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Biology

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno para la detección específica de Mycoplasma pneumoniae

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

En la infección por Mycoplasma pneumoniae, las pruebas serológicas pueden generar buenos resultados, pero con baja especificidad debido a la reacción inmunológica cruzada. El ELISA interno de captura de antígeno, descrito en este documento, garantiza una alta especificidad de la especie y ha demostrado ser una prueba de detección confiable para el diagnóstico preciso de M. pneumoniae.

Abstract

Mycoplasma pneumoniae es un procariota deficiente en la pared celular, conocido principalmente por colonizar el tracto respiratorio humano y ser endémico, con picos epidémicos cada 6 años, en niños mayores y adultos jóvenes. El diagnóstico de M. pneumoniae es difícil debido a la naturaleza fastidiosa del patógeno y la posibilidad de transporte asintomático. El diagnóstico de laboratorio de la infección por M. pneumoniae basado en la titulación de anticuerpos en las muestras de suero de los pacientes sigue siendo el método más practicado. Debido al problema potencial de la reactividad cruzada inmunológica con el uso de suero policlonal para M. pneumoniae, se ha desarrollado un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno (ELISA) para mejorar la especificidad del diagnóstico serológico. Las placas ELISA están recubiertas con anticuerpos policlonales de M. pneumoniae, criados en conejos y específicos después de la adsorción contra un panel de bacterias heterólogas que comparten antígenos con especies de M. pneumoniae y / o se sabe que colonizan el tracto respiratorio . Los antígenos homólogos de M. pneumoniae reaccionados se reconocen específicamente por sus anticuerpos correspondientes en las muestras de suero. Una mayor optimización de los parámetros fisicoquímicos a los que se somete el ELISA de captura de antígeno condujo a un ELISA altamente específico, sensible y reproducible.

Introduction

Los micoplasmas se encuentran entre los procariotas más pequeños y simples conocidos. Se distinguen principalmente de otras bacterias por la falta de una estructura de pared celular. Por lo tanto, los micoplasmas se clasificaron en una clase separada llamada Mollicutes1. La deficiencia de la pared celular confiere resistencia intrínseca a estos microorganismos contra algunos agentes antimicrobianos y es en gran parte responsable de su polimorfismo. Los micoplasmas tienen un genoma pequeño y un tamaño reducido, lo que limita sus capacidades metabólicas y biosintéticas y explica su naturaleza parasitaria y saprofita1.

Mycoplasma pneumoniae es uno de los Mycoplasmas que infectan al hombre y se cree que es el más virulento2. M. pneumoniae coloniza el tracto respiratorio superior, lo que lleva a neumonía atípica en niños y adultos jóvenes. Los signos clínicos engendrados por la infección por M. pneumoniae son similares a la gripe, con dolor de cabeza, fiebre y tos3. La citadherencia de M. pneumoniae a las células huésped está mediada por un orgánulo de unión que incluye la adhesión mayor P1 y varias proteínas accesorias 4,5. Pueden ocurrir más manifestaciones clínicas debido a la inflamación local y la estimulación del sistema inmune del huésped resultante de la adhesión íntima de M. pneumoniae a la mucosa de la vía aérea6. A pesar de que la neumonía es un sello distintivo de la infección por M. pneumoniae, se ha revelado que la infección con esta bacteria también puede ser responsable de un amplio espectro de manifestaciones no pulmonares en diferentes sitios anatómicos como el sistema nervioso central, corazón, piel y articulaciones7.

Como para todas las especies de Mycoplasma, el diagnóstico de M. pneumoniae es un desafío. Los signos clínicos que evocan micoplasmosis son en su mayoría inaparentes y no característicos8. Dado que es muy difícil diagnosticar la infección por M. pneumoniae basándose únicamente en las manifestaciones clínicas y los síntomas, el cribado de laboratorio es de particular interés9. La detección de colonias de M. pneumoniae por cultivo es el método estándar de oro para un diagnóstico adecuado. Sin embargo, los exigentes requerimientos de crecimiento y el largo tiempo necesario para la entrega de resultados definitivos (1-2 semanas) complican el cultivo, y por lo tanto significa que rara vez se utiliza para el diagnóstico de rutina10. Las tecnologías de amplificación de ácidos nucleicos se validaron en términos de velocidad y eficiencia, aunque debido a su costo relativamente alto y la falta de disponibilidad en algunos centros de salud, estas técnicas moleculares no se consideran pruebas diagnósticas de primera línea. Es cierto que las pruebas PCR comerciales se utilizan ampliamente para diagnosticar infecciones por M. pneumoniae, pero aún no pueden reemplazar la serología. Además, la frecuente aparición de resultados falsos negativos y falsos positivos ha limitado el uso de la PCR9. Rutinariamente, la serología sigue siendo la más practicada en los laboratorios para el diagnóstico de la infección por M. pneumoniae. Se han reportado varios enfoques serológicos durante décadas, como las hemaglutininas frías, la prueba de fijación del complemento 11, la prueba de hemaglutinación indirecta12, la inmunofluorescencia 13 y la tecnología de ELISA, que se aplicó por primera vez a la serología de micoplasmas a principios de la década de 198014,15,16. Uno de los principales problemas encontrados al realizar el serodiagnóstico ELISA de la infección por M. pneumoniae son las reacciones cruzadas, lo que reduce considerablemente la especificidad de la técnica. Se informó previamente de adsorción inespecífica de sueros humanos con antígenos de M. pneumoniae; de hecho, muchos de los anticuerpos detectados por ELISA en sueros humanos no siempre pueden estar unidos a antígenos micoplasmáticos 17, debido a la similitud de M. pneumoniae con algunas bacterias18,19 y algunos tejidos animales y humanos20.

Debido a las altas lecturas de fondo observadas en la prueba ELISA convencional que se practicó en el laboratorio, la interpretación de los resultados a menudo era complicada y, por lo tanto, la entrega de un diagnóstico adecuado de M. pneumoniae era una tarea difícil. Mientras enfrentábamos este problema, optamos por mejorar el ELISA de M. pneumoniae eliminando reacciones inespecíficas de antígenos de M. pneumoniae con anticuerpos para ser probados. Para ello, se trabajó en el agotamiento selectivo de los antígenos inespecíficos de M. pneumoniae mediante la técnica de adsorción. De hecho, el objetivo principal del ELISA de captura de antígeno es detectar específicamente la inmunoglobulina (Ig) G de M. pneumoniae en muestras de suero humano. El concepto de este ELISA consiste principalmente en la captura selectiva de antígenos específicos de M. pneumoniae, antes de añadir las muestras de suero humano. Esta selectividad se asegura incubando el antígeno crudo de M. pneumoniae con un antisuero policlonal de M. pneumoniae, producido en conejos en el laboratorio y haciéndolo específico de la especie por adsorción contra un panel de bacterias heterólogas, pertenecientes o no a la clase Mollicutes, que comparten antígenos con M . pneumoniae especies y/o conocidas por colonizar las vías respiratorias. El procedimiento de adsorción se repitió tres veces, y su eficacia para eliminar la reactividad cruzada se probó mediante inmunotransferencia. El ensayo ELISA desarrollado es una combinación de ELISA sándwich e indirecto. Brevemente, los pocillos de la placa ELISA se recubren primero con un antisuero policlonal específico para M. pneumoniae. Luego, se agrega el antígeno de M. pneumoniae y queda atrapado entre el antisuero y los anticuerpos presentes en la muestra de suero que se va a analizar. El complejo inmunológico formado es detectado por un anticuerpo secundario conjugado con enzimas (IgG conjugada con peroxidasa). Las reacciones se visualizan mediante la adición de sustrato cromogénico, y la absorbancia se mide espectrofotométricamente. Este ELISA interno se presenta esquemáticamente en la Figura 1. El ELISA casero demostró ser eficiente en la detección específica de la infección por M. pneumoniae y actualmente es una de las pruebas más practicadas en la actividad diagnóstica de rutina.

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Protocol

El presente estudio se ha realizado de conformidad con los aspectos éticos establecidos por el comité de ética del Instituto Pasteur de Túnez.

1. Pasos previos a ELISA: requisitos previos y preprocesamiento

  1. Cepas bacterianas y medios de crecimiento
    NOTA: Las especies de Mollicutes y las bacterias amuralladas utilizadas en el presente estudio y sus medios de crecimiento se enumeran en la Tabla 1.
    1. Crecimiento de especies de Mollicutes
      1. Inocular 200 μL del stock de glicerol de cada especie en 1.800 μL del medio.
      2. Cultivar especies de Mollicutes estáticamente a 37 °C con 5% deCO2 durante 2-4 días hasta que se observe un cambio de pH (el indicador de pH es rojo fenol).
      3. Amplíe los cultivos a 10 ml agregando una dilución de 1/10del cultivo a los medios y permita que crezcan nuevamente en las mismas condiciones.
        NOTA: De acuerdo con el metabolismo, algunas especies humanas de Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium y M. fermentans) acidifican el medio debido a la fermentación de la glucosa, y algunas otras (M. hominis y Ureaplasma) alcalinizan el medio por hidrólisis de arginina o hidrólisis de urea, respectivamente. En cuanto a los micoplasmas aviares, la acidificación del medio de Frey demuestra la presencia de M. gallisepticum, mientras que su alcalinización demuestra el crecimiento de M. imitans.
      4. Extienda 50 μL de los cultivos en placas de agar para confirmar el crecimiento de la bacteria. Mantener las placas de agar a 37 °C con un 5% deCO2 y observarlas regularmente bajo el microscopio para detectar la aparición de colonias típicas de huevos fritos (Mycoplasmas) y colonias de erizos oscuros (Ureaplasmas).
    2. Crecimiento de especies no mollicutes
      1. Cultivar las bacterias no Mollicutes en 3 ml del medio a 37 °C durante la noche (agitar a 200 rpm).
      2. Comparar la turbidez de los cultivos con los medios de control para confirmar el crecimiento.
      3. Amplíe los cultivos a 10 ml agregando una dilución de 1/100del cultivo a los medios y permita que crezcan nuevamente en las mismas condiciones.
  2. Preparación de antígenos
    1. Preparación de antígenos de especies de Mollicutes
      1. Recolectar las proteínas enteras (presentes en cultivos confirmados de M. pneumoniae y las otras especies de Mollicutes) por centrifugación a 40.000 x g a 4 °C durante 30 min.
      2. Desechar el sobrenadante y lavar los gránulos tres veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS, pH 7.4) mediante una serie de tres centrifugaciones con las mismas condiciones.
      3. Resuspender cada antígeno en 500 μL de PBS.
    2. Preparación de antígenos de especies no mollicutes
      1. Centrifugar los cultivos cultivados durante la noche de las bacterias no Mollicutes a 1.500 x g durante 15 min.
      2. Resuspender cada pellet bacteriano en 500 μL de PBS.
        NOTA: La concentración de proteína se determina utilizando el método clásico de cuantificación de Bradford con albúmina sérica bovina como estándar21. La concentración proteica de las especies de Mollicutes suele oscilar entre 0,7-4,8 mg/ml. Para las otras especies bacterianas, la concentración de proteína puede alcanzar 20 mg / ml. Todos los antígenos se almacenan a -20 °C hasta su uso posterior.
  3. Cribado de reactividad cruzada mediante inmunotransferencia
    1. Desnaturalice las proteínas bacterianas mezclando 8 μL de cada antígeno con un volumen igual de tampón de muestra (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% de glicerol [v/v], 10% de SDS [p/v] y 0,2% de azul de bromofenol), incubar la mezcla a 100 °C durante 5 min.
      NOTA: La desnaturalización se realiza para cubrir las proteínas con carga negativa y romper sus estructuras secundarias, lo que les permite correr a través del gel de poliacrilamida y separarse según sus pesos moleculares.
    2. Someter las proteínas desnaturalizadas (100 μg de proteína/pocillo) a electroforesis en gel de dodecil sulfato-poliacrilamida de sodio (SDS-PAGE) por el método 22 de Laemmli con12 % de gel separador y 5% de gel de apilado. Después de eso, transfiera las proteínas electroforéticamente a la membrana de nitrocelulosa por el método23 de Towbin et al.
    3. Sumerja la membrana de nitrocelulosa en leche descremada al 5% en PBS durante 30 minutos para bloquear las superficies desocupadas. Incubar los coágulos de proteína a temperatura ambiente durante 2 h con antisuero policlonal de M. pneumoniae de conejo (producido en el Instituto Pasteur de Túnez) diluido a 1/200 en PBS-Tween 20, luego con IgG anti-conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) diluida a 1/2.000 en PBS-Tween 20 durante 1 h a temperatura ambiente.
    4. Lavar los anticuerpos no unidos con PBS y obtener los resultados exponiendo la lámina de nitrocelulosa a la solución de sustrato (4-cloro-1-naftol,H2O2). Detenga la reacción agregando agua después de 5-15 min.
  4. Procedimiento de adsorción
    NOTA: Para eliminar las reacciones cruzadas entre el antisuero policlonal M. pneumoniae y los antígenos heterólogos de las bacterias, se emplea el procedimiento de adsorción descrito previamente por Ben Abdelmoumen y Roy24 .
    1. Preparar un conjunto de antígenos de las 12 bacterias heterólogas (se sospecha que comparten antígenos con M. pneumoniae), mezclarlo en un tubo de microcentrífuga y ajustar la concentración de proteína correspondiente a la mitad del antisuero que se adsorberá en el experimento.
      NOTA: El volumen y la concentración varían entre los diferentes ensayos. Este paso depende principalmente de la concentración del anticuerpo a adsorber. Por ejemplo, si la concentración de anticuerpos = 3,56 mg/ml, la concentración del conjunto de antígenos (compuesto por las 12 bacterias heterólogas) debe ser de 1,78 mg/ml (por lo tanto, aproximadamente 0,148 mg de cada antígeno).
    2. Centrifugar la mezcla de antígenos a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C, recoger el pellet agrupado e incubarlo con la IgG policlonal purificada anti-M. pneumoniae durante 2 h a 37 °C con agitación lenta.
    3. Después de la incubación, centrifugar la suspensión a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C y recuperar el sobrenadante (que corresponde al antisuero policlonal específico de M. pneumoniae ).
      NOTA: Para asegurar la especificidad del antisuero policlonal M. pneumoniae , repita el procedimiento de adsorción tres veces. Antes de que pueda usarse en el ensayo ELISA, el antisuero policlonal adsorbido de M. pneumoniae debe probarse mediante inmunotransferencia para detectar la ausencia de reacciones cruzadas contra el conjunto de bacterias incluido.

2. Pasos ELISA: El ensayo en sí

  1. Recubrimiento de microplacas con el anticuerpo de captura
    1. Diluir el anticuerpo de captura (antisuero policlonal preadsorbido de M. pneumoniae ) a una concentración de 10 μg/ml en tampón carbonato-bicarbonato 0,1 M (pH 9,6).
    2. Cubra la placa ELISA de 96 pocillos agregando 100 μL del anticuerpo de captura diluido a cada pocillo.
    3. Después de la incubación nocturna a 4 °C, retire la solución de recubrimiento y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado (composición [por L]: 146,29 g de NaCl, 39,4 g de Tris-HCl, 0,2 g de timerosal y 0,5 ml de Tween 20; pH 7,3).
  2. Bloqueante
    1. Bloquee las superficies de unión restantes de los pocillos recubiertos agregando 100 μL de la solución de bloqueo (0,5% de caseína en PBS) a cada pocillo.
    2. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
    3. Retire la solución de bloqueo con una pipeta y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.
  3. Aplicación del antígeno
    1. Añadir una cantidad igual de proteínas enteras de M. pneumoniae a todos los pocillos recubiertos (10 ng/pocillo).
    2. Dejar que la reacción tenga lugar durante 2 h a temperatura ambiente.
    3. Retire el exceso de la solución de antígeno y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.
  4. Aplicación de las muestras de ensayo y los controles
    1. Diluir las muestras de prueba (sueros humanos) y los controles (sueros positivos y negativos de referencia) a 1/200, 1/400 y 1/800 en PBS-Tween 20.
    2. Añadir 100 μL de las muestras diluidas y los controles en los pocillos apropiados. Llevar a cabo cada reacción por duplicado. Marque los pocillos que no contienen antígeno ni sueros como en blanco.
    3. Después de incubar la placa durante 90 minutos a temperatura ambiente, retire las soluciones de suero y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.
  5. Aplicación del anticuerpo de detección conjugado enzimático
    1. Diluir los anticuerpos de detección conjugados con enzimas, anticonejo conjugado con HRP e IgG antihumana a 1/10,000 en PBS-Tween 20.
    2. Pipetear 100 μL del anticuerpo de detección adecuadamente diluido para cada pocillo.
    3. Después de incubar la placa durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad, retire los anticuerpos de detección no unidos y lave la placa cinco veces con el tampón de lavado.
  6. Detección y análisis de datos
    1. Añadir 100 μL de la solución cromógena de 3,3', 5,5' tetrametilbencidina (TMB) para visualizar la unión antígeno-anticuerpo.
    2. Deje que la placa se desarrolle durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego agregue 100 μL de la solución de parada (7.5% H2SO4) para detener la reacción enzimática.
    3. Lea la absorbancia a una longitud de onda de 450 nm utilizando el lector de microplacas y clasifique los resultados en función del cálculo del índice de positividad (IP).
      IP = Absorbancia del suero probado / Absorbancia del corte
      IP < 0.7: Resultado negativo
      IP = 0.7: La prueba debe repetirse dentro de 2 semanas
      IP > 0.7: Resultado positivo
      NOTA: La fórmula IP se concibe en el laboratorio y el valor 0,7 se configura después de la optimización. Para reacciones duplicadas, se calcula el valor medio de absorbancia. La dilución sérica óptima y la concentración de antígenos se establecen mediante el método de titulación del tablero de ajedrez ELISA (datos no mostrados). Valor de corte = DO (densidad óptica) de un suero positivo de referencia (diluido a la misma dilución que la muestra). Este DO debe ser al menos tres veces mayor que el valor de DO del control negativo.

3. Pasos post-ELISA: Evaluación de resultados y validación de pruebas

  1. La capacidad del ELISA interno para diagnosticar específicamente la infección por M. pneumoniae en los pacientes analizados se evalúa a través de inmunoblots suplementarios utilizando antígenos de M. pneumoniae y las bacterias heterólogas para confirmar la positividad de los sueros humanos probados en anticuerpos contra M. pneumoniae y su negatividad en las otras bacterias sospechosas (datos no mostrados).

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Representative Results

La actividad inmunoblotting del antisuero policlonal Mycoplasma pneumoniae no adsorbido a bacterias heterólogas
La reactividad cruzada existe, como se muestra en los resultados de inmunotransferencia (Figura 2) y, en comparación con el control positivo (Carril 1), algunos de los antígenos de M. pneumoniae se comparten con las bacterias examinadas. La intensidad de estas reacciones cruzadas fue variable. Por ejemplo, los antígenos M. gallisepticum y M. imitans mostraron la reactividad más fuerte con M. pneumoniae antiserum (carriles 9 y 10), además de ser micoplasmas aviares. Por el contrario, ninguno de los dos aislados clínicos humanos de Ureaplasma urealyticum mostró ninguna reactividad (carriles 7 y 8). Sin embargo, los antígenos de las especies restantes de Mycoplasma genital humano M. hominis, M. fermentans y M. genitalium produjeron reacciones cruzadas considerables con M. pneumoniae antiserum (carriles 11, 12 y 13, respectivamente). Escherichia coli (Lane 2), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) y Klebsiella pneumoniae (Lane 6) también reaccionaron con anticuerpos policlonales contra M. pneumoniae, y su patrón de perfil antigénico fue muy similar. Este perfil fue ligeramente diferente de los de las dos especies de bacterias coco Streptococcus pneumoniae y Staphylococcusaureus; la reactividad fue menor con S. pneumoniae (Carril 3) y aún menor con S. aureus (Carril 5).

Especificidad de anticuerpos contra Mycoplasma pneumoniae garantizada por procedimiento de adsorción
Después de la adsorción del antisuero policlonal M . pneumoniae contra los antígenos bacterianos heterólogos, la especificidad se probó mediante inmunotransferencia (Figura 3). Aparte de algunas proteínas del antígeno de M. pneumoniae reveladas en el carril 1 (control positivo), los otros antígenos no se detectaron casi por completo (carriles 2-13). Las proteínas reveladas en Lane 1 son en realidad las proteínas específicas detectadas por los anticuerpos específicos de M. pneumoniae que quedan después de la adsorción. Con base en este resultado, se demostró la eficiencia del procedimiento de adsorción, ya que se eliminaron las reacciones inespecíficas encontradas del antisuero policlonal M. pneumoniae con los antígenos heterólogos, descritos anteriormente. El antisuero de M. pneumoniae convertido en específico se utilizó en todas las pruebas serológicas e inmunotransferencia posteriores.

ELISA de antígeno de captura: ensayo válido para la actividad serodiagnóstica de laboratorio de rutina
Dado que todos los sueros se probaron en pocillos duplicados para las diferentes diluciones, se calcularon los valores medios de DO y se trazó un gráfico de barras que correlacionaba estos valores de absorbancia con sus diluciones séricas correspondientes (Figura 4). Sobre la base del cálculo de IP, el conjunto de sueros humanos probados y presentados en este documento resultó positivo para la IgG de M. pneumoniae. Varios otros conjuntos de suero también se probaron utilizando este ELISA casero, y en cada momento el ensayo demostró ser eficiente para detectar específicamente la IgG de M. pneumoniae y, por lo tanto, distinguir a los pacientes infectados por M. pneumoniae de los no infectados (datos no mostrados).

Los resultados del ELISA siempre fueron confirmados por varios análisis de inmunoblot que mostraron simultáneamente la positividad en M. pneumoniae y la negatividad en todas las demás bacterias de cualquier suero probado encontrado positivo por el antígeno de captura interno M. pneumoniae ELISA (datos no mostrados).

Figure 1
Figura 1: Presentación esquemática del ELISA de captura de antígeno desarrollado en el laboratorio para la detección específica de IgG de Mycoplasma pneumoniae. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Análisis inmunoblot de reacciones cruzadas entre Mycoplasma pneumoniae y un conjunto de bacterias heterólogas. La reactividad del antisuero policlonal no adsorbido de M. pneumoniae se probó contra antígenos de Escherichia coli (Lane 2), Streptococcus pneumoniae (Lane 3), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4), Staphylococcus aureus (Lane 5), Klebsiella pneumoniae (Lane 6), dos aislados de Ureaplasma urealyticum (Lanes 7 y 8), M. imitans (Lane 9), M. gallisepticum (Lane 10), M. hominis (Lane 11), M. fermentans (carril 12), y M. genitalium (carril 13). Carril 1: M. pneumoniae (control positivo). Los pesos moleculares de algunas de las principales proteínas de M. pneumoniae se dieron a la izquierda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Confirmación de inmunoblot de la eficacia del procedimiento de adsorción para eliminar reacciones cruzadas. Reactividad de todas las bacterias heterólogas seleccionadas; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, dos aislados de Ureaplasma urealyticum, M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans y M. genitalium (Lanes 2-13, respectivamente) se probaron contra el antisuero policlonal adsorbido de M. pneumoniae. El antígeno de M. pneumoniae se cargó en el carril 1 como control positivo (solo se revelaron proteínas específicas). Lane MW: escalera de proteínas preteñidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resultados del ELISA de captura de antígeno. El ELISA se realizó utilizando el antisuero policlonal Mycoplasma pneumoniae adsorbido como agente de recubrimiento. Los gráficos de barras 1 y 2 representan controles negativos y positivos, respectivamente. Los gráficos de barras 3-13 representan los sueros de un grupo de pacientes examinados. Cada suero se probó en tres diluciones diferentes: 1/200 (barras moradas), 1/400 (barras naranjas) y 1/800 (barras azules). Los valores de OD sirvieron para calcular el índice de positividad. Cada reacción se realizó por duplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Microorganismo Colar* Medio Referencia
Especies de micoplasma y ureaplasma Mycoplasma pneumoniae ATCC 160 20030 SP4 [35]
Mycoplasma genitalium CIP 103767T SP4
Mycoplasma fermentans ATCC 160 20026 SP4
Mycoplasma hominis CIP 103715T SP4 suplementado con arginina
Ureaplasma urealyticum 2 aislados clínicos** SP4 suplementado con urea
Mycoplasma gallisepticum CIP S6 15302 Frey [36]
Mycoplasma imitans ATCC 160 20037 Frey
Otras bacterias Escherichia coli ATCC 25922 Caldo LB [37]
Klebsiella pneumoniae Aislado clínico*** Caldo LB
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Caldo LB
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Caldo LB
Streptococcus pneumoniae Aislado clínico*** Caldo de sangre
* ATCC: American Type Culture Collection, CIP: Collection Institut Pasteur
** Se recogieron aislamientos de muestras clínicas enviadas voluntariamente al Laboratorio de Micoplasmas (Instituto Pasteur de Túnez) para el diagnóstico de rutina
Los aislamientos se recogieron de muestras clínicas enviadas voluntariamente al Laboratorio de Bacteriología (Instituto Pasteur de Túnez) para el diagnóstico de rutina

Tabla 1: Lista de cepas de bacterias utilizadas en este estudio.

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Discussion

Este documento presenta una descripción general de un ELISA interno desarrollado principalmente para garantizar la detección específica de M. pneumoniae Infección. Se proporcionan los detalles sobre el protocolo del ensayo ELISA en sí, así como algunos pasos previos y posteriores al procesamiento. La especificidad de este ensayo está garantizada por la técnica de adsorción. Este procedimiento fue descrito previamente en pruebas ELISA desarrolladas para el diagnóstico de humanos y aves Mycoplasmas17,24. También se empleó en ensayos ELISA para el diagnóstico de otras infecciones bacterianas como la enfermedad de Lyme.25. En estos tres artículos, se demostró que la adsorción ayuda a aumentar la especificidad del ELISA sin escarificar o disminuir la sensibilidad.17,24,25. En el caso del presente ensayo ELISA, las especies de bacterias apropiadas seleccionadas para la adsorción pueden dividirse en dos grupos: el primer grupo contiene algunas especies patógenas de Mollicutes humanos y aviares (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticumy M. imitans), mientras que el segundo contiene las bacterias más frecuentes que se sabe que infectan a los seres humanos (E. coli, P. aeruginosay S. aureus) y aquellos notoriamente conocidos por su tropismo al tracto respiratorio (K. pneumoniae y S. pneumoniae). La amplia selección de bacterias heterólogas se basó en el hecho de que ya no se respeta el dogma de las especies y la especificidad de los órganos. Muchos informes sobre la detección de microorganismos en hábitats desconocidos se han publicado anteriormente. Por ejemplo M. pneumoniae se ha aislado de muchos sitios extrapulmonares y se ha encontrado que está asociado con una gama variada de complicaciones extrapulmonares con síntomas leves a graves, aunque se asumió que era específico del tracto respiratorio6,7. El caso opuesto (aislamiento genital Mycoplasma especies del tracto respiratorio) fue señalizado para M. hominis y M. fermentans26,27. La inclusión de las aves Mycoplasma En la prueba de serodiagnóstico de infección humana se basó en estudios previos que informaban de la posibilidad de infección de seres humanos (especialmente personas inmunocomprometidas y veterinarios) con Mycoplasma spp. originario de animales domésticos28,29,30. Es cierto que, hasta ahora, no se encontró ningún papel que evocara el aislamiento de M. gallisepticum y M. imitans (las dos especies incluidas en el procedimiento de adsorción en este trabajo) de humanos. A pesar de esto, nada es imposible, especialmente porque estas especies se encuentran entre las especies más manejadas regularmente por los veterinarios y están filogenéticamente demasiado cerca de M. pneumoniae. De hecho, estas dos aves Mycoplasma spp. han mostrado la mayor reactividad con M. pneumoniae antisuero (como se ilustra en Figura 2). Brevemente, al diseñar el procedimiento de adsorción, un espectro relativamente grande de bacterias sospechosas que podrían compartir antígenos con M. pneumoniae se incluyó. Las elecciones realizadas se basaron en la relación filogenética y el tropismo con el tracto respiratorio. Sin embargo, debido a la diversidad de la flora humana y la variabilidad antigénica, es imposible predecir e incluir todas las posibles especies y cepas bacterianas heterólogas que podrían reaccionar de forma cruzada con M. pneumoniae anticuerpos. Por lo tanto, la posibilidad de reacción cruzada entre M. pneumoniae antisuero, incluso después de la adsorción, y otras bacterias siguen siendo probables. Además, dado que M. pneumoniae Es comúnmente conocido por infectar a niños y adultos jóvenes, el procedimiento de adsorción puede mejorarse aún más en el futuro mediante la adición de otros patógenos respiratorios pediátricos como Haemophilus influenzae31 y Streptococcus pyogenes32 en la lista de preseleccionados de adsorción bacteriana.

El propósito de este ELISA es detectar la presencia del anticuerpo diana (M. pneumoniae-IgG específico) en el suero humano. Por lo tanto, para poder utilizar el suero como muestra (ya que es el más fácil de recolectar y el menos doloroso para los pacientes) y para garantizar la especificidad, el ELISA interno se basa en el principio de dos tipos de ELISA: ELISA indirecto y sándwich. La muestra de suero (anticuerpo primario) se une entre el anticuerpo de detección (segundo anticuerpo marcado) y el antígeno de captura, que estaba específicamente vinculado al anticuerpo de captura (antes se hacía específico por adsorción e inmovilizado en la superficie de la microplaca). Dadas estas características únicas, se cree que este ELISA es efectivo y especial. Sin embargo, esta prueba no es perfecta, y pueden ocurrir problemas. Todavía se pueden encontrar resultados falsos positivos y falsos negativos, a veces debido a la calidad del suero o la fase de infección, y a veces debido a errores durante la aplicación del protocolo en el laboratorio. Por ejemplo, los resultados del serodiagnóstico ELISA pueden verse afectados incluso si los pocillos no están suficientemente lavados. Además, la incubación (temperatura y tiempo) podría influir en los resultados de la prueba. La selección de microplacas y agentes bloqueantes también fue reportada como un paso crítico durante el desarrollo de ELISA33,34. Por todo ello, es importante trabajar continuamente para mejorar esta prueba ELISA con el fin de determinar los parámetros y condiciones óptimas, como la dilución de los diferentes anticuerpos (muestras de suero, captura de anticuerpos, detección de anticuerpos), los pasos de incubación y lavado, y la inclusión de los controles negativos y positivos adecuados.

El cultivo de bacterias y la producción de sus antígenos para realizar el procedimiento de adsorción podría considerarse un paso pesado, especialmente para las especies de Mollicutes. Sin embargo, se cree que esto es importante ya que este paso ayuda en gran medida a mejorar la especificidad del ELISA y a evitar pruebas de confirmación adicionales como la inmunotransferencia o la PCR. Además, en el contexto de la infección por M. pneumoniae, definitivamente se requiere un diagnóstico eficaz y confiable para establecer una terapia antibiótica adecuada y apropiada, ya que el uso de medicamentos betalactámicos en el tratamiento de la neumonía adquirida en la comunidad es ineficaz contra M. pneumoniae8. Después de años de ser utilizado en la actividad diagnóstica de rutina en el laboratorio, se cree que el ELISA de captura de antígeno, descrito en este artículo, representa una herramienta válida para el cribado específico de la infección por M. pneumoniae.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Este estudio fue financiado por el Ministerio de Salud de Túnez y el Ministerio de Educación Superior e Investigación Científica de Túnez.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

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Biología Número 192
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de captura de antígeno para la detección específica de <em>Mycoplasma pneumoniae</em>
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Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

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