Summary
CRISPR-Cas-teknologier har revolutioneret genomredigering. At finde og isolere den ønskede kimlinjeredigering er dog fortsat en stor flaskehals. Derfor beskriver denne protokol en robust metode til hurtig screening af F0 CRISPR-injiceret zebrafisksæd for kimlinjeredigeringer ved hjælp af standard PCR-, restriktionsfordøje- og gelelektroforeseteknikker.
Abstract
Fremkomsten af målrettede CRISPR-Cas-nukleaseteknologier har revolutioneret evnen til at udføre præcis genomredigering i både etablerede og nye modelsystemer. CRISPR-Cas genomredigeringssystemer bruger et syntetisk guide-RNA (sgRNA) til at målrette en CRISPR-associeret (Cas) endonuklease til specifikke genomiske DNA-loci, hvor Cas-endonukleasen genererer et dobbeltstrengsbrud. Reparation af dobbeltstrengsbrud ved hjælp af iboende fejlbehæftede mekanismer fører til indsættelser og / eller sletninger, der forstyrrer locus. Alternativt kan inkluderingen af dobbeltstrengede DNA-donorer eller enkeltstrengede DNA-oligonukleotider i denne proces fremkalde inkludering af præcise genomredigeringer, der spænder fra enkeltnukleotidpolymorfier til små immunologiske tags eller endda store fluorescerende proteinkonstruktioner. En stor flaskehals i denne procedure kan dog være at finde og isolere den ønskede redigering i kimlinjen. Denne protokol skitserer en robust metode til screening og isolering af kimlinjemutationer på specifikke loci i Danio rerio (zebrafisk); Disse principper kan dog tilpasses i enhver model, hvor in vivo-sædopsamling er mulig.
Introduction
CRISPR-systemet (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas er et kraftfuldt værktøj til at udføre loci-specifik mutagenese og præcis genomredigering i Danio rerio (zebrafisk) modelsystem 1,2,3,4. Cas-ribonukleoprotein (RNP) består af to hovedkomponenter: en Cas-endonuklease (almindeligvis Cas9 eller Cas12a) og et locus-specifikt syntetisk guide-RNA (sgRNA)5. Sammen genererer Cas-RNP et dobbeltstrenget brud (DSB) på det ønskede sted, der kan repareres af en af to iboende reparationsmekanismer. Den ikke-homologe endesammenføjning (NHEJ) reparationsmekanisme er fejlbehæftet og resulterer ofte i en række indsættelser eller sletninger (indels) omkring DSB. Disse indels kan være skadelige, hvis de introducerer en frameshift-mutation eller for tidligt stop i den resulterende proteinsekvens. Alternativt bruger den homologistyrede reparationsmekanisme (HDR) en donorskabelon med homologiområder omkring DSB-stedet til at reparere skaden. Forskere kan drage fordel af HDR-systemet til at generere præcise genomiske redigeringer. Specifikt kan de co-injicere en dobbeltstrenget DNA-donorkonstruktion, der indeholder de ønskede redigeringer samt homologiregioner, der flankerer DSB-stedet i genomet. De øgede stordriftsfordele for disse kommercielt producerede CRISPR-komponenter har i høj grad reduceret barriererne for screening af flere loci og for at etablere en større indsats for præcis genomredigering. I seksuelt reproducerende dyremodeller er en stor flaskehals imidlertid identifikation og isolering af kimlinjestabile mutante dyr.
Zebrafiskens modelsystem udviser flere nøglekvaliteter, der forbedrer dets anvendelse i omvendte genetiske undersøgelser. De er lette at opdrætte i stort antal med grundlæggende vandlevende udstyr, og hunner udviser høj frugtbarhed hele året rundt6. Desuden gør deres eksterne æglægning og befrugtning dem modtagelige for mikroinjektion af CRISPR / Cas-komponenter. Cas-RNP injiceres almindeligvis i zebrafiskembryoner i etcellestadiet for at generere DSB'er / reparation, der i teorien arves af alle dattercellerne. Imidlertid kræver diploide genomer to DSB / reparationshændelser for at mutagenisere begge homologe kromosomer. Selvom Cas-RNP injiceres på encellestadiet, kan DSB / reparation muligvis ikke forekomme før senere udviklingspunkter. Sammen bidrager disse faktorer til mosaikkarakteren af F0-injicerede fisk. En almindelig praksis er at krydse F0-injicerede fisk og screene F1-afkom for indels / specifikke redigeringer. Men da ikke alle F0-injicerede fisk har kimlinjemutationer, resulterer denne praksis i mange uproduktive kryds, der ikke genererer den ønskede redigering. Screening af F0-kimlinjen snarere end F1-somatisk væv øger sandsynligheden for at isolere den ønskede kimlinjeredigering og reducerer antallet af dyr, der kræves i denne proces.
Sædceller kan let opsamles fra F0-injicerede zebrafisk uden behov for eutanasi. Denne funktion giver mulighed for kryopræservering og rederivation af frosne sædceller7, men kan også udnyttes til hurtigt at screene, identificere og isolere kimlinjebærerne af ønskede genomiske mutationer 8,9. Brocal et al. (2016) har tidligere beskrevet en sekventeringsbaseret metode til screening af kimlinjeredigeringer i F0-injicerede zebrahanzebrafisk10. Selvom det er nyttigt til at identificere de muterede alleler, der er til stede i kimlinjen, kan denne tilgang blive dyr ved høj gennemstrømning og er muligvis ikke tilgængelig for alle laboratorier. I modsætning hertil tilbyder den nuværende protokol en tilgængelig og omkostningseffektiv elektroforesebaseret strategi til identifikation af kimlinjeredigeringer. Specifikt skitserer denne protokol en robust metode til screening og isolering af kimlinjemutationer ved specifikke loci ved anvendelse af agarosegelelektroforese med høj opløsning. Derudover beskriver denne protokol en lignende strategi til identifikation af en vellykket integration af en donorkonstruktion, der indeholder specifikke redigeringer. Som altid, hvis der ønskes specifikke redigeringer, kan sekventeringsbaserede strategier udføres sammen med protokollen beskrevet nedenfor. Selvom denne protokol er specifik for zebrafiskmodelsystemet, bør disse principper kunne tilpasses enhver model, hvor indsamling af sæd er en rutineprocedure. Sammen vil disse strategier muliggøre identifikation af F0-injicerede hanner med kimlinjeindels/redigeringer, der kan løses på en gel efter standard polymerasekædereaktion (PCR) og/eller restriktionsfordøjelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i vejledningen om pleje og brug af forsøgsdyr fra National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af University of Texas i Austin Animal Care and Use Committee (AUP-2021-00254).
1. Design af sgRNA til CRISPR-mutagenese
- Få exonsekvensen, der indeholder de målrettede loci.
- Design et syntetisk guide-RNA (sgRNA) med et protospacer-tilstødende motiv (PAM) -sted, der er specifikt for Cas-endonukleasen.
- Hvis du medinjicerer en donorkonstruktion, skal du designe sgRNA'et til at have et forudsagt snitsted så tæt på de ønskede redigeringer som muligt.
BEMÆRK: APE er en gratis software med et værktøj til at finde Cas9 sgRNA-websteder11. Alternativt kan værktøjer som CHOPCHOP bruges, som tilbyder en online grænseflade til design af sgRNA'er, der overvejer de forskellige PAM-steder i Cas9 og andre Cas-endonukleaser12.
- Hvis du medinjicerer en donorkonstruktion, skal du designe sgRNA'et til at have et forudsagt snitsted så tæt på de ønskede redigeringer som muligt.
- Design fremadgående og baglæns primere for at forstærke området omkring det designede CRISPR/Cas-skærested. PCR-produktet skal være ca. 200-400 basepar (bp) i længden for at kunne løse små indels på en gel senere i protokollen.
BEMÆRK: CHOPCHOP11 designer automatisk primere for hvert sgRNA, det udsender. - Valgfrit: Design en DNA-donorkonstruktion med de(n) ønskede redigering(er).
- Der opnås den genomiske sekvens af exonen, der indeholder loci for den ønskede mutation.
BEMÆRK: Intronic-sekvenser kan variere mellem individer, så det er bedst at undgå inkludering af introniske sekvenser i donorkonstruktionen, da dette kan forstyrre den homologiafhængige reparationsvej. - Hvis der ønskes en specifik aminosyreændring, skal du ændre det specifikke codon i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Når du foretager disse ændringer, skal du være opmærksom på kodonfrekvensen. Hvis det er muligt, skal du vælge et codon med høj brug. - For at forhindre CRISPR/Cas-fordøjelse af donorkonstruktionen skal du foretage yderligere synonyme mutationer, der (i) forstyrrer PAM og/eller (ii) forstyrrer sgRNA-sekvensen, idet der lægges større vægt på at foretage ikke-synonyme ændringer tættere på PAM-stedet.
- Brug en restriktionswebstedsfinder (APE11 har også denne funktion) til at finde unikke begrænsningssteder (dem, der kun forekommer én gang) i det forudsagte PCR-produkt af vildtypesekvensen.
- Gentag denne proces for det forudsagte PCR-produkt, der afspejler den vellykkede integration af donorkonstruktionen.
- Sammenlign listen over begrænsningssteder mellem vildtypesekvenserne og donorintegrerede sekvenser for at finde et begrænsningssted, der kun findes i den redigerede rækkefølge.
- Hvis der ikke findes et unikt begrænsningssted, skal du fortsætte med at foretage synonyme ændringer inden for donorkonstruktionen, indtil dette er opnået.
BEMÆRK: Hvis det er muligt, fortsæt med at lave synonyme mutationer, der ville forstyrre sgRNA-bindingen til donorkonstruktionen.
- Trim donorsekvensen til en håndterbar størrelse (50-100 bp) med mindst 20 bp homologi omkring det forudsagte CRISPR/Cas-snitsted og redigeringer, hvis det er muligt.
- Der opnås den genomiske sekvens af exonen, der indeholder loci for den ønskede mutation.
- Få de designede sgRNA- og / eller DNA-donoroligonukleotider samt eventuelle primere, der kræves til genotypning.
BEMÆRK: For at forhindre fordøjelse af DNA-donoroligonukleotider af nukleaser anbefales det at modificere de første tre fosfatbindinger på 5'- og 3'-enderne af DNA-oligonukleotiderne med phosphorothioat. - 1 nL af injektionsblandingen injiceres i embryoner i etcellestadiet. Typisk indeholder en standard injektionsblanding følgende:
1 μL 25 μM locus-specifikt sgRNA
1 μL 25 μM Cas9 endonuklease
Valgfrit: 1 μL 3 μM DNA-donorkonstruktion- Bring det samlede volumen op på 5 μL med 0,1 M RNasefri KCl.
- Tillad de F0-injicerede personer at udvikle sig til seksuelt modne voksne. Den resterende protokol fokuserer på screening af de F0-injicerede hanner for kimlinjeredigeringer.
2. Opsætning af avlstanke
- Prime F0 hanner til parring ved at oprette avlstanke med skillevægge mellem F0 hanner og hunner.
- For at minimere antallet af nødvendige avlstanke skal du oprette tre hanner overfor to hunner i hver tank.
- Opsæt så mange F0-hanner, som effektivt kan screenes og huses som individer efter sædopsamling. Hunnernes genotype er ikke vigtig, da deres gameter ikke vil blive indsamlet under denne procedure.
- Opret en avlstank af vildtypehanner overfor hunner. Vildtype sæd vil tjene som en kontrol for fortolkningen af resultaterne senere i proceduren.
- For at minimere antallet af nødvendige avlstanke skal du oprette tre hanner overfor to hunner i hver tank.
- Inkuber de forberedte avlstanke natten over.
3. Forberedelse af materialerne til sædopsamlingsproceduren
- Forbered nok bedøvelsesopløsning (0,016% tricain-HCI i fiskevand) til at fylde en lille glasskål.
- Dispenser 40 μL 50 mM NaOH i 0,2 ml PCR-rør. Forbered et rør til hver sædprøve, der skal indsamles. Opbevares på is.
- Forbered individuelle 0,8 L tanke for hver fisk, der vil blive udtaget prøver under proceduren. Disse tanke vil huse de fisk, der udtages prøver af, indtil genotypebestemmelsen er afsluttet.
BEMÆRK: Dette er den primære faktor, der begrænser antallet af fisk, der effektivt kan screenes i denne protokol. Sørg for, at der er tilstrækkelig plads til at huse de individer, der udtages prøver af, indtil genotypebestemmelsen er afsluttet. - Fugt en 1-tommer x 1-tommer svamp (skåret med en lav, ovalformet divot for at holde en mandlig zebrafisk ventral side op under proceduren) i fiskevand og pres overskydende væske ud.
- Placer svampen i synsfeltet for et stereomikroskop ved lav forstørrelse (figur 1A).
- Placer skrå loftbelysning for optimal visning.
4. Bedøvelse af hanfisken og opsamling af sædcellerne
- Forbered et rent kapillarrør.
- Ryst forsigtigt rørbeholderen for at frigøre et enkelt kapillarrør.
- Placer kapillarrøret i den medfølgende pære, og sæt det til side.
- Overfør en hanfisk til den tilberedte bedøvelsesopløsning (0,016% tricain-HCI i fiskevand).
- Rør forsigtigt opløsningen med en slidset ske for at fremskynde anæstesiprocessen.
- Når operculum (gill) bevægelsen sænkes (ca. 1-2 min), fortsæt med sædopsamlingen.
- Brug hulskeen til at overføre fisken til en ren stak køkkenrulle.
- Brug hulskeen til forsigtigt at rulle fisken for at fjerne overskydende vand.
- Tør forsigtigt fisken med rent, foldet silkepapir for at fjerne eventuelt resterende vand.
- Brug hulskeen til at overføre fisken til den tilberedte svamp (figur 1B).
- Placer fiskens ventrale side opad med hovedet nærmest den dominerende hånd på den person, der udfører proceduren.
- Tør forsigtigt området omkring analfinnerne med rent, foldet silkepapir.
- Saml sædcellerne.
- Brug enden af kapillarrøret til forsigtigt at flytte bækkenfinnerne sideværts væk fra midterlinjen for at udsætte cloaca (figur 1C).
- Placer enden af kapillarrøret nær cloaca.
- Brug pincetten til forsigtigt at klemme siderne af fisken, der begynder lige under gællerne og slutter ved cloaca (figur 1C').
- Saml sæd i kapillarrøret ved kapillær virkning. Ca. 1 μL er tilstrækkeligt til denne procedure (figur 1D).
BEMÆRK: Nogle laboratorier rapporterer at bruge p10 pipet tips i stedet for kapillarrør til sædopsamling. - Hvis sæd ikke frigives med let tryk, skal fisken returneres til systemvandet.
- Overvåg for genopretning fra anæstesi.
- Klem ikke fisken hårdt for at udvise sædceller, da dette kan skade fisken.
- Hvil fisken i 2 uger, før du forsøger at samle sæd igen.
- Efter opsamling anbringes fisken i en ren isolationstank med systemvand til individuelle huse.
- Overvåg fisken for genopretning fra anæstesi.
- Hvil fisken i 2 uger, før du forsøger at samle sæd igen.
- Kapillarrøret med den opsamlede sæd anbringes i det forberedte PCR-rør (med 40 μL 50 mM NaOH).
- Klem gummipæren for at udvise den opsamlede prøve.
- Bortskaf det brugte kapillarrør i en godkendt glasaffaldsbeholder.
- Inkuber prøverne på is, indtil alle hannerne er blevet presset.
- Gentag trin 4.1-4.5 for hver enkelt mand.
- Mærk isolationstankene og sædprøverne således, at de endelige sædgenotyperesultater kan spores tilbage til det tilsvarende individ med formodede mutationer.
- Overvåg alle individer, og sørg for, at de er oprejst og udforsker deres tanke, før du sætter tankene tilbage på systemet.
- Sæt hunnerne, der bruges til priming, tilbage i deres respektive tanke på systemet.
- Hvis en fisk ikke kommer sig efter anæstesien efter 10 minutter, skal du følge eutanasiproceduren, der er godkendt af den institution, der er tilknyttet laboratoriet.
- Eksempel: Hurtig afkøling af individet i et isbad med fiskevand, der er 2-4 ° C.
- Bortskaf den aflivede fisk i en passende beholder til dyrekroppe i henhold til den procedure, der er godkendt af den institution, der er tilknyttet laboratoriet.
5. Ekstraktion af DNA fra sædprøverne
- Drej kort alle sædprøverne ned i en minicentrifuge, og placer PCR-rør i en termisk cykler.
- Luk låget på den termiske cyklist.
- Kør følgende indstillinger i den termiske cyklist:
- Prøverne opvarmes i 40 minutter ved 95 °C.
- Prøverne afkøles til 25 °C.
- Fjern prøverne fra den termiske cyklist.
- Med en ren pipettespids til hver prøve neutraliseres pH-værdien ved at tilsætte 10 μL 1 M Tris-HCl (bufferet til pH 8).
- Bland godt ved pipettering op og ned.
- Drej kortvarigt prøverne ned i en minicentrifuge.
- Genomiske DNA-prøver kan opbevares i flere dage ved 4 °C eller anbringes ved -20 °C i op til 6 måneder.
6. PCR-amplifikation (og/eller restriktionsfordøjelse) af det ønskede locus
- Forstærk det ønskede locus ved hjælp af en standard PCR-protokol.
- Forvarm den termiske cyklist til den indledende denatureringstemperatur i PCR-reaktionen nedenfor.
- Forbered en 25 μL reaktionsblanding for hver sædprøve i PCR-rør:
12,5 μL 2x Taq Polymerase Master Mix
1,5 μL 10 μM fremadgående primer
1,5 μL 10 μM omvendt primer
4,5 μL nukleasefrit vand
5 μL neutraliseret sæd-DNA-prøve - Bland godt ved pipettering op og ned.
- Drej kortvarigt prøverne ned i en minicentrifuge.
- Anbring prøverne i den forvarmede termiske operatør med følgende indstillinger:
Indledende denaturering: 95 °C i 3 min
35 cyklusser med denaturering (95 °C i 30 s), udglødning (55 °C i 30 s) og forlængelse (72 °C i 30 s)
Endelig forlængelse: 72 °C i 5 min
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at justere forlængelsestemperaturen og/eller tiden afhængigt af den specifikke Taq-polymerase og PCR-amplifikationsproduktets forventede længde. - Fjern PCR-prøverne fra den termiske cyklist.
- Valgfrit: Udfør den donorspecifikke restriktionsfordøjelse på et lille volumen af PCR-produktet, så der efterlades mindst 5-10 μL ufordøjet PCR-produkt til gelelektroforese.
- Forbered en 30 μL reaktion i 0,2 ml PCR-rør:
10 μL urenset PCR-produkt
15 μL nukleasefrit vand
3 μL 10x restriktionsenzymbuffer
2 μL restriktionsenzym (BstNI anvendes i de repræsentative resultater til analyse af dnah10 knock-in allel)
BEMÆRK: Mange restriktionsenzymer er stadig aktive i en typisk PCR-reaktionsbuffer; Tilføjelsen af restriktionsfordøjelsesbuffer kan dog hjælpe med at forbedre resultaterne. Se specifikke producentinstruktioner for fejlfinding, hvis der opstår problemer. - Bland godt ved pipettering op og ned.
- Drej kortvarigt prøverne ned i en minicentrifuge.
- Anbring prøverne i en termisk cyklist med følgende indstillinger:
- PCR-amplikon skæres ved 60 °C i 1 time.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at justere snittemperaturen og inkubationstiden for det specifikke restriktionsenzym, der anvendes. - Restriktionsenzymet inaktiveres med den krævede temperatur og inkubationstid, hvis angivet af producenten.
BEMÆRK: BstNI-enzymet kræver ikke varmeinaktivering.
- PCR-amplikon skæres ved 60 °C i 1 time.
- Forbered en 30 μL reaktion i 0,2 ml PCR-rør:
7. Udførelse af gelelektroforese for at adskille PCR-amplicons i forskellige størrelser
- Forbered 500 ml 0,5x TBE-løbebuffer: Tilsæt 50 ml 10x TBE-bufferkoncentrat til 450 ml deioniseret vand.
- Forbered 100 ml 4% agarosegel i 0,5x TBE-løbebuffer: Tilsæt 4 g agarose med 10 μL 10.000x gelplet til 100 ml 0,5x TBE-løbebuffer. Mikrobølgeovn, indtil agarosepulveret er helt opløst.
- Hæld gelopløsningen i en passende størrelse gelstøberamme, og indsæt kammen på den ene side af gelen.
BEMÆRK: En større gelstørrelse (anbefalet: 15 cm x 15 cm) er fordelagtig ved denne procedure, da det giver amplicons mere plads til at løse gelen.- Hvis et restriktionsfordøjelsesprodukt skal analyseres, er det bedst at køre det på samme gel som PCR-produktet, så resultaterne kan sammenlignes. Juster kambrøndens størrelse efter behov, så den passer til alle prøverne på gelen.
- Lad gelen stå ved stuetemperatur, indtil den er størknet. Fjern forsigtigt kammen. Fjern forsigtigt gelen fra støberammen.
- Hæld gelopløsningen i en passende størrelse gelstøberamme, og indsæt kammen på den ene side af gelen.
- Opsæt gelelektroforeseriggen.
- Placer gelen i elektroforeseriggen, således at brøndene er nærmest den negative elektrode. Hæld 0,5x TBE-løbebuffer i elektroforeseriggen, indtil brøndene er helt nedsænket.
- Ilæg gelen.
- Læg 5 μL DNA-stige i den første brønd (vælg en DNA-stige, der indeholder DNA-fragmenter, der har samme størrelse som PCR-amplicon).
- Brug en ny pipettespids til hver prøve (inklusive vildtypekontrolprøven) til at fylde 5-10 μL af PCR-produktet i de resterende huller.
- Valgfrit: Hvis et restriktionsfordøjelsesprodukt skal analyseres, skal du også lægge disse prøver på gelen.
BEMÆRK: Det er bedst at indlæse lige store mængder DNA mellem PCR og restriktionsfordøjelsesproduktet. For eksempel blev der i 30 μL restriktionsfordøjereaktionsblandingen tilsat 10 μL PCR-produkt. DNA-koncentrationen af 15 μL fordøjet produkt var derfor sammenlignelig med 5 μL uoprenset PCR-produkt.
- Kør gelen.
- Tilslut elektroderne til gelelektroforeseriggen, og påfør 150 V i mindst 1 time for at sikre tilstrækkelig adskillelse af amplikonerne.
- Tag billedet af gelen for at se DNA-båndene.
BEMÆRK: Stærkt mutageniserede CRISPR-målrettede loci vil køre som flere båndstørrelser, der repræsenterer en kombination af indsættelses-/deletionsalleler med vildtypeamplikonerne.- Hvis gelbåndene ikke er opløst efter 1 time, påføres gelen 150 V i intervaller på 15 minutter, indtil båndene er tilstrækkeligt adskilt på gelen.
- Valgfrit: Hvis screening for indsættelse af en præcis redigering såsom en SNP, epitoptag eller fluorescerende tag, screenes sæd-DNA'et med PCR-metoder, der er specifikke for den ønskede redigering. For eksempel, når man identificerer et donorspecifikt restriktionssted, vil der være et ekstra bånd til stede i restriktionsfordøjelsesproduktet sammenlignet med PCR-produktet fra sædprøven.
8. Isolering af kimlinjestabile alleler
- Efter 2 ugers hvile fra sædklemmeproceduren skal du krydse F0-individerne, hvis sædgenomiske DNA indeholdt de ønskede redigeringer.
BEMÆRK: Sæddannelse fra individuelle spermatogonia-kloner kan være cyklisk hos zebrafisk; Således producerer den ønskede allel muligvis ikke sædceller på tidspunktet for outcross. Af denne grund kan det være nødvendigt at udføre yderligere krydsning mere end én gang for at isolere den allel, der er impliceret ved den indledende screening. - Når F1-krydsede fisk er seksuelt modne, skal du fortsætte med standard genotypemetoder (for eksempel fin-clip-DNA) ved hjælp af den samme PCR- og gelelektroforeseprotokol udført under screening af sædgenomisk DNA.
- Sanger sekvenserer PCR-produkterne for at identificere F1-individerne med den samme ønskede redigering.
- Valgfrit: Hvis den ønskede redigering introducerer eller afbryder et begrænsningswebsted, skal du screene med en passende protokol til sammenfatning af begrænsninger.
- In-cross F1 heterozygoter med samme ønskede redigering.
- Screene F2-afkom for den forventede fænotype og/eller genomiske redigeringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eksperimentelle tilgange, der er beskrevet i denne protokol, giver mulighed for hurtigere identifikation af genomredigeringer eller formodede skadelige alleler ved at fokusere på analysen af tusindvis af genomer afledt af indsamling af F0-injiceret mandlig sæd. Figur 2 fremhæver, hvordan man fortolker de resultater, der opnås ved hjælp af denne protokol.
For at generere mutationer i p2ry12-locus blev zebrafiskembryoner med encellestadiet injiceret med Cas9-endonuklease og et p2ry12-specifikt sgRNA (figur 2B, grå fremhævning). F0-injicerede fisk blev sat i systemet indtil seksuel modenhed, og sæd blev indsamlet fra seks individuelle mænd. DNA blev ekstraheret fra sædprøverne ved hjælp af høj varme og basale betingelser (HotSHOT DNA-ekstraktion) og neutraliseret før PCR-amplifikation af p2ry12-locus. PCR-produkterne blev adskilt på en høj procentdel (4%) agarosegel i 1,5 timer ved højspænding (150 V). I dette eksempel løb vildtypeamplikon som et enkelt lyst bånd på omkring 250 basepar i længden (figur 2C; WT). I modsætning hertil kørte de F0-injicerede mandlige ampliconer indeholdende indels på gelen som flere bånd (figur 2C; baner # 1-2, # 5-8). Alternativt kunne de muterede F0-injicerede mandlige amplicons køre som et enkelt bånd med ændret gelmobilitet (ikke vist i p2ry12-eksemplet, men tydeligt i PCR-produktet af dnah10 F0-han #2; Figur 2E). Det var mindre klart på p2ry12-eksempelgelen, om prøve #3 og prøve #4 indeholdt indels i sammenligning med vildtypebåndet, så disse personer er muligvis ikke de bedste grundlæggerkandidater. Isolering af alleler fra F0-hanner med mere karakteristiske amplicon ændringer er bedst til formering af stabile kimlinjebærere, da de let scores på 4% agarosegel. For eksempel syntes F0-han #6 sædprøve at indeholde en stor deletion i en af allelerne (figur 2C; bane 6; lyst bånd med øget gelmobilitet). Hvis denne store deletionsallel blev valgt til i F1-generationen, ville den let kunne skelnes fra WT-allelen på en 4% agarosegel. Alternativt, hvis der ønskes en samling af forskellige alleler, kan F0-han #7 være en effektiv grundlæggerkandidat, da dets PCR-produkt syntes at indeholde flere diskrete alleler med forskellige mobiliteter. Når en grundlægger han er valgt, kan den ønskede allel isoleres ved at krydse individet tilbage til den oprindelige vildtypestamme, der anvendes til injektioner.
For at generere en specifik knock-in-mutation i dnah10-genet blev zebrafiskembryoner i etcellestadiet injiceret med Cas9-endonuklease, et dnah10-specifikt sgRNA (figur 2D; grå fremhævning) og et DNA-donoroligonukleotid indeholdende den ønskede redigering (figur 2D; rød) og et donorspecifikt BstNI-restriktionssted (figur 2D , parentes). Dette design giver mulighed for nem identifikation af donorintegration med en restriktionsfordøjelse efter PCR. Ved at ændre basepar inden for sgRNA-genkendelsesstedet (figur 2D; grå fremhævning) forhindrer dette design Cas9-fordøjelsen af donorsekvensen. Når den F0-injicerede fisk nåede seksuel modenhed, blev sæd opsamlet, og DNA blev ekstraheret ved hjælp af hot shot-metoden. Fra disse prøver blev dnah10-locus forstærket ved hjælp af PCR, og produkterne blev adskilt på en høj procentdel (4%) agarosegel i 1 time ved højspænding (150 V). I dette eksempel løb vildtype-amplikonen som et enkelt lyst bånd på omkring 400 basepar i længden (figur 2E; toppanel: WT). I modsætning hertil kørte de F0-injicerede mandlige ampliconer, der indeholdt indels, som flere bånd (figur 2E; toppanel: baner #1, #4 og #5) eller som et enkelt bånd med nedsat gelmobilitet (figur 2E; toppanel: bane #2). For at afgøre, om nogen af sædprøverne indeholdt donorintegrerede alleler, blev PCR-produkterne fordøjet med BstNI-restriktionsenzymet i 1 time, og produktet blev kørt på en 4% agarosegel i 1 time ved højspænding (150 V). Sammenligning af det ufordøjede PCR-produkt (figur 2D; øverste panel) med det fordøjede produkt (figur 2D; nederste paneler) afslører prøver med sandsynlig integration af donorkonstruktionen. I dette eksempel havde den F0-injicerede han #1 et ekstra bånd i det fordøjede produkt, der ikke var til stede i PCR-produktet (figur 2D; nederste panel: bane #1, cirklet). Derfor repræsenterer denne mand den bedste grundlæggerkandidat til at etablere en mutant linje med den ønskede knock-in.
Når den formodede F0-bærerhan er krydset, skal allelen sekvensverificeres i F1-afkommet. Det foreslås direkte at Sanger sekvensere amplicons afledt af F1 heterozygot fisk efterfulgt af at udføre heterozygote allelanalysemetoder såsom Poly Peak Parser13 eller ved hjælp af en række næste generations sekventeringsbaserede metoder såsom MiSeq 14 eller Hi-Tom15 sekventering. Dette er en nødvendig og komplementær tilgang for at sikre, at den præcise redigering eller skadelige indelmutation faktisk går kimlinjen og ikke kun er en artefakt af gelelektroforeseanalysen. Faktisk kan brugen af næste generations sekventeringsmetoder til sekvensering af sæd-DNA fra F0-bærere let anvendes i stedet for gelelektroforeseanalysen beskrevet i denne protokol. Men at have en let scorelig agarosegel-genotypemetode er en mere økonomisk og egalitær tilgang for det globale samfund af zebrafiskforskere.
Figur 1: Opsætning af sædklemmeproceduren . (A) Svampen er placeret under et stereomikroskop ved lav forstørrelse med loftbelysning. (B) Den fugtede 1 i x 1 i svamp, skåret med en oval divot (stiplede linje), bruges til at holde den bedøvede hanfisk ventrale side op under proceduren. (C) Anatomi af den ventrale side af den bedøvede hanfisk, der skildrer analfinnerne (af, pink), bækkenfinner (pf, blå) og cloaca (pil), hvor sæd vil blive udvist under proceduren. (C') Filtertang bruges til forsigtigt at presse den bedøvede hanfisk fra gællerne til cloacaen, mens den udviste sæd trækkes ind i en glaspipette ved kapillær virkning (hvid pil). D) Et kapillarrør indeholdende tilstrækkelig udstødt sæd (uigennemsigtig væske; sort beslag) til nedstrøms DNA-ekstraktion og -analyse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Arbejdsproces og repræsentative resultater . (A) Protokollens generelle arbejdsgang. (B) Repræsentativt design af p2ry12 sgRNA-stedet (grå fremhævning) med et Cas9-specifikt PAM-sted (understreget). (C) Repræsentative resultater af 4% gelelektroforese efter 1,5 timer ved 150 V. Wild-type (WT) kontrol og F0-p2ry12 CRISPR-injicerede mandlige sædprøver (1-8) efter PCR-amplifikation. (D) Repræsentativt design af dnah10 sgRNA-stedet (grå fremhævning) med et Cas9-specifikt PAM-sted (understreget) nær det målrettede codon (fed skrift). DNA-donorsekvens med den ønskede kodonredigering (rød fed) og BstNI-begrænsningssted (parentes med apostrof, der markerer det afskårne sted). (E) Repræsentative resultater af 4% gelelektroforese efter 1 time ved 150 V. Top: PCR-produkt af vildtypen (WT) og F0 dnah10 CRISPR-injicerede mandlige sædprøver (1-5). Nederst: BstNI-restriktionsfordøjet produkt af ovennævnte prøver. Prøve 1 demonstrerer den vellykkede integration af donorkonstruktionen baseret på det ekstra bånd efter fordøjelsen (rød cirkel). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til hurtigt at karakterisere formodede genomredigeringer eller målrettede mutationer ved hjælp af CRISPR-Cas-teknologi ved fokuseret analyse på F0 mandlige sædgenomer. Denne protokol bør kunne anvendes til andre dyremodeller, hvor sædceller er let tilgængelige til prøveudtagning uden eutanasi. Denne metode øger gennemløbet af screening for ønskede redigeringer og er især nyttig til at identificere sjældne HDR-medierede knock-in-hændelser. Denne tilgang tjener også til at reducere antallet af forsøgsdyr, der bruges til at finde en stabil kimlinjeredigering ved at lette hurtig screening af potentielt tusindvis af genomer i en sædprøve fra en formodet F0-bærer, hvilket er i modsætning til mere traditionelle tilgange, der kan kræve screening af hundredvis af embryoner afledt af krydsninger af formodede F0-bærere.
Denne protokol bygger på etablerede protokoller for sædopsamling i zebrafisk 7,10,14,16,17,18 ved at inkludere en reproducerbar teknik til identifikation af kimlinjeredigeringer ved hjælp af gelelektroforese med høj opløsning. Denne tilgang kan let inkorporeres i enhver standard CRISPR / Cas-arbejdsgang for at øge gennemstrømningen til screening og isolering af målgenomredigeringer. Derudover er denne protokol velegnet til laboratorier bemandet med personale med en række træning og erfaring samt undervisningslaboratorier. Vores metode til sædopsamling er imidlertid ikke tilstrækkelig til kryopræservering, som er blevet ekspertbeskrevet i tidligere publikationer10,17.
Denne protokol bruger en agarosegelelektroforese med høj opløsning til at identificere formodede mandlige bærere af ønskede indel og præcise genomiske mutationer. Imidlertid er sædgenomisk DNA modtageligt for et utal af andre tilgange, herunder fluorescerende fragmentanalyse eller stregkodet sekventering14, smelteanalyse med høj opløsning18 eller simpel amplicon detektion af fluorescerende mærker eller epitoper ved hjælp af standard gelelektroforesemetoder. Downstream-valideringen af alle alleler ved hjælp af tilgange som Sanger-baseret eller næste generations sekventering skal udføres, inden eksperimentelt arbejde med formodede alleler påbegyndes. Faktisk kan eksisterende metoder til screening for mutationer i embryoner ved hjælp af næste generations sekventeringsmetode14 omgå behovet for analyse af agarosegeler, som er beskrevet i denne protokol. At have en gel-scorbar genotypemetode er imidlertid en mere omkostningseffektiv og egalitær tilgang at overveje, da ikke alle laboratorier har let adgang til billige næste generations sekventeringsmetoder under isolerings- og eksperimentelle faser af arbejdet med hver mutant stamme.
Sammenfattende giver denne protokol trinvise anvisninger til reproducerbar screening af sædgenomer fra CRISPR / Cas-redigerede mænd, således at færre krydsninger og mindre PCR-screening af embryoner er nødvendige for at screene for ønskede redigeringer. Anvendelsen af denne metode vil reducere antallet af fisk, der skal oprettes og analyseres for at kunne identificere de redigerede alleler af interesse, hvilket også reducerer tid og omkostninger for personale til generering af stabile linjer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Anna Hindes ved Washington University School of Medicine for hendes indledende indsats for at opnå sædgenomisk DNA af god kvalitet ved hjælp af hot shot-metoden. Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award (R01AR072009 til RSG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose powder | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Breeding tanks | Carolina Biological | 161937 | |
| BstNI Restriction Enzyme | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonuclease | IDT | 1081060 | |
| DNA Ladder, 100 bp | Thermo Scientific | FERSM0241 | |
| dnah10 donor construct | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5’ and 3’ ends (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC AGTGATTACGTCACGC-3') |
|
| dnah10 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') |
|
| dnah10 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') |
|
| dnah10 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3' | |
| Electrophoresis power supply | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Filter forceps | Millipore | XX6200006P | |
| Fish (system) water | Generic | n/a | |
| Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber) | Thermo Scientific | B2 | |
| Gel imaging light box | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Gel stain, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Glass bowl, 250 mL | Generic | n/a | |
| Isolation tanks, 0.8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Microcap capillary tube with bulb, 20 µL | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuge | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipettes, various with appropriate tips | Generic | n/a | |
| Microwave | Generic | n/a | |
| Nuclease free water | Promega | P119-C | |
| Paper towels | Generic | n/a | |
| PCR tubes, 0.2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Plastic spoon, with drilled holes/slots | Generic | n/a | |
| KCl solution, 0.2 M RNAse Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 forward primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') |
|
| p2ry12 reverse primer | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') |
|
| p2ry12 synthetic sgRNA | Synthego | Synthetic sgRNA, target sequence: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3' | |
| Restriction Enzyme 10X Buffer | NEB | B6003SVIAL | |
| NaOH solution, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot | Generic | n/a | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polymerase master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrate, 10X | VWR | E442 | |
| Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| Tissue paper | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0±0.2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0) | Promega | H5131 |
References
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
- Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
- Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
- Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
- Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
- Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
- Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259 (2016).
- Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
- Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
- Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
