Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Antigen-capture enzym-linked immunosorbent assay til specifik påvisning af mycoplasma pneumoniae

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

I Mycoplasma pneumoniae infektion, serologi test kan generere gode resultater, men med lav specificitet på grund af immunologisk krydsreaktion. Den interne antigen-capture ELISA, beskrevet i dette papir, garanterer høj artsspecificitet og har vist sig at være en pålidelig screeningstest til nøjagtig diagnose af M. pneumoniae.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae er en prokaryot med cellevægsmangel, der hovedsageligt er kendt for at kolonisere det menneskelige luftveje og være endemisk, med epidemiske toppe hvert 6. år hos ældre børn og unge voksne. Diagnose af M. pneumoniae er udfordrende på grund af patogenens kræsne natur og muligheden for asymptomatisk transport. Laboratoriediagnose af M. pneumoniae-infektion baseret på antistoftitrering i serumprøver af patienter forbliver den mest praktiserede metode. På grund af det potentielle problem med immunologisk krydsreaktivitet ved anvendelse af polyklonalt serum til M. pneumoniae er der udviklet et antigenindfangningsenzymbundet immunosorbentassay (ELISA) for at forbedre specificiteten af serologisk diagnose. ELISA-plader er belagt med M. pneumoniae polyklonale antistoffer, hævet hos kaniner og gjort specifikke efter adsorption mod et panel af heterologe bakterier, der deler antigener med M. pneumoniae-arter og / eller vides at kolonisere luftvejene. De reagerede M. pneumoniae homologe antigener genkendes derefter specifikt af deres tilsvarende antistoffer i serumprøverne. Yderligere optimering af de fysisk-kemiske parametre, som antigenindfangnings-ELISA'en udsættes for, førte til en meget specifik, følsom og reproducerbar ELISA.

Introduction

Mycoplasmer er blandt de mindste og enkleste kendte prokaryoter. De adskiller sig hovedsageligt fra andre bakterier ved manglen på en cellevægsstruktur. Således blev mycoplasmer klassificeret i en separat klasse ved navn Mollicutes1. Cellevægsmanglen giver iboende resistens over for disse mikroorganismer mod nogle antimikrobielle midler og er i høj grad ansvarlig for deres polymorfisme. Mycoplasmer har lille genom og reduceret størrelse, hvilket begrænser deres metaboliske og biosyntetiske evner og forklarer deres parasitære og saprofytiske natur1.

Mycoplasma pneumoniae er en af de Mycoplasmer, der inficerer mennesket og menes at være den mest virulente2. M. pneumoniae koloniserer de øvre luftveje, hvilket fører til atypisk lungebetændelse hos børn og unge voksne. De kliniske tegn fremkaldt af M. pneumoniae infektion er influenzalignende, med hovedpine, feber og hoste3. Cytadherensen af M. pneumoniae til værtsceller medieres af en vedhæftningsorganel, herunder P1 større adhæsion og flere tilbehørsproteiner 4,5. Flere kliniske manifestationer kan forekomme på grund af lokal inflammation og stimulering af værtsimmunsystemet som følge af den intime vedhæftning af M. pneumoniae til luftvejsslimhinden6. Selvom lungebetændelse er et kendetegn ved M. pneumoniae-infektion, er det blevet afsløret, at infektion med denne bakterie også kan være ansvarlig for et bredt spektrum af ikke-pulmonale manifestationer på forskellige anatomiske steder såsom centralnervesystemet, hjerte, hud og led7.

Som for alle Mycoplasma-arter er diagnosen M. pneumoniae udfordrende. De kliniske tegn, der fremkalder mycoplasmosis, er for det meste usynlige og ikke-karakteristiske8. Da det er meget svært at diagnosticere M. pneumoniae-infektion ved kun at stole på kliniske manifestationer og symptomer, er laboratoriescreening af særlig interesse9. Påvisning af M. pneumoniae-kolonier ved kultur er guldstandardmetoden til en korrekt diagnose. Imidlertid komplicerer de kræsne vækstkrav og den lange tid, der er nødvendig for levering af endelige resultater (1-2 uger), kulturen og betyder således, at den sjældent bruges til rutinemæssig diagnose10. Nukleinsyreamplifikationsteknologier blev valideret med hensyn til hastighed og effektivitet, selvom disse molekylære teknikker på grund af deres relativt høje omkostninger og utilgængelighed i nogle sundhedsfaciliteter ikke betragtes som diagnostiske førstelinjetest. Det er rigtigt, at kommercielle PCR-tests i vid udstrækning anvendes til at diagnosticere M. pneumoniae-infektioner, men de kan stadig ikke erstatte serologi. Også den hyppige forekomst af både falsk negative og falsk positive resultater har begrænset brugen af PCR9. Rutinemæssigt forbliver serologi den mest praktiserede i laboratorier til diagnosticering af M. pneumoniae-infektion. Flere serologiske tilgange er blevet rapporteret i årtier, såsom kolde hæmagglutininer, komplementfikseringstest11, indirekte hæmagglutinationstest 12, immunofluorescens 13 og ELISA-teknologien, som først blev anvendt til mycoplasma-serologi i begyndelsen af 1980'erne14,15,16. Et af de største problemer, der opstår ved udførelse af ELISA-serodiagnose af M. pneumoniae-infektion, er krydsreaktioner, hvilket reducerer teknikkens specificitet betydeligt. Uspecifik adsorption af humane sera med M. pneumoniae-antigener er tidligere rapporteret; Faktisk er mange af de antistoffer, der påvises af ELISA i humane sera, muligvis ikke altid bundet til mycoplasmalantigener 17 på grund af M. pneumoniaes fællestræk med nogle bakterier18,19 og nogle animalske og humane væv20.

På grund af de høje baggrundsaflæsninger, der blev observeret i den konventionelle ELISA-test, der blev praktiseret i laboratoriet, var fortolkningen af resultaterne ofte kompliceret, og derfor var leveringen af en ordentlig M. pneumoniae-diagnose en hård opgave. Mens vi stod over for dette problem, valgte vi at forbedre M. pneumoniae ELISA ved at fjerne uspecifikke reaktioner af M. pneumoniae-antigener med antistoffer, der skal testes. Til dette formål arbejdede vi på selektiv udtømning af de uspecifikke M. pneumoniae-antigener ved hjælp af adsorptionsteknikken. Faktisk er hovedmålet med antigen-capture ELISA specifikt at detektere M. pneumoniae immunoglobulin (Ig) G i humane serumprøver. Konceptet med denne ELISA består hovedsagelig af selektiv indfangning af M. pneumoniae-specifikke antigener, før de humane serumprøver tilsættes. Denne selektivitet sikres ved at inkubere M. pneumoniae råantigen med et M. pneumoniae polyklonalt antiserum, der produceres hos kaniner i laboratoriet, og gøre det artsspecifikt ved adsorption mod et panel af heterologe bakterier, der tilhører eller ikke tilhører Mollicutes-klassen, og som deler antigener med M . pneumoniae arter og / eller kendt for at kolonisere luftvejene. Adsorptionsproceduren blev gentaget tre gange, og dens effektivitet til eliminering af krydsreaktivitet blev testet ved immunoblotting. Det udviklede ELISA-assay er en kombination af sandwich og indirekte ELISA. Kort fortalt er brøndene i ELISA-pladen først belagt med et polyklonalt antiserum, der er specifikt for M. pneumoniae. Derefter tilsættes M. pneumoniae-antigen og fanges mellem antiserumet og antistofferne i serumprøven, der skal testes. Det dannede immunologiske kompleks detekteres af et sekundært enzymkonjugeret antistof (peroxidasekonjugeret IgG). Reaktionerne visualiseres ved tilsætning af kromogent substrat, og absorbansen måles spektrophotometrisk. Denne interne ELISA er skematisk præsenteret i figur 1. Den hjemmelavede ELISA viste sig at være effektiv til specifikt at detektere M. pneumoniae-infektion og er i øjeblikket en af de mest praktiserede tests i rutinemæssig diagnostisk aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse er udført i overensstemmelse med etiske aspekter fastlagt af det etiske udvalg ved Pasteur-instituttet i Tunis.

1. Trin før ELISA: Forudsætninger og forbehandling

  1. Bakteriestammer og vækstmedier
    BEMÆRK: Mollicutes-arter og de murede bakterier, der anvendes i denne undersøgelse, og deres vækstmedier er anført i tabel 1.
    1. Vækst af Mollicutes arter
      1. Der podes 200 μL fra glycerolstammen af hver art i 1 800 μL af mediet.
      2. Mollicutes-arter dyrkes statisk ved 37 °C med 5% CO 2 i2-4 dage, indtil der observeres en pH-ændring (pH-indikatoren er phenolrød).
      3. Opskaler kulturerne til 10 ml ved at tilføje en 1/10th fortynding af kulturen til medierne og lad dem vokse igen under de samme forhold.
        BEMÆRK: Ifølge metabolismen syrer nogle humane Mollicutes-arter (M. pneumoniae, M. genitalium og M. fermentaner) mediet på grund af glucosefermentering, og nogle andre (M. hominis og Ureaplasma) alkaliserer mediet ved henholdsvis argininhydrolyse eller urinstofhydrolyse. Med hensyn til fuglemycoplasmer viser forsuringen af Freys medium tilstedeværelsen af M. gallisepticum, mens dens alkalisering beviser væksten af M. imitans.
      4. Spred 50 μL af kulturerne på agarplader for at bekræfte bakteriens vækst. Agarpladerne opbevares ved 37 °C med 5% CO2 og observeres regelmæssigt under mikroskopet for udseendet af typiske spejlægkolonier (Mycoplasmer) og mørke søpindsvinlignende kolonier (Ureaplasmer).
    2. Vækst af ikke-Mollicutes arter
      1. Dyrk ikke-Mollicutes-bakterierne i 3 ml af mediet ved 37 °C natten over (omrystning ved 200 omdr./min.).
      2. Sammenlign kulturernes turbiditet med kontrolmedierne for at bekræfte væksten.
      3. Opskaler kulturerne til 10 ml ved at tilføje en 1/100th fortynding af kulturen til medierne og lad dem vokse igen under de samme forhold.
  2. Antigen forberedelse
    1. Antigenpræparation af Mollicutes-arter
      1. Hele proteinerne (til stede i bekræftede kulturer af M. pneumoniae og de andre Mollicutes-arter) høstes ved centrifugering ved 40.000 x g ved 4 °C i 30 minutter.
      2. Supernatanten kasseres, og pellets vaskes tre gange med 1 ml 1x fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4) ved en serie på tre centrifugeringer med samme betingelser.
      3. Hvert antigen resuspenderes i 500 μl PBS.
    2. Antigenpræparat af ikke-Mollicutes-arter
      1. Centrifuger de natligt dyrkede kulturer af ikke-Mollicutes-bakterierne ved 1.500 x g i 15 minutter.
      2. Hver bakteriepille resuspenderes i 500 μL PBS.
        BEMÆRK: Proteinkoncentrationen bestemmes ved hjælp af den klassiske Bradford-kvantificeringsmetode med bovint serumalbumin som standard21. Proteinkoncentrationen af Mollicutes-arter ligger normalt mellem 0,7-4,8 mg / ml. For de andre bakteriearter kan proteinkoncentrationen nå op på 20 mg/ml. Alle antigener opbevares ved -20 °C indtil deres efterfølgende anvendelse.
  3. Krydsreaktivitetsscreening ved immunblotting
    1. Denaturerer bakterieproteinerne ved at blande 8 μL af hvert antigen med et lige så stort volumen prøvebuffer (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glycerol [v/v], 10% SDS [w/v] og 0,2% bromphenolblåt), inkuber blandingen ved 100 °C i 5 minutter.
      BEMÆRK: Denaturering udføres for at dække proteinerne med negativ ladning og for at bryde deres sekundære strukturer, hvilket gør det muligt for dem at løbe over polyacrylamidgelen og adskilles i henhold til deres molekylvægt.
    2. Udsæt de denaturerede proteiner (100 μg protein/brønd) for natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ved Laemmlis metode22 med 12 % separeringsgel og 5% stablingsgel. Derefter overføres proteinerne elektroforetisk til nitrocellulosemembranen ved hjælp af Towbin et al.'s metode23.
    3. Nedsænk nitrocellulosemembranen i 5% skummetmælk i PBS i 30 minutter for at blokere de ledige overflader. Inkuber proteinblotterne ved stuetemperatur i 2 timer med kaninpolyklonalt M. pneumoniae-antiserum (produceret på Pasteur Institute of Tunis) fortyndet til 1/200 i PBS-Tween 20, derefter med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret antikanin IgG fortyndet til 1/2.000 i PBS-Tween 20 i 1 time ved stuetemperatur.
    4. De ubundne antistoffer vaskes af med PBS, og resultaterne opnås ved at udsætte nitrocellulosepladen for substratopløsningen (4-chlor-1-naphthol,H2O2). Stop reaktionen ved at tilsætte vand efter 5-15 min.
  4. Procedure for adsorption
    BEMÆRK: For at eliminere krydsreaktioner mellem polyklonale M. pneumoniae-antiserum og heterologe bakterieantigener anvendes adsorptionsproceduren, der tidligere er beskrevet af Ben Abdelmoumen og Roy24 .
    1. Forbered en antigenpulje af de 12 heterologe bakterier (mistænkt for at dele antigener med M. pneumoniae), bland den i et mikrocentrifugerør, og juster proteinkoncentrationen svarende til halvdelen af det antiserum, der skal adsorberes i eksperimentet.
      BEMÆRK: Volumen og koncentration varierer mellem de forskellige assays. Dette trin afhænger hovedsageligt af koncentrationen af det antistof, der skal adsorberes. For eksempel, hvis antistofkoncentrationen = 3,56 mg / ml, bør koncentrationen af antigenpuljen (sammensat af de 12 heterologe bakterier) være 1,78 mg / ml (derfor ca. 0,148 mg af hvert antigen).
    2. Antigenblandingen centrifugeres ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 °C, opsamles og inkuberes med den rensede polyklonale anti-M. pneumoniae IgG i 2 timer ved 37 °C under langsom omrøring.
    3. Efter inkubation centrifugeres suspensionen ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 °C, og supernatanten (som svarer til det specifikke polyklonale M. pneumoniae antiserum).
      BEMÆRK: For at sikre specificiteten af det polyklonale M. pneumoniae antiserum, gentag adsorptionsproceduren tre gange. Før det kan anvendes i ELISA-assayet, bør det adsorberede polyklonale M. pneumoniae-antiserum testes ved immunoblotting for fravær af krydsreaktioner mod det medfølgende sæt bakterier.

2. ELISA-trin: Selve analysen

  1. Mikropladebelægning med indfangningsantistoffet
    1. Indfangningsantistoffet (M. pneumoniae præadsorberet polyklonalt antiserum) fortyndes til en koncentration på 10 μg/ml i 0,1 M carbonat-bicarbonatbuffer (pH 9,6).
    2. Overtræk ELISA-pladen med 96 brønde ved at tilsætte 100 μL af det fortyndede indfangningsantistof til hvert hul.
    3. Efter inkubation natten over ved 4 °C fjernes overfladebehandlingsopløsningen, og pladen vaskes fem gange med vaskebufferen (sammensætning [pr. L]: 146,29 g NaCl, 39,4 g Tris-HCl, 0,2 g Thimerosal og 0,5 ml Tween 20; pH 7,3).
  2. Blokering
    1. De resterende bindingsflader i de coatede huller blokeres ved at tilsætte 100 μL blokerende opløsning (0,5 % kasein i PBS) til hvert hul.
    2. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
    3. Fjern blokeringsopløsningen med en pipette og vask pladen fem gange med vaskebufferen.
  3. Anvendelse af antigenet
    1. Der tilsættes en lige stor mængde M. pneumoniae hele proteiner til alle overtrukne huller (10 ng/brønd).
    2. Lad reaktionen finde sted i 2 timer ved stuetemperatur.
    3. Fjern overskuddet af antigenopløsningen og vask pladen fem gange med vaskebufferen.
  4. Anvendelse af analyseprøver og kontroller
    1. Testprøverne (humane sera) og kontrollerne (referencepositive og negative sera) fortyndes til 1/200, 1/400 og 1/800 i PBS-Tween 20.
    2. Der tilsættes 100 μL af de fortyndede prøver og betjeningsanordninger i de relevante huller. Udfør hver reaktion i to eksemplarer. Hullerne, der hverken indeholder antigen eller sera, markeres som blinde.
    3. Efter at have inkuberet pladen i 90 minutter ved stuetemperatur, fjernes serumopløsningerne, og pladen vaskes fem gange med vaskebufferen.
  5. Anvendelse af enzymkonjugeret detektionsantistof
    1. Fortynd de enzymkonjugerede detektionsantistoffer, HRP-konjugerede antikaniner og anti-human IgG til 1/10.000 i PBS-Tween 20.
    2. Der pipetteres 100 μL af det passende fortyndede detektionsantistof i hvert hul.
    3. Efter inkubation af pladen i 1 time ved stuetemperatur i mørke fjernes de ubundne detektionsantistoffer, og pladen vaskes fem gange med vaskebufferen.
  6. Registrering og dataanalyse
    1. Der tilsættes 100 μL af 3,3', 5,5' tetramethylbenzidinkromogenopløsningen (TMB) for at visualisere antigen-antistofbindingen.
    2. Pladen lader sig udvikle sig i 30 minutter ved stuetemperatur, og tilsæt derefter 100 μL stopopløsning (7,5%H2SO4) for at standse den enzymatiske reaktion.
    3. Absorbansen aflæses ved bølgelængden 450 nm ved hjælp af mikropladelæseren, og resultaterne sorteres ud fra beregningen af positivitetsindekset (IP).
      IP = Absorbans af det testede serum / Absorbans af afskæringen
      IP < 0,7: Negativt resultat
      IP = 0,7: Testen skal gentages inden for 2 uger
      IP > 0.7: Positivt resultat
      BEMÆRK: IP-formlen udtænkes i laboratoriet, og 0,7-værdien konfigureres efter optimering. For dobbeltreaktioner beregnes absorbansmiddelværdien. Optimal serumfortynding og antigenkoncentration bestemmes ved ELISA-skakternetitreringsmetoden (data ikke vist). Afskæringsværdi = OD (optisk densitet) af et positivt referenceserum (fortyndet i samme fortynding som prøven). Denne OD skal være mindst tre gange højere end OD-værdien for den negative kontrol.

3. Trin efter ELISA: Vurdering af resultater og validering af test

  1. Den interne ELISA's evne til specifikt at diagnosticere M. pneumoniae-infektion hos de testede patienter evalueres gennem supplerende immunblots ved hjælp af antigener af M. pneumoniae og de heterologe bakterier for at bekræfte positiviteten af de testede humane sera i M. pneumoniae-antistoffer og deres negativitet i de andre mistænkte bakterier (data ikke vist).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunoblottingaktiviteten af det ikke-adsorberede polyklonale Mycoplasma pneumoniae-antiserum mod heterologe bakterier
Krydsreaktivitet eksisterer faktisk som vist i immunoblotting-resultaterne (figur 2), og sammenlignet med den positive kontrol (bane 1) deles nogle af M. pneumoniae-antigenerne med de screenede bakterier. Intensiteten af disse krydsreaktioner varierede. For eksempel viste M. gallisepticum og M. imitans antigener den stærkeste reaktivitet med M. pneumoniae antiserum (bane 9 og 10), udover at være aviær mycoplasmaer. Modsat viste ingen af de to humane kliniske isolater af Ureaplasma urealyticum nogen reaktivitet (bane 7 og 8). Imidlertid gav antigener af de resterende humane genitale Mycoplasma-arter M. hominis, M. fermentans og M. genitalium betydelige krydsreaktioner med M. pneumoniae antiserum (henholdsvis bane 11, 12 og 13). Escherichia coli (bane 2), Pseudomonas aeruginosa (bane 4) og Klebsiella pneumoniae (bane 6) reagerede også med polyklonale M. pneumoniae-antistoffer, og deres antigene profilmønster var meget ens. Denne profil var lidt forskellig fra de to cocci bakteriearter Streptococcus pneumoniae og Staphylococcusaureus; reaktiviteten var mindre med S. pneumoniae (bane 3) og endnu mindre med S.aureus (bane 5).

Specificitet af Mycoplasma pneumoniae-antistoffer garanteret ved adsorptionsprocedure
Efter adsorptionen af M. pneumoniae polyklonalt antiserum mod de heterologe bakterieantigener blev specificiteten testet ved immunoblotting (figur 3). Bortset fra nogle proteiner af M. pneumoniae-antigen afsløret i bane 1 (positiv kontrol), blev de andre antigener næsten fuldstændig ikke-detekteret (bane 2-13). De afslørede proteiner i bane 1 er faktisk de specifikke proteiner, der påvises af de specifikke M. pneumoniae-antistoffer , der er tilbage efter adsorption. Baseret på dette resultat blev effektiviteten af adsorptionsproceduren bevist, da de stødte uspecifikke reaktioner af M. pneumoniae polyklonalt antiserum med de heterologe antigener, der er beskrevet ovenfor, blev elimineret. M. pneumoniae antiserum gjort specifikt blev derefter anvendt i alle de efterfølgende serologiske og immunblotting tests.

ELISA for indfangningsantigen: Gyldigt assay til rutinemæssig serodiagnostisk aktivitet i laboratoriet
Da alle sera blev testet i dobbeltbrønde for de forskellige fortyndinger, blev OD-middelværdierne beregnet, og der blev afbildet et søjlediagram, der korrelerede disse absorbansværdier med deres tilsvarende serumfortyndinger (figur 4). Baseret på IP-beregning viste sættet af humane sera testet og præsenteret i dette papir positivt for M. pneumoniae IgG. Flere andre serumsæt blev også testet ved hjælp af denne hjemmelavede ELISA, og hver gang viste analysen sig effektiv til specifikt at detektere M. pneumoniae IgG og dermed skelne de M. pneumoniae-inficerede patienter fra de uinficerede (data ikke vist).

ELISA-resultaterne blev altid bekræftet af flere immunoblot-analyser, der samtidig viste positiviteten i M. pneumoniae og negativiteten i alle de andre bakterier af ethvert testet serum, der blev fundet positivt af det interne capture-antigen M. pneumoniae ELISA (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: Skematisk præsentation af antigen-capture ELISA udviklet i laboratoriet til specifik påvisning af Mycoplasma pneumoniae IgG. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Immunoblot-analyse af krydsreaktioner mellem Mycoplasma pneumoniae og et sæt heterologe bakterier. Reaktiviteten af M . pneumoniae ikke-adsorberet polyklonalt antiserum blev testet mod antigener af Escherichia coli (bane 2), Streptococcus pneumoniae (bane 3), Pseudomonas aeruginosa (bane 4), Staphylococcus aureus (bane 5), Klebsiella pneumoniae (bane 6), to Ureaplasma urealyticumisolater (bane 7 og 8), M. imitans (bane 9), M. gallisepticum (bane 10), M. hominis (bane 11), M. fermentaner (bane 12) og M. genitalium (bane 13). Bane 1: M. pneumoniae (positiv kontrol). Molekylvægt af nogle større M. pneumoniae proteiner blev givet til venstre. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Immunoblot-bekræftelse af adsorptionsprocedurens effektivitet til eliminering af krydsreaktioner. Reaktivitet af alle de udvalgte heterologe bakterier; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, to Ureaplasma urealyticum isolater, M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans og M. genitalium (bane 2-13) blev testet mod det adsorberede M. pneumoniae polyklonale antiserum. M. pneumoniae-antigen blev indlæst i bane 1 som positiv kontrol (kun specifikke proteiner blev afsløret). Bane MW: forfarvet proteinstige. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Resultater af ELISA til indfangning af antigener. ELISA blev udført under anvendelse af det adsorberede polyklonale antiserum Mycoplasma pneumoniae som belægningsmiddel. Søjlediagram 1 og 2 viser henholdsvis negative og positive kontroller. Søjlediagrammer 3-13 viser sera af en gruppe testede patienter. Hvert serum blev testet ved tre forskellige fortyndinger: 1/200 (lilla søjler), 1/400 (orange søjler) og 1/800 (blå bjælker). OD-værdier tjente til at beregne positivitetsindekset. Hver reaktion blev udført i to eksemplarer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Mikroorganisme Stamme* Medium Henvisning
Mycoplasma og ureaplasma arter Mycoplasma pneumoniae ATCC 160 20030 SP4 [35]
Mycoplasma genitalium CIP 103767T SP4
Mycoplasma fermentaner ATCC 160 20026 SP4
Mycoplasma hominis CIP 103715T SP4 suppleret med arginin
Ureaplasma urealyticum 2 kliniske isolater** SP4 suppleret med urinstof
Mycoplasma gallisepticum CIP S6 15302 Frey [36]
Mycoplasma imitans ATCC 160 20037 Frey
Andre bakterier Escherichia coli ATCC 25922 LB bouillon [37]
Klebsiella pneumoniae Klinisk isolat*** LB bouillon
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 LB bouillon
Staphylococcus aureus ATCC 25923 LB bouillon
Streptococcus pneumoniae Klinisk isolat*** Blod bouillon
* ATCC: American Type Culture Collection, CIP: Collection Institut Pasteur
** Isolater blev indsamlet fra kliniske prøver, der frivilligt blev sendt til Laboratory of Mycoplasms (Pasteur Institute of Tunis) til rutinemæssig diagnostik
Isolater blev indsamlet fra kliniske prøver, der frivilligt blev sendt til bakteriologisk laboratorium (Pasteur Institute of Tunis) til rutinemæssig diagnostik

Tabel 1: Liste over bakteriestammer, der anvendes i denne undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette dokument indeholder en generel beskrivelse af en intern ELISA, der hovedsagelig er udviklet for at sikre specifik screening af M. pneumoniae Infektion. Detaljerne om protokollen for selve ELISA-analysen samt nogle for- og efterbehandlingstrin er angivet. Specificiteten af dette assay sikres ved adsorptionsteknikken. Denne procedure er tidligere beskrevet i ELISA-test udviklet til diagnosticering af mennesker og fugle Mycoplasmas17,24. Det blev også anvendt i ELISA-assays til diagnosticering af andre bakterielle infektioner såsom borreliose25. I disse tre papirer viste adsorption sig at hjælpe med at øge ELISA-specificiteten uden at skræmme eller mindske følsomheden17,24,25. I forbindelse med den foreliggende ELISA-analyse kan de relevante bakteriearter, der udvælges til adsorption, opdeles i to grupper: den første gruppe omfatter nogle patogene Mollicutes-arter af mennesker og fugle (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumog M. imitans), mens den anden indeholder de hyppigste bakterier, der vides at inficere mennesker (E. coli, P. aeruginosaog S. aureus) og dem, der er notorisk kendt for deres tropisme i luftvejene (K. pneumoniae og S. pneumoniae). Det brede udvalg af heterologe bakterier var baseret på det faktum, at dogmet om arter og organspecificitet ikke længere respekteres. Mange rapporter om påvisning af mikroorganismer i ukendte levesteder er tidligere blevet offentliggjort. For eksempel M. pneumoniae er blevet isoleret fra mange ekstrapulmonale steder og fundet at være forbundet med en varieret række ekstra-pulmonale komplikationer med milde til svære symptomer, selv om det blev antaget at være specifikt for luftvejene6,7. Det modsatte tilfælde (isolering af kønsorganer Mycoplasma arter fra luftvejene) blev signaleret til M. hominis og M. fermentans26,27. Medtagelsen af fugle Mycoplasma SPPP. i serodiagnosetesten af infektion hos mennesker var baseret på tidligere undersøgelser, der rapporterede muligheden for infektion hos mennesker (især immunkompromitterede personer og dyrlæger) med Mycoplasma spp. stammer fra husdyr28,29,30. Det er rigtigt, at der indtil nu ikke er fundet noget papir, der fremkalder isolation af M. gallisepticum og M. imitans (de to arter, der er inkluderet i adsorptionsproceduren i dette papir) fra mennesker. På trods af dette er intet umuligt, især da disse arter er blandt de mest regelmæssigt håndterede arter af dyrlæger og er fylogenetisk for tæt på M. pneumoniae. Faktisk er disse to fugle Mycoplasma SPP. har vist den stærkeste reaktivitet med M. pneumoniae antiserum (som illustreret i Figur 2). Kort sagt, mens du designer adsorptionsproceduren, et relativt stort spektrum af mistænkelige bakterier, der kunne dele antigener med M. pneumoniae var inkluderet. De valg, der blev truffet, var baseret på fylogenetisk slægtskab og tropisme til luftvejene. På grund af menneskelig floradiversitet og antigen variabilitet er det imidlertid umuligt at forudsige og inkludere alle mulige heterologe bakteriearter og stammer, der kan krydsreagere med M. pneumoniae Antistoffer. Således er muligheden for krydsreaktion mellem M. pneumoniae antiserum, selv efter adsorption, og andre bakterier forbliver sandsynlige. Da M. pneumoniae er almindeligt kendt for at inficere børn og unge voksne, kan adsorptionsproceduren forbedres yderligere i fremtiden ved tilsætning af andre pædiatriske respiratoriske patogener såsom Haemophilus influenzae31 og Streptococcus pyogenes32 ind på adsorptionsbakteriens shortlist.

Formålet med denne ELISA er at påvise tilstedeværelsen af målantistoffet (specifikt M. pneumoniae-IgG) i det humane sera. Så for at kunne både bruge serumet som en prøve (da det er det nemmeste at indsamle og det mindre smertefulde for patienterne) og for at sikre specificitet, er den interne ELISA baseret på princippet om to ELISA-typer: indirekte og sandwich ELISA. Serumprøven (primært antistof) er bundet mellem detektionsantistoffet (mærket andet antistof) og indfangningsantigenet, som var specifikt knyttet til indfangningsantistoffet (på forhånd gjort specifikt ved adsorption og immobiliseret på mikropladeoverfladen). I betragtning af disse unikke egenskaber menes det, at denne ELISA er effektiv og speciel. Ikke desto mindre er denne test ikke perfekt, og der kan opstå problemer. Falske positive og falske negative resultater kan stadig forekomme, nogle gange på grund af serumkvaliteten eller infektionsfasen, og nogle gange på grund af fejl under protokolapplikationen i laboratoriet. For eksempel kan ELISA-serodiagnoseresultater påvirkes, selvom brøndene ikke vaskes tilstrækkeligt. Inkubationen (temperatur og tid) kan også påvirke testresultaterne. Valg af mikroplade og blokeringsmiddel blev også rapporteret at være et kritisk trin under ELISA-udvikling33,34. Af alle disse grunde er det vigtigt løbende at arbejde på at forbedre denne ELISA-test for at bestemme de optimale parametre og betingelser, såsom fortynding af de forskellige antistoffer (serumprøver, indfangningsantistof, påvisning af antistof), inkubations- og vasketrin og inkludering af passende negative og positive kontroller.

Kulturen af bakterier og produktionen af deres antigener til at udføre adsorptionsproceduren kan betragtes som et tungt skridt, især for Mollicutes-arter. Ikke desto mindre menes det, at dette er vigtigt, da dette trin i høj grad hjælper med at forbedre ELISA-specificiteten og undgå yderligere bekræftelsestest såsom immunoblotting eller PCR. Desuden er der i forbindelse med M. pneumoniae-infektion absolut behov for en effektiv og pålidelig diagnose for at etablere en passende og passende antibiotikabehandling, da brugen af beta-lactam-lægemidler til behandling af samfundserhvervet lungebetændelse er ineffektiv mod M. pneumoniae8. Efter i årevis at have været anvendt i rutinemæssig diagnostisk aktivitet i laboratoriet, menes det, at antigen-capture ELISA, beskrevet i dette papir, repræsenterer et gyldigt værktøj til specifik screening af M. pneumoniae-infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev finansieret af det tunesiske sundhedsministerium og det tunesiske ministerium for videregående uddannelse og videnskabelig forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf (2022).
  34. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  35. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  36. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  37. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Tags

Biologi nr. 192
Antigen-capture enzym-linked immunosorbent assay til specifik påvisning af <em>mycoplasma pneumoniae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter