האנטיגנים שלהם לביצוע הליך הספיחה יכולים להיחשב כצעד כבד, במיוחד עבור מיני Mollicutes. עם זאת, הוא האמין כי זה חשוב כמו צעד זה מסייע מאוד בשיפור הספציפיות ELISA והימנעות בדיקות אישור נוספות כגון immunoblotting או PCR. יתר על כן, בהקשר של זיהום M. pneumoniae, אבחנה יעילה ואמינה בהחלט נדרשת על מנת לקבוע טיפול אנטיביוטי הולם ומתאים, שכן השימוש בתרופות בטא לקטאם לטיפול בדלקת ריאות הנרכשת בקהילה אינו יעיל נגד M. דלקת ריאות8. לאחר שנים של שימוש בפעילות אבחון שגרתית במעבדה, הוא האמין כי ELISA לכידת אנטיגן, המתואר במאמר זה, מייצג כלי תקף להקרנה ספציפית של זיהום M. דלקת ריאות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

המחקר מומן על ידי משרד הבריאות התוניסאי והמשרד התוניסאי להשכלה גבוהה ולמחקר מדעי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf (2022).
  34. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  35. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  36. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  37. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Tags

ביולוגיה גיליון 192
בדיקת חיסון הקשורה לאנזים לכידת אנטיגן לזיהוי ספציפי של <em>דלקת ריאות מיקופלסמה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter