Summary
Her tester vi opløsningen af Rhodiola granulat (RG) in vitro, tegner opløsningskurver af salidrosid, gallinsyre og ethylgallat i ultrarent vand og tilpasser kurverne til forskellige matematiske modeller. Denne protokol indeholder oplysninger og vejledning om in vivo bioækvivalens- og in vivo-in vitro-korrelationsundersøgelser af RG.
Abstract
Sammensætningen af den tibetanske medicin Rhodiola granulat (RG) er kompleks, og den samlede kvalitet af RG er vanskelig at bestemme. Derfor er etablering af en metode til bestemmelse af multikomponent in vitro-opløsning af RG af stor betydning for kvalitetskontrol. Denne undersøgelse bruger den anden padlemetode i den fjerde generelle regel 0931 fra den kinesiske farmakopé (2020-udgave), i overensstemmelse med apparat 2 i United States Pharmacopeia (USP). Opløsningsapparatet blev indstillet til en rotationshastighed på 100 o / min med ultrarent vand som opløsningsmedium. Et prøvevolumen på 1 ml blev indsamlet på hvert tidspunkt. Desuden blev den kumulative opløsning af gallinsyre, salidrosid og ethylgallinsyre i RG på forskellige tidspunkter bestemt ved højtydende væskekromatografi (HPLC). Endelig blev opløsningskurverne tegnet, og kurverne blev tilpasset GompertzMod, Gompertz, Logistic og Weibull ligningerne. Resultaterne viste, at den kumulative opløsning af gallinsyre i RG var over 80% efter 1 min, den kumulative opløsning af salidrosid og ethylgallinsyre var over 65% efter 5 min, og den kumulative opløsning af hver indekskomponent faldt efter 30 min. Kurvetilpasningen viste, at GompertzMod-ligningen var den bedst passende model for hver indekskomponent i RG. Afslutningsvis er opløsningstestmetoden beskrevet i denne protokol enkel, nøjagtig og pålidelig. Det kan karakterisere opløsningsadfærden af indekskomponenterne i RG in vitro, hvilket giver en metodologisk reference til kvalitetskontrol af RG og kvalitetsevaluering af andre etniske forbindelser.
Introduction
I Kina fortsætter forekomsten af hjerte-kar-sygdomme med at stige, og sygeligheden og dødeligheden af hjerte-kar-sygdomme rangerer først blandt kinesiske beboere1. Angina pectoris af koronar hjertesygdom er forårsaget af luminal stenose på grund af koronar aterosklerose, hvilket fører til relativt utilstrækkelig koronar blodforsyning og myokardieiskæmi og hypoxi2. I de senere år er den helbredende virkning af traditionel kinesisk medicin til behandling af koronar hjertesygdom blevet anerkendt af mange læger3.
Traditionel kinesisk medicin spiller en vigtig rolle i at lindre kliniske symptomer og forbedre patienternes livskvalitet4. Rhodiola granulat (RG) ekstraheres og raffineres fra den tibetanske plateau lægeplante Rhodiola rosea L. Hovedkomponenterne i RG er salidrosid, rhodiosin og flavonoider 5,6. RG har den virkning at supplere Qi7 og aktivere og fremme blodcirkulationen for at lindre smerter. Klinisk bruges det til behandling af brystobstruktioner forårsaget af Qi-mangel og blodstasis, koronar hjertesygdom, angina pectoris8. Indholdsbestemmelse alene afspejler ikke fuldt ud lægemidlernes iboende kvalitet, da både opløsning og opløsning in vitro kan påvirke biotilgængeligheden og effektiviteten af lægemidlerne 9,10. Inspektionsmetoderne til opløsning af kinesisk medicin omfatter rotationskurvmetoden, padlemetoden og småkopmetoden. Ulempen ved den roterende kurvmetode er, at kun den ydre del af den roterende kurv kommer i kontakt med opløsningsmediet under rotation, hvilket ikke afspejler opløsningsadfærden i den virkelige verden. Padlemetoden kan overvinde ovenstående mangel, hvilket gør den mere velegnet end kurvmetoden til nogle solide kinesiske medicinpræparater11. På nuværende tidspunkt foreligger der ingen rapport om in vitro-opløsningsanalysen af RG. For at kontrollere kvaliteten af RG mere omfattende blev opløsningsadfærden af de tre indekskomponenter (gallinsyre, salidrosid og ethylgallat) i RG undersøgt. Denne undersøgelse giver data til kvalitetskontrol af RG og en metodologisk reference til kvalitetsevaluering af andre etniske sammensatte præparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af opløsning
- Stamopløsningen af referencestoffet fremstilles: 10,6 mg salidrosid, 5,24 mg gallinsyre og 5,21 mg gallinethylgallinsyre afvejes separat på en elektronisk analysevægt, og de tilsættes enkeltvis i en 5 ml målekolbe. Derefter tilsættes methanol af HPLC-kvalitet for at opløses og fortyndes til 5 ml. Til sidst rystes stamopløsningen grundigt for at opnå stamopløsningen med massekoncentrationer på henholdsvis 2,120 mg/ml, 1,048 mg/ml og 1,042 mg/ml.
BEMÆRK: Stamopløsningen af referencestoffet indeholder 2,120 mg/ml salidrosid, 1,048 mg/ml gallinsyre og 1,042 mg/ml ethylgallat som stamopløsning af hver opløsning i den efterfølgende standardkurve. - Forbered analyseprøveopløsningen. Uddrag 2,8 g RG (materialetabel) med 10 ml methanol af HPLC-kvalitet ved hjælp af en ultralydsrensningsmaskine (effekt: 200 W, frekvens: 40 kHz) i 30 minutter, og filtrer den derefter med et 0,22 μm filter til systemtilpasningstesten.
- Der fremstilles en blandet referenceopløsning, der indeholder 0,590 mg/ml salidrosid, 2,030 mg/ml gallinsyre og 1,930 mg/ml ethylgallat.
BEMÆRK: Hver standard (2,950 mg salidrosid, 10,150 mg gallinsyre og 9,650 mg ethylgallinsyre) opløses i en 5 ml målekolbe i HPLC-methanol som opløsningsmedium. - Få det teoretiske indhold af hver karakteristisk komponent i RG til ultraren vandekstraktion.
- Anbring 2,8 g RG i en 500 ml konisk kolbe, tilsæt 200 ml ultrarent vand og ultralydekstrakt (effekt: 200 W, frekvens: 40 kHz) i 60 min. Derefter filtreres det med et 0,22 μm filter.
- Indholdet af testopløsningen bestemmes i overensstemmelse med den lineære ligning opnået i det følgende eksperiment.
2. Kromatografisk tilstand
- De kromatografiske betingelser som vist i tabel 1 indstilles for højtydende væskekromatografi. For detaljer om det anvendte instrument henvises til materialetabellen.
3. Test af systemets tilpasningsevne
- Undersøg det lineære forhold.
- Stamopløsningerne af gallinsyre og ethylgallat fortyndes med 5, 10, 25, 50 og 125 gange og referencestamopløsningerne af salidrosid med 2, 4, 8, 16 og 32 gange for at opnå gradientkoncentrationsopløsningen til tegning af en standardkurve.
BEMÆRK: Standardkurvens fortyndingsforhold justeres i henhold til det indledende forsøg med prøvebehandlingen. I det indledende forsøg blev stamopløsningerne af de tre standarder først fortyndet 5, 10, 25, 50 og 125 gange, og derefter blev den første standardkurve plottet. Da koncentrationen af testprøven blev detekteret, blev det imidlertid konstateret, at koncentrationerne af salidrosid ikke faldt inden for det lineære område for denne standardkurve, og koncentrationerne blev derfor justeret for at inkludere dem i kurven. Sammenfattende blev ovennævnte indledende forsøg anvendt til at bestemme de endelige fortyndingskoncentrationer af de tre testprøver til efterfølgende eksperimentelle undersøgelser.
- Stamopløsningerne af gallinsyre og ethylgallat fortyndes med 5, 10, 25, 50 og 125 gange og referencestamopløsningerne af salidrosid med 2, 4, 8, 16 og 32 gange for at opnå gradientkoncentrationsopløsningen til tegning af en standardkurve.
- Præcisionstest: 10 μL af den blandede referenceopløsning injiceres i HPLC-systemet seks gange dagligt, og prøverne udføres under de samme HPLC-betingelser, som beskrevet i trin 2.1. Optag topområdet for hver funktionskomponent.
- Stabilitetstestforsøg: Der indsprøjtes 10 μL af den fremstillede prøveopløsning, og HPLC's toparealer bestemmes efter de kromatografiske betingelser efter henholdsvis 0 timer, 6 timer, 10 timer, 12 timer, 14 timer, 16 timer, 18 timer, 20 timer og 24 timer.
BEMÆRK: Toparealerne registreres automatisk af HPLC-systemet. - Reproducerbarhedstest: Der udtages seks prøver af samme batch RG til fremstilling af analyseprøveopløsningen efter metoden i trin 1.2. Der injiceres 10 μL af hver prøve i HPLC-systemet. Prøverne køres som beskrevet i trin 2.1, og reproducerbarheden bestemmes.
BEMÆRK: Repeterbarheden blev evalueret ved at sammenligne koncentrationsforskellene mellem de seks prøver. - Eksperiment med genopretning
- Der fremstilles seks portioner af samme batch RG til analyseopløsningen. Derefter tilsættes ca. 50 % af referencestoffet for hver indekskomponent i testopløsningen for at beregne genfindingsprocenten. Disse prøver køres i HPLC-systemet under de samme betingelser, som er beskrevet i trin 2.1.
- Beregn inddrivelseshastigheden.
BEMÆRK: Genfindingshastighed = (C - A) / B x 100, hvor A er mængden af komponent, der skal måles i testopløsningen, B er mængden af tilsat referencestof, og C er den målte værdi af opløsningen indeholdende referencestoffet og RG-prøven. Se trin 2.1 for de kromatografiske betingelser for at udføre ovenstående trin (dvs. trin 3.1-3.5).
4. In vitro opløsningstest
- Udfør opløsningstesten ved hjælp af padlemetoden i den anden metode i den generelle regel 0931 fra den kinesiske farmakopé (2020-udgave)12.
BEMÆRK: Prøveudtagningsteknik og udstyr: Lægemiddelopløsningsapparatet (materialetabel) har en opløsningskop, en padle, et temperaturstyringssystem og et hastighedsjusteringssystem. Før opløsningseksperimentet påbegyndes, forvarmes vandet til en indstillet temperatur, og derefter indstilles den tilsvarende hastighed. Start med at registrere tiden umiddelbart efter tilføjelse af RG. - Tilsæt 100 ml ultrarent vand i opløsningskoppen i lægemiddelopløsningsapparatet og hold temperaturen på 37 °C ± 0,5 °C. Indstil rotationshastigheden til 100 o / min.
BEMÆRK: Opløsningsapparatet har en varmeanordning, der gør det muligt at indstille temperaturen i systemet. Der var ingen signifikant forskel i opløsningshastigheden af salidrosid i vand, kunstig mavesaft (16,4 ml fortyndet saltsyre [234 ml koncentreret saltsyre fortyndet til 1000 ml med vand] med ca. 800 ml vand og 10 g pepsin, godt rystet og fortyndet med vand til 1.000 ml) og kunstig tarmsaft (fosfatbuffer [pH 6,8] indeholdende trypsin)13. Det lettest tilgængelige vand (ultrarent) blev valgt som opløsningsmedium. - Tilsæt 2,8 g RG i en opløsningskop og begynd straks at registrere opløsningens varighed. I alt 1 ml af prøven opsamles med en injektor (se materialetabellen) efter 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min og 60 min, og der fyldes straks op i volumen i opløsningskoppen med opløsningsmediet ved samme temperatur.
BEMÆRK: Prøvetagningsrøret i opløsningskoppen kan ikke opsamle små prøvevolumener, så injektoren bruges til at opsamle prøven. Prøver skal indsamles hurtigt for at undgå at gå glip af specificerede indsamlingstidspunkter. - De indsamlede prøver filtreres straks gennem en 0,22 μm mikroporøs membran og tages det efterfølgende filtrat. Bestem indholdet af hver komponent på hvert tidspunkt ved HPLC (som pr. trin 2.1), og beregn den kumulative opløsning.
- For at beregne den kumulative opløsning beregnes opløsningen af hvert tidspunkt (Xn):
Xn = A / B x 100, hvor A er mængden af komponenter målt på hvert tidspunkt og B er det teoretiske indhold af hver komponent. - Beregn derefter den kumulative opløsning (Y):
Y = X n + (X 1 + ... + X n-1) x V 2 / V 1, hvor V1 er det samlede volumen af opløsningsmediet og V 2 er volumenet af opløst stof tilsat efter hver prøveudtagning.
BEMÆRK: På grund af de lave responsværdier for salidrosid og gallinsyre i kromatogrammet blev den kumulative opløsning af salidrosid og ethylgallat ved tidspunktet 1 min ikke plottet ind i opløsningskurven.
- For at beregne den kumulative opløsning beregnes opløsningen af hvert tidspunkt (Xn):
5. Tilpasning af opløsningsmodellen
- Importer de kumulative opløsningsdata på hvert tidspunkt til dataanalysesoftwaren.
- Brug plug-in'et til analyse af lægemiddelopløsning i dataanalysesoftwaren til at tilpasse GompertzMod-ligningen, Gompertz-ligningen, den logistiske ligning og Weibull-ligningen14. Jo større værdien af R2 er, desto bedre er den kurvetilpasningseffekt.
- Start softwaren, vælg vinduet Book1 for at åbne vinduet Redigering af Origin-data.
- I den første kolonne A(X)-Lang navneinputtid skal du definere tid som tid og indtaste hver opløsningsbestemmelsestid. Inputdata i anden kolonne B(Y)-Langt navn, definer data som den kumulative opløsning, indtast den kumulative opløsningsprocent for hver opløsningsbestemmelsestid.
- Efter dataindtastning skal du vælge kolonnen A(X) og B(Y) og vælge plug-in'en Drug Dissolution Analysis i softwaremenulinjen og klikke på Fit Dissolution Data > Concatenate Fit > OK. Softwaren genererer tilpasningsresultaterne for hver model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse var præcisionen, stabiliteten, repeterbarheden og prøvegenvindingen af RG alle inden for det metodologiske interval, der er specificeret i kinesisk farmakopé (bind 4, 2020)12, hvilket indikerer, at metoden var mulig. Efter gentagen fejlfinding blev det fastslået, at elueringsgradienten, der blev anvendt i denne undersøgelse, havde god opløsning (figur 1) for de tre indekskomponenter i RG. De tre indekskomponenter i RG havde et godt lineært forhold inden for et specifikt koncentrationsområde (tabel 2). Præcisionstestresultaterne (tabel 3) viste, at den relative standardafvigelse (RSD) for toparealerne af salidrosid, gallinsyre og ethylgallat var henholdsvis 1,95%, 2,83% og 1,42%, hvilket indikerer, at instrumentets præcision var god. Stabilitetstestresultaterne (tabel 4) viste, at RSD for topområderne af salidrosid, gallinsyre og ethylgallat var henholdsvis 2,37%, 2,47% og 2,82%, hvilket tyder på, at prøveopløsningen var stabil inden for 24 timer. Repeterbarhedstestresultaterne (tabel 5) viste, at RSD'erne for topområderne af salidrosid, gallinsyre og ethylgallat var henholdsvis 2,79%, 2,67% og 1,55%, hvilket viste, at repeterbarheden af denne metode var god. Resultaterne af genvindingseksperimentet viste, at de gennemsnitlige genvindinger af salidrosid, gallinsyre og ethylgallat var henholdsvis 99,91%, 100,40% og 102,80% (tabel 6).
In vitro-opløsningseksperimentet i denne undersøgelse var at bestemme indholdet af tre karakteristiske komponenter (salidrosid, gallinsyre og ethylgallat) i RG-prøver på hvert tidspunkt ved HPLC og derefter beregne den kumulative opløsning. Opløsningskurverne for hver komponent er vist i figur 2. Efter at prøven blev sat i opløsningskoppen, var den kumulative opløsning af gallinsyre i RG over 80% efter 1 min. Den kumulative opløsning af salidrosid og ethylgallinsyre var over 65% efter 5 min, hvilket afspejles i dataene, at hver indekskomponent kunne opløses over 60% efter 5 min. Den kumulative opløsning af hver indekskomponent faldt imidlertid efter 30 min. Endvidere blev opløsningskurverne tilpasset GompertzMod-ligningen, Gompertz-ligningen, den logistiske ligning og Weibull-ligningen. Resultaterne viste, at GompertzMod-ligningen var den bedst egnede model for de tre indekskomponenter (salidrosid, gallinsyre og ethylgallat) i RG. Resultaterne af opløsningsmodellens tilpasning af tre indekskomponenter i RG er vist i tabel 7.
Figur 1: Repræsentative kromatogrammer for de tre karakteristiske komponenter efter indstilling af de kromatografiske betingelser, der er nævnt i trin 2.1 (n = 1). A) Kromatogrammet for prøveopløsningen. Peak 1 er gallinsyre, peak 2 er salidrosid, og peak 3 er ethylgallat. B) Referenceopløsningens kromatogram. Peak 1 er gallinsyre, peak 2 er salidrosid, og peak 3 er ethylgallat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opløsningskurve for karakteristiske komponenter (n = 4). (A) Kumulativ opløsning af gallinsyre 1 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min og 60 min efter administration. (B) Kumulativ opløsning af salidrosid 5 min, 10 min, 20 min, 30 min og 60 min efter administration. C) Kumulativ opløsning af ethylgallat 5 min, 10 min, 20 min, 30 minutter og 60 minutter efter administration. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Betingelse | Parameter |
| Kromatografisk søjle | C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) |
| Mobil fase | Acetonitril (A)-0,2% eddikesyre (B) |
| Eluering af forløb | 0–5min, 0%–4%A; 5–15min, 4%–5%A; 15–20min, 5%–7%A; 20–30min, 7%–14%A; 30–40min, 14%–13%A; 40–45min, 13%–4%A |
| Strømningshastighed | 1,0 ml/min |
| Kolonne temperatur | 30 °C |
| Registrering af bølgelængde | 275 nm |
| Prøvevolumen | 10 μL |
Tabel 1: De kromatografiske betingelser, der er fastsat i dette eksperiment. Tabellen viser detaljerne om den kromatografiske kolonne, den mobile fase, gradientelueringen, strømningshastigheden, søjletemperaturen, detektionsbølgelængden og prøvevolumenet.
| Indeks komponenter | Lineær ligning | R2 | Linearitetsområde (mg/ml) |
| Salidroside | Y = 2221X - 19,742 | 0.9996 | 0.06625–2.12 |
| Gallinsyre | Y = 29497X - 224 | 0.9997 | 0.008384–1.048 |
| Ethylgallat | Y = 28902X - 86,171 | 0.9999 | 0.008336–1.042 |
Tabel 2: Det lineære forhold mellem indekskomponenterne i RG. De tre indekskomponenter i RG havde et godt lineært forhold i et specifikt koncentrationsområde.
| Spidsareal for indekskomponenter | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD % |
| Salidroside | 900.6 | 917.4 | 899.8 | 917.4 | 940.1 | 890.5 | 1.95 |
| Gallinsyre | 6430.2 | 6544.2 | 6281.2 | 6327.7 | 6142.5 | 6636.9 | 2.83 |
| Ethylgallat | 12748.9 | 12833.1 | 13190.4 | 13152.3 | 13128.3 | 13090.5 | 1.42 |
Tabel 3: Resultaterne af præcisionsmålingen. RSD for toparealerne af salidrosid, gallinsyre og ethylgallat var 1,95%, 2,83% og 1,42% (n = 6).
| Spidsareal for indekskomponenter | 0 timer | 6 timer | 12 timer | 18 timer | 21 timer | 24 timer | RSD % |
| Salidroside | 486.6 | 509 | 479 | 505.1 | 502.8 | 492 | 2.37 |
| Gallinsyre | 3236.5 | 3359.8 | 3152.2 | 3347.6 | 3337 | 3319.9 | 2.47 |
| Ethylgallat | 442 | 413 | 421 | 429 | 443.8 | 436 | 2.82 |
Tabel 4: Resultaterne af stabilitetstesten. RSD for topområderne af salidrosid, gallinsyre og ethylgallat var 2,37%, 2,47% og 2,82% (n = 6).
| Spidsareal for indekskomponenter | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD % |
| Salidroside | 1337.3 | 1276.5 | 1283.7 | 1286.8 | 1242.6 | 1237.2 | 2.83 |
| Gallinsyre | 8432.1 | 8976.1 | 8792 | 9083.1 | 9040.2 | 8751.4 | 2.74 |
| Ethylgallat | 422.8 | 415.3 | 421.9 | 416.3 | 428.9 | 406.1 | 1.87 |
Tabel 5: Resultaterne af reproducerbarhedstesten. RSD for topområderne af salidrosid, gallinsyre og ethylgallat var 2,83%, 2,74% og 1,87% (n = 6).
| Kendt indhold (mg) | Tilføjelse af mængde (mg) | Målemængde (mg) | Inddrivelser (%) | Gennemsnitlige inddrivelser (%) | RSD (%) |
| 0.5838 | 0.406 | 0.9783 | 97.18 | 99.91 | 2.70 |
| 0.5743 | 0.406 | 0.9984 | 104.47 | ||
| 0.5751 | 0.406 | 0.9755 | 98.63 | ||
| 0.5764 | 0.406 | 0.9776 | 98.81 | ||
| 0.5906 | 0.406 | 0.991 | 98.6 | ||
| 0.5802 | 0.406 | 0.9934 | 101.77 | ||
| 0.1234 | 0.118 | 0.2424 | 100.87 | 100.4 | 1.67 |
| 0.1214 | 0.118 | 0.2428 | 102.85 | ||
| 0.1216 | 0.118 | 0.2396 | 100 | ||
| 0.1218 | 0.118 | 0.2389 | 99.19 | ||
| 0.1249 | 0.118 | 0.2406 | 98.09 | ||
| 0.1226 | 0.118 | 0.2423 | 101.4 | ||
| 0.0221 | 0.386 | 0.4232 | 103.91 | 103.8 | 2.02 |
| 0.0218 | 0.386 | 0.4115 | 100.97 | ||
| 0.0218 | 0.386 | 0.4176 | 102.55 | ||
| 0.0218 | 0.386 | 0.4337 | 106.7 | ||
| 0.0224 | 0.386 | 0.4302 | 105.65 | ||
| 0.022 | 0.386 | 0.4198 | 103.05 |
Tabel 6: Resultaterne af målingen af prøvegenvindingsgraden. RSD for genvindingshastigheden for salidrosid, gallinsyre og ethylgallat var henholdsvis 2,70%, 1,67% og 2,02%.
| Indeks komponenter | Opløsning ligning | R2 |
| Gallinsyre | GompertzMod | 0.4978 |
| Gompertz | 0.3740 | |
| Logistik | 0.3739 | |
| Weibull | 0.3739 | |
| Salidroside | GompertzMod | 0.9894 |
| Gompertz | 0.9783 | |
| Logistik | 0.9781 | |
| Weibull | 0.9781 | |
| Ethylgallat | GompertzMod | 0.9895 |
| Gompertz | 0.9852 | |
| Logistik | 0.9853 | |
| Weibull | 0.9853 |
Tabel 7: Kurvetilpasningsresultater af opløsningsmodellen af tre indekskomponenter i ultrarent vand. Tilpasningsresultaterne for hver indekskomponent i RG var de bedste med GompertzMod-ligningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Opløsningstesten er en ideel in vitro-metode til simulering af opløsning og opløsning af faste orale præparater i mave-tarmkanalen15. Det er et vigtigt indeks til evaluering og kontrol af kvaliteten af faste orale præparater. Derfor spiller opløsningstesten en væsentlig rolle i udviklingen af faste orale lægemidler16. Især med udviklingen af traditionel kinesisk medicin (TCM) kvalitetskontrolteknologi er bestemmelsen af opløsning gradvist blevet anvendt til screeningsundersøgelser af kinesiske og etniske medicinforbindelsespræparater17,18.
I øjeblikket er bestemmelsen af opløsningen af TCM og etnisk medicin in vitro hovedsageligt baseret på påvisning af en enkelt indekskomponent. Imidlertid er den faste fremstilling af traditionel kinesisk medicin og etnisk medicin kompleks, og deres opløsning påvirkes af mange faktorer (f.eks. Temperatur, opløsningsmedium osv.) og deres komplekse kemiske sammensætning19,20. Derfor kan detektion af multiindekskomponenter bedre afspejle den gensidige indflydelse og opløsningsforskel mellem forskellige komponenter. I dette papir blev in vitro-opløsningstesten af de tre indekskomponenter (gallinsyre, salidrosid og ethylgallat) i RG målt, og opløsningskurverne for disse tre karakteristiske komponenter blev plottet, hvilket gav en reference til kvalitetskontrol af RG.
Under eksperimentet skal følgende to punkter især bemærkes. For det første bør der ved prøveudtagning til opløsningstesten i henhold til den kinesiske farmakopé 2020 udgave12 genopfyldes et tilsvarende volumen opløsningsmedium ved en temperatur på 37 °C ± 0,5 °C umiddelbart efter prøveindsamling, hvilket er det vigtigste trin i den eksperimentelle proces. For det andet skal prøverne indsamles fra et område midtvejs mellem bladets top og overfladen af opløsningsmediet, ~ 10 mm fra opløsningskoppens indre væg. Dette skyldes, at der er en koncentrationsgradient fra starten af opløsningen af lægemidlet til tidspunktet for fuldstændig opløsning. Koncentrationsgradienten er omvendt proportional med omrøringshastigheden, så koncentrationen af opløst stof er højest nær det uopløste lægemiddel og den laveste, hvor omrøringen er svag. Derfor bør prøveudtagning i disse to yderpunkter undgås21.
Selvom påvisning af multiindekskomponenter bedre kan afspejle opløsningsvariationen af forskellige komponenter i TCM/etnisk medicinsammensatte formuleringer sammenlignet med påvisning af enkeltindekskomponenter, har det visse begrænsninger. Der er risiko for menneskelige fejl, når man bruger en sprøjte til at indsamle prøverne. Målingens præcision og nøjagtighed kan forbedres, hvis der kan gennemføres automatiske lægemiddelopløsningsmålinger22.
Sammenfattende har vi etableret en in vitro opløsningsmetode til bestemmelse af multiindekskomponenter i RG, som danner grundlag for yderligere undersøgelser af RG. Dette forsøg kan give oplysninger og vejledning om in vivo-bioækvivalensundersøgelser og in vivo-in vitro-korrelationsundersøgelser af andre etniske lægemidler23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Key Research and Development Program of China (2017YFC1703904), University (Chengdu University of TCM) - enterprise (Tibet Rhodiola Pharmaceutical Holding Co. LTD) samarbejdsprojekt (1052022040101); det regionale innovations- og samarbejdsprojekt under afdelingen for videnskab og teknologi i Sichuanprovinsen (2020YFQ0032); og det centrale F&U- og transformationsprogram for videnskabs- og teknologiafdelingen i Qinghai-provinsen (2020-SF-C33).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromatographic column | ZORBAX Eclipse | XDB-C18 | 4.6 mm x 250 mm, 5 µm |
| Drug dissolution tester | Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd. | RCZ-6B3 | |
| Electronic analytical balance | Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. | FA1004 | |
| Ethyl gallate (HPLC, ≥98%) | Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. | DSTDM006301 | |
| Function drawing software | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2022 | |
| Gallic acid (HPLC, ≥98%) | Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. | DSTDM000802 | |
| High performance liquid chromatography | Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd. | Agilent 1260 Infinity  |
|
| HPLC grade methanol | Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd. | 216565 | |
| Injector | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd. | 0.7 (22 G) | |
| Millipore filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | φ13 0.22 Nylon66 | |
| Rhodiola granules | Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd. | 210501 | |
| Salidroside (HPLC, ≥98%) | Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd. | DST200425-037 | |
| Ultra pure water systemic | Merck Millipore Ltd. | Milli-Q | |
| Ultrasonic cleansing machine | Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd | SB-8200 DTS |
References
- Smith, S. C., Zheng, Z. J. The impending cardiovascular pandemic in China. Circulation Cardiovascular Quality and Outcomes. 3 (3), 226-227 (2010).
- Wang, D., Wang, P., Zhang, R., Xi, X. Efficacy and safety of Xuefu Zhuyu decoction combined with Western medicine for angina pectoris in coronary heart disease: A protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine. 99 (50), 23195 (2020).
- Yang, X., et al. The role of traditional Chinese medicine in the regulation of stress in treating coronary heart disease. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3231424 (2019).
- Yang, J., Tian, S., Zhao, J., Zhang, W. Exploring the mechanism of TCM formulae in the treatment of different types of coronary heart disease by network pharmacology and machining learning. Pharmacological Research. 159, 105034 (2020).
- Pu, W. L., et al. Anti-inflammatory effects of Rhodiola rosea L.: A review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 121, 109552 (2020).
- Tao, H., et al. Rhodiola species: A comprehensive review of traditional use, phytochemistry, pharmacology, toxicity, and clinical study. Medicinal Research Reviews. 39 (5), 1779-1850 (2019).
- Li, M., et al. Exploring the biochemical basis of the meridian tropism theory for the qi-invigorating traditional Chinese medicine herb Panax ginseng. Journal of Evidence-Based Integrative Medicine. 26, 2515690 (2021).
- Pang, Y., Liang, J. Q. Effect of Nordicam on hemodynamics in rats with myocardial ischemia-reperfusion injury. Journal of Chinese Medicinal Materials. 36 (2), 276-279 (2013).
- Nickerson, B., Kong, A., Gerst, P., Kao, S. Correlation of dissolution and disintegration results for an immediate-release tablet. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 150, 333-340 (2018).
- Kambayashi, A., Yomota, C. Exploring clinically relevant dissolution specifications for oral solid dosage forms of weak acid drugs using an in silico modeling and simulation approach. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105728 (2021).
- Meng, S., Jiang, T. Y., Bu, C. J., Liu, J. Q. Research progress on the dissolution of traditional Chinese medicine preparations. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 8 (32), 180-181 (2015).
- Chinese Pharmacopoeia Committee. Pharmacopoeia of the People's Republic of China. 4, Chinese Medical Science and Technology Press. (2020).
- Lin, J. Z. Evaluation on Pre-Preparation of Rhodiola Extract. , Chengdu University of Traditional Chinese Medicine. (2013).
- Zhou, Y. B., et al. Calculation of drug solubility Weibull distribution parameters by Origin software. Herald of Medicine. 30 (06), 721-723 (2011).
- Hu, C. Q., Pan, R. X. Progress in evaluation/prediction of bioequivalence of solid oral preparations by dissolution test. Chinese Journal of New Drugs. 23 (01), 44-51 (2014).
- Zhang, H., Yu, L. X. Dissolution testing for solid oral drug products: Theoretical considerations. American Pharmaceutical Review. 7 (5), 26-30 (2004).
- Ren, J. L., et al. Analytical strategies for the discovery and validation of quality-markers of traditional Chinese medicine. Phytomedicine. 67, 153165 (2020).
- Li, H., et al. Establishment of modified biopharmaceutics classification system absorption model for oral Traditional Chinese Medicine (Sanye Tablet). Journal of Ethnopharmacology. 244, 112148 (2019).
- Song, X. Y., Li, Y. D., Shi, Y. P., Jin, L., Chen, J. Quality control of traditional Chinese medicines: a review. Chinese Journal of Natural Medicines. 11 (6), 596-607 (2013).
- Wu, X., et al. Quality markers based on biological activity: A new strategy for the quality control of traditional Chinese medicine. Phytomedicine. 44, 103-108 (2018).
- Wei, N. -N., Wang, X., Su, M.
- Chi, Z., Azhar, I., Khan, H., Yang, L., Feng, Y. Automatic dissolution testing with high-temporal resolution for both immediate-release and fixed-combination drug tablets. Scientific Reports. 9 (1), 17114 (2019).
- Haidar, S. H., et al. Bioequivalence approaches for highly variable drugs and drug products. Pharmaceutical Research. 25 (1), 237-241 (2008).
