Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Антиген-захват фермент-связанный иммуносорбентный анализ для специфического обнаружения Mycoplasma pneumoniae

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

При инфекции Mycoplasma pneumoniae серологические тесты могут давать хорошие результаты, но с низкой специфичностью из-за иммунологической перекрестной реакции. Собственный ИФА захвата антигена, описанный в этой статье, гарантирует высокую видовую специфичность и, как было показано, является надежным скрининговым тестом для точной диагностики M. pneumoniae.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae - это прокариот с дефицитом клеточной стенки, который, как известно, в основном колонизирует дыхательные пути человека и является эндемичным, с эпидемическим пиком каждые 6 лет, у детей старшего возраста и молодых людей. Диагностика M. pneumoniae является сложной задачей из-за привередливой природы возбудителя и возможности бессимптомного носительства. Лабораторная диагностика инфекции M. pneumoniae на основе титрования антител в образцах сыворотки пациентов остается наиболее практикуемым методом. Из-за потенциальной проблемы иммунологической перекрестной реактивности с использованием поликлональной сыворотки для M. pneumoniae был разработан иммуносорбентный анализ антиген-захвата (ИФА) для улучшения специфичности серологической диагностики. Пластины ИФА покрыты поликлональными антителами M. pneumoniae , выращенными у кроликов и специфичными после адсорбции против панели гетерологичных бактерий, которые разделяют антигены с видами M. pneumoniae и/ или, как известно, колонизируют дыхательные пути. Реагирующие гомологичные антигены M. pneumoniae затем специфически распознаются по соответствующим антителам в образцах сыворотки. Дальнейшая оптимизация физико-химических параметров, которым подвергается ИФА захвата антигена, привела к получению высокоспецифичного, чувствительного и воспроизводимого ИФА.

Introduction

Микоплазмы являются одними из самых маленьких и простых известных прокариот. Они в основном отличаются от других бактерий отсутствием структуры клеточной стенки. Таким образом, микоплазмы были классифицированы в отдельный класс под названием Mollicutes1. Дефицит клеточной стенки придает внутреннюю устойчивость этим микроорганизмам против некоторых антимикробных агентов и в значительной степени отвечает за их полиморфизм. Микоплазмы имеют малый геном и уменьшенные размеры, что ограничивает их метаболические и биосинтетические возможности и объясняет их паразитарную и сапрофитную природу1.

Mycoplasma pneumoniae является одной из микоплазм, которые заражают человека, и считается самой вирулентной2. M. pneumoniae колонизирует верхние дыхательные пути, что приводит к атипичной пневмонии у детей и молодых людей. Клинические признаки, порожденные инфекцией M. pneumoniae, похожи на грипп, с головной болью, лихорадкой и кашлем3. Цитадренция M. pneumoniae к клеткам-хозяева опосредована органеллой прикрепления, включающей большую адгезию P1 и несколько вспомогательных белков 4,5. Более клинические проявления могут возникать из-за местного воспаления и стимуляции иммунной системы хозяина в результате тесного присоединения M. pneumoniae к слизистой оболочке дыхательных путей6. Хотя пневмония является отличительной чертой инфекции M. pneumoniae, было выявлено, что инфекция этой бактерией также может быть ответственна за широкий спектр нелегочных проявлений в различных анатомических местах, таких как центральная нервная система, сердце, кожа и суставы7.

Как и для всех видов Mycoplasma, диагностика M. pneumoniae является сложной. Клинические признаки, вызывающие микоплазмоз, в основном неочевидные и нехарактерные8. Поскольку очень трудно диагностировать инфекцию M. pneumoniae, полагаясь только на клинические проявления и симптомы, лабораторный скрининг представляет особый интерес9. Обнаружение колоний M. pneumoniae по культуре является золотым стандартом для правильной диагностики. Однако привередливые требования к росту и длительное время, необходимое для доставки окончательных результатов (1-2 недели), усложняют культуру и, таким образом, означают, что она редко используется для рутинной диагностики10. Технологии амплификации нуклеиновых кислот были проверены с точки зрения скорости и эффективности, хотя из-за их относительно высокой стоимости и недоступности в некоторых медицинских учреждениях эти молекулярные методы не считаются диагностическими тестами первой линии. Это правда, что коммерческие ПЦР-тесты широко используются для диагностики инфекций M. pneumoniae, но они все еще не могут заменить серологию. Кроме того, частое появление как ложноотрицательных, так и ложноположительных результатов ограничило использование ПЦР9. Как правило, серология остается наиболее практикуемой в лабораториях для диагностики инфекции M. pneumoniae. В течение десятилетий сообщалось о нескольких серологических подходах, таких как холодные гемагглютинины, тест фиксации комплемента11, тест на непрямую гемагглютинацию12, иммунофлуоресценция13 и технология ИФА, которая была впервые применена к серологии микоплазмы в начале 1980-х годов 14,15,16. Одной из основных проблем, возникающих при выполнении ИФА-серодиагностики инфекции M. pneumoniae, являются перекрестные реакции, что значительно снижает специфичность методики. Ранее сообщалось о неспецифической адсорбции сывороток человека антигенами M. pneumoniae; на самом деле, многие из антител, обнаруженных с помощью ИФА в сыворотках человека, не всегда могут быть связаны с микоплазмальными антигенами17 из-за общности M. pneumoniae с некоторыми бактериями18,19 и некоторыми тканями животных и человека20.

Из-за высоких фоновых показаний, наблюдаемых в обычном тесте ИФА, который практиковался в лаборатории, интерпретация результатов часто была сложной, и, таким образом, постановка правильного диагноза M. pneumoniae была трудным заданием. Столкнувшись с этой проблемой, мы решили улучшить ИФА M. pneumoniae , удалив неспецифические реакции антигенов M. pneumoniae с антителами, подлежащими тестированию. С этой целью мы работали над селективным истощением неспецифических антигенов M. pneumoniae с использованием метода адсорбции. Фактически, основной целью ИФА захвата антигена является конкретное обнаружение иммуноглобулина M. pneumoniae (Ig) G в образцах сыворотки крови человека. Концепция этого ИФА состоит в основном из селективного захвата специфических антигенов M. pneumoniae, перед добавлением образцов сыворотки крови человека. Эта селективность обеспечивается инкубацией сырого антигена M. pneumoniae с поликлональной антисывороткой M. pneumoniae , продуцируемой у кроликов в лаборатории, и превращением ее в видоспецифичным путем адсорбции против группы гетерологичных бактерий, принадлежащих или не принадлежащих к классу Mollicutes, разделяющих антигены с M. pneumoniae виды и/или известные колонизирующие дыхательные пути. Процедуру адсорбции повторяли трижды, а ее эффективность по устранению перекрестной реактивности проверяли иммуноблоттингом. Разработанный ИФА-анализ представляет собой комбинацию сэндвича и непрямого ИФА. Вкратце, колодцы ИФА-пластины сначала покрываются поликлональной антисывороткой, специфичной для M. pneumoniae. Затем добавляется антиген M. pneumoniae и захватывается между антисывороткой и антителами, присутствующими в образце сыворотки для тестирования. Сформированный иммунологический комплекс обнаруживается вторичным фермент-конъюгированным антителом (пероксидазо-конъюгированный IgG). Реакции визуализируются добавлением хромогенного субстрата, а поглощение измеряется спектрофотометрически. Этот внутренний ИФА схематично представлен на рисунке 1. Домашний ИФА оказался эффективным в выявлении инфекции M. pneumoniae и в настоящее время является одним из наиболее практикуемых тестов в рутинной диагностической деятельности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Настоящее исследование было проведено в соответствии с этическими аспектами, установленными этическим комитетом Института Пастера в Тунисе.

1. Этапы подготовки к ИФА: предварительные требования и предварительная обработка

  1. Бактериальные штаммы и питательные среды
    ПРИМЕЧАНИЕ: Виды молликутов и бактерии с стенками, используемые в настоящем исследовании, и их питательные среды перечислены в таблице 1.
    1. Рост видов Mollicutes
      1. Инокулируют 200 мкл из запаса глицерина каждого вида в 1 800 мкл среды.
      2. Выращивайте молликуты статически при 37 °C с 5% CO2 в течение 2-4 дней до тех пор, пока не будет наблюдаться изменение рН (показатель рН фенол красный).
      3. Увеличить масштаб культур до 10 мл, добавив 1/10-го разбавления культуры в среду и дать им снова вырасти в тех же условиях.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно метаболизму, некоторые виды Mollicutes человека (M. pneumoniae, M. genitalium и M. fermentans) подкисляют среду за счет ферментации глюкозы, а некоторые другие (M. hominis и Ureaplasma) подщелачивают среду путем гидролиза аргинина или гидролиза мочевины, соответственно. Что касается птичьих микоплазм, то подкисление среды Фрея демонстрирует наличие M. gallisepticum, в то время как ее подщелачивание доказывает рост M. imitans.
      4. Распределите 50 мкл культур на агаровые пластины, чтобы подтвердить рост бактерий. Поддерживайте агаровые пластины при 37 °C с 5% CO2 и регулярно наблюдайте за ними под микроскопом для появления типичных колоний жареных яиц (Mycoplasmas) и темных ежоподобных колоний (Ureaplasmas).
    2. Рост видов, не относящихся к молликутам
      1. Культивируйте бактерии, не относящиеся к моллюскам, в 3 мл среды при 37 °C в течение ночи (встряхивание при 200 об/мин).
      2. Сравните мутность культур с контрольными средами, чтобы подтвердить рост.
      3. Увеличьте масштаб культур до 10 мл, добавив 1/100-е разбавление культуры в среду и позвольте им снова расти в тех же условиях.
  2. Препарат антигена
    1. Антигенный препарат вида Молликутес
      1. Собирают цельные белки (присутствующие в подтвержденных культурах M. pneumoniae и других видов Mollicutes) путем центрифугирования при 40 000 х г при 4 °C в течение 30 мин.
      2. Откажитесь от супернатанта и трижды промойте гранулы 1 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS, pH 7,4) серией из трех центрифугаций с теми же условиями.
      3. Повторное суспендирование каждого антигена в 500 мкл PBS.
    2. Антигенный препарат немолликутных видов
      1. Центрифугируйте выращенные на ночь культуры бактерий, не относящихся к молликутам, по 1 500 х г в течение 15 мин.
      2. Повторно суспендировать каждую бактериальную гранулу в 500 мкл PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию белка определяют с использованием классического метода количественного определения Брэдфорда с бычьим сывороточным альбумином в стандартнойкомплектации 21. Концентрация белка у видов молликутов обычно колеблется в пределах 0,7-4,8 мг/мл. Для других видов бактерий концентрация белка может достигать 20 мг/мл. Все антигены хранятся при -20 °C до их последующего использования.
  3. Скрининг перекрестной реактивности с помощью иммуноблоттинга
    1. Денатурировать бактериальные белки путем смешивания 8 мкл каждого антигена с равным объемом буфера образца (0,5 М Трис-HCl; рН 6,8, 10% глицерина [v/v], 10% SDS [мас./об.] и 0,2% бромфенола синего), инкубировать смесь при 100 °C в течение 5 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Денатурация выполняется для покрытия белков отрицательным зарядом и разрушения их вторичных структур, что позволяет им проходить через полиакриламидный гель и разделяться в соответствии с их молекулярными массами.
    2. Подвергайте денатурированные белки (100 мкг белка/лунку) электрофорезу додецилсульфат-полиакриламидного геля (SDS-PAGE) методом 22 Леммли с12 % разделяющим гелем и 5% укладывающим гелем. После этого переносят белки электрофоретически на нитроцеллюлозную мембрану методом23 Towbin et al.
    3. Погрузите нитроцеллюлозную мембрану в 5% обезжиренное молоко в PBS в течение 30 минут, чтобы заблокировать незанятые поверхности. Инкубируют белковые пятна при комнатной температуре в течение 2 ч с кроличьей поликлональной антисывороткой M. pneumoniae (произведенной в Институте Пастера в Тунисе), разведенной до 1/200 в PBS-Tween 20, затем с пероксидазой хрена (HRP)-конъюгированной анти-кроликовой IgG, разведенной до 1/2000 в PBS-Tween 20 в течение 1 ч при комнатной температуре.
    4. Смойте несвязанные антитела PBS и получите результаты, подвергнув нитроцеллюлозный лист воздействию раствора субстрата (4-хлор-1-нафтол, H2O2). Остановите реакцию, добавив воду через 5-15 мин.
  4. Процедура адсорбции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для устранения перекрестных реакций между поликлональными антисыворотками M. pneumoniae и антигенами гетерологичных бактерий используется процедура адсорбции, ранее описанная Беном Абдельмуменом и Роем24 .
    1. Подготовьте пул антигенов из 12 гетерологичных бактерий (предположительно разделяющих антигены с M. pneumoniae), смешайте его в микроцентрифужной трубке и отрегулируйте концентрацию белка, соответствующую половине антисыворотки, подлежащей адсорбации в эксперименте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем и концентрация варьируются между различными анализами. Этот шаг в основном зависит от концентрации антитела, подлежащего адсорбированию. Например, если концентрация антител = 3,56 мг/мл, концентрация пула антигенов (состоящего из 12 гетерологичных бактерий) должна составлять 1,78 мг/мл (следовательно, примерно 0,148 мг каждого антигена).
    2. Центрифугируют антигенную смесь при 14 000 х г в течение 10 мин при 4 °C, собирают объединенную гранулу и инкубируют ее с очищенным поликлональным анти-M. pneumoniae IgG в течение 2 ч при 37 °C с медленным перемешиванием.
    3. После инкубации центрифугируют суспензию при 14 000 х г в течение 10 мин при 4 °C и восстанавливают супернатант (который соответствует специфическому поликлональному M . pneumoniae antiserum).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить специфичность поликлональной антисыворотки M. pneumoniae , повторите процедуру адсорбции три раза. Прежде чем его можно будет использовать в ИФА-анализе, адсорбированную поликлональную антисыворотку M. pneumoniae следует проверить иммуноблоттингом на отсутствие перекрестных реакций против включенного набора бактерий.

2. Этапы ИФА: Сам анализ

  1. Покрытие микропластин с захватным антителом
    1. Разбавляют захватное антитело (M. pneumoniae предварительно адсорбированная поликлональная антисыворота) до концентрации 10 мкг/мл в 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера (рН 9,6).
    2. Покройте 96-луночную ИФА-пластину, добавив 100 мкл разбавленного антитела захвата в каждую лунку.
    3. После ночной инкубации при 4 °C удаляют раствор покрытия и промывают пластину пять раз промывочным буфером (композиция [на л]: 146,29 г NaCl, 39,4 г Tris-HCl, 0,2 г тимеросала и 0,5 мл Tween 20; рН 7,3).
  2. Блокировка
    1. Блокируют оставшиеся связующие поверхности скважин с покрытием, добавляя 100 мкл блокирующего раствора (0,5% казеина в PBS) в каждую скважину.
    2. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
    3. Удалите блокирующий раствор пипеткой и вымойте пластину пять раз с помощью промывочного буфера.
  3. Применение антигена
    1. Добавьте равное количество цельных белков M. pneumoniae во все покрытые лунки (10 нг/лунку).
    2. Дайте реакции произойти в течение 2 ч при комнатной температуре.
    3. Удалите избыток раствора антигена и промойте пластину пять раз с помощью промывочного буфера.
  4. Применение тестовых образцов и средств контроля
    1. Разбавьте тестовые образцы (сыворотки человека) и контрольные (ссылочные положительные и отрицательные сыворотки) до 1/200, 1/400 и 1/800 в PBS-Tween 20.
    2. Добавить 100 мкл разреженных проб и контрольных образцов в соответствующие скважины. Проводите каждую реакцию в двух экземплярах. Пометьте лунки, не содержащие ни антигена, ни сыворотки, как пустые.
    3. После инкубации тарелки в течение 90 мин при комнатной температуре удалите растворы сыворотки и промыть пластину пять раз с помощью промывочного буфера.
  5. Применение фермент-конъюгированного детектирующего антитела
    1. Разбавьте фермент-конъюгированные детектирующие антитела, HRP-конъюгированные анти-кролики и античеловеческий IgG до 1/10000 в PBS-Tween 20.
    2. Пипетка 100 мкл соответствующего разбавленного детектирующего антитела к каждой лунке.
    3. После инкубации пластины в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте удаляют несвязанные антитела обнаружения и промывают пластину пять раз моющим буфером.
  6. Обнаружение и анализ данных
    1. Добавьте 100 мкл раствора хромогена 3,3', 5,5' тетраметил-бензидина (TMB) для визуализации связывания антиген-антитело.
    2. Дайте пластине развиться в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавьте 100 мкл стоп-раствора (7,5%H2SO4), чтобы остановить ферментативную реакцию.
    3. Считайте поглощение на длине волны 450 нм с помощью микропластичного считывателя и отсортируйте результаты на основе расчета индекса позитивности (IP).
      IP = Поглощение тестируемой сыворотки / Поглощение отсечки
      IP < 0.7: Отрицательный результат
      IP = 0,7: Тест должен быть повторен в течение 2 недель
      IP > 0.7: Положительный результат
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формула IP разрабатывается в лаборатории, а значение 0,7 настраивается после оптимизации. Для дублирующих реакций рассчитывается среднее значение поглощения. Оптимальное разведение в сыворотке крови и концентрация антигена устанавливаются методом тетер-подборщика ИФА (данные не показаны). Пороговое значение = OD (оптическая плотность) эталонной положительной сыворотки (разбавленной при том же разведении, что и образец). Этот OD должен быть как минимум в три раза выше значения OD отрицательного элемента управления.

3. Этапы после ИФА: оценка результатов и проверка теста

  1. Способность собственного ИФА специфически диагностировать инфекцию M. pneumoniae у тестируемых пациентов оценивается с помощью дополнительных иммуноблотов с использованием антигенов M. pneumoniae и гетерологичных бактерий для подтверждения положительности тестируемых человеческих сывороток в антителах M. pneumoniae и их негативности у других подозреваемых бактерий (данные не показаны).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Иммуноблоттинговая активность неадсорбированной поликлональной Mycoplasma pneumoniae против оболочки к гетерологичным бактериям
Перекрестная реактивность действительно существует, как показано в результатах иммуноблоттинга (рисунок 2), и по сравнению с положительным контролем (полоса 1), некоторые из антигенов M. pneumoniae разделяются с проверенными бактериями. Интенсивность этих перекрестных реакций была переменной. Например, антигены M. gallisepticum и M. imitans показали самую сильную реактивность с M. pneumoniae antiserum (lanes 9 и 10), помимо того, что они были птичьими микоплазмами. Напротив, ни один из двух человеческих клинических изолятов Ureaplasma urealyticum не показал какой-либо реактивности (полосы 7 и 8). Однако антигены остальных видов генитальных микоплазм человека M. hominis, M. fermentans и M. genitalium вызывали значительные перекрестные реакции с M. pneumoniae antiserum (Lanes 11, 12 и 13 соответственно). Escherichia coli (Lane 2), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) и Klebsiella pneumoniae (Lane 6) также реагировали с поликлональными антителами M. pneumoniae , и их антигенный профиль был очень похож. Этот профиль немного отличался от профиля двух кокковых бактерий видов Streptococcus pneumoniae и Staphylococcusaureus; реактивность была меньше при S. pneumoniae (Lane 3) и еще меньше у S.aureus (Lane 5).

Специфичность антител Mycoplasma pneumoniae, гарантированная процедурой адсорбции
После адсорбции поликлональной антисыворотки M. pneumoniae против гетерологичных бактериальных антигенов специфичность проверяли иммуноблоттингом (рисунок 3). За исключением некоторых белков антигена M. pneumoniae , выявленных в Lane 1 (положительный контроль), другие антигены были почти полностью не обнаружены (Lanes 2-13). Выявленные белки в Lane 1 на самом деле являются специфическими белками, обнаруженными специфическими антителами M. pneumoniae, оставшимися после адсорбции. На основании этого результата доказана эффективность процедуры адсорбции, так как устранены встречающиеся неспецифические реакции поликлональной антисыворотки M. pneumoniae с гетерологичными антигенами, описанными выше. M. pneumoniae antiserum, ставший специфическим, затем использовался во всех последующих серологических и иммуноблоттинговых тестах.

ИФА захвата антигена: действительный анализ для рутинной лабораторной серодиагностической активности
Поскольку все сыворотки были испытаны в дублирующихся скважинах для различных разбавлений, были рассчитаны средние значения OD и построена гистограмма, коррелирующая эти значения поглощения с соответствующими разбавлениями сыворотки (рисунок 4). Основываясь на расчетах IP, набор человеческих сывороток, протестированных и представленных в этой статье, оказался положительным для M. pneumoniae IgG. Несколько других наборов сыворотки также были протестированы с использованием этого домашнего ИФА, и каждый раз анализ оказывался эффективным в конкретном выявлении M. pneumoniae IgG и, таким образом, в различении пациентов, инфицированных M. pneumoniae, от неинфицированных (данные не показаны).

Результаты ИФА всегда подтверждались несколькими иммуноблот-анализами, одновременно показывающими позитивность у M. pneumoniae и негативность у всех других бактерий любой протестированной сыворотки, признанной положительной с помощью собственного захвата антигена M. pneumoniae ELISA (данные не показаны).

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое представление ИФА захвата антигена, разработанного в лаборатории для специфического обнаружения Mycoplasma pneumoniae IgG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Иммуноблотический анализ перекрестных реакций между Mycoplasma pneumoniae и набором гетерологичных бактерий. Реактивность неадсорбированной поликлональной антисывороты M. pneumoniae была проверена на антигены Escherichia coli (Lane 2), Streptococcus pneumoniae (Lane 3), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4), Staphylococcus aureus (Lane 5), Klebsiella pneumoniae (Lane 6), два изолята Ureaplasma urealyticum (Lanes 7 и 8), M. imitans (Lane 9), M. gallisepticum (Lane 10), M. hominis (Lane 11), M. fermentans (переулок 12) и M. genitalium (переулок 13). Полоса 1: M. pneumoniae (положительный контроль). Молекулярные массы некоторых основных белков M. pneumoniae были даны слева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Иммуноблотовое подтверждение эффективности процедуры адсорбции для устранения перекрестных реакций. Реакционная способность всех выбранных гетерологичных бактерий; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, два изолята Ureaplasma urealyticum , M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans и M. genitalium (Lanes 2-13, соответственно) были протестированы против адсорбированной поликлональной антисыворотки M. pneumoniae . Антиген M. pneumoniae был загружен в Lane 1 в качестве положительного контроля (были выявлены только специфические белки). Lane MW: предварительно окрашенная белковая лестница. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Результаты ИФА захвата антигена. ИФА проводили с использованием адсорбированной поликлональной антисывороты Mycoplasma pneumoniae в качестве агента покрытия. Гистограммы 1 и 2 изображают отрицательные и положительные элементы управления соответственно. Гистограммы 3-13 изображают сыворотки группы испытуемых пациентов. Каждая сыворотка тестировалась в трех различных разведении: 1/200 (фиолетовые полосы), 1/400 (оранжевые полосы) и 1/800 (синие полосы). Значения OD служили для расчета индекса позитивности. Каждая реакция выполнялась в двух экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Микроорганизм Напряжение* Терпимая Ссылка
Виды микоплазм и уреаплазм Mycoplasma pneumoniae АТХК 160 20030 Пакет обновления 4 (SP4) [35]
Микоплазма гениталий CIP 103767T Пакет обновления 4 (SP4)
Микоплазма ферментанская АТХК 160 20026 Пакет обновления 4 (SP4)
Микоплазма гоминис CIP 103715T SP4 с добавлением аргинина
Ureaplasma urealyticum 2 клинических изолята** SP4 с мочевиной
Микоплазма галлизептическая CIP S6 15302 Фрей [36]
Mycoplasma imitans АТХК 160 20037 Фрей
Другие бактерии Кишечная палочка АТХК 25922 Бульон LB [37]
Klebsiella pneumoniae Клинический изолят*** Бульон LB
Синегнойная палочка АТХК 27853 Бульон LB
Золотистый стафилококк АТХК 25923 Бульон LB
Стрептококк пневмония Клинический изолят*** Кровяный бульон
* ATCC: Коллекция культуры американского типа, CIP: Коллекция Института Пастера
** Изоляты были взяты из клинических образцов, добровольно отправленных в Лабораторию микоплазм (Институт Пастера в Тунисе) для плановой диагностики
Изоляты были взяты из клинических образцов, добровольно отправленных в Лабораторию бактериологии (Институт Пастера в Тунисе) для рутинной диагностики.

Таблица 1: Список штаммов бактерий, используемых в этом исследовании.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В настоящем документе представлено общее описание собственной ИФА, в основном разработанной для обеспечения специфического скрининга M. pneumoniae инфекция. Приведены подробности о протоколе самого анализа ИФА, а также о некоторых этапах предварительной и постобработки. Специфика этого анализа обеспечивается техникой адсорбции. Эта процедура была ранее описана в ИФА-тестах, разработанных для диагностики человека и птицы. Mycoplasmas17,24. Он также использовался в анализах ИФА для диагностики других бактериальных инфекций, таких как болезнь Лайма.25. В этих трех работах было доказано, что адсорбция помогает повысить специфичность ИФА без скарификации или снижения чувствительности.17,24,25. В случае настоящего ИФА-анализа соответствующие виды бактерий, отобранные для адсорбции, могут быть разделены на две группы: первая группа содержит некоторые патогенные виды моллюсков человека и птиц (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumи M. imitans), в то время как второй содержит наиболее частые бактерии, которые, как известно, заражают людей (E. coli, P. aeruginosaи S. aureus) и те, которые печально известны своим тропизмом к дыхательным путям (K. pneumoniae и S. pneumoniae). Широкий ассортимент селекции гетерологичных бактерий основывался на том, что догма видовой и органной специфичности больше не соблюдается. Ранее было опубликовано много сообщений об обнаружении микроорганизмов в незнакомых местах обитания. Например M. pneumoniae был выделен из многих внелегочных участков и, как было установлено, связан с различным спектром внелегочных осложнений с легкими и тяжелыми симптомами, хотя предполагалось, что он специфичен для дыхательных путей.6,7. Противоположный случай (изоляция гениталий) Mycoplasma виды из дыхательных путей) было сигнализировано для M. hominis и M. fermentans26,27. Включение птиц Mycoplasma spp. в серодиагностике тест на инфекцию человека был основан на предыдущих исследованиях, сообщающих о возможности заражения людей (особенно лиц с ослабленным иммунитетом и ветеринаров) Mycoplasma spp. происходит от домашних животных28,29,30. Это правда, что до сих пор не было найдено ни одной бумаги, напоминающей об изоляции M. gallisepticum и M. imitans (два вида, включенные в процедуру адсорбции в этой статье) от человека. Несмотря на это, нет ничего невозможного, тем более что эти виды являются одними из наиболее регулярно обрабатываемых ветеринарами видов и филогенетически слишком близки к M. pneumoniae. На самом деле, эти две птицы Mycoplasma spp. показали самую сильную реактивность с M. pneumoniae антисыворотка (как показано на рисунке Рисунок 2). Короче говоря, при разработке процедуры адсорбции относительно большой спектр подозрительных бактерий, которые могут делиться антигенами с M. pneumoniae был включен. Сделанный выбор был основан на филогенетической связанности и тропизме к дыхательным путям. Тем не менее, из-за разнообразия флоры человека и антигенной изменчивости невозможно предсказать и включить все возможные гетерологичные виды бактерий и штаммы, которые могли бы перекрестно реагировать с M. pneumoniae Антитела. Таким образом, возможность перекрестной реакции между M. pneumoniae антисыворотка, даже после адсорбции, и другие бактерии остаются вероятными. Более того, поскольку M. pneumoniae общеизвестно, что он заражает детей и молодых людей, процедура адсорбции может быть дополнительно улучшена в будущем путем добавления других детских респираторных патогенов, таких как Haemophilus influenzae31 и Streptococcus pyogenes32 в шорт-лист адсорбционных бактерий.

Целью данного ИФА является обнаружение присутствия целевого антитела (специфического M. pneumoniae-IgG) в сыворотках человека. Итак, чтобы иметь возможность как использовать сыворотку в качестве образца (так как она самая простая в сборе и менее болезненная для пациентов), так и обеспечить специфичность, собственный ИФА основан на принципе двух типов ИФА: непрямой и сэндвич-ИФА. Образец сыворотки (первичное антитело) связан между детектирующим антителом (меченым вторым антителом) и антигеном захвата, который был специфически связан с антителом захвата (предварительно ставшим специфичным путем адсорбции и иммобилизованным на поверхности микропластины). Учитывая эти уникальные характеристики, считается, что этот ИФА является эффективным и особенным. Тем не менее, этот тест не идеален, и могут возникнуть неприятности. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты все еще могут встречаться, иногда из-за качества сыворотки или фазы инфекции, а иногда из-за ошибок при применении протокола в лаборатории. Например, результаты ИФА-серодиагностики могут быть затронуты даже в том случае, если скважины недостаточно промыты. Кроме того, инкубация (температура и время) может влиять на результаты испытаний. Также сообщалось, что выбор микропластин и блокирующих агентов является критическим шагом во время разработки ИФА33,34. По всем этим причинам важно постоянно работать над улучшением этого ИФА-теста, чтобы определить оптимальные параметры и условия, такие как разбавление различных антител (образцы сыворотки, антитела захвата, обнаружение антител), этапы инкубации и промывки, а также включение соответствующих отрицательных и положительных контрольных элементов.

Культуру бактерий и выработку их антигенов для выполнения процедуры адсорбции можно считать тяжелым шагом, особенно для видов молликутов. Тем не менее, считается, что это важно, поскольку этот шаг значительно помогает повысить специфичность ИФА и избежать дальнейших подтверждающих тестов, таких как иммуноблоттинг или ПЦР. Кроме того, в контексте инфекции M. pneumoniae определенно требуется эффективная и достоверная диагностика для установления адекватной и адекватной антибиотикотерапии, поскольку применение бета-лактамных препаратов при лечении внебольничной пневмонии неэффективно в отношении M. pneumoniae8. После многих лет использования в рутинной диагностической деятельности в лаборатории считается, что ИФА захвата антигена, описанная в этой статье, представляет собой действительный инструмент для специфического скрининга инфекции M. pneumoniae .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что конкурирующих интересов нет.

Acknowledgments

Это исследование финансировалось Министерством здравоохранения Туниса и Министерством высшего образования и научных исследований Туниса.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf (2022).
  34. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  35. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  36. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  37. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Tags

Биология выпуск 192
Антиген-захват фермент-связанный иммуносорбентный анализ для специфического обнаружения <em>Mycoplasma pneumoniae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter