Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Antigenfångande enzymbunden immunosorbentanalys för specifik detektion av mykoplasma pneumoniae

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

Vid Mycoplasma pneumoniae-infektion kan serologitester generera goda resultat, men med låg specificitet på grund av immunologisk korsreaktion. Den interna antigenfångande ELISA, som beskrivs i detta dokument, garanterar hög artspecificitet och har visat sig vara ett tillförlitligt screeningtest för korrekt diagnos av M. pneumoniae.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae är en cellväggsbrist prokaryot, främst känd för att kolonisera de mänskliga luftvägarna och vara endemisk, med epidemiska toppar vart 6: e år, hos äldre barn och unga vuxna. Diagnos av M. pneumoniae är utmanande på grund av patogenens snabba natur och möjligheten till asymptomatisk transport. Laboratoriediagnos av M. pneumoniae-infektion baserad på antikroppstitrering i serumproverna från patienter är fortfarande den mest praktiserade metoden. På grund av det potentiella problemet med immunologisk korsreaktivitet med användning av polyklonalt serum för M. pneumoniae har en antigenfångande enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) utvecklats för att förbättra specificiteten av serologisk diagnos. ELISA-plattor beläggs med M. pneumoniae polyklonala antikroppar, uppföds hos kaniner och görs specifika efter adsorption mot en panel av heterologa bakterier som delar antigener med M. pneumoniae-arter och / eller är kända för att kolonisera luftvägarna. De reagerade M. pneumoniae homologa antigenerna känns sedan specifikt igen av deras motsvarande antikroppar i serumproverna. Ytterligare optimering av de fysikalisk-kemiska parametrar som antigenfångande ELISA utsätts för ledde till en mycket specifik, känslig och reproducerbar ELISA.

Introduction

Mykoplasmer är bland de minsta och enklaste kända prokaryoterna. De skiljer sig huvudsakligen från andra bakterier genom bristen på en cellväggsstruktur. Således klassificerades Mycoplasmas i en separat klass med namnet Mollicutes1. Cellväggsbristen ger inneboende resistens mot dessa mikroorganismer mot vissa antimikrobiella medel och är till stor del ansvarig för deras polymorfism. Mykoplasmer har litet genom och minskad storlek, vilket begränsar deras metaboliska och biosyntetiska förmåga och förklarar deras parasitiska och saprofytiska natur1.

Mycoplasma pneumoniae är en av de Mycoplasmas som infekterar människan och tros vara den mest virulenta2. M. pneumoniae koloniserar övre luftvägarna, vilket leder till atypisk lunginflammation hos barn och unga vuxna. De kliniska tecknen som orsakas av M. pneumoniae-infektion är influensaliknande, med huvudvärk, feber och hosta3. Cythedensen hos M. pneumoniae till värdceller förmedlas av en fästorganell inklusive P1-större vidhäftning och flera tillbehörsproteiner 4,5. Fler kliniska manifestationer kan uppstå på grund av lokal inflammation och stimulering av värdens immunsystem till följd av den intima vidhäftningen av M. pneumoniae till luftvägsslemhinnan6. Även om lunginflammation är ett kännetecken för M. pneumoniae-infektion, har det visat sig att infektion med denna bakterie också kan vara ansvarig för ett brett spektrum av icke-lungmanifestationer på olika anatomiska platser såsom centrala nervsystemet, hjärta, hud och leder7.

Som för alla Mycoplasma-arter är diagnosen M. pneumoniae utmanande. De kliniska tecknen som framkallar mykoplasmos är mestadels otydliga och icke-karakteristiska8. Eftersom det är mycket svårt att diagnostisera M. pneumoniae-infektion genom att endast förlita sig på kliniska manifestationer och symtom, är laboratoriescreening av särskilt intresse9. Att upptäcka M. pneumoniae-kolonier genom kultur är guldstandardmetoden för en korrekt diagnos. De krävande tillväxtkraven och den långa tid som behövs för leverans av definitiva resultat (1-2 veckor) komplicerar dock kulturen och innebär därmed att den sällan används för rutindiagnos10. Nukleinsyraförstärkningstekniker validerades när det gäller hastighet och effektivitet, men på grund av deras relativt höga kostnader och otillgänglighet i vissa vårdinrättningar anses dessa molekylära tekniker inte vara första linjens diagnostiska tester. Det är sant att kommersiella PCR-tester används i stor utsträckning för att diagnostisera M. pneumoniae-infektioner, men de kan fortfarande inte ersätta serologi. Den frekventa förekomsten av både falska negativa och falskt positiva resultat har också begränsat användningen av PCR9. Rutinmässigt är serologi fortfarande den mest praktiserade i laboratorier för diagnos av M. pneumoniae-infektion. Flera serologiska tillvägagångssätt har rapporterats i årtionden, såsom kalla hemagglutininer, komplementbindningstest 11, indirekt hemagglutinationstest 12, immunofluorescens13 och tekniken för ELISA, som först tillämpades på mykoplasma-serologi i början av 1980-talet14,15,16. Ett av de största problemen som uppstår vid utförande av ELISA-serodiagnos av M. pneumoniae-infektion är korsreaktioner, vilket avsevärt sänker teknikens specificitet. Icke-specifik adsorption av humana serum med M. pneumoniae-antigener rapporterades tidigare; i själva verket kan många av de antikroppar som detekteras av ELISA i humana serum inte alltid vara bundna till mykoplasmala antigener 17, på grund av gemensamheten hos M. pneumoniae med vissa bakterier18,19 och vissa djur- och mänskliga vävnader20.

På grund av de höga bakgrundsavläsningarna som observerades i det konventionella ELISA-testet som praktiserades i laboratoriet var tolkningen av resultaten ofta komplicerad, och därmed var leveransen av en korrekt M. pneumoniae-diagnos en tuff uppgift. Medan vi stod inför detta problem valde vi att förbättra M. pneumoniae ELISA genom att ta bort ospecifika reaktioner av M. pneumoniae-antigener med antikroppar som ska testas. För detta ändamål arbetade vi med selektiv utarmning av de ospecifika M. pneumoniae-antigenerna med hjälp av adsorptionstekniken. Faktum är att huvudmålet med antigenfångande ELISA är att specifikt detektera M. pneumoniae immunoglobulin (Ig) G i humana serumprover. Konceptet för denna ELISA består huvudsakligen av selektiv infångning av M. pneumoniae-specifika antigener innan de humana serumproverna tillsätts. Denna selektivitet försäkras genom att inkubera M. pneumoniae råantigen med ett M. pneumoniae polyklonalt antiserum, producerat hos kaniner i laboratoriet och göra det artspecifikt genom adsorption mot en panel av heterologa bakterier, som tillhör eller inte tillhör Mollicutes-klassen, som delar antigener med M. pneumoniae arter och/eller kända för att kolonisera luftvägarna. Adsorptionsförfarandet upprepades tre gånger, och dess effektivitet för att eliminera korsreaktivitet testades genom immunoblotting. Den utvecklade ELISA-analysen är en kombination av sandwich och indirekt ELISA. Kortfattat är brunnarna på ELISA-plattan först belagda med ett polyklonalt antiserum som är specifikt för M. pneumoniae. Därefter tillsätts M. pneumoniae-antigen och fångas mellan antiserumet och antikropparna som finns i serumprovet som ska testas. Det bildade immunologiska komplexet detekteras av en sekundär enzymkonjugerad antikropp (peroxidaskonjugerad IgG). Reaktionerna visualiseras genom tillsats av kromogent substrat, och absorbansen mäts spektrofotometriskt. Denna interna ELISA presenteras schematiskt i figur 1. Den hemlagade ELISA visade sig vara effektiv för att specifikt upptäcka M. pneumoniae-infektion och är för närvarande ett av de mest praktiserade testerna i rutinmässig diagnostisk aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denna studie har genomförts i enlighet med etiska aspekter som fastställts av den etiska kommittén vid Pasteur-institutet i Tunis.

1. Pre-ELISA-steg: Förutsättningar och förbehandling

  1. Bakteriestammar och tillväxtmedier
    OBS: Mollicutes-arter och de muromgärdade bakterier som används i denna studie och deras tillväxtmedier listas i tabell 1.
    1. Tillväxt av Mollicutes arter
      1. Inokulera 200 μl från glycerolbeståndet av varje art i 1 800 μl av mediet.
      2. Odla Mollicutes arter statiskt vid 37 ° C med 5% CO 2 i2-4 dagar tills en pH-förändring observeras (pH-indikatorn är fenolröd).
      3. Skala upp kulturerna till 10 ml genom att lägga till en 1/10:e utspädning av kulturen till media och låt dem växa igen under samma förhållanden.
        OBS: Enligt ämnesomsättningen försurar vissa humana Mollicutes-arter (M. pneumoniae, M. genitalium och M. fermentans) mediet på grund av glukosfermentering, och några andra (M. hominis och Ureaplasma) alkaliserar mediet genom argininhydrolys respektive ureahydrolys. När det gäller aviära mykoplasmer visar försurningen av Freys medium närvaron av M. gallisepticum, medan dess alkalisering bevisar tillväxten av M. imitans.
      4. Sprid 50 μL av kulturerna på agarplattor för att bekräfta bakteriens tillväxt. Håll agarplattorna vid 37 °C med 5%CO2 och observera dem regelbundet under mikroskopet för utseendet av typiska stekta äggkolonier (Mycoplasmas) och mörka urchinliknande kolonier (Ureaplasmas).
    2. Tillväxt av icke-Mollicutes-arter
      1. Odla de icke-mollikulerade bakterierna i 3 ml av mediet vid 37 °C över natten (skaka vid 200 rpm).
      2. Jämför kulturernas grumlighet med kontrollmediet för att bekräfta tillväxten.
      3. Skala upp kulturerna till 10 ml genom att lägga till en 1/100:e utspädning av kulturen till media och låt dem växa igen under samma förhållanden.
  2. Antigenberedning
    1. Antigenberedning av Mollicutes-arter
      1. Skörda hela proteinerna (som förekommer i bekräftade kulturer av M. pneumoniae och de andra Mollicutes-arterna) genom centrifugering vid 40 000 x g vid 4 °C i 30 minuter.
      2. Kassera supernatanten och tvätta pelletsen tre gånger med 1 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS, pH 7,4) med en serie av tre centrifugeringar med samma betingelser.
      3. Återsuspendera varje antigen i 500 μl PBS.
    2. Antigenberedning av icke-Mollicutes-arter
      1. Centrifugera de odlade kulturerna över natten av de icke-Mollicutes-bakterierna vid 1 500 x g i 15 minuter.
      2. Återsuspendera varje bakteriepellet i 500 μL PBS.
        OBS: Proteinkoncentrationen bestäms med hjälp av den klassiska Bradford-kvantifieringsmetoden med bovint serumalbumin som standard21. Proteinkoncentrationen hos Mollicutes-arter varierar vanligtvis mellan 0,7-4,8 mg / ml. För de andra bakteriearterna kan proteinkoncentrationen nå 20 mg/ml. Alla antigener lagras vid -20 °C tills de därefter används.
  3. Korsreaktivitetsscreening genom immunoblotting
    1. Denaturera bakterieproteinerna genom att blanda 8 μL av varje antigen med en lika stor volym provbuffert (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glycerol [v/v], 10% SDS [w/v] och 0,2% bromfenolblått), inkubera blandningen vid 100 °C i 5 minuter.
      OBS: Denaturering utförs för att täcka proteinerna med negativ laddning och för att bryta deras sekundära strukturer, vilket gör att de kan springa över polyakrylamidgelén och separeras enligt deras molekylvikter.
    2. Utsätt de denaturerade proteinerna (100 μg protein/brunn) för natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) med Laemmlis metod22 med 12 % separeringsgel och 5% staplingsgel. Därefter överför proteinerna elektroforetiskt till nitrocellulosamembranet med Towbin et al.s metod23.
    3. Sänk ner nitrocellulosamembranet i 5% skummjölk i PBS i 30 minuter för att blockera de lediga ytorna. Inkubera proteinfläckarna vid rumstemperatur i 2 timmar med kaninpolyklonal M. pneumoniae antiserum (producerad vid Pasteur Institute of Tunis) utspädd till 1/200 i PBS-Tween 20, sedan med pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad anti-kanin IgG utspädd till 1/2 000 i PBS-Tween 20 i 1 h vid rumstemperatur.
    4. Tvätta bort de obundna antikropparna med PBS och få resultaten genom att exponera nitrocellulosaarket för substratlösningen (4-klor-1-naftol,H2O2). Stoppa reaktionen genom att tillsätta vatten efter 5-15 min.
  4. Adsorptionsförfarande
    OBS: För att eliminera korsreaktioner mellan polyklonala M. pneumoniae-antiserum och heterologa bakterieantigener används adsorptionsproceduren som tidigare beskrivits av Ben Abdelmoumen och Roy24 .
    1. Förbered en antigenpool av de 12 heterologa bakterierna (misstänks dela antigener med M. pneumoniae), blanda den i ett mikrocentrifugrör och justera proteinkoncentrationen motsvarande hälften av antiserumet som ska adsorberas i experimentet.
      OBS: Volymen och koncentrationen varierar mellan de olika analyserna. Detta steg beror huvudsakligen på koncentrationen av antikroppen som ska adsorberas. Till exempel, om antikroppskoncentrationen = 3,56 mg / ml, bör koncentrationen av antigenpoolen (bestående av de 12 heterologa bakterierna) vara 1,78 mg / ml (därför cirka 0,148 mg av varje antigen).
    2. Centrifugera antigenblandningen vid 14 000 x g i 10 minuter vid 4 °C, samla upp den poolade pelleten och inkubera den med den renade polyklonala anti-M. pneumoniae IgG i 2 timmar vid 37 °C med långsam omrörning.
    3. Efter inkubation centrifugerar du suspensionen vid 14 000 x g i 10 minuter vid 4 °C och återvinner supernatanten (vilket motsvarar det specifika polyklonala M. pneumoniae-antiserumet ).
      OBS: För att säkerställa specificitet av det polyklonala M. pneumoniae-antiserumet, upprepa adsorptionsproceduren tre gånger. Innan det kan användas i ELISA-analysen bör det adsorberade polyklonala M. pneumoniae-antiserumet testas genom immunoblotting för frånvaro av korsreaktioner mot den medföljande uppsättningen bakterier.

2. ELISA-steg: Själva analysen

  1. Mikroplattbeläggning med infångningsantikroppen
    1. Späd infångningsantikroppen (M. pneumoniae föradsorberat polyklonalt antiserum) till en koncentration av 10 μg/ml i 0,1 M karbonat-bikarbonatbuffert (pH 9,6).
    2. Täck ELISA-plattan med 96 brunnar genom att tillsätta 100 μl av den utspädda infångningsantikroppen till varje brunn.
    3. Efter inkubation över natten vid 4 °C, avlägsna beläggningslösningen och tvätta plattan fem gånger med tvättbufferten (sammansättning [per L]: 146,29 g NaCl, 39,4 g Tris-HCl, 0,2 g Thimerosal och 0,5 ml Tween 20; pH 7,3).
  2. Blockering
    1. Blockera de återstående bindningsytorna på de belagda brunnarna genom att tillsätta 100 μL av blockeringslösningen (0,5% kasein i PBS) till varje brunn.
    2. Inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
    3. Ta bort blockeringslösningen med en pipett och tvätta plattan fem gånger med tvättbufferten.
  3. Applicering av antigenet
    1. Tillsätt lika mycket M. pneumoniae hela proteiner till alla belagda brunnar (10 ng/brunn).
    2. Låt reaktionen äga rum i 2 timmar vid rumstemperatur.
    3. Ta bort överskottet av antigenlösningen och tvätta plattan fem gånger med tvättbufferten.
  4. Användning av testprover och kontroller
    1. Späd testproverna (humana serum) och kontrollerna (positiva och negativa referensserum) till 1/200, 1/400 och 1/800 i PBS-Tween 20.
    2. Tillsätt 100 μl av de utspädda proverna och kontrollerna i lämpliga brunnar. Utför varje reaktion i två exemplar. Markera brunnarna som varken innehåller antigen eller serum som tomma.
    3. Efter inkubering av plattan i 90 minuter vid rumstemperatur, ta bort serumlösningarna och tvätta plattan fem gånger med tvättbufferten.
  5. Applicering av den enzymkonjugerade detektionsantikroppen
    1. Späd de enzymkonjugerade detektionsantikropparna, HRP-konjugerade antikaniner och anti-human IgG till 1/10 000 i PBS-Tween 20.
    2. Pipettera 100 μl av den lämpligt utspädda detektionsantikroppen mot varje brunn.
    3. Efter inkubation av plattan i 1 timme vid rumstemperatur i mörkret, ta bort de obundna detektionsantikropparna och tvätta plattan fem gånger med tvättbufferten.
  6. Detektion och dataanalys
    1. Tillsätt 100 μl av kromogenlösningen 3,3', 5,5' tetrametylbensidin (TMB) för att visualisera antigen-antikroppsbindningen.
    2. Låt plattan utvecklas i 30 minuter vid rumstemperatur och tillsätt sedan 100 μL av stopplösningen (7,5%H2S04) för att stoppa den enzymatiska reaktionen.
    3. Läs absorbansen vid 450 nm våglängd med hjälp av mikroplattläsaren och sortera ut resultaten baserat på beräkningen av positivitetsindexet (IP).
      IP = Absorbans hos det testade serumet / Absorbansen hos cut-off
      IP < 0.7: Negativt resultat
      IP = 0,7: Testet ska upprepas inom 2 veckor
      IP > 0.7: Positivt resultat
      IP-formeln är tänkt i laboratoriet och 0,7-värdet ställs in efter optimering. För dubbla reaktioner beräknas medelvärdet av absorbansen. Optimal serumutspädning och antigenkoncentration fastställs med ELISA-rutnätstitreringsmetoden (data visas inte). Brytpunkt = OD (optisk densitet) för ett positivt referensserum (utspätt vid samma utspädning som provet). Denna OD bör vara minst tre gånger högre än OD-värdet för den negativa kontrollen.

3. Steg efter ELISA: Resultatbedömning och testvalidering

  1. Förmågan hos den interna ELISA att specifikt diagnostisera M. pneumoniae-infektion hos de testade patienterna utvärderas genom kompletterande immunobloter med antigener av M. pneumoniae och de heterologa bakterierna för att bekräfta positiviteten hos de testade humana serumen i M. pneumoniae-antikroppar och deras negativitet hos de andra misstänkta bakterierna (data visas inte).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunoblottningsaktiviteten hos det icke-adsorberade polyklonala Mycoplasma pneumoniae-antiserumet mot heterologa bakterier
Korsreaktivitet existerar verkligen som visas i immunoblottingresultaten (figur 2) och jämfört med den positiva kontrollen (Lane 1) delas några av M. pneumoniae-antigenerna med de screenade bakterierna. Intensiteten hos dessa korsreaktioner var varierande. Till exempel visade M. gallisepticum och M. imitans antigener den starkaste reaktiviteten med M. pneumoniae antiserum (Lanes 9 och 10), förutom att vara aviära Mycoplasmas. Opposerande visade inget av de två humana kliniska isolaten av Ureaplasma urealyticum någon reaktivitet (Lanes 7 och 8). Antigener av de återstående mänskliga genitala Mycoplasma-arterna M. hominis, M. fermentans och M. genitalium gav emellertid betydande korsreaktioner med M. pneumoniae antiserum (Lanes 11, 12 respektive 13). Escherichia coli (Lane 2), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) och Klebsiella pneumoniae (Lane 6) reagerade också med polyklonala M. pneumoniae-antikroppar , och deras antigena profilmönster var mycket lika. Denna profil skilde sig något från de två cocci-bakteriearterna Streptococcus pneumoniae och Staphylococcusaureus; reaktiviteten var mindre med S. pneumoniae (Lane 3) och ännu mindre med S.aureus (Lane 5).

Specificitet av Mycoplasma pneumoniae-antikroppar garanterade genom adsorptionsförfarande
Efter adsorptionen av M. pneumoniae polyklonalt antiserum mot de heterologa bakterieantigenerna testades specificiteten genom immunoblotting (figur 3). Bortsett från vissa proteiner av M. pneumoniae-antigen som avslöjades i Lane 1 (positiv kontroll), var de andra antigenerna nästan helt icke-detekterade (Lanes 2-13). De avslöjade proteinerna i Lane 1 är faktiskt de specifika proteiner som detekteras av de specifika M. pneumoniae-antikropparna som återstår efter adsorption . Baserat på detta resultat visades effektiviteten hos adsorptionsförfarandet, eftersom de uppkomna ospecifika reaktionerna av M. pneumoniae polyklonal antiserum med de heterologa antigenerna, som beskrivs ovan, eliminerades. M. pneumoniae antiserum som gjordes specifikt användes sedan i alla efterföljande serologiska och immunoblottingtester.

Capture-antigen ELISA: Giltig analys för rutinmässig serodiagnostisk laboratorieaktivitet
Eftersom alla serum testades i dubbla brunnar för de olika utspädningarna beräknades OD-medelvärden och ett stapeldiagram som korrelerade dessa absorbansvärden till deras motsvarande serumutspädningar plottades (figur 4). Baserat på IP-beräkning visade sig den uppsättning mänskliga serum som testades och presenterades i detta dokument vara positivt för M. pneumoniae IgG. Flera andra serumuppsättningar testades också med denna hemlagade ELISA, och vid varje tidpunkt visade sig analysen vara effektiv för att specifikt detektera M. pneumoniae IgG och därmed skilja de M. pneumoniae-infekterade patienterna från de oinfekterade (data visas inte).

ELISA-resultaten bekräftades alltid av flera immunoblotanalyser som samtidigt visade positiviteten i M. pneumoniae och negativiteten hos alla andra bakterier i något testat serum som befanns vara positivt av det interna fångstantigenet M. pneumoniae ELISA (data visas inte).

Figure 1
Figur 1: Schematisk presentation av antigenfångande ELISA som utvecklats i laboratoriet för specifik detektion av Mycoplasma pneumoniae IgG. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Immunoblotanalys av korsreaktioner mellan Mycoplasma pneumoniae och en uppsättning heterologa bakterier. Reaktiviteten hos M. pneumoniae icke-adsorberad polyklonal antiserum testades mot antigener av Escherichia coli (Lane 2), Streptococcus pneumoniae (Lane 3), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4), Staphylococcus aureus (Lane 5), Klebsiella pneumoniae (Lane 6), två Ureaplasma urealyticum isolat (Lanes 7 och 8), M. imitans (Lane 9), M. gallisepticum (Lane 10), M. hominis (Lane 11), M. fermentans (Lane 12) och M. genitalium (Lane 13). Bana 1: M. pneumoniae (positiv kontroll). Molekylvikter av några större M. pneumoniae-proteiner gavs till vänster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Immunoblotbekräftelse av adsorptionsförfarandets effektivitet för att eliminera korsreaktioner. Reaktivitet hos alla valda heterologa bakterier; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, två Ureaplasma urealyticum isolat, M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans och M. genitalium (Lanes 2-13, respektive) testades mot det adsorberade M. pneumoniae polyklonala antiserumet. M. pneumoniae-antigen laddades i Lane 1 som positiv kontroll (endast specifika proteiner avslöjades). Lane MW: förfärgad proteinstege. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Resultat av antigenfångande ELISA. ELISA utfördes med användning av det adsorberade Mycoplasma pneumoniae polyklonala antiserumet som beläggningsmedel. Stapeldiagram 1 och 2 visar negativa respektive positiva kontroller. Stapeldiagram 3-13 visar sera för en grupp testade patienter. Varje serum testades vid tre olika utspädningar: 1/200 (lila staplar), 1/400 (orange staplar) och 1/800 (blå staplar). OD-värden tjänade till att beräkna positivitetsindexet. Varje reaktion utfördes i två exemplar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mikroorganism Anstränga* Medium Hänvisning
Mykoplasma och ureaplasma arter Mycoplasma pneumoniae ATCC 160 20030 SP4 [35]
Mycoplasma genitalium CIP 103767T SP4
Mykoplasma fermentaner ATCC 160 20026 SP4
Mykoplasma hominis CIP 103715T SP4 kompletterat med arginin
Ureaplasma urealyticum 2 kliniska isolat** SP4 kompletterat med urea
Mykoplasma gallisepticum CIP S6 15302 Frey [36]
Mykoplasma imitans ATCC 160 20037 Frey
Andra bakterier Escherichia coli ATCC 25922 LB buljong [37]
Klebsiella pneumoniae Kliniskt isolat*** LB buljong
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 LB buljong
Staphylococcus aureus ATCC 25923 LB buljong
Streptococcus pneumoniae Kliniskt isolat*** Blod buljong
* ATCC: American Type Culture Collection, CIP: Samling Institut Pasteur
** Isolat samlades in från kliniska prover som frivilligt skickades till Laboratory of Mycoplasmas (Pasteur Institute of Tunis) för rutindiagnostik
Isolat samlades in från kliniska prover som frivilligt skickades till laboratoriet för bakteriologi (Pasteur Institute of Tunis) för rutindiagnostik

Tabell 1: Lista över bakteriestammar som används i denna studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta dokument presenteras en allmän beskrivning av en intern ELISA som huvudsakligen utvecklats för att säkerställa särskild screening av M. pneumoniae infektion. Detaljerna om protokollet för själva ELISA-analysen samt några för- och efterbehandlingssteg tillhandahålls. Specificiteten hos denna analys säkerställs genom adsorptionstekniken. Denna procedur beskrevs tidigare i ELISA-tester utvecklade för diagnos av människa och fågel Mycoplasmas17,24. Det användes också i ELISA-analyser för diagnos av andra bakterieinfektioner som borrelia25. I dessa tre artiklar visade sig adsorption hjälpa till att öka ELISA-specificiteten utan att markberifiera eller minska känsligheten17,24,25. När det gäller denna ELISA-analys kan lämpliga bakteriearter som valts ut för adsorption delas in i två grupper: den första gruppen innehåller vissa patogena humana och aviära Mollicutes-arter (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumoch M. imitans), medan den andra innehåller de vanligaste bakterierna som är kända för att infektera människor (E. coli, P. aeruginosaoch S. aureus) och de som är notoriskt kända för sin tropism i luftvägarna (K. pneumoniae och S. pneumoniae). Det breda urvalet av heterologa bakterier baserades på det faktum att dogmen om arter och organspecificitet inte respekteras längre. Många rapporter om upptäckt av mikroorganismer i okända livsmiljöer har tidigare publicerats. Till exempel M. pneumoniae har isolerats från många extra-lungplatser och visat sig vara associerad med ett varierat utbud av extra-lungkomplikationer med milda till svåra symtom, även om det antogs vara specifikt för luftvägarna6,7. Det motsatta fallet (isolerande könsorgan Mycoplasma arter från luftvägarna) signalerades för M. hominis och M. fermentans26,27. Införandet av fågel Mycoplasma i serodiagnostestet av infektion hos människa baserades på tidigare studier som rapporterade möjligheten till infektion hos människor (särskilt personer med nedsatt immunförsvar och veterinärer) med Mycoplasma härstammar från husdjur28,29,30. Det är sant att hittills har inget papper hittats som framkallar isoleringen av M. gallisepticum och M. imitans (de två arter som ingår i adsorptionsförfarandet i detta dokument) från människor. Trots detta är ingenting omöjligt, särskilt eftersom dessa arter är bland de mest regelbundet hanterade arterna av veterinärer och är fylogenetiskt för nära M. pneumoniae. Faktum är att dessa två fågel Mycoplasma har visat starkast reaktivitet med M. pneumoniae antiserum (som illustreras i Figur 2). Kortfattat, medan du utformar adsorptionsproceduren, ett relativt stort spektrum av misstänkta bakterier som kan dela antigener med M. pneumoniae ingick. De val som gjordes baserades på fylogenetisk släktskap och tropism till luftvägarna. På grund av mänsklig floradiversitet och antigenvariation är det dock omöjligt att förutsäga och inkludera alla möjliga heterologa bakteriearter och stammar som kan korsreagera med M. pneumoniae Antikroppar. Således är möjligheten till korsreaktion mellan M. pneumoniae antiserum, även efter adsorption, och andra bakterier förblir troliga. Dessutom, eftersom M. pneumoniae är allmänt känt för att infektera barn och unga vuxna, kan adsorptionsproceduren förbättras ytterligare i framtiden genom tillsats av andra pediatriska andningspatogener såsom Haemophilus influenzae31 och Streptococcus pyogenes32 in i adsorptionsbakteriens kortlista.

Syftet med denna ELISA är att detektera närvaron av målantikroppen (specifik M. pneumoniae-IgG) i det humana serumet. Så, för att kunna både använda serumet som ett prov (eftersom det är det enklaste att samla in och det mindre smärtsamma för patienter) och för att säkerställa specificitet, är den interna ELISA baserad på principen om två ELISA-typer: indirekt och smörgås ELISA. Serumprovet (primär antikropp) är bundet mellan detektionsantikroppen (märkt andra antikropp) och infångningsantigenet, som specifikt var kopplat till infångningsantikroppen (i förväg gjord specifik genom adsorption och immobiliserad på mikroplattytan). Med tanke på dessa unika egenskaper antas det att denna ELISA är effektiv och speciell. Ändå är detta test inte perfekt, och problem kan uppstå. Falska positiva och falska negativa resultat kan fortfarande uppstå, ibland på grund av serumkvaliteten eller infektionsfasen, och ibland på grund av fel under protokollapplikationen i laboratoriet. Till exempel kan ELISA-serodiagnosresultat påverkas även om brunnarna inte tvättas tillräckligt. Inkubationen (temperatur och tid) kan också påverka testresultaten. Val av mikroplatta och blockerande medel rapporterades också vara ett kritiskt steg under ELISA-utvecklingen33,34. Av alla dessa skäl är det viktigt att kontinuerligt arbeta för att förbättra detta ELISA-test för att bestämma de optimala parametrarna och förhållandena, såsom utspädning av de olika antikropparna (serumprover, infångningsantikropp, detektion av antikropp), inkubations- och tvättsteg och införandet av lämpliga negativa och positiva kontroller.

Bakteriekulturen och produktionen av deras antigener för att utföra adsorptionsförfarandet kan betraktas som ett tungt steg, särskilt för Mollicutes-arter. Ändå antas det att detta är viktigt eftersom detta steg i hög grad hjälper till att förbättra ELISA-specificiteten och för att undvika ytterligare bekräftelsetester som immunoblotting eller PCR. Dessutom, i samband med M. pneumoniae-infektion, krävs definitivt en effektiv och tillförlitlig diagnos för att upprätta en adekvat och lämplig antibiotikabehandling, eftersom användningen av beta-laktamläkemedel vid behandling av samhällsförvärvad lunginflammation är ineffektiv mot M. pneumoniae8. Efter år av att ha använts i rutinmässig diagnostisk aktivitet i laboratoriet antas det att antigenfångningen ELISA, som beskrivs i detta dokument, representerar ett giltigt verktyg för specifik screening av M. pneumoniae-infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att det inte finns några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Denna studie finansierades av det tunisiska hälsoministeriet och det tunisiska ministeriet för högre utbildning och vetenskaplig forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Razin, S., Yogev, D., Naot, Y. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (4), 1094-1156 (1998).
  2. Chanock, R. M. Mycoplasma infections of man. The New England Journal of Medicine. 273 (22), 1199-1206 (1965).
  3. Braun, G. S., Wagner, K. S., Huttner, B. D., Schmid, H. Mycoplasma pneumoniae: Usual suspect and unsecured diagnosis in the acute setting. The Journal of Emergency Medicine. 30 (4), 371-375 (2006).
  4. Baseman, J. B., Cole, R. M., Krause, D. C., Leith, D. K. Molecular basis for cytadhesion of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 151, 1514-1522 (1982).
  5. Waldo, R. H., Krause, D. C. Synthesis, stability, and function of cytadhesin P1 and accessory protein B/C complex of Mycoplasma pneumoniae. Journal of Bacteriology. 188 (2), 569-575 (2006).
  6. Waites, K. B., Balish, M. F., Atkinson, T. P. New insights into the pathogenesis and detection of Mycoplasma pneumoniae infections. Future Microbiology. 3 (6), 635-648 (2008).
  7. Narita, M. Pathogenesis of extrapulmonary manifestations of Mycoplasma pneumoniae infection with special reference to pneumonia. Journal of Infection and Chemotherapy. 16 (3), 162-169 (2010).
  8. Kashyap, S., Sarkar, M. Mycoplasma pneumonia: Clinical features and management. Lung India. 27 (2), 75-85 (2010).
  9. Zhang, L., Zong, Z. Y., Liu, Y. B., Ye, H., Lv, X. J. PCR versus serology for diagnosing Mycoplasma pneumoniae infection: A systematic review & meta-analysis. Indian Journal of Medical Research. 134 (3), 270-280 (2011).
  10. Saraya, T. Mycoplasma pneumoniae infection: Basics. Journal of General and Family Medicine. 18 (3), 118-125 (2017).
  11. Jacobs, E. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections: a critical review of current procedures. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 79-82 (1993).
  12. Kok, T. W., Marmion, B. P., Varkanis, G., Worswick, D. A., Martin, J. Laboratory diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection: 3. Detection of IgM antibodies to M. pneumoniae by a modified indirect haemagglutination test. Epidemiology and Infection. 103 (3), 613-623 (1989).
  13. Smith, T. F. Mycoplasma pneumoniae infections: diagnosis based on immunofluorescence titer of IgG and IgM antibodies. Mayo Clinic Proceedings. 61 (10), 830-831 (1986).
  14. Busolo, F., Tonin, E., Conventi, L. Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Mycoplasma pneumoniae antibodies. Journal of Clinical Microbiology. 12 (1), 69-73 (1980).
  15. Van Griethuysen, A. J., et al. Use of the enzyme-linked immunosorbent assay for the early diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection. European Journal of Clinical Microbiology. 3 (2), 116-121 (1984).
  16. Raisanen, S. M., Suni, J. I., Leinikki, P. Serological diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection by enzyme immunoassay. Journal of Clinical Pathology. 33 (9), 836-840 (1980).
  17. Sasaki, T., Bonissol, C., Stoilikovic, B., Ito, K. Demonstration of cross-reactive antibodies to mycoplasmas in human sera by ELISA and immunoblotting. Microbiology and Immunology. 31 (7), 639-648 (1987).
  18. Brunner, H., et al. Unexpectedly high frequency of antibody to Mycoplasma pneumoniae in human sera as measured by sensitive techniques. Journal of Infectious Diseases. 135 (4), 524-530 (1977).
  19. Plackett, P., Marmion, B. P., Shaw, E. J., Lemcke, R. M. Immunochemical analysis of Mycoplasma pneumoniae: 3. Separation and chemical identification of serological active lipids. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 47 (2), 171-195 (1969).
  20. Ponka, A. The occurrence and clinical picture of serologically verified Mycoplasma pneumoniae infections with emphasis on central nervous system, cardiac and joint manifestations. Annals of Clinical Research. 11, 1-60 (1979).
  21. Bradford, M. M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  23. Towbin, H., Staehlin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications. Proceedings of National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  24. Ben Abdelmoumen, B., Roy, S. An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of avian mycoplasmas in culture. Avian Diseases. 39, 85-93 (1995).
  25. Fawcett, P. T., O'Brien, A. E., Doughty, R. A. An adsorption procedure to increase the specificity of enzyme-linked immunosorbent assays for lyme disease without decreasing sensitivity. Arthritis and Rheumatism. 32 (8), 1041-1044 (1989).
  26. Nicolson, G. L., Nasralla, M. Y., Nicolson, N. L. The pathogenesis and treatment of mycoplasmal infections. Antimicrobics and Infectious Disease Newsletter. 17 (11), 81-88 (1999).
  27. Meyer, R. D., Clough, W. Extragenital Mycoplasma hominis infections in adults: emphasis on immunosuppression. Clinical Infectious Diseases. 17, Supplement_1 243-249 (1993).
  28. Pitcher, D. G., Nicholas, R. A. J. Mycoplasma host specificity: Fact or fiction. Veterinary Journal. 170 (3), 300-306 (2005).
  29. Lierz, M., Jansen, A., Hafez, H. M. Mycoplasma lipofaciens transmission to veterinarian. Emerging Infectious Diseases. 14 (7), 1161-1163 (2008).
  30. Baker, A. S., Ruoff, K. L., Madoff, S. Isolation of Mycoplasma species from a patient with seal finger. Clinical Infectious Diseases. 27 (5), 1168-1170 (1998).
  31. Slack, M., P, E. A review of the role of Haemophilus influenzae in community-acquired pneumonia. Pneumonia. 6 (1), 26-43 (2015).
  32. Janira Avire, N., Whiley, H., Ross, K. A review of Streptococcus pyogenes: public health risk factors, prevention and control. Pathogens. 10 (2), 248 (2021).
  33. Corning and Falcon Microplates Selection Guide: For Assays and Drug Discovery. Corning Inc. , Available from: https: //www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/CLS-C-DL-MP-014REV9.pdf (2022).
  34. Steinitz, M. Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry. 282 (2), 232-238 (2000).
  35. Tully, J. G., Whitcomb, R. F., Clark, H. F., Williamson, D. L. Pathogenic mycoplasmas: cultivation and vertebrate pathogenicity of a new spiroplasma. Science. 195 (4281), 892-894 (1977).
  36. Frey, M. L., Hanson, R. P., Andrson, D. P. A medium for the isolation of avian mycoplasmas. American Journal of Veterinary Research. 29 (11), 2163-2171 (1968).
  37. Bertani, G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293-300 (1951).

Tags

Biologi utgåva 192
Antigenfångande enzymbunden immunosorbentanalys för specifik detektion av <em>mykoplasma pneumoniae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter