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Biology

Saggio immunoassorbente legato all'enzima di cattura dell'antigene per la rilevazione specifica di Mycoplasma pneumoniae

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64645
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Group of Mycoplasmas, Laboratory of Molecular Microbiology, Vaccinology, and Biotechnology Development, Pasteur Institute of Tunis

Summary

Nell'infezione da Mycoplasma pneumoniae, i test sierologici possono generare buoni risultati, ma con bassa specificità a causa della reazione crociata immunologica. L'ELISA interno per la cattura dell'antigene, descritto in questo articolo, garantisce un'elevata specificità delle specie e ha dimostrato di essere un test di screening affidabile per una diagnosi accurata di M. pneumoniae.

Abstract

Il Mycoplasma pneumoniae è un procariota carente della parete cellulare, noto principalmente per colonizzare il tratto respiratorio umano e per essere endemico, con picchi epidemici ogni 6 anni, nei bambini più grandi e nei giovani adulti. La diagnosi di M. pneumoniae è difficile a causa della natura meticolosa dell'agente patogeno e della possibilità di trasporto asintomatico. La diagnosi di laboratorio dell'infezione da M. pneumoniae basata sulla titolazione degli anticorpi nei campioni di siero dei pazienti rimane il metodo più praticato. A causa del potenziale problema della cross-reattività immunologica con l'uso di siero policlonale per M. pneumoniae, è stato sviluppato un saggio di immunoassorbimento enzimatico legato all'antigene (ELISA) per migliorare la specificità della diagnosi sierologica. Le piastre ELISA sono rivestite con anticorpi policlonali M. pneumoniae, allevati nei conigli e resi specifici dopo l'adsorbimento contro un pannello di batteri eterologhi che condividono antigeni con le specie di M. pneumoniae e/o sono noti per colonizzare le vie respiratorie . Gli antigeni omologhi di M. pneumoniae reagiti vengono quindi specificamente riconosciuti dai loro anticorpi corrispondenti nei campioni di siero. Un'ulteriore ottimizzazione dei parametri fisico-chimici a cui è sottoposto l'ELISA di cattura dell'antigene ha portato a un ELISA altamente specifico, sensibile e riproducibile.

Introduction

I micoplasmi sono tra i procarioti più piccoli e semplici conosciuti. Si distinguono principalmente dagli altri batteri per la mancanza di una struttura della parete cellulare. Pertanto, i micoplasmi sono stati classificati in una classe separata denominata Mollicutes1. Il deficit della parete cellulare conferisce resistenza intrinseca a questi microrganismi contro alcuni agenti antimicrobici ed è in gran parte responsabile del loro polimorfismo. I micoplasmi hanno un genoma piccolo e dimensioni ridotte, il che limita le loro capacità metaboliche e biosintetiche e spiega la loro natura parassitaria e saprofita1.

Mycoplasma pneumoniae è uno dei micoplasmi che infettano l'uomo e si pensa che sia il più virulento2. M. pneumoniae colonizza il tratto respiratorio superiore, portando a polmonite atipica nei bambini e nei giovani adulti. I segni clinici generati dall'infezione da M. pneumoniae sono simil-influenzali, con mal di testa, febbre e tosse3. La cytadherence di M. pneumoniae alle cellule ospiti è mediata da un organello di attaccamento che include l'adesione maggiore P1 e diverse proteine accessorie 4,5. Altre manifestazioni cliniche possono verificarsi a causa dell'infiammazione locale e della stimolazione del sistema immunitario dell'ospite derivanti dall'aderenza intima di M. pneumoniae alla mucosa delle vie aeree6. Sebbene la polmonite sia un segno distintivo dell'infezione da M. pneumoniae, è stato rivelato che l'infezione da questo batterio può anche essere responsabile di un ampio spettro di manifestazioni non polmonari in diversi siti anatomici come il sistema nervoso centrale, il cuore, la pelle e le articolazioni7.

Come per tutte le specie di Mycoplasma, la diagnosi di M. pneumoniae è impegnativa. I segni clinici che evocano la micoplasmosi sono per lo più inapparenti e non caratteristici8. Poiché è molto difficile diagnosticare l'infezione da M. pneumoniae basandosi solo su manifestazioni e sintomi clinici, lo screening di laboratorio è di particolare interesse9. Rilevare le colonie di M. pneumoniae mediante coltura è il metodo gold standard per una corretta diagnosi. Tuttavia, i meticolosi requisiti di crescita e il lungo tempo necessario per la consegna dei risultati definitivi (1-2 settimane) complicano la coltura, e quindi significa che viene raramente utilizzata per la diagnosi di routine10. Le tecnologie di amplificazione degli acidi nucleici sono state convalidate in termini di velocità ed efficienza, anche se a causa del loro costo relativamente elevato e dell'indisponibilità in alcune strutture sanitarie, queste tecniche molecolari non sono considerate test diagnostici di prima linea. È vero che i test PCR commerciali sono ampiamente utilizzati per diagnosticare le infezioni da M. pneumoniae, ma non possono ancora sostituire la sierologia. Inoltre, il frequente verificarsi di risultati falsi negativi e falsi positivi ha limitato l'uso della PCR9. Di routine, la sierologia rimane la più praticata nei laboratori per la diagnosi dell'infezione da M. pneumoniae. Diversi approcci sierologici sono stati riportati per decenni, come le emoagglutinine fredde, il test di fissazione del complemento11, il test di emoagglutinazione indiretta 12, l'immunofluorescenza 13 e la tecnologia di ELISA, che è stata applicata per la prima volta alla sierologia del micoplasma nei primi anni 198014,15,16. Uno dei principali problemi riscontrati durante l'esecuzione della sierodiagnosi ELISA dell'infezione da M. pneumoniae sono le reazioni crociate, che riducono considerevolmente la specificità della tecnica. In precedenza è stato riportato adsorbimento aspecifico di sieri umani con antigeni di M. pneumoniae; infatti, molti degli anticorpi rilevati dall'ELISA nei sieri umani potrebbero non essere sempre legati agli antigeni micoplasmatici 17, a causa della comunanza di M. pneumoniae con alcuni batteri18,19 e alcuni tessuti animali e umani20.

A causa delle elevate letture di fondo osservate nel test ELISA convenzionale praticato in laboratorio, l'interpretazione dei risultati era spesso complicata e quindi la consegna di una corretta diagnosi di M. pneumoniae era un compito difficile. Di fronte a questo problema, abbiamo optato per migliorare l'ELISA di M. pneumoniae rimuovendo le reazioni non specifiche degli antigeni di M. pneumoniae con anticorpi da testare. A questo scopo, abbiamo lavorato sulla deplezione selettiva degli antigeni non specifici di M. pneumoniae utilizzando la tecnica dell'adsorbimento. Infatti, l'obiettivo principale dell'ELISA di cattura dell'antigene è quello di rilevare specificamente l'immunoglobulina (Ig) G di M. pneumoniae nei campioni di siero umano. Il concetto di questo ELISA consiste principalmente nella cattura selettiva di antigeni specifici di M. pneumoniae, prima di aggiungere i campioni di siero umano. Questa selettività è assicurata mediante l'incubazione dell'antigene grezzo di M. pneumoniae con un antisiero policlonale M. pneumoniae, prodotto nei conigli in laboratorio e rendendolo specie-specifico mediante adsorbimento contro un pannello di batteri eterologhi, appartenenti o non appartenenti alla classe Mollicutes, che condividono antigeni con M. pneumoniae specie e/o note per colonizzare le vie respiratorie. La procedura di adsorbimento è stata ripetuta tre volte e la sua efficacia nell'eliminare la cross-reattività è stata testata mediante immunoblotting. Il test ELISA sviluppato è una combinazione di ELISA a sandwich e ELISA indiretto. In breve, i pozzetti della piastra ELISA vengono prima rivestiti con un antisiero policlonale specifico per M. pneumoniae. Quindi, l'antigene di M. pneumoniae viene aggiunto e intrappolato tra l'antisiero e gli anticorpi presenti nel campione di siero da testare. Il complesso immunologico formato viene rilevato da un anticorpo secondario coniugato enzimatico (IgG coniugate con perossidasi). Le reazioni vengono visualizzate mediante l'aggiunta di substrato cromogenico e l'assorbanza viene misurata spettrofotometricamente. Questo ELISA interno è schematicamente presentato nella Figura 1. L'ELISA fatto in casa si è dimostrato efficace nel rilevare specificamente l'infezione da M. pneumoniae ed è attualmente uno dei test più praticati nell'attività diagnostica di routine.

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Protocol

Il presente studio è stato condotto in conformità con gli aspetti etici stabiliti dal comitato etico dell'Istituto Pasteur di Tunisi.

1. Fasi pre-ELISA: prerequisiti e pre-elaborazione

  1. Ceppi batterici e terreni di crescita
    NOTA: Le specie di Mollicutes e i batteri murati utilizzati nel presente studio e i loro substrati di crescita sono elencati nella Tabella 1.
    1. Crescita delle specie di Mollicutes
      1. Inoculare 200 μL dallo stock di glicerolo di ciascuna specie in 1.800 μL di terreno.
      2. Coltivare le specie Mollicutes staticamente a 37 °C con il 5% di CO 2 per2-4 giorni fino a quando non si osserva un cambiamento di pH (l'indicatore di pH è rosso fenolo).
      3. Aumentare le colture a 10 ml aggiungendouna diluizione di 1/10 della coltura ai terreni e consentire loro di crescere di nuovo nelle stesse condizioni.
        NOTA: Secondo il metabolismo, alcune specie umane di Mollicutes (M. pneumoniae, M. genitalium e M. fermentans) acidificano il terreno a causa della fermentazione del glucosio e alcune altre (M. hominis e Ureaplasma) alcalinizzano il mezzo mediante idrolisi dell'arginina o idrolisi dell'urea, rispettivamente. Per quanto riguarda i micoplasmi aviari, l'acidificazione del terreno di Frey dimostra la presenza di M. gallisepticum, mentre la sua alcalinizzazione dimostra la crescita di M. imitans.
      4. Distribuire 50 μL delle colture su piastre di agar per confermare la crescita dei batteri. Mantenere le piastre di agar a 37 °C con il 5% di CO2 e osservarle regolarmente al microscopio per la comparsa di tipiche colonie di uova fritte (Mycoplasmas) e colonie simili a ricci scuri (Ureaplasmas).
    2. Crescita di specie non-Mollicutes
      1. Coltura dei batteri non mollicutes in 3 mL di terreno a 37 °C durante la notte (agitazione a 200 giri/min).
      2. Confronta la torbidità delle colture con i mezzi di controllo per confermare la crescita.
      3. Aumentare le colture a 10 ml aggiungendouna diluizione 1/100 della coltura ai terreni e consentire loro di crescere di nuovo nelle stesse condizioni.
  2. Preparazione dell'antigene
    1. Preparazione dell'antigene delle specie di Mollicutes
      1. Raccogliere le proteine intere (presenti in colture confermate di M. pneumoniae e delle altre specie di Mollicutes) mediante centrifugazione a 40.000 x g a 4 °C per 30 min.
      2. Scartare il surnatante e lavare il pellet tre volte con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS, pH 7,4) mediante una serie di tre centrifugazioni con le stesse condizioni.
      3. Risospendere ogni antigene in 500 μL di PBS.
    2. Preparazione dell'antigene di specie non-Mollicutes
      1. Centrifugare le colture coltivate durante la notte dei batteri non-Mollicutes a 1.500 x g per 15 minuti.
      2. Risospendere ogni pellet batterico in 500 μL di PBS.
        NOTA: La concentrazione proteica viene determinata utilizzando il classico metodo di quantificazione Bradford con albumina sierica bovina come standard21. La concentrazione proteica delle specie di Mollicutes varia solitamente tra 0,7-4,8 mg/ml. Per le altre specie batteriche, la concentrazione proteica può raggiungere i 20 mg/ml. Tutti gli antigeni sono conservati a -20 °C fino al loro successivo utilizzo.
  3. Screening della cross-reattività mediante immunoblotting
    1. Denaturare le proteine batteriche mescolando 8 μL di ciascun antigene con un volume uguale di tampone campione (0,5 M Tris-HCl; pH 6,8, 10% glicerolo [v/v], 10% SDS [p/v] e 0,2% blu di bromofenolo), incubare la miscela a 100 °C per 5 minuti.
      NOTA: La denaturazione viene eseguita per coprire le proteine con carica negativa e per rompere le loro strutture secondarie, il che consente loro di attraversare il gel di poliacrilammide e di essere separate in base ai loro pesi molecolari.
    2. Sottoporre le proteine denaturate (100 μg di proteine/pozzetto) all'elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) con il metodo 22 di Laemml con il12 % di gel separante e il 5% di gel impilabile. Successivamente, trasferire le proteine elettroforeticamente alla membrana nitrocellulosa con il metodo23 di Towbin et al.
    3. Immergere la membrana nitrocellulosa nel latte scremato al 5% in PBS per 30 minuti per bloccare le superfici non occupate. Incubare i peeling proteici a temperatura ambiente per 2 ore con antisiero policlonale M. pneumoniae di coniglio (prodotto presso l'Istituto Pasteur di Tunisi) diluito a 1/200 in PBS-Tween 20, quindi con IgG anti-coniglio coniugato con perossidasi di rafano (HRP) diluito a 1/2.000 in PBS-Tween 20 per 1 ora a temperatura ambiente.
    4. Lavare via gli anticorpi non legati con PBS e ottenere i risultati esponendo il foglio di nitrocellulosa alla soluzione di substrato (4-cloro-1-naftolo, H2 O2). Interrompere la reazione aggiungendo acqua dopo 5-15 minuti.
  4. Procedura di adsorbimento
    NOTA: Per eliminare le reazioni crociate tra l'antisiero policlonale di M. pneumoniae e gli antigeni dei batteri eterologhi, viene utilizzata la procedura di adsorbimento precedentemente descritta da Ben Abdelmoumen e Roy24 .
    1. Preparare un pool di antigeni dei 12 batteri eterologhi (sospettati di condividere antigeni con M. pneumoniae), mescolarlo in una provetta da microcentrifuga e regolare la concentrazione proteica corrispondente alla metà dell'antisiero da adsorbitare nell'esperimento.
      NOTA: Il volume e la concentrazione variano tra i diversi test. Questo passaggio dipende principalmente dalla concentrazione dell'anticorpo da adsorbitare. Ad esempio, se la concentrazione di anticorpi = 3,56 mg/ml, la concentrazione del pool di antigeni (composto dai 12 batteri eterologhi) dovrebbe essere di 1,78 mg/ml (quindi, circa 0,148 mg di ciascun antigene).
    2. Centrifugare la miscela di antigeni a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C, raccogliere il pellet raggruppato e incubarlo con il policlonale purificato anti-M. pneumoniae IgG per 2 ore a 37 °C con agitazione lenta.
    3. Dopo l'incubazione, centrifugare la sospensione a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C e recuperare il surnatante (che corrisponde all'antisiero policlonale specifico M. pneumoniae ).
      NOTA: Per garantire la specificità dell'antisiero policlonale M. pneumoniae , ripetere la procedura di adsorbimento tre volte. Prima di poter essere utilizzato nel test ELISA, l'antisiero policlonale adsorbito M. pneumoniae deve essere testato mediante immunoblotting per l'assenza di reazioni crociate contro il set di batteri incluso.

2. Fasi ELISA: il test stesso

  1. Rivestimento in micropiastre con l'anticorpo di cattura
    1. Diluire l'anticorpo di cattura (antisiero policlonale preadsorbito di M. pneumoniae ) ad una concentrazione di 10 μg/mL in tampone carbonato-bicarbonato 0,1 M (pH 9,6).
    2. Rivestire la piastra ELISA a 96 pozzetti aggiungendo 100 μL dell'anticorpo di cattura diluito a ciascun pozzetto.
    3. Dopo l'incubazione notturna a 4 °C, rimuovere la soluzione di rivestimento e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio (composizione [per L]: 146,29 g di NaCl, 39,4 g di Tris-HCl, 0,2 g di Thimerosal e 0,5 mL di Tween 20; pH 7,3).
  2. Inceppamento
    1. Bloccare le restanti superfici di legame dei pozzetti rivestiti aggiungendo 100 μL della soluzione bloccante (caseina allo 0,5% in PBS) a ciascun pozzetto.
    2. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere la soluzione di blocco con una pipetta e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio.
  3. Applicazione dell'antigene
    1. Aggiungere una quantità uguale di proteine intere di M. pneumoniae a tutti i pozzetti rivestiti (10 ng/pozzetto).
    2. Lasciare che la reazione avvenga per 2 ore a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere l'eccesso della soluzione di antigene e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio.
  4. Applicazione dei campioni di prova e dei controlli
    1. Diluire i campioni di prova (sieri umani) e i controlli (sieri positivi e negativi di riferimento) a 1/200, 1/400 e 1/800 in PBS-Tween 20.
    2. Aggiungere 100 μL dei campioni diluiti e dei controlli nei pozzetti appropriati. Esegui ogni reazione in duplicato. Contrassegnare i pozzetti che non contengono né antigene né sieri come vuoti.
    3. Dopo aver incubato la piastra per 90 minuti a temperatura ambiente, rimuovere le soluzioni di siero e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio.
  5. Applicazione dell'anticorpo di rilevazione enzima-coniugato
    1. Diluire gli anticorpi di rilevamento coniugati con enzimi, gli anti-coniglio coniugati con HRP e le IgG anti-umane a 1/10.000 in PBS-Tween 20.
    2. Pipettare 100 μL dell'anticorpo di rilevazione opportunamente diluito in ciascun pozzetto.
    3. Dopo aver incubato la piastra per 1 ora a temperatura ambiente al buio, rimuovere gli anticorpi di rilevamento non legati e lavare la piastra cinque volte con il tampone di lavaggio.
  6. Rilevamento e analisi dei dati
    1. Aggiungere 100 μL della soluzione cromogeno 3,3', 5,5' tetrametil-benzidina (TMB) per visualizzare il legame antigene-anticorpo.
    2. Lasciare sviluppare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere 100 μL della soluzione di arresto (7,5% H2SO4) per arrestare la reazione enzimatica.
    3. Leggere l'assorbanza a 450 nm di lunghezza d'onda utilizzando il lettore di micropiastre e ordinare i risultati in base al calcolo dell'indice di positività (IP).
      IP = Assorbanza del siero testato / Assorbanza del cut-off
      IP < 0.7: risultato negativo
      IP = 0,7: il test deve essere ripetuto entro 2 settimane
      IP > 0.7: risultato positivo
      NOTA: La formula IP è concepita in laboratorio e il valore 0.7 viene impostato dopo l'ottimizzazione. Per le reazioni duplicate, viene calcolato il valore medio dell'assorbanza. La diluizione sierica ottimale e la concentrazione di antigene sono stabilite con il metodo di titolazione a scacchiera ELISA (dati non mostrati). Valore soglia = OD (densità ottica) di un siero positivo di riferimento (diluito alla stessa diluizione del campione). Questo OD dovrebbe essere almeno tre volte superiore al valore OD del controllo negativo.

3. Fasi post-ELISA: valutazione dei risultati e convalida dei test

  1. La capacità dell'ELISA interno di diagnosticare specificamente l'infezione da M. pneumoniae nei pazienti testati viene valutata attraverso immunoblot supplementari utilizzando antigeni di M. pneumoniae e batteri eterologhi per confermare la positività dei sieri umani testati negli anticorpi di M. pneumoniae e la loro negatività negli altri batteri sospetti (dati non mostrati).

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Representative Results

L'attività immunoblotting dell'antisiero policlonale Mycoplasma pneumoniae non adsorbito a batteri eterologhi
La cross-reattività esiste effettivamente come mostrato nei risultati dell'immunoblotting (Figura 2) e rispetto al controllo positivo (Lane 1), alcuni degli antigeni di M. pneumoniae sono condivisi con i batteri schermati. L'intensità di queste reazioni crociate era variabile. Ad esempio, gli antigeni di M. gallisepticum e M. imitans hanno mostrato la più forte reattività con l'antisiero di M. pneumoniae (corsie 9 e 10), oltre ad essere micoplasmi aviari. Al contrario, nessuno dei due isolati clinici umani di Ureaplasma urealyticum ha mostrato alcuna reattività (corsie 7 e 8). Tuttavia, gli antigeni delle restanti specie genitali umane di Mycoplasma M. hominis, M. fermentans e M. genitalium hanno prodotto notevoli reazioni crociate con l'antisiero di M. pneumoniae (Lanes 11, 12 e 13, rispettivamente). Anche Escherichia coli (Lane 2), Pseudomonas aeruginosa (Lane 4) e Klebsiella pneumoniae (Lane 6) hanno reagito con anticorpi policlonali M. pneumoniae e il loro profilo antigenico era molto simile . Questo profilo era leggermente diverso da quelli delle due specie di batteri cocchi Streptococcus pneumoniae e Staphylococcusaureus; la reattività è stata minore con S. pneumoniae (Lane 3) e ancora minore con S.aureus (Lane 5).

Specificità degli anticorpi del Mycoplasma pneumoniae garantita dalla procedura di adsorbimento
Dopo l'adsorbimento dell'antisiero policlonale M . pneumoniae contro gli antigeni batterici eterologhi, la specificità è stata testata mediante immunoblotting (Figura 3). A parte alcune proteine dell'antigene di M. pneumoniae rivelate nella corsia 1 (controllo positivo), gli altri antigeni sono stati quasi completamente non rilevati (corsie 2-13). Le proteine rivelate nella corsia 1 sono in realtà le proteine specifiche rilevate dagli anticorpi specifici di M. pneumoniae che rimangono dopo l'adsorbimento. Sulla base di questo risultato, è stata dimostrata l'efficienza della procedura di adsorbimento, poiché sono state eliminate le reazioni non specifiche riscontrate dell'antisiero policlonale M. pneumoniae con gli antigeni eterologhi, descritti sopra. L'antisiero M. pneumoniae reso specifico è stato poi utilizzato in tutti i successivi test sierologici e immunoblotting.

Capture-antigene ELISA: Saggio valido per l'attività sierodiagnostica di laboratorio di routine
Poiché tutti i sieri sono stati testati in pozzetti duplicati per le diverse diluizioni, sono stati calcolati i valori medi OD ed è stato tracciato un grafico a barre che correla questi valori di assorbanza alle corrispondenti diluizioni di siero (Figura 4). Sulla base del calcolo IP, il set di sieri umani testati e presentati in questo articolo si è rivelato positivo per M. pneumoniae IgG. Diversi altri set di siero sono stati testati utilizzando questo ELISA fatto in casa, e ogni volta il test si è dimostrato efficace nel rilevare specificamente le IgG di M. pneumoniae e quindi distinguere i pazienti infetti da M. pneumoniae da quelli non infetti (dati non mostrati).

I risultati dell'ELISA sono sempre stati confermati da diverse analisi immunoblot che hanno mostrato simultaneamente la positività in M. pneumoniae e la negatività in tutti gli altri batteri di qualsiasi siero testato trovato positivo dall'antigene di cattura interno M. pneumoniae ELISA (dati non mostrati).

Figure 1
Figura 1: Presentazione schematica dell'ELISA di cattura dell'antigene sviluppato in laboratorio per la rilevazione specifica di Mycoplasma pneumoniae IgG. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi immunoblot delle reazioni crociate tra Mycoplasma pneumoniae e un insieme di batteri eterologhi. La reattività dell'antisiero policlonale non adsorbito di M. pneumoniae è stata testata contro antigeni di Escherichia coli (corsia 2), Streptococcus pneumoniae (corsia 3), Pseudomonas aeruginosa (corsia 4), Staphylococcus aureus (corsia 5), Klebsiella pneumoniae (corsia 6), due isolati di Ureaplasma urealyticum (corsia 7 e 8), M. imitans (corsia 9), M. gallisepticum (corsia 10), M. hominis (corsia 11), M. fermentans (corsia 12) e M. genitalium (corsia 13). Corsia 1: M. pneumoniae (controllo positivo). I pesi molecolari di alcune delle principali proteine di M. pneumoniae sono stati dati sulla sinistra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Conferma immunoblot dell'efficienza della procedura di adsorbimento per eliminare le reazioni crociate. Reattività di tutti i batteri eterologhi selezionati; Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, due isolati di Ureaplasma urealyticum, M. imitans, M. gallisepticum, M. hominis, M. fermentans e M. genitalium (Lanes 2-13, rispettivamente) sono stati testati contro l'antisiero policlonale adsorbito M. pneumoniae. L'antigene di M. pneumoniae è stato caricato nella corsia 1 come controllo positivo (sono state rivelate solo proteine specifiche). Lane MW: scala proteica pre-colorata. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Risultati dell'ELISA di cattura dell'antigene. L'ELISA è stato eseguito utilizzando l'antisiero policlonale adsorbito Mycoplasma pneumoniae come agente di rivestimento. I grafici a barre 1 e 2 rappresentano rispettivamente i controlli negativi e positivi. I grafici a barre 3-13 raffigurano i sieri di un gruppo di pazienti testati. Ogni siero è stato testato a tre diverse diluizioni: 1/200 (barre viola), 1/400 (barre arancioni) e 1/800 (barre blu). I valori OD servivano a calcolare l'indice di positività. Ogni reazione è stata eseguita in duplicato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Microrganismo Sforzo* Medio Riferimento
Specie di Mycoplasma e ureaplasma Mycoplasma pneumoniae ATCC 160 20030 SP4 [35]
Mycoplasma genitalium CIP 103767T SP4
Mycoplasma fermentans ATCC 160 20026 SP4
Mycoplasma hominis CIP 103715T SP4 integrato con arginina
Ureaplasma urealyticum 2 isolati clinici** SP4 integrato con urea
Mycoplasma gallisepticum CIP S6 15302 Frey [36]
Mycoplasma imitans ATCC 160 20037 Frey
Altri batteri Escherichia coli ATCC 25922 Brodo LB [37]
Klebsiella pneumoniae Isolato clinico*** Brodo LB
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Brodo LB
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Brodo LB
Streptococcus pneumoniae Isolato clinico*** Brodo di sangue
* ATCC: American Type Culture Collection, CIP: Collection Institut Pasteur
** Gli isolati sono stati raccolti da campioni clinici inviati volontariamente al Laboratorio di Micoplasmi (Istituto Pasteur di Tunisi) per la diagnostica di routine
Gli isolati sono stati raccolti da campioni clinici inviati volontariamente al Laboratorio di Batteriologia (Istituto Pasteur di Tunisi) per la diagnostica di routine

Tabella 1: Elenco dei ceppi batterici utilizzati in questo studio.

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Discussion

Questo documento presenta una descrizione generale di un ELISA interno sviluppato principalmente per garantire uno screening specifico di M. pneumoniae Infezione. Vengono forniti i dettagli sul protocollo del test ELISA stesso e alcune fasi di pre e post-elaborazione. La specificità di questo test è assicurata dalla tecnica di adsorbimento. Questa procedura è stata precedentemente descritta nei test ELISA sviluppati per la diagnosi di esseri umani e aviari Mycoplasmas17,24. È stato anche impiegato nei saggi ELISA per la diagnosi di altre infezioni batteriche come la malattia di Lyme25. In questi tre articoli, l'adsorbimento ha dimostrato di aiutare ad aumentare la specificità di ELISA senza scarificare o diminuire la sensibilità17,24,25. Nel caso del presente test ELISA, le specie batteriche appropriate selezionate per l'adsorbimento possono essere suddivise in due gruppi: il primo gruppo contiene alcune specie patogene umane e aviarie di Mollicutes (M. genitalium, M. fermentans, M. hominis, U. urealyticum, M. gallisepticume M. imitans), mentre il secondo contiene i batteri più frequenti noti per infettare l'uomo (E. coli, P. aeruginosae S. aureus) e quelli notoriamente noti per il loro tropismo alle vie respiratorie (K. pneumoniae e S. pneumoniae). L'ampia selezione di batteri eterologhi si basava sul fatto che il dogma della specificità delle specie e degli organi non è più rispettato. Molti rapporti sul rilevamento di microrganismi in habitat sconosciuti sono stati precedentemente pubblicati. Per esempio M. pneumoniae è stato isolato da molti siti extra-polmonari e trovato per essere associato a una vasta gamma di complicanze extra-polmonari con sintomi da lievi a gravi, anche se si presumeva che fosse specifico per il tratto respiratorio.6,7. Il caso opposto (isolamento genitale Mycoplasma specie delle vie respiratorie) è stato segnalato per M. hominis e M. fermentans26,27. L'inclusione di aviaria Mycoplasma SPP. nel test di sierodiagnosi dell'infezione umana si basava su studi precedenti che riportavano la possibilità di infezione di esseri umani (in particolare persone immunocompromesse e veterinari) con Mycoplasma spp. originato da animali domestici28,29,30. È vero che, fino ad ora, non è stato trovato alcun documento che evocasse l'isolamento di M. gallisepticum e M. imitans (le due specie incluse nella procedura di adsorbimento in questo articolo) dall'uomo. Nonostante questo, nulla è impossibile, soprattutto perché queste specie sono tra le specie più regolarmente gestite dai veterinari e sono filogeneticamente troppo vicine a M. pneumoniae. Infatti, questi due aviari Mycoplasma hanno mostrato la più forte reattività con M. pneumoniae antisiero (come illustrato in Figura 2). In breve, durante la progettazione della procedura di adsorbimento, uno spettro relativamente ampio di batteri sospetti che potrebbero condividere antigeni con M. pneumoniae è stato incluso. Le scelte fatte si sono basate sulla correlazione filogenetica e sul tropismo con le vie respiratorie. Tuttavia, a causa della diversità della flora umana e della variabilità antigenica, è impossibile prevedere e includere tutte le possibili specie batteriche eterologhe e ceppi che potrebbero reagire in modo incrociato con M. pneumoniae anticorpi. Pertanto, la possibilità di una reazione incrociata tra M. pneumoniae antisiero, anche dopo l'adsorbimento, e altri batteri rimane probabile. Inoltre, dal momento che M. pneumoniae è comunemente noto per infettare bambini e giovani adulti, la procedura di adsorbimento può essere ulteriormente migliorata in futuro con l'aggiunta di altri patogeni respiratori pediatrici come Haemophilus influenzae31 e Streptococcus pyogenes32 nella shortlist dei batteri di adsorbimento.

Lo scopo di questo ELISA è quello di rilevare la presenza dell'anticorpo bersaglio (specifico M. pneumoniae-IgG) nei sieri umani. Quindi, per poter utilizzare il siero come campione (poiché è il più facile da raccogliere e il meno doloroso per i pazienti) sia per garantire la specificità, l'ELISA interno si basa sul principio di due tipi di ELISA: ELISA indiretto e ELISA a sandwich. Il campione di siero (anticorpo primario) è legato tra l'anticorpo di rilevazione (marcato secondo anticorpo) e l'antigene di cattura, che era specificamente legato all'anticorpo di cattura (precedentemente reso specifico dall'adsorbimento e immobilizzato sulla superficie della micropiastra). Date queste caratteristiche uniche, si ritiene che questo ELISA sia efficace e speciale. Tuttavia, questo test non è perfetto e possono verificarsi problemi. Si possono ancora riscontrare risultati falsi positivi e falsi negativi, a volte a causa della qualità del siero o della fase di infezione, a volte a causa di errori durante l'applicazione del protocollo in laboratorio. Ad esempio, i risultati della sierodiagnosi ELISA possono essere influenzati anche se i pozzetti non sono sufficientemente lavati. Inoltre, l'incubazione (temperatura e tempo) potrebbe influenzare i risultati del test. Anche la selezione delle micropiastre e dell'agente bloccante è stata segnalata come un passo critico durante lo sviluppo di ELISA33,34. Per tutti questi motivi, è importante lavorare continuamente per migliorare questo test ELISA al fine di determinare i parametri e le condizioni ottimali, come la diluizione dei diversi anticorpi (campioni di siero, anticorpi di cattura, anticorpi di rilevazione), le fasi di incubazione e lavaggio e l'inclusione degli opportuni controlli negativi e positivi.

La coltura dei batteri e la produzione dei loro antigeni per eseguire la procedura di adsorbimento potrebbe essere considerata un passo pesante, soprattutto per le specie di Mollicutes. Tuttavia, si ritiene che questo sia importante in quanto questo passaggio aiuta notevolmente a migliorare la specificità ELISA e ad evitare ulteriori test di conferma come immunoblotting o PCR. Inoltre, nel contesto dell'infezione da M. pneumoniae, è sicuramente necessaria una diagnosi efficace e affidabile al fine di stabilire una terapia antibiotica adeguata e appropriata, in quanto l'uso di farmaci beta-lattamici nel trattamento della polmonite acquisita in comunità è inefficace contro M. pneumoniae8. Dopo anni di utilizzo in attività diagnostica di routine in laboratorio, si ritiene che l'ELISA di cattura dell'antigene, descritto in questo articolo, rappresenti un valido strumento per lo screening specifico dell'infezione da M. pneumoniae.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che non vi sono interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dal Ministero della Salute tunisino e dal Ministero tunisino dell'Istruzione Superiore e della Ricerca Scientifica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-chloro-1-naphtol Sigma-Aldrich C6788-50 TAB
Bacto peptone BD 211677
Bacto tryptone BD 211705
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9647-50 G
Carbonate bicarbonate buffer Sigma-Aldrich C3041-50 Cap
Casein Sigma-Aldrich C7078-1 KG
CMRL1066  VWR P0058-N1L
D-Glucose Sigma-Aldrich G7528-1KG
Difco PPLO Broth BD 255420 Frey media
ELISA plate-Reader MULTISKAN GO, Thermo Scientific Ref: 51119200
Fetal bovine serum Capricorn Scientific FBS-12A
Goat peroxidase-conjugated anti-human IgG Abcam ab6759
Goat peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG Life Technologies 656120
Hydrochloric Acid 37% Prolab 2025.290
Hydrogen peroxide (H2O2), solution 30% Scharlau HI01361000
L-arginin Sigma-Aldrich A5006-1KG
LB broth Prepared in Pasteur Institute of Tunis Provided by the laboratory of bacteriology of the Pasteur Institute of Tunis
Mycoplasma pneumoniae polyclonal antiserum produced in rabbit Produced in Pasteur Institute of Tunis Serum was produced by rabbit immunization at the Pasteur Institute of Tunis
Nicotinamide adenine dinucleotide Sigma-Aldrich N7004-10G
Nunc Maxisorp flat-bottom 96-well microtiter plate  Invitrogen 44-2404-21
Penicillin G sodium (1 MIU) PANPHARMA
Phenol red fluka chemika 77660
Skim milk MP Biomedicals 902887
Sodium bicarbonate  Sigma-Aldrich S6297-1KG
Sodium carbonate Sigma-Aldrich S7795-1KG
Sodium chloride (NaCl) Novachim PS02805
Sulfuric acid (H2SO4) 95-97% Merck 1007311011
Thimerosal USB 22215
TMB substrate (3,3’, 5,5’ TetraMethyl-Benzidine solution) Abcam ab142042
Trizma base Sigma-Aldrich T6791-1 KG
Tween 20 Sigma-Aldrich 1379-500 ML
Yeast extract, powder, Ultrapure Thermo Scientific  J23547 

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Biologia Numero 192
Saggio immunoassorbente legato all'enzima di cattura dell'antigene per la rilevazione specifica di <em>Mycoplasma pneumoniae</em>
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Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui,… More

Yacoub, E., Chniba, I., Khadraoui, N., Mlik, B., Ben Abdelmoumen Mardassi, B. Antigen-Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Specific Detection of Mycoplasma pneumoniae. J. Vis. Exp. (192), e64645, doi:10.3791/64645 (2023).

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