Summary
Bei einer Infektion mit Mycoplasma pneumoniae können serologische Tests gute Ergebnisse liefern, jedoch aufgrund einer immunologischen Kreuzreaktion mit geringer Spezifität. Der hauseigene Antigen-Capture-ELISA, der in diesem Artikel beschrieben wird, garantiert eine hohe Speziesspezifität und hat sich als zuverlässiger Screening-Test für die genaue Diagnose von M. pneumoniae erwiesen.
Abstract
Mycoplasma pneumoniae ist ein Prokaryot mit Zellwandmangel, der hauptsächlich dafür bekannt ist, die menschlichen Atemwege zu besiedeln und bei älteren Kindern und jungen Erwachsenen endemisch zu sein, mit epidemischen Spitzen alle 6 Jahre. Die Diagnose von M. pneumoniae ist aufgrund der anspruchsvollen Natur des Erregers und der Möglichkeit einer asymptomatischen Übertragung schwierig. Die Labordiagnostik der M. pneumoniae-Infektion auf der Grundlage der Antikörpertitration in den Serumproben von Patienten ist nach wie vor die am meisten praktizierte Methode. Aufgrund des potenziellen Problems der immunologischen Kreuzreaktivität bei der Verwendung von polyklonalem Serum für M. pneumoniae wurde ein Enzym-Capture-Enzym-Immunoassay (ELISA) entwickelt, um die Spezifität der serologischen Diagnose zu verbessern. ELISA-Platten sind mit polyklonalen Antikörpern von M. pneumoniae beschichtet, die bei Kaninchen gezüchtet und nach Adsorption gegen eine Gruppe heterologer Bakterien spezifisch gemacht werden, die Antigene mit M. pneumoniae-Arten teilen und/oder von denen bekannt ist, dass sie die Atemwege besiedeln . Die umgesetzten homologen M. pneumoniae-Antigene werden dann spezifisch durch ihre entsprechenden Antikörper in den Serumproben erkannt. Eine weitere Optimierung der physikalisch-chemischen Parameter, denen der Antigen-Capture-ELISA ausgesetzt ist, führte zu einem hochspezifischen, sensitiven und reproduzierbaren ELISA.
Introduction
Mykoplasmen gehören zu den kleinsten und einfachsten bekannten Prokaryoten. Sie unterscheiden sich von anderen Bakterien vor allem durch das Fehlen einer Zellwandstruktur. Daher wurden Mykoplasmen in eine eigene Klasse namens Mollicutes1 eingeordnet. Der Zellwandmangel verleiht diesen Mikroorganismen eine intrinsische Resistenz gegen einige antimikrobielle Wirkstoffe und ist weitgehend für deren Polymorphie verantwortlich. Mykoplasmen haben ein kleines Genom und eine reduzierte Größe, was ihre metabolischen und biosynthetischen Fähigkeiten einschränkt und ihre parasitäre und saprophytische Natur erklärt1.
Mycoplasma pneumoniae ist eines der Mykoplasmen, die den Menschen infizieren und gilt als das virulenteste2. M. pneumoniae besiedelt die oberen Atemwege, was bei Kindern und jungen Erwachsenen zu einer atypischen Lungenentzündung führt. Die klinischen Symptome, die durch eine Infektion mit M. pneumoniae hervorgerufen werden, sind grippeähnlich mit Kopfschmerzen, Fieber und Husten3. Die Cytadhärenz von M. pneumoniae an Wirtszellen wird durch eine Bindungsorganelle vermittelt, die P1-Hauptadhäsion und mehrere akzessorische Proteineenthält 4,5. Weitere klinische Manifestationen können aufgrund einer lokalen Entzündung und Stimulation des Immunsystems des Wirts auftreten, die sich aus der engen Anhaftung von M. pneumoniae an die Atemwegsschleimhautergeben 6. Obwohl Lungenentzündung ein Kennzeichen der Infektion mit M. pneumoniae ist, hat sich gezeigt, dass eine Infektion mit diesem Bakterium auch für ein breites Spektrum nicht-pulmonaler Manifestationen an verschiedenen anatomischen Stellen wie dem zentralen Nervensystem, dem Herzen, der Haut und den Gelenken verantwortlich sein kann7.
Wie bei allen Mykoplasmenarten ist die Diagnose von M. pneumoniae eine Herausforderung. Die klinischen Symptome, die an eine Mykoplasmose erinnern, sind meist inapparent, und nicht charakteristisch8. Da es sehr schwierig ist, eine Infektion mit M. pneumoniae zu diagnostizieren, wenn man sich nur auf klinische Manifestationen und Symptome verlässt, ist das Laborscreening von besonderem Interesse9. Der Nachweis von M. pneumoniae-Kolonien durch Kultur ist die Goldstandardmethode für eine korrekte Diagnose. Die anspruchsvollen Wachstumsanforderungen und die lange Zeit, die für die Bereitstellung endgültiger Ergebnisse benötigt wird (1-2 Wochen), erschweren die Kultur jedoch und bedeuten daher, dass sie selten für die Routinediagnose verwendet wird10. Nukleinsäure-Amplifikationstechnologien wurden in Bezug auf Geschwindigkeit und Effizienz validiert, obwohl diese molekularen Techniken aufgrund ihrer relativ hohen Kosten und der Nichtverfügbarkeit in einigen Gesundheitseinrichtungen nicht als Erstlinien-Diagnosetests gelten. Es ist wahr, dass kommerzielle PCR-Tests weit verbreitet sind, um M. pneumoniae-Infektionen zu diagnostizieren, aber sie können die Serologie immer noch nicht ersetzen. Auch das häufige Auftreten von falsch negativen und falsch positiven Ergebnissen hat den Einsatz von PCR9 eingeschränkt. Routinemäßig ist die Serologie in Laboratorien nach wie vor die am meisten praktizierte für die Diagnose einer M. pneumoniae-Infektion. Seit Jahrzehnten wird über mehrere serologische Ansätze berichtet, wie z. B. kalte Hämagglutinine, Komplementbindungstest11, indirekter Hämagglutinationstest 12, Immunfluoreszenz 13 und die Technologie des ELISA, die erstmals in den frühen 1980er Jahren in der Mykoplasmenserologie angewendet wurde14,15,16. Eines der Hauptprobleme bei der Durchführung der ELISA-Serodiagnostik einer Infektion mit M. pneumoniae sind Kreuzreaktionen, die die Spezifität der Technik erheblich verringern. Unspezifische Adsorption menschlicher Seren mit M. pneumoniae-Antigenen wurde bereits berichtet; Tatsächlich sind viele der durch ELISA in menschlichen Seren nachgewiesenen Antikörper möglicherweise nicht immer an Mykoplasmenantigene 17 gebunden, was auf die Gemeinsamkeit von M. pneumoniae mit einigen Bakterien18,19 und einigen tierischen und menschlichen Geweben20 zurückzuführen ist.
Aufgrund der hohen Hintergrundwerte, die im herkömmlichen ELISA-Test beobachtet wurden, der im Labor praktiziert wurde, war die Interpretation der Ergebnisse oft kompliziert, und daher war die Bereitstellung einer korrekten M. pneumoniae-Diagnose eine schwierige Aufgabe. Angesichts dieses Problems haben wir uns entschieden, den M. pneumoniae ELISA zu verbessern, indem wir unspezifische Reaktionen von M. pneumoniae-Antigenen mit zu testenden Antikörpern entfernen. Zu diesem Zweck arbeiteten wir an der selektiven Depletion der unspezifischen M. pneumoniae-Antigene mit Hilfe der Adsorptionstechnik. Tatsächlich besteht das Hauptziel des Antigen-Capture-ELISA darin, M. pneumoniae Immunglobulin (Ig) G in humanen Serumproben spezifisch nachzuweisen. Das Konzept dieses ELISA besteht hauptsächlich aus dem selektiven Einfangen von M. pneumoniae-spezifischen Antigenen vor der Zugabe der humanen Serumproben. Diese Selektivität wird sichergestellt, indem das rohe Antigen von M. pneumoniae mit einem polyklonalen Antiserum von M. pneumoniae, das bei Kaninchen im Labor hergestellt wird, inkubiert und durch Adsorption gegen eine Gruppe heterologer Bakterien, die zur Klasse der Mollicutes gehören oder nicht, artspezifisch gemacht wird und Antigene mit M. pneumoniae teilt Arten und/oder von denen bekannt ist, dass sie die Atemwege besiedeln. Das Adsorptionsverfahren wurde dreimal wiederholt, und seine Wirksamkeit zur Eliminierung der Kreuzreaktivität wurde durch Immunoblotting getestet. Der entwickelte ELISA-Assay ist eine Kombination aus Sandwich- und indirektem ELISA. Kurz gesagt, die Vertiefungen der ELISA-Platte werden zunächst mit einem polyklonalen Antiserum beschichtet, das spezifisch für M. pneumoniae ist. Dann wird das M. pneumoniae-Antigen zugegeben und zwischen dem Antiserum und den Antikörpern eingeschlossen, die in der zu testenden Serumprobe vorhanden sind. Der gebildete immunologische Komplex wird durch einen sekundären enzymkonjugierten Antikörper (Peroxidase-konjugiertes IgG) detektiert. Die Reaktionen werden durch Zugabe von chromogenem Substrat sichtbar gemacht und die Absorption spektrophotometrisch gemessen. Dieser interne ELISA ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Der hausgemachte ELISA erwies sich als effizient bei der spezifischen Erkennung von M. pneumoniae-Infektionen und ist derzeit einer der am meisten praktizierten Tests in der Routinediagnostik.
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Protocol
Die vorliegende Studie wurde in Übereinstimmung mit ethischen Aspekten durchgeführt, die von der Ethikkommission des Pasteur-Instituts in Tunis festgelegt wurden.
1. Pre-ELISA-Schritte: Voraussetzungen und Vorverarbeitung
- Bakterienstämme und Nährmedien
ANMERKUNG: Mollicutes-Arten und die in dieser Studie verwendeten ummauerten Bakterien sowie ihre Wachstumsmedien sind in Tabelle 1 aufgeführt.- Wachstum von Mollicutes-Arten
- 200 μL aus dem Glycerinbestand jeder Spezies in 1.800 μL des Mediums impfen.
- Wachsen Sie Mollicutes-Arten statisch bei 37 °C mit 5%CO2 für 2-4 Tage, bis eine pH-Änderung beobachtet wird (der pH-Indikator ist phenolrot).
- Skalieren Sie die Kulturen auf 10 ml, indem Sie eine 1/10-Verdünnung der Kultur in das Medium geben und sie unter den gleichen Bedingungen erneut wachsen lassen.
ANMERKUNG: Je nach Stoffwechsel säuern einige menschliche Mollicutes-Arten (M. pneumoniae, M. genitalium und M. fermentans) das Medium aufgrund von Glukosefermentation an, und einige andere (M. hominis und Ureaplasma) alkalisieren das Medium durch Argininhydrolyse bzw. Harnstoffhydrolyse. In Bezug auf Vogelmykoplasmen zeigt die Ansäuerung des Frey-Mediums das Vorhandensein von M. gallisepticum, während seine Alkalisierung das Wachstum von M. imitans beweist. - Verteilen Sie 50 μL der Kulturen auf Agarplatten, um das Wachstum der Bakterien zu bestätigen. Halten Sie die Agarplatten bei 37 °C mit 5%CO2 und beobachten Sie sie regelmäßig unter dem Mikroskop auf das Auftreten typischer Spiegeleikolonien (Mycoplasmen) und dunkler igelartiger Kolonien (Ureaplasmen).
- Wachstum von Nicht-Mollicutes-Arten
- Kultur der Nicht-Mollicutes-Bakterien in 3 ml des Mediums bei 37 °C über Nacht (Schütteln bei 200 U/min).
- Vergleichen Sie die Trübung der Kulturen mit den Kontrollmedien, um das Wachstum zu bestätigen.
- Skalieren Sie die Kulturen auf 10 ml, indem Sie eine 1/100-Verdünnung der Kultur in das Medium geben und sie unter den gleichen Bedingungen erneut wachsen lassen.
- Wachstum von Mollicutes-Arten
- Antigen-Präparat
- Antigenpräparat von Mollicutes-Arten
- Die gesamten Proteine (die in bestätigten Kulturen von M. pneumoniae und den anderen Mollicutes-Arten vorhanden sind) werden durch Zentrifugation bei 40.000 x g bei 4 °C für 30 Minuten geerntet.
- Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Pellets dreimal mit 1 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) durch eine Reihe von drei Zentrifugationen unter den gleichen Bedingungen.
- Resuspendieren Sie jedes Antigen in 500 μL PBS.
- Antigenpräparation von Nicht-Mollicutes-Arten
- Zentrifugieren Sie die über Nacht gezüchteten Kulturen der Nicht-Mollicutes-Bakterien bei 1.500 x g für 15 min.
- Resuspendieren Sie jedes Bakterienpellet in 500 μL PBS.
ANMERKUNG: Die Proteinkonzentration wird unter Verwendung der klassischen Bradford-Quantifizierungsmethode mit Rinderserumalbumin als Standard21 bestimmt. Die Proteinkonzentration von Mollicutes-Arten liegt normalerweise zwischen 0,7 und 4,8 mg / ml. Bei den anderen Bakterienarten kann die Proteinkonzentration 20 mg/ml erreichen. Alle Antigene werden bis zu ihrer späteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
- Antigenpräparat von Mollicutes-Arten
- Kreuzreaktivitäts-Screening durch Immunoblotting
- Denaturieren Sie die bakteriellen Proteine, indem Sie 8 μl jedes Antigens mit einem gleichen Volumen Probenpuffer (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10 % Glycerin [v/v], 10 % SDS [w/v] und 0,2 % Bromphenolblau) mischen und das Gemisch bei 100 °C für 5 min inkubieren.
HINWEIS: Die Denaturierung wird durchgeführt, um die Proteine mit negativer Ladung zu überziehen und ihre sekundären Strukturen aufzubrechen, wodurch sie über das Polyacrylamidgel laufen und nach ihren Molekulargewichten getrennt werden können. - Die denaturierten Proteine (100 μg Protein/Well) werden nach der Laemml-Methode22 mit 12 % Trenngel und 5% Stapelgel einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) unterzogen. Danach werden die Proteine nach der Methode23 von Towbin et al. elektrophoretisch auf die Nitrozellulosemembran übertragen.
- Tauchen Sie die Nitrozellulosemembran für 30 min in 5%ige Magermilch in PBS ein, um die unbesetzten Flächen zu blockieren. Inkubieren Sie die Proteinblots bei Raumtemperatur für 2 h mit dem polyklonalen Antiserum von M. pneumoniae (hergestellt am Pasteur-Institut in Tunis), verdünnt auf 1/200 in PBS-Tween 20, dann mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG, verdünnt auf 1/2.000 in PBS-Tween 20 für 1 h bei Raumtemperatur.
- Die ungebundenen Antikörper werden mit PBS abgewaschen und die Ergebnisse erhalten, indem die Nitrocellulosefolie der Substratlösung (4-Chlor-1-naphthol,H2O2) ausgesetzt wird. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von Wasser nach 5-15 Minuten.
- Denaturieren Sie die bakteriellen Proteine, indem Sie 8 μl jedes Antigens mit einem gleichen Volumen Probenpuffer (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10 % Glycerin [v/v], 10 % SDS [w/v] und 0,2 % Bromphenolblau) mischen und das Gemisch bei 100 °C für 5 min inkubieren.
- Adsorptionsverfahren
ANMERKUNG: Um Kreuzreaktionen zwischen polyklonalem M. pneumoniae-Antiserum und heterologen Bakterienantigenen zu eliminieren, wird das zuvor von Ben Abdelmoumen und Roy24 beschriebene Adsorptionsverfahren angewendet.- Bereiten Sie einen Antigenpool der 12 heterologen Bakterien (die im Verdacht stehen, Antigene mit M. pneumoniae zu teilen) vor, mischen Sie ihn in einem Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie die Proteinkonzentration entsprechend der Hälfte des Antiserums ein, das im Experiment adsorbiert werden soll.
HINWEIS: Das Volumen und die Konzentration variieren zwischen den verschiedenen Assays. Dieser Schritt hängt hauptsächlich von der Konzentration des zu adsorbierenden Antikörpers ab. Wenn beispielsweise die Antikörperkonzentration = 3,56 mg/ml beträgt, sollte die Konzentration des Antigenpools (bestehend aus den 12 heterologen Bakterien) 1,78 mg/ml betragen (also etwa 0,148 mg jedes Antigens). - Das Antigengemisch wird bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert, das gepoolte Pellet aufgefangen und mit dem gereinigten polyklonalen Anti-M. pneumoniae IgG für 2 h bei 37 °C unter langsamem Rühren inkubiert.
- Nach der Inkubation wird die Suspension bei 14.000 x g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert und der Überstand (der dem spezifischen polyklonalen M. pneumoniae-Antiserum entspricht) zurückgewonnen.
HINWEIS: Um die Spezifität des polyklonalen M. pneumoniae-Antiserums zu gewährleisten, wiederholen Sie den Adsorptionsvorgang dreimal. Bevor es im ELISA-Test verwendet werden kann, sollte das adsorbierte polyklonale M. pneumoniae-Antiserum durch Immunoblotting auf das Fehlen von Kreuzreaktionen gegen die eingeschlossene Bakteriengruppe getestet werden.
- Bereiten Sie einen Antigenpool der 12 heterologen Bakterien (die im Verdacht stehen, Antigene mit M. pneumoniae zu teilen) vor, mischen Sie ihn in einem Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie die Proteinkonzentration entsprechend der Hälfte des Antiserums ein, das im Experiment adsorbiert werden soll.
2. ELISA-Schritte: Der Assay selbst
- Mikrotiterplatten-Beschichtung mit dem Fänger-Antikörper
- Verdünnen Sie den Fängerantikörper (M. pneumoniae präadsorbiertes polyklonales Antiserum) auf eine Konzentration von 10 μg/ml in 0,1 M Karbonat-Bicarbonat-Puffer (pH 9,6).
- Beschichten Sie die 96-Well-ELISA-Platte, indem Sie 100 μL des verdünnten Fängerantikörpers in jede Vertiefung geben.
- Nach nächtlicher Inkubation bei 4 °C wird die Beschichtungslösung entfernt und die Platte fünfmal mit dem Waschpuffer gewaschen (Zusammensetzung [pro L]: 146,29 g NaCl, 39,4 g Tris-HCl, 0,2 g Thiomersal und 0,5 ml Tween 20; pH 7,3).
- Blockierend
- Blockieren Sie die verbleibenden Bindungsflächen der beschichteten Vertiefungen, indem Sie jeder Vertiefung 100 μL der Blockierungslösung (0,5% Casein in PBS) hinzufügen.
- 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
- Entfernen Sie die Verstopfungslösung mit einer Pipette und waschen Sie die Platte fünfmal mit dem Waschpuffer.
- Anwendung des Antigens
- Geben Sie eine gleiche Menge an M. pneumoniae-Vollproteinen in alle beschichteten Vertiefungen (10 ng / Well).
- Die Reaktion wird 2 h bei Raumtemperatur einwirken lassen.
- Entfernen Sie den Überschuss der Antigenlösung und waschen Sie die Platte fünfmal mit dem Waschpuffer.
- Anwendung der Prüfmuster und Kontrollen
- Die Testproben (humane Seren) und Kontrollen (positive und negative Referenzseren) werden auf 1/200, 1/400 und 1/800 in PBS-Tween 20 verdünnt.
- Geben Sie 100 μL der verdünnten Proben und Kontrollen in die entsprechenden Vertiefungen. Führen Sie jede Reaktion doppelt durch. Markieren Sie die Vertiefungen, die weder Antigen noch Seren enthalten, als leer.
- Nachdem Sie die Platte für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert haben, entfernen Sie die Serumlösungen und waschen Sie die Platte fünfmal mit dem Waschpuffer.
- Applikation des enzymkonjugierten Detektionsantikörpers
- Verdünnen Sie die enzymkonjugierten Nachweisantikörper, HRP-konjugierten Antikaninchen- und Anti-Human-IgG auf 1/10.000 in PBS-Tween 20.
- Pipettieren Sie 100 μL des entsprechend verdünnten Nachweisantikörpers in jede Vertiefung.
- Nach dem Inkubieren der Platte für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln die ungebundenen Detektionsantikörper entfernen und die Platte fünfmal mit dem Waschpuffer waschen.
- Detektion und Datenanalyse
- Fügen Sie 100 μL der 3,3', 5,5' Tetramethylbenzidin (TMB) Chromogenlösung hinzu, um die Antigen-Antikörper-Bindung sichtbar zu machen.
- Lassen Sie die Platte 30 Minuten bei Raumtemperatur einwirken und fügen Sie dann 100 μL der Stopplösung (7,5%H2SO4) hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen.
- Lesen Sie die Absorption bei 450 nm Wellenlänge mit dem Mikroplatten-Reader ab und sortieren Sie die Ergebnisse basierend auf der Berechnung des Positivitätsindex (IP) aus.
IP = Absorption des getesteten Serums / Absorption des Cut-offs
IP < 0,7: Negatives Ergebnis
IP = 0,7: Der Test sollte innerhalb von 2 Wochen wiederholt werden.
IP > 0,7: Positives Ergebnis
HINWEIS: Die IP-Formel wurde im Labor konzipiert und der Wert 0,7 wird nach der Optimierung eingestellt. Bei Doppelreaktionen wird der Mittelwert der Absorption berechnet. Die optimale Serumverdünnung und Antigenkonzentration wird durch die ELISA-Schachbrett-Titrationsmethode ermittelt (Daten nicht gezeigt). Cut-off-Wert = OD (optische Dichte) eines positiven Referenzserums (verdünnt mit der gleichen Verdünnung wie die Probe). Dieser OD-Wert sollte mindestens dreimal höher sein als der OD-Wert der Negativkontrolle.
3. Post-ELISA-Schritte: Ergebnisbewertung und Testvalidierung
- Die Fähigkeit des hauseigenen ELISA, eine Infektion mit M. pneumoniae bei den getesteten Patienten spezifisch zu diagnostizieren, wird durch ergänzende Immunoblots unter Verwendung von Antigenen von M. pneumoniae und den heterologen Bakterien bewertet, um die Positivität der getesteten humanen Seren in M. pneumoniae-Antikörpern und ihre Negativität in den anderen verdächtigen Bakterien zu bestätigen (Daten nicht gezeigt).
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Representative Results
Die Immunblotting-Aktivität des nicht-adsorbierten polyklonalen Mycoplasma pneumoniae-Antiserums gegenüber heterologen Bakterien
Eine Kreuzreaktivität existiert tatsächlich, wie in den Immunoblotting-Ergebnissen gezeigt wird (Abbildung 2), und im Vergleich zur Positivkontrolle (Lane 1) werden einige der M. pneumoniae-Antigene mit den gescreenten Bakterien geteilt. Die Intensität dieser Kreuzreaktionen war unterschiedlich. Zum Beispiel zeigten die Antigene von M. gallisepticum und M. imitans die stärkste Reaktivität mit dem Antiserum von M. pneumoniae (Lanes 9 und 10), abgesehen davon, dass es sich um aviäre Mykoplasmen handelte. Im Gegensatz dazu zeigte keines der beiden humanen klinischen Isolate von Ureaplasma urealyticum eine Reaktivität (Lanes 7 und 8). Antigene der verbleibenden humanen Genital-Mycoplasmen-Spezies M. hominis, M. fermentans und M. genitalium führten jedoch zu erheblichen Kreuzreaktionen mit dem Antiserum von M. pneumoniae (Lanes 11, 12 bzw. 13). Escherichia coli (Lane 2), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) und Klebsiella pneumoniae (Lane 6) reagierten ebenfalls mit polyklonalen M. pneumoniae-Antikörpern , und ihr antigenes Profilmuster war sehr ähnlich . Dieses Profil unterschied sich geringfügig von dem der beiden Kokkenbakterienarten Streptococcus pneumoniae und Staphylococcusaureus; Die Reaktivität war bei S. pneumoniae (Bahn 3) und bei S. aureus (Bahn 5) noch geringer.
Spezifität von Mycoplasma pneumoniae-Antikörpern, die durch Adsorptionsverfahren garantiert werden
Nach der Adsorption des polyklonalen Antiserums von M. pneumoniae gegen die heterologen bakteriellen Antigene wurde die Spezifität mittels Immunoblotting getestet (Abbildung 3). Abgesehen von einigen Proteinen des M. pneumoniae-Antigens , die in Spur 1 (Positivkontrolle) nachgewiesen wurden, wurden die anderen Antigene fast vollständig nicht nachgewiesen (Bahnen 2-13). Die in Lane 1 aufgedeckten Proteine sind tatsächlich die spezifischen Proteine, die von den spezifischen M. pneumoniae-Antikörpern nachgewiesen werden, die nach der Adsorption übrig bleiben. Basierend auf diesem Ergebnis wurde die Wirksamkeit des Adsorptionsverfahrens nachgewiesen, da die aufgetretenen unspezifischen Reaktionen des polyklonalen Antiserums von M. pneumoniae mit den oben beschriebenen heterologen Antigenen eliminiert wurden. Das spezifisch gemachte Antiserum von M. pneumoniae wurde dann in allen nachfolgenden serologischen und immunoblolottierenden Tests verwendet.
Capture-Antigen-ELISA: Valider Test für die serodiagnostische Routineaktivität im Labor
Da alle Seren in doppelten Vertiefungen für die verschiedenen Verdünnungen getestet wurden, wurden OD-Mittelwerte berechnet und ein Balkendiagramm aufgetragen, das diese Extinktionswerte mit den entsprechenden Serumverdünnungen korrelierte (Abbildung 4). Basierend auf der IP-Berechnung erwiesen sich die in dieser Arbeit getesteten und vorgestellten humanen Seren als positiv für das M. pneumoniae IgG. Mehrere andere Serum-Sets wurden ebenfalls mit diesem hausgemachten ELISA getestet, und jedes Mal erwies sich der Assay als effizient beim spezifischen Nachweis des M. pneumoniae-IgG und damit bei der Unterscheidung der M. pneumoniae-infizierten Patienten von den nicht infizierten Patienten (Daten nicht gezeigt).
Die ELISA-Ergebnisse wurden immer durch mehrere Immunoblot-Analysen bestätigt, die gleichzeitig die Positivität in M. pneumoniae und die Negativität in allen anderen Bakterien eines getesteten Serums zeigten, das durch den hauseigenen Fängerantigen-ELISA M. pneumoniae positiv befunden wurde (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 1: Schematische Darstellung des im Labor entwickelten Antigen-Capture-ELISA zum spezifischen Nachweis von Mycoplasma pneumoniae IgG. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Immunoblot-Analyse von Kreuzreaktionen zwischen Mycoplasma pneumoniae und einer Gruppe heterologer Bakterien. Die Reaktivität des nicht-adsorbierten polyklonalen Antiserums von M. pneumoniae wurde gegen Antigene von Escherichia coli (Lane 2), Streptococcus pneumoniae (Lane 3), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4), Staphylococcus aureus (Lane 5), Klebsiella pneumoniae (Lane 6), zwei Ureaplasma urealyticum Isolate (Lanes 7 und 8), M. imitans (Lane 9), M. gallisepticum (Lane 10), M. hominis (Lane 11), M. fermentans (Spur 12) und M. genitalium (Spur 13). Bahn 1: M. pneumoniae (Positivkontrolle). Die Molekulargewichte einiger wichtiger M. pneumoniae-Proteine waren auf der linken Seite angegeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Immunoblot-Bestätigung der Effizienz des Adsorptionsverfahrens zur Eliminierung von Kreuzreaktionen. Reaktivität aller ausgewählten heterologen Bakterien; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, zwei Ureaplasma urealyticum-Isolate , M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans und M. genitalium (Lanes 2-13) wurden gegen das adsorbierte polyklonale Antiserum von M. pneumoniae getestet. Das M. pneumoniae-Antigen wurde in Spur 1 als Positivkontrolle geladen (es wurden nur spezifische Proteine nachgewiesen). Lane MW: vorgefärbte Proteinleiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Ergebnisse des Antigen-Capture-ELISA. Der ELISA wurde mit dem adsorbierten polyklonalen Antiserum Mycoplasma pneumoniae als Überzugsmittel durchgeführt. Die Balkendiagramme 1 und 2 zeigen negative bzw. positive Kontrollen. Die Balkendiagramme 3-13 zeigen die Seren einer Gruppe von getesteten Patienten. Jedes Serum wurde in drei verschiedenen Verdünnungen getestet: 1/200 (violette Balken), 1/400 (orangefarbene Balken) und 1/800 (blaue Balken). OD-Werte dienten zur Berechnung des Positivitätsindex. Jede Reaktion wurde doppelt durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Mikroorganismus | Dehnung* | Mittel | Referenz | |
| Mykoplasmen und Ureaplasmen-Spezies | Mycoplasma pneumoniae | ATCC 160 20030 | SP4 | [35] |
| Mycoplasma genitalium | CIP 103767T | SP4 | ||
| Mycoplasma fermentans | ATCC 160 20026 | SP4 | ||
| Mycoplasma hominis | CIP 103715T | SP4 mit Arginin ergänzt | ||
| Ureaplasma urealyticum | 2 klinische Isolate** | SP4 mit Harnstoff ergänzt | ||
| Mycoplasma gallisepticum | CIP S6 15302 | Frey | [36] | |
| Mycoplasma imitans | ATCC 160 20037 | Frey | ||
| Sonstige Bakterien | Escherichia Coli | ATCC 25922 | LB Brühe | [37] |
| Klebsiella pneumoniae | Klinisches Isolat*** | LB Brühe | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC 27853 | LB Brühe | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC 25923 | LB Brühe | ||
| Streptococcus pneumoniae | Klinisches Isolat*** | Blutbrühe | ||
| * ATCC: American Type Culture Collection, CIP: Collection Institut Pasteur | ||||
| ** Die Isolate wurden aus klinischen Proben entnommen, die freiwillig zur Routinediagnostik an das Labor für Mykoplasmen (Pasteur-Institut in Tunis) geschickt wurden. | ||||
| Die Isolate wurden aus klinischen Proben entnommen, die freiwillig zur Routinediagnostik an das Labor für Bakteriologie (Institut Pasteur in Tunis) geschickt wurden | ||||
Tabelle 1: Liste der Bakterienstämme, die in dieser Studie verwendet wurden.
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Discussion
Dieser Artikel enthält eine allgemeine Beschreibung eines internen ELISA, der hauptsächlich entwickelt wurde, um ein spezifisches Screening auf M. pneumoniae Infektion. Die Details über das Protokoll des ELISA-Assays selbst sowie einige Vor- und Nachbearbeitungsschritte werden bereitgestellt. Die Spezifität dieses Assays wird durch die Adsorptionstechnik sichergestellt. Dieses Verfahren wurde bereits in ELISA-Tests beschrieben, die für die Diagnose von Menschen und Vögeln entwickelt wurden Mycoplasmas17,24. Es wurde auch in ELISA-Assays zur Diagnose anderer bakterieller Infektionen wie der Lyme-Borreliose eingesetzt25. In diesen drei Arbeiten wurde nachgewiesen, dass die Adsorption dazu beiträgt, die ELISA-Spezifität zu erhöhen, ohne die Empfindlichkeit zu vertikutieren oder zu verringern17,24,25. Im Falle des vorliegenden ELISA-Tests können die geeigneten Bakterienarten, die für die Adsorption ausgewählt wurden, in zwei Gruppen unterteilt werden: Die erste Gruppe enthält einige pathogene menschliche und aviäre Mollicutes-Arten (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumund M. imitans), während die zweite die häufigsten Bakterien enthält, von denen bekannt ist, dass sie Menschen infizieren (E. coli, P. aeruginosaund S. aureus) und solche, die für ihren Tropismus in den Atemwegen berüchtigt sind (K. pneumoniae und S. pneumoniae). Die breite Selektion heterologer Bakterien beruhte darauf, dass das Dogma der Art- und Organspezifität nicht mehr beachtet wird. Viele Berichte über den Nachweis von Mikroorganismen in unbekannten Lebensräumen wurden bereits veröffentlicht. Zum Beispiel M. pneumoniae wurde von vielen extrapulmonalen Stellen isoliert und mit einer Vielzahl von extrapulmonalen Komplikationen mit leichten bis schweren Symptomen in Verbindung gebracht, obwohl angenommen wurde, dass es spezifisch für die Atemwege ist6,7. Der umgekehrte Fall (Isolierung der Genitalien) Mycoplasma B. Arten aus den Atemwegen) wurde für M. hominis und M. fermentans26,27. Die Einbeziehung von Vögeln Mycoplasma spp. in der Serodiagnose auf der Grundlage von Infektionen beim Menschen auf der Grundlage früherer Studien, die über die Möglichkeit einer Infektion von Menschen (insbesondere immungeschwächten Personen und Tierärzten) mit Mycoplasma spp. von Haustieren stammen28,29,30. Es ist wahr, dass bis jetzt kein Papier gefunden wurde, das die Isolation von M. gallisepticum und M. imitans (die beiden Spezies, die in diesem Artikel in das Adsorptionsverfahren einbezogen wurden) vom Menschen. Trotzdem ist nichts unmöglich, zumal diese Arten zu den am häufigsten von Tierärzten behandelten Arten gehören und phylogenetisch zu nahe an M. pneumoniae. In der Tat sind diese beiden Vögel Mycoplasma spp. haben die stärkste Reaktivität mit M. pneumoniae Antiserum (wie in Abbildung 2). Kurz gesagt, während der Entwicklung des Adsorptionsverfahrens, ein relativ großes Spektrum verdächtiger Bakterien, die Antigene mit M. pneumoniae enthalten war. Die getroffenen Entscheidungen basierten auf der phylogenetischen Verwandtschaft und dem Tropismus zu den Atemwegen. Aufgrund der Vielfalt der menschlichen Flora und der Variabilität der Antigene ist es jedoch unmöglich, alle möglichen heterologen Bakterienarten und -stämme, die mit M. pneumoniae Antikörper. Somit ist die Möglichkeit einer Kreuzreaktion zwischen M. pneumoniae Antiserum, auch nach Adsorption, und andere Bakterien bleibt wahrscheinlich. Da M. pneumoniae allgemein bekannt ist, Kinder und junge Erwachsene zu infizieren, kann das Adsorptionsverfahren in Zukunft durch die Zugabe anderer pädiatrischer Atemwegserreger wie Haemophilus influenzae31 und Streptococcus pyogenes32 in die engere Auswahl der Adsorptionsbakterien.
Der Zweck dieses ELISA ist es, das Vorhandensein des Zielantikörpers (spezifisches M. pneumoniae-IgG) im menschlichen Seren nachzuweisen. Um das Serum sowohl als Probe verwenden zu können (da es am einfachsten zu entnehmen und für die Patienten weniger schmerzhaft ist) als auch um die Spezifität zu gewährleisten, basiert der hauseigene ELISA auf dem Prinzip von zwei ELISA-Typen: indirekter und Sandwich-ELISA. Die Serumprobe (primärer Antikörper) wird zwischen dem Detektionsantikörper (markierter zweiter Antikörper) und dem Fängerantigen gebunden, das spezifisch mit dem Fängerantikörper verknüpft wurde (zuvor durch Adsorption spezifisch gemacht und auf der Mikrotiterplattenoberfläche immobilisiert). Angesichts dieser einzigartigen Eigenschaften wird angenommen, dass dieser ELISA effektiv und besonders ist. Dennoch ist dieser Test nicht perfekt und es können Probleme auftreten. Falsch positive und falsch negative Ergebnisse können immer noch auftreten, manchmal aufgrund der Serumqualität oder der Infektionsphase, manchmal aufgrund von Fehlern bei der Protokollanwendung im Labor. Zum Beispiel können die Ergebnisse der ELISA-Serodiagnostik auch dann beeinflusst werden, wenn die Vertiefungen nicht ausreichend gewaschen werden. Auch die Inkubation (Temperatur und Zeit) könnte die Testergebnisse beeinflussen. Es wurde auch berichtet, dass die Auswahl von Mikrotiterplatten und Blockierern ein kritischer Schritt während der ELISA-Entwicklung war33,34. Aus all diesen Gründen ist es wichtig, kontinuierlich an der Verbesserung dieses ELISA-Tests zu arbeiten, um die optimalen Parameter und Bedingungen zu bestimmen, wie z.B. die Verdünnung der verschiedenen Antikörper (Serumproben, Capture-Antikörper, Antikörpernachweis), die Inkubations- und Waschschritte sowie die Einbeziehung der entsprechenden Negativ- und Positivkontrollen.
Die Kultivierung von Bakterien und die Produktion ihrer Antigene zur Durchführung des Adsorptionsverfahrens könnte als ein schwerer Schritt angesehen werden, insbesondere für Mollicutes-Arten. Es wird jedoch angenommen, dass dies wichtig ist, da dieser Schritt erheblich dazu beiträgt, die ELISA-Spezifität zu erhöhen und weitere Bestätigungstests wie Immunblotting oder PCR zu vermeiden. Darüber hinaus ist im Zusammenhang mit einer Infektion mit M. pneumoniae eine effektive und zuverlässige Diagnose unbedingt erforderlich, um eine adäquate und angemessene Antibiotikatherapie zu etablieren, da der Einsatz von Beta-Lactam-Medikamenten bei der Behandlung von ambulant erworbener Pneumonie gegen M. pneumoniae8 unwirksam ist. Nach jahrelanger Verwendung in der Routinediagnostik im Labor wird angenommen, dass der in dieser Arbeit beschriebene Antigen-Capture-ELISA ein gültiges Instrument für das spezifische Screening von M. pneumoniae-Infektionen darstellt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom tunesischen Gesundheitsministerium und dem tunesischen Ministerium für Hochschulbildung und wissenschaftliche Forschung finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-1-naphtol | Sigma-Aldrich | C6788-50 TAB | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD | 211705 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-50 G | |
| Carbonate bicarbonate buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50 Cap | |
| Casein | Sigma-Aldrich | C7078-1 KG | |
| CMRL1066 | VWR | P0058-N1L | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528-1KG | |
| Difco PPLO Broth | BD | 255420 | Frey media |
| ELISA plate-Reader | MULTISKAN GO, Thermo Scientific | Ref: 51119200 | |
| Fetal bovine serum | Capricorn Scientific | FBS-12A | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG | Abcam | ab6759 | |
| Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG | Life Technologies | 656120 | |
| Hydrochloric Acid 37% | Prolab | 2025.290 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% | Scharlau | HI01361000 | |
| L-arginin | Sigma-Aldrich | A5006-1KG | |
| LB broth | Prepared in Pasteur Institute of Tunis | Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis | |
| Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit | Produced in Pasteur Institute of Tunis | Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis | |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | N7004-10G | |
| Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate | Invitrogen | 44-2404-21 | |
| Penicillin G sodium (1 MIU) | PANPHARMA | ||
| Phenol red | fluka chemika | 77660 | |
| Skim milk | MP Biomedicals | 902887 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-1KG | |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-1KG | |
| Sodium chloride (NaCl) | Novachim | PS02805 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% | Merck | 1007311011 | |
| Thimerosal | USB | 22215 | |
| TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) | Abcam | ab142042 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6791-1 KG | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | 1379-500 ML | |
| Yeast extract, powder, Ultrapure | Thermo Scientific | J23547 |
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