Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Antigen-fangst enzymbundet immunosorbentanalyse for spesifikk påvisning av Mycoplasma pneumoniae

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

Ved Mycoplasma pneumoniae-infeksjon kan serologitester gi gode resultater, men med lav spesifisitet på grunn av immunologisk kryssreaksjon. Den interne antigenfangsten ELISA, beskrevet i dette papiret, garanterer høy artsspesifisitet og har vist seg å være en pålitelig screeningstest for nøyaktig diagnose av M. pneumoniae.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae er en cellevegg-mangelfull prokaryote, hovedsakelig kjent for å kolonisere den menneskelige luftveiene og å være endemisk, med epidemiske topper hvert 6. år, hos eldre barn og unge voksne. Diagnose av M. pneumoniae er utfordrende på grunn av patogenes raske natur og muligheten for asymptomatisk transport. Laboratoriediagnostikk av M. pneumoniae-infeksjon basert på antistofftitrering i serumprøver av pasienter er fortsatt den mest praktiserte metoden. På grunn av det potensielle problemet med immunologisk kryssreaktivitet ved bruk av polyklonalt serum for M. pneumoniae, er det utviklet en antigen-fangst enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) for å forbedre spesifisiteten til serologisk diagnose. ELISA-plater er belagt med M. pneumoniae polyklonale antistoffer, oppdratt hos kaniner og gjort spesifikke etter adsorpsjon mot et panel av heterologe bakterier som deler antigener med M. pneumoniae-arter og/eller er kjent for å kolonisere luftveiene. De reagerte M. pneumoniae homologe antigenene blir da spesifikt gjenkjent av deres tilsvarende antistoffer i serumprøvene. Ytterligere optimalisering av de fysisk-kjemiske parametrene som antigenfangsten ELISA blir utsatt for, førte til en svært spesifikk, sensitiv og reproduserbar ELISA.

Introduction

Mykoplasmer er blant de minste og enkleste kjente prokaryoter. De skiller seg hovedsakelig fra andre bakterier ved mangel på en celleveggstruktur. Dermed ble mykoplasmer klassifisert i en egen klasse kalt Mollicutes1. Celleveggmangelen gir iboende motstand mot disse mikroorganismer mot noen antimikrobielle midler og er i stor grad ansvarlig for deres polymorfisme. Mykoplasmer har lite genom og redusert størrelse, noe som begrenser deres metabolske og biosyntetiske evner og forklarer deres parasittiske og saprofytiske natur1.

Mycoplasma pneumoniae er en av mykoplasmaene som infiserer mennesket og antas å være den mest virulente2. M. pneumoniae koloniserer øvre luftveier, noe som fører til atypisk lungebetennelse hos barn og unge voksne. De kliniske tegnene som følge av M. pneumoniae-infeksjon er influensalignende, med hodepine, feber og hoste3. Cytadherensen av M. pneumoniae til vertsceller er mediert av en festeorganell inkludert P1 major-adhesjon og flere tilbehørsproteiner 4,5. Flere kliniske manifestasjoner kan oppstå på grunn av lokal betennelse og stimulering av vertsimmunsystemet som følge av intim tilslutning av M. pneumoniae til luftveisslimhinnen6. Selv om lungebetennelse er et kjennetegn på M. pneumoniae-infeksjon, har det blitt avslørt at infeksjon med denne bakterien også kan være ansvarlig for et bredt spekter av ikke-pulmonale manifestasjoner på forskjellige anatomiske steder som sentralnervesystemet, hjerte, hud og ledd.

Som for alle Mycoplasma-arter er diagnosen M. pneumoniae utfordrende. De kliniske tegnene som fremkaller mykoplasmose er for det meste inapparent og ikke-karakteristiske8. Siden det er svært vanskelig å diagnostisere M. pneumoniae-infeksjon ved bare å stole på kliniske manifestasjoner og symptomer, er laboratoriescreening av særlig interesse9. Å oppdage M. pneumoniae-kolonier etter kultur er gullstandardmetoden for en riktig diagnose. Imidlertid kompliserer de raske vekstkravene og den lange tiden som trengs for levering av endelige resultater (1-2 uker) kulturen, og betyr dermed at den sjelden brukes til rutinemessig diagnose10. Nukleinsyreforsterkningsteknologier ble validert når det gjelder hastighet og effektivitet, men på grunn av deres relativt høye kostnader og utilgjengelighet i enkelte helseinstitusjoner, betraktes disse molekylære teknikkene ikke som førstelinjediagnostiske tester. Det er sant at kommersielle PCR-tester er mye brukt til å diagnostisere M. pneumoniae-infeksjoner, men de kan fortsatt ikke erstatte serologi. Også den hyppige forekomsten av både falske negative og falske positive resultater har begrenset bruken av PCR9. Rutinemessig er serologi fortsatt den mest praktiserte i laboratorier for diagnose av M. pneumoniae-infeksjon. Flere serologitilnærminger har blitt rapportert i flere tiår, for eksempel kalde hemagglutininer, komplementfikseringstest11, indirekte hemagglutinasjonstest 12, immunfluorescens 13 og teknologien til ELISA, som først ble brukt på mykoplasma-serologi tidlig på 1980-tallet14,15,16. Et av de store problemene som oppstår ved utførelse av ELISA-serodiagnose av M. pneumoniae-infeksjon er kryssreaksjoner, noe som reduserer teknikkens spesifisitet betydelig. Ikke-spesifikk adsorpsjon av human sera med M. pneumoniae-antigener ble tidligere rapportert; Faktisk kan mange av antistoffene oppdaget av ELISA i human sera ikke alltid være bundet til mykoplasmatale antigener 17, på grunn av likheten til M. pneumoniae med noen bakterier18,19 og noen dyre- og menneskevev20.

På grunn av de høye bakgrunnsavlesningene som ble observert i den konvensjonelle ELISA-testen som ble praktisert i laboratoriet, var tolkningen av resultatene ofte komplisert, og dermed var levering av en riktig M. pneumoniae-diagnose en tøff oppgave. Mens vi møtte dette problemet, valgte vi å forbedre M. pneumoniae ELISA ved å fjerne ikke-spesifikke reaksjoner av M. pneumoniae-antigener med antistoffer som skal testes . For dette formålet jobbet vi med selektiv uttømming av de ikke-spesifikke M. pneumoniae-antigenene ved hjelp av adsorpsjonsteknikken. Faktisk er hovedmålet med antigenfangst ELISA å spesifikt oppdage M. pneumoniae immunoglobulin (Ig) G i humane serumprøver. Konseptet med denne ELISA består hovedsakelig av selektiv fangst av M. pneumoniae-spesifikke antigener, før tilsetning av humane serumprøver. Denne selektiviteten er forsikret ved å inkubere M. pneumoniae råantigen med et M. pneumoniae polyklonalt antiserum, produsert hos kaniner i laboratoriet og gjøre det artsspesifikt ved adsorpsjon mot et panel av heterologe bakterier, som tilhører eller ikke tilhører Mollicutes-klassen, deler antigener med M. pneumoniae arter og/eller kjent for å kolonisere luftveiene. Adsorpsjonsprosedyren ble gjentatt tre ganger, og effektiviteten for å eliminere kryssreaktivitet ble testet ved immunoblotting. Den utviklede ELISA-analysen er en kombinasjon av sandwich og indirekte ELISA. Kort fortalt blir brønnene på ELISA-platen først belagt med et polyklonalt antiserum spesifikt for M. pneumoniae. Deretter tilsettes M. pneumoniae-antigen og fanges mellom antiserumet og antistoffene som er tilstede i serumprøven som skal testes. Det dannede immunologiske komplekset påvises av et sekundært enzymkonjugert antistoff (peroksidasekonjugert IgG). Reaksjonene visualiseres ved tilsetning av kromogent substrat, og absorbansen måles spektrofotometrisk. Denne interne ELISA er skjematisk presentert i figur 1. Den hjemmelagde ELISA viste seg å være effektiv i å spesifikt oppdage M. pneumoniae-infeksjon og er for tiden en av de mest praktiserte testene i rutinemessig diagnostisk aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien er utført i samsvar med etiske aspekter etablert av den etiske komiteen for Pasteur Institute of Tunis.

1. Pre-ELISA trinn: Forutsetninger og forbehandling

  1. Bakteriestammer og vekstmedier
    MERK: Mollicutes-arter og de inngjerdede bakteriene som ble brukt i denne studien og deres vekstmedier er oppført i tabell 1.
    1. Vekst av Mollicutes-arter
      1. Inokulere 200 μL fra glyserolbestanden av hver art i 1,800 μL av mediet.
      2. Dyrk Mollicutes-arter statisk ved 37 °C med 5% CO 2 i2-4 dager til en pH-endring observeres (pH-indikatoren er fenolrød).
      3. Skaler opp kulturene til 10 ml ved å legge til en 1/10th fortynning av kulturen til media og la dem vokse igjen under de samme forholdene.
        MERK: Ifølge stoffskiftet alkaliserer noen humane Mollicutes-arter (M. pneumoniae, M. genitalium og M. fermentans) mediet på grunn av glukosegjæring, og noen andre (M. hominis og Ureaplasma) alkaliserer mediet ved henholdsvis argininhydrolyse eller ureahydrolyse. Når det gjelder aviære mykoplasmer, demonstrerer forsuringen av Freys medium tilstedeværelsen av M. gallisepticum, mens alkaliniseringen viser veksten av M. imitans.
      4. Spred 50 μL av kulturene på agarplater for å bekrefte bakteriens vekst. Oppretthold agarplatene ved 37 °C med 5% CO2 og observer dem regelmessig under mikroskopet for utseendet til typiske stekte eggkolonier (Mycoplasmas) og mørke kråkebollelignende kolonier (Ureaplasmas).
    2. Vekst av ikke-Mollicutes arter
      1. Dyrk ikke-Mollicutes-bakteriene i 3 ml av mediet ved 37 °C over natten (risting ved 200 o / min).
      2. Sammenlign kulturens turbiditet med kontrollmediene for å bekrefte veksten.
      3. Skaler opp kulturene til 10 ml ved å legge til en 1/100th fortynning av kulturen til media og la dem vokse igjen under de samme forholdene.
  2. Antigen forberedelse
    1. Antigen forberedelse av Mollicutes arter
      1. Høst hele proteinene (tilstede i bekreftede kulturer av M. pneumoniae og de andre Mollicutes-artene) ved sentrifugering ved 40 000 x g ved 4 ° C i 30 minutter.
      2. Kast supernatanten og vask pellets tre ganger med 1 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4) med en serie på tre sentrifugeringer med samme forhold.
      3. Resuspend hvert antigen i 500 μL PBS.
    2. Antigen forberedelse av ikke-Mollicutes arter
      1. Sentrifuge nattens dyrkede kulturer av ikke-Mollicutes-bakteriene ved 1,500 x g i 15 minutter.
      2. Resuspend hver bakteriepellet i 500 μL PBS.
        MERK: Proteinkonsentrasjonen bestemmes ved hjelp av den klassiske Bradford-kvantifiseringsmetoden med bovint serumalbumin som standard21. Proteinkonsentrasjonen av Mollicutes-arter varierer vanligvis mellom 0,7-4,8 mg / ml. For de andre bakterieartene kan proteinkonsentrasjonen nå 20 mg/ml. Alle antigener lagres ved -20 °C til senere bruk.
  3. Kryssreaktivitetsscreening ved immunblotting
    1. Denaturere bakterieproteinene ved å blande 8 μL av hvert antigen med et likt volum prøvebuffer (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glyserol [v/v], 10% SDS [w/v] og 0,2% bromfenolblå), inkuber blandingen ved 100 °C i 5 minutter.
      NOTAT: Denaturering utføres for å dekke proteinene med negativ ladning og for å bryte deres sekundære strukturer, noe som gjør at de kan løpe over polyakrylamidgelen og separeres i henhold til deres molekylvekter.
    2. Utsett de denaturerte proteinene (100 μg protein/brønn) for natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ved Laemmlis metode22 med 12 % separerende gel og 5% stablingsgel. Deretter overfører du proteinene elektroforetisk til nitrocellulosemembranen ved hjelp av Towbin et al.s metode23.
    3. Senk nitrocellulosemembranen i 5% skummet melk i PBS i 30 minutter for å blokkere de ledige overflatene. Inkuber proteinflekkene ved romtemperatur i 2 timer med kanin polyklonal M. pneumoniae antiserum (produsert ved Pasteur Institute of Tunis) fortynnet til 1/200 i PBS-Tween 20, deretter med pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert antikanin IgG fortynnet til 1/2 000 i PBS-Tween 20 i 1 time ved romtemperatur.
    4. Vask av de ubundne antistoffene med PBS og oppnå resultatene ved å utsette nitrocelluloseplaten for substratoppløsningen (4-klor-1-nafthol, H2O2). Stopp reaksjonen ved å tilsette vann etter 5-15 minutter.
  4. Adsorpsjon prosedyre
    MERK: For å eliminere kryssreaksjoner mellom polyklonale M. pneumoniae antiserum og heterologe bakterieantigener, brukes adsorpsjonsprosedyren tidligere beskrevet av Ben Abdelmoumen og Roy24 .
    1. Forbered en antigenpool av de 12 heterologe bakteriene (mistenkt for å dele antigener med M. pneumoniae), bland den i et mikrosentrifugerør og juster proteinkonsentrasjonen som tilsvarer halvparten av antiserumet som skal adsorberes i forsøket.
      MERK: Volumet og konsentrasjonen varierer mellom de forskjellige analysene. Dette trinnet avhenger hovedsakelig av konsentrasjonen av antistoffet som skal adsorberes. For eksempel, hvis antistoffkonsentrasjonen = 3,56 mg/ml, bør konsentrasjonen av antigenpoolen (sammensatt av de 12 heterologe bakteriene) være 1,78 mg/ml (derfor ca. 0,148 mg av hvert antigen).
    2. Sentrifuger antigenblandingen ved 14 000 x g i 10 minutter ved 4 °C, samler den samlede pelleten og inkuberer den med den rensede polyklonale anti-M. pneumoniae IgG i 2 timer ved 37 °C med langsom omrøring.
    3. Etter inkubering sentrifugerer du suspensjonen ved 14 000 x g i 10 minutter ved 4 °C og gjenoppretter supernatanten (som tilsvarer det spesifikke polyklonale M. pneumoniae antiserumet).
      MERK: For å sikre spesifisitet av polyklonalt M. pneumoniae antiserum, gjenta adsorpsjonsprosedyren tre ganger. Før det kan brukes i ELISA-analysen, bør det adsorberte polyklonale M. pneumoniae antiserumet testes ved immunoblotting for fravær av kryssreaksjoner mot det inkluderte settet av bakterier.

2. ELISA-trinn: Selve analysen

  1. Mikroplatebelegg med fangstantistoffet
    1. Fortynn fangstantistoffet (M. pneumoniae pre-adsorbert polyklonalt antiserum) til en konsentrasjon på 10 μg/ml i 0,1 M karbonat-bikarbonatbuffer (pH 9,6).
    2. Belegg ELISA-platen med 96 brønner ved å tilsette 100 μL av det fortynnede fangstantistoffet til hver brønn.
    3. Etter inkubering over natten ved 4 °C, fjern beleggløsningen og vask platen fem ganger med vaskebufferen (sammensetning [per L]: 146,29 g NaCl, 39,4 g Tris-HCl, 0,2 g Thimerosal og 0,5 ml Tween 20; pH 7,3).
  2. Blokkerer
    1. Blokker de gjenværende bindingsflatene til de belagte brønnene ved å tilsette 100 μL av blokkeringsløsningen (0,5% kasein i PBS) til hver brønn.
    2. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
    3. Fjern blokkeringsløsningen med en pipette og vask platen fem ganger med vaskebufferen.
  3. Påføring av antigenet
    1. Tilsett like mye M. pneumoniae hele proteiner til alle belagte brønner (10 ng / brønn).
    2. La reaksjonen finne sted i 2 timer ved romtemperatur.
    3. Fjern overskuddet av antigenoppløsningen og vask platen fem ganger med vaskebufferen.
  4. Anvendelse av testprøvene og kontrollene
    1. Fortynn testprøvene (human sera) og kontroller (referanse positiv og negativ sera) til 1/200, 1/400 og 1/800 i PBS-Tween 20.
    2. Tilsett 100 μL av de fortynnede prøvene og kontrollene i de aktuelle brønnene. Utfør hver reaksjon i duplikat. Merk brønnene som verken inneholder antigen eller sera som blanke.
    3. Etter inkubering av platen i 90 minutter ved romtemperatur, fjern serumløsningene og vask platen fem ganger med vaskebufferen.
  5. Påføring av enzymkonjugert deteksjonsantistoff
    1. Fortynn de enzymkonjugerte deteksjonsantistoffene, HRP-konjugert antikanin og anti-human IgG til 1/10 000 i PBS-Tween 20.
    2. Pipette 100 μL av det passende fortynnede deteksjonsantistoffet til hver brønn.
    3. Etter inkubering av platen i 1 time ved romtemperatur i mørket, fjern de ubundne deteksjonsantistoffene og vask platen fem ganger med vaskebufferen.
  6. Deteksjon og dataanalyse
    1. Tilsett 100 μL av kromogenoppløsningen 3,3', 5,5' tetrametylbenzidin (TMB) for å visualisere antigen-antistoffbindingen.
    2. La platen utvikle seg i 30 minutter ved romtemperatur, og tilsett deretter 100 μL av stoppoppløsningen (7,5% H2SO4) for å stoppe den enzymatiske reaksjonen.
    3. Les absorbansen ved 450 nm bølgelengde ved hjelp av mikroplateleseren og sorter resultatene basert på beregningen av positivitetsindeksen (IP).
      IP = Absorbans av det testede serum / Absorbans av cut-off
      IP < 0.7: Negativt resultat
      IP = 0,7: Testen skal gjentas innen 2 uker
      IP > 0.7: Positivt resultat
      MERK: IP-formelen er unnfanget i laboratoriet og 0,7-verdien er satt opp etter optimalisering. For dupliserte reaksjoner beregnes gjennomsnittsverdien av absorbans. Optimal serumfortynning og antigenkonsentrasjon etableres ved hjelp av ELISA-titreringsmetoden for sjakkbrett (data ikke vist). Grenseverdi = OD (optisk tetthet) av et referansepositivt serum (fortynnet ved samme fortynning som prøven). Denne OD-en bør være minst tre ganger høyere enn OD-verdien for den negative kontrollen.

3. Post-ELISA trinn: Resultatvurdering og testvalidering

  1. Den interne ELISAs evne til spesifikt å diagnostisere M. pneumoniae-infeksjon hos de testede pasientene evalueres gjennom supplerende immunobloter ved bruk av antigener av M. pneumoniae og de heterologe bakteriene for å bekrefte positiviteten til den testede humane sera i M. pneumoniae-antistoffer og deres negativitet i de andre mistenkte bakteriene (data ikke vist).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunoblottingsaktiviteten til det ikke-adsorberte polyklonale Mycoplasma pneumoniae antiserum til heterologe bakterier
Kryssreaktivitet eksisterer faktisk som vist i immunblottingsresultatene (figur 2), og sammenlignet med den positive kontrollen (Lane 1) deles noen av M. pneumoniae-antigenene med de screenede bakteriene. Intensiteten av disse kryssreaksjonene var variabel. For eksempel viste M. gallisepticum og M. imitans antigener den sterkeste reaktiviteten med M. pneumoniae antiserum (Lanes 9 og 10), foruten å være aviær mykoplasmer. I motsetning til dette viste ingen av de to humane kliniske isolatene av Ureaplasma urealyticum noen reaktivitet (Lanes 7 og 8). Antigener av de gjenværende humane genitale Mycoplasma-artene M. hominis, M. fermentans og M. genitalium ga imidlertid betydelige kryssreaksjoner med M. pneumoniae antiserum (henholdsvis Lanes 11, 12 og 13). Escherichia coli (Lane 2), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) og Klebsiella pneumoniae (Lane 6) reagerte også med polyklonale M. pneumoniae antistoffer , og deres antigene profilmønster var svært likt. Denne profilen var litt forskjellig fra de to kokkebakterieartene Streptococcus pneumoniae og Staphylococcusaureus; reaktiviteten var mindre med S . pneumoniae (Lane 3) og enda mindre med S.aureus (Lane 5).

Spesifisitet av Mycoplasma pneumoniae antistoffer garantert ved adsorpsjonsprosedyre
Etter adsorpsjon av M. pneumoniae polyklonalt antiserum mot de heterologe bakterielle antigenene ble spesifisiteten testet ved immunblotting (figur 3). Bortsett fra noen proteiner av M. pneumoniae-antigen avslørt i Lane 1 (positiv kontroll), var de andre antigenene nesten helt ikke-påvist (Lanes 2-13). De avslørte proteinene i Lane 1 er faktisk de spesifikke proteinene som oppdages av de spesifikke M. pneumoniae-antistoffene som er igjen etter adsorpsjon. Basert på dette resultatet ble effektiviteten av adsorpsjonsprosedyren bevist, siden de oppståtte ikke-spesifikke reaksjonene av M. pneumoniae polyklonalt antiserum med heterologe antigener, beskrevet ovenfor, ble eliminert. M. pneumoniae antiserum gjort spesifikt ble deretter brukt i alle de påfølgende serologiske og immunoblotting tester.

Fangstantigen ELISA: Gyldig analyse for rutinemessig laboratorieserodiagnostisk aktivitet
Siden alle sera ble testet i dupliserte brønner for de forskjellige fortynningene, ble OD-gjennomsnittsverdier beregnet og en søylediagram som korrelerte disse absorbansverdiene med deres tilsvarende serumfortynninger ble plottet (figur 4). Basert på IP-beregning viste settet med human sera testet og presentert i denne artikkelen seg å være positivt for M. pneumoniae IgG. Flere andre serumsett ble også testet ved hjelp av denne hjemmelagde ELISA, og hver gang viste analysen seg å være effektiv i å spesifikt oppdage M. pneumoniae IgG og dermed skille de M. pneumoniae-infiserte pasientene fra de uinfiserte (data ikke vist).

ELISA-resultater ble alltid bekreftet av flere immunoblotanalyser samtidig som viste positiviteten i M. pneumoniae og negativiteten i alle de andre bakteriene i et hvilket som helst testet serum som ble funnet å være positivt av det interne fangstantigenet M. pneumoniae ELISA (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk presentasjon av antigenfangsten ELISA utviklet i laboratoriet for spesifikk påvisning av Mycoplasma pneumoniae IgG. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Immunblotanalyse av kryssreaksjoner mellom Mycoplasma pneumoniae og et sett heterologe bakterier. Reaktiviteten til M. pneumoniae ikke-adsorbert polyklonalt antiserum ble testet mot antigener av Escherichia coli (Lane 2), Streptococcus pneumoniae (Lane 3), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4), Staphylococcus aureus (Lane 5), Klebsiella pneumoniae (Lane 6), to Ureaplasma urealyticum isolater (Lanes 7 og 8), M. imitans (Lane 9), M. gallisepticum (Lane 10), M. hominis (Lane 11), M. fermentans (Lane 12), og M. genitalium (Lane 13). Kjørefelt 1: M. pneumoniae (positiv kontroll). Molekylvekter av noen store M. pneumoniae proteiner ble gitt til venstre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Immunoblotbekreftelse av effektiviteten av adsorpsjonsprosedyren for å eliminere kryssreaksjoner. Reaktivitet av alle de utvalgte heterologe bakteriene; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, to Ureaplasma urealyticum isolater, M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans og M. genitalium (Lanes 2-13, henholdsvis) ble testet mot adsorbert M. pneumoniae polyklonalt antiserum. M. pneumoniae antigen ble lastet i Lane 1 som positiv kontroll (bare spesifikke proteiner ble avslørt). Lane MW: forhåndsfarget proteinstige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Resultater fra antigenfangsten ELISA. ELISA ble utført med det adsorberte Mycoplasma pneumoniae polyklonale antiserum som beleggmiddel. Søylediagram 1 og 2 viser henholdsvis negative og positive kontroller. Bar grafer 3-13 viser sera av en gruppe testede pasienter. Hvert serum ble testet ved tre forskjellige fortynninger: 1/200 (lilla søyler), 1/400 (oransje søyler) og 1/800 (blå søyler). OD-verdier tjente til å beregne positivitetsindeksen. Hver reaksjon ble utført i to eksemplarer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Mikroorganisme Belastning* Middels Referanse
Mycoplasma og ureaplasma arter Mycoplasma pneumoniae ATCC 160 20030 SP4 [35]
Mycoplasma genitalium CIP 103767T SP4
Mycoplasma fermentans ATCC 160 20026 SP4
Mycoplasma hominis CIP 103715T SP4 supplert med arginin
Ureaplasma urealyticum 2 kliniske isolater** SP4 supplert med urea
Mycoplasma gallisepticum CIP S6 15302 Frey [36]
Mycoplasma imitans ATCC 160 20037 Frey
Andre bakterier Escherichia coli ATCC 25922 LB kjøttkraft [37]
Klebsiella pneumoniae Klinisk isolat*** LB kjøttkraft
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 LB kjøttkraft
Staphylococcus aureus ATCC 25923 LB kjøttkraft
Streptococcus pneumoniae Klinisk isolat*** Blod kjøttkraft
* ATCC: American Type Culture Collection, CIP: Collection Institut Pasteur
** Isolater ble samlet inn fra kliniske prøver frivillig sendt til Laboratoriet for mykoplasmer (Pasteur Institute of Tunis) for rutinediagnostikk
Isolater ble samlet inn fra kliniske prøver frivillig sendt til Laboratory of Bacteriology (Pasteur Institute of Tunis) for rutinemessig diagnostikk

Tabell 1 Liste over bakteriestammer som ble brukt i denne studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen presenterer en generell beskrivelse av en intern ELISA hovedsakelig utviklet for å sikre spesifikk screening av M. pneumoniae Infeksjon. Detaljer om selve ELISA-analyseprotokollen, samt noen før- og etterbehandlingstrinn, er gitt. Spesifisiteten til denne analysen sikres ved adsorpsjonsteknikken. Denne prosedyren ble tidligere beskrevet i ELISA-tester utviklet for diagnostisering av human og aviær Mycoplasmas17,24. Det ble også ansatt i ELISA-analyser for diagnostisering av andre bakterielle infeksjoner som Lyme-sykdommen.25. I disse tre papirene ble adsorpsjon vist å bidra til å øke ELISA-spesifisiteten uten å scarifying eller redusere følsomheten17,24,25. Når det gjelder den foreliggende ELISA-analysen, kan de aktuelle bakterieartene som er valgt for adsorpsjon, deles inn i to grupper: den første gruppen inneholder noen patogene humane og aviære Mollicutes-arter (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumog M. imitans), mens den andre inneholder de hyppigste bakteriene som er kjent for å infisere mennesker (E. coli, P. aeruginosaog S. aureus) og de som er notorisk kjent for sin tropisme til luftveiene (K. pneumoniae og S. pneumoniae). Det brede utvalget av heterologe bakterier var basert på det faktum at dogmet om arter og organspesifisitet ikke respekteres lenger. Mange rapporter om påvisning av mikroorganismer i ukjente habitater har tidligere blitt publisert. For eksempel M. pneumoniae har blitt isolert fra mange ekstrapulmonale steder og funnet å være assosiert med et variert utvalg av ekstrapulmonale komplikasjoner med milde til alvorlige symptomer, selv om det ble antatt å være spesifikt for luftveiene6,7. Det motsatte tilfellet (isolere genital Mycoplasma arter fra luftveiene) ble signalisert for M. hominis og M. fermentans26,27. Inkluderingen av aviær Mycoplasma spp. i serodiagnosetesten av human infeksjon var basert på tidligere studier som rapporterte muligheten for infeksjon av mennesker (spesielt immunkompromitterte personer og veterinærer) med Mycoplasma spp. stammer fra husdyr28,29,30. Det er sant at det til nå ikke ble funnet noe papir som fremkaller isolasjonen av M. gallisepticum og M. imitans (de to artene som inngår i adsorpsjonsprosedyren i denne artikkelen) fra mennesker. Til tross for dette er ingenting umulig, spesielt siden disse artene er blant de mest regelmessig håndterte artene av veterinærer og er fylogenetisk for nær M. pneumoniae. Faktisk er disse to aviærene Mycoplasma spp. har vist sterkest reaktivitet med M. pneumoniae antiserum (som illustrert i Figur 2). Kort sagt, mens du utformet adsorpsjonsprosedyren, et relativt stort spekter av mistenkelige bakterier som kunne dele antigener med M. pneumoniae ble inkludert. Valgene som ble gjort var basert på fylogenetisk slektskap og tropisme til luftveiene. Likevel, på grunn av menneskelig floradiversitet og antigen variasjon, er det umulig å forutsi og inkludere alle mulige heterologe bakteriearter og stammer som kan kryssreagere med M. pneumoniae Antistoffer. Dermed er muligheten for kryssreaksjon mellom M. pneumoniae antiserum, selv etter adsorpsjon, og andre bakterier er fortsatt sannsynlig. Dessuten, siden M. pneumoniae er kjent for å infisere barn og unge voksne, kan adsorpsjonsprosedyren forbedres ytterligere i fremtiden ved å legge til andre pediatriske respiratoriske patogener som Haemophilus influenzae31 og Streptococcus pyogenes32 inn i adsorpsjonsbakteriell shortlist.

Formålet med denne ELISA er å oppdage tilstedeværelsen av målantistoffet (spesifikt M. pneumoniae-IgG) i den humane sera. Så, for å kunne både bruke serumet som en prøve (siden det er lettest å samle inn og mindre smertefullt for pasienter) og for å sikre spesifisitet, er den interne ELISA basert på prinsippet om to ELISA-typer: indirekte og sandwich ELISA. Serumprøven (primært antistoff) er bundet mellom deteksjonsantistoffet (merket andre antistoff) og fangstantigenet, som var spesifikt knyttet til fangstantistoffet (på forhånd gjort spesifikt ved adsorpsjon og immobilisert på mikroplateoverflaten). Gitt disse unike egenskapene, antas det at denne ELISA er effektiv og spesiell. Likevel er denne testen ikke perfekt, og problemer kan oppstå. Falske positive og falske negative resultater kan fortsatt oppstå, noen ganger på grunn av serumkvaliteten eller infeksjonsfasen, og noen ganger på grunn av feil under protokollapplikasjonen i laboratoriet. For eksempel kan ELISA-serodiagnoseresultatene påvirkes selv om brønnene ikke er tilstrekkelig vasket. Inkubasjonen (temperatur og tid) kan også påvirke testresultatene. Valg av mikroplate og blokkeringsmiddel ble også rapportert å være et kritisk skritt under ELISA-utvikling33,34. Av alle disse grunnene er det viktig å kontinuerlig arbeide for å forbedre denne ELISA-testen for å bestemme de optimale parametrene og forholdene, for eksempel fortynning av de forskjellige antistoffene (serumprøver, fangstantistoff, påvisning av antistoff), inkubasjons- og vasketrinn og inkludering av passende negative og positive kontroller.

Kulturen av bakterier og produksjonen av deres antigener for å utføre adsorpsjonsprosedyren kan betraktes som et tungt skritt, spesielt for Mollicutes-arter. Likevel antas det at dette er viktig, da dette trinnet i stor grad bidrar til å forbedre ELISA-spesifisiteten og for å unngå ytterligere bekreftelsestester som immunoblotting eller PCR. Videre, i sammenheng med M. pneumoniae-infeksjon, er det definitivt nødvendig med en effektiv og pålitelig diagnose for å etablere en tilstrekkelig og passende antibiotikabehandling, da bruk av beta-laktammedikamenter i behandlingen av samfunnservervet lungebetennelse er ineffektiv mot M. pneumoniae8. Etter år med å bli brukt i rutinemessig diagnostisk aktivitet i laboratoriet, antas det at antigenfangst ELISA, beskrevet i dette papiret, representerer et gyldig verktøy for spesifikk screening av M. pneumoniae-infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Denne studien ble finansiert av det tunisiske helsedepartementet og det tunisiske departementet for høyere utdanning og vitenskapelig forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf (2022).
  34. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  35. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  36. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  37. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Tags

Biologi utgave 192
Antigen-fangst enzymbundet immunosorbentanalyse for spesifikk påvisning av <em>Mycoplasma pneumoniae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter