Summary
यह प्रोटोकॉल घायल पीसी 12 कोशिकाओं के इलाज के लिए दो जड़ी बूटियों की एक संयोजन रणनीति प्रदान करता है। प्रोटोकॉल पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) के सर्वोत्तम अनुप्रयोग मोड को अनुकूलित करने के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।
Abstract
सेरेब्रल इस्किमिया के उपचार में पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) के संयोजन के फायदों को देखते हुए, हमने घायल पीसी 12 कोशिकाओं के इलाज के लिए दो जड़ी बूटी संयोजन रणनीति का पता लगाने के लिए तैयारी संयोजन और घटक संयोजन के बीच प्रभावकारिता और तंत्र में अंतर का अध्ययन किया। कोबाल्ट क्लोराइड (CoCl2) को ग्लूकोज मुक्त माध्यम के साथ संयुक्त पीसी 12 कोशिकाओं के ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित करने के लिए नियोजित किया गया था। फिर, एस्ट्रागलस मोनगोलिकस (एएसटी) और एरिजेरोन ब्रेविसकैपस (एरी ) इंजेक्शन के इष्टतम संयोजन का चयन किया गया और पीसी 12 कोशिकाओं पर उनकी सुरक्षित और प्रभावी एकाग्रता की जांच के बाद समान डिजाइन विधियों का पालन किया गया। इसके अलावा, स्क्रीनिंग किए गए घटक संयोजन में दो जड़ी बूटियों में 10 μM एस्ट्रागलोसाइड A, 40 μM scutellarin और 75 μM क्लोरोजेनिक एसिड शामिल हैं। फिर, एमटीटी, एनेक्सीन वी-एफआईटीसी / पीआई, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण का उपयोग तैयारी संयोजन की प्रभावकारिता और तंत्र और घायल पीसी 12 कोशिकाओं पर घटक संयोजन का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। परिणामों से पता चला कि सेल प्रो-सर्वाइवल के लिए इष्टतम तैयारी संयोजन 6: 1.8 (μM) की एकाग्रता के साथ एस्ट इंजेक्शन और एरी कैप्सूल था। घटक संयोजन (10 μM एस्ट्रागलोसाइड A, 40 μM scutellarin, और 75 μM क्लोरोजेनिक एसिड) तैयारी संयोजन की तुलना में अधिक प्रभावी था। दोनों संयोजनों ने उल्लेखनीय रूप से एपोप्टोटिक दर, कैसपेज़ -3 की प्रतिदीप्ति तीव्रता और इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) स्तर को कम कर दिया; इस बीच, उन्होंने पी-एकेटी / एकेटी, बीसीएल -2 / बैक्स और एनआरएफ 2 के अभिव्यक्ति स्तरों को विनियमित किया। घटक संयोजन में ये प्रभाव अधिक स्पष्ट थे। निष्कर्ष में, दोनों संयोजन पीसी12 कोशिकाओं पर ग्लूकोज मुक्त माध्यम के साथ संयुक्त सीओसीएल 2 द्वारा प्रेरित चोट को रोक सकते हैं, इस प्रकार सेल अस्तित्व को बढ़ावा देते हैं। हालांकि, तैयारी संयोजन पर घटक संयोजन की दक्षता ऑक्सीडेटिव तनाव और एपोप्टोसिस से संबंधित पीआई 3 के / एकेटी / एनआरएफ 2 सिग्नलिंग मार्ग के मजबूत विनियमन के कारण हो सकती है।
Introduction
क्रोनिक सेरेब्रल इस्किमिया, सेरेब्रल हाइपोपरफ्यूजन के कारण, मध्यम आयु वर्ग औरबुजुर्ग लोगों में एक आम बीमारी है। एक दीर्घकालिक मनोगत इस्किमिया रोग के रूप में, यह प्रगतिशील या लगातार न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन का कारण बन सकता है। मुख्य रोग तंत्र में सेल एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव क्षति शामिल है, जिससे प्रगतिशील या लगातार न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन होता है; यह अल्जाइमर रोग, संवहनी मनोभ्रंश और अन्य बीमारियों का पैथोलॉजिकल आधार है, और रोगियों के जीवन की गुणवत्ता को गंभीरता से प्रभावित करता है। हालांकि, क्रोनिक सेरेब्रल इस्किमिया2 के इलाज के लिए आधुनिक चिकित्सा में अभी भी आदर्श दवाओं की कमी है। इसी समय, पारंपरिक चीनी चिकित्सा (टीसीएम) 4 के नैदानिक अभ्यास में एस्ट्रागलस मोनगोलिकस (एएसटी) और एरिगेरोन ब्रेविसकैपस (एरी) के संयोजन का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। सेरेब्रल इस्किमिया के बाद तंत्रिका समारोह की वसूली को बढ़ावा देने में संयोजन रणनीति में उल्लेखनीय सुधार हुआ है, जो एक दवा की तुलना में बेहतर है; हालांकि,दो दवाओं के संयोजन में खुराक अनुपात में बड़े अंतर हैं। प्रभावी घटक और कार्रवाई के तंत्र को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं किया गया है, जो इसके नैदानिक अनुप्रयोग को प्रतिबंधित करने वाला महत्वपूर्ण मुद्दा है।
पिछले अध्ययनों ने चूहों में सेरेब्रल इस्किमिया के इलाज में एस्ट इंजेक्शन और एरी इंजेक्शन के तैयारी संयोजन के सहक्रियात्मक प्रभाव का प्रदर्शन किया है। यह पी-एकेटी प्रोटीन की अभिव्यक्ति को बढ़ा सकता है और बीसीएल -2 संबद्ध मृत्यु प्रमोटर (बीएडी) प्रोटीन 5,6 की अभिव्यक्ति को डाउनरेगुलेट कर सकता है, जो बी-लिम्फोब्लास्टोमा 2 (बीसीएल -2) परिवार के प्रोटीन में से एक है और इसमें एपोप्टोसिस को बढ़ावा देने का प्रभाव है। हालांकि, इसके सहक्रियात्मक प्रभाव का भौतिक आधार और तंत्र स्पष्ट नहीं है। इसके अलावा, पीसी 12 कोशिकाओं के चोट मॉडल को सीओसीएल2 संयुक्त ग्लूकोज-मुक्त माध्यम के साथ स्थापित किया गया था, और एएसटी और एरी में इष्टतम घटक संयोजन की जांचऔर परिभाषित किया गया है।
इस अध्ययन में, घायल पीसी 12 सेल मॉडल का उपयोग करके एएसटी और एरी की प्रभावी खुराक की जांच की जाती है। सजातीय डिजाइन विधि के साथ संयुक्त इस मॉडल का उपयोग करके दो दवाओं के इष्टतम संयोजन की जांच की जाती है। सेल मॉडल का उपयोग तैयारी संयोजन और घायल पीसी 12 कोशिकाओं में घटक संयोजन के प्रभाव और तंत्र में अंतर का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। इस रणनीति का उद्देश्य सबसे अच्छा संयोजन मोड निर्धारित करने के लिए पीआई 3 के / एकेटी / एनआरएफ 2 सिग्नल मार्ग के माध्यम से घायल पीसी 12 कोशिकाओं पर दो प्रकार के संयोजनों के सुरक्षात्मक प्रभाव और नियामक तंत्र का पता लगाना है। यह अध्ययन टीसीएम के सर्वोत्तम अनुप्रयोग मोड को अनुकूलित करने के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।
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Protocol
1. अभिकर्मक की तैयारी
- 125 एमएल बाँझ कल्चर फ्लास्क में 90 एमएल डीएमईएम उच्च चीनी माध्यम, 10 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 1 एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान जोड़कर पूरा माध्यम तैयार करें। पूर्ण माध्यम मिलाएं, और बंद परिस्थितियों में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
- 8.4 एमएम स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए डीएमईएम चीनी मुक्त माध्यम (पूरी तरह से घुल गया) के 10 एमएल में 0.02 ग्राम सीओसीएल2 पाउडर (सटीक रूप से तौला गया) जोड़कर सीओसीएल2 समाधान तैयार करें। समाधान को 0.22 μm बैक्टीरियल फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें, इसे सील करें, और इसे प्रकाश से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: CoCl2 अस्थिर है और इसे एक एयरटाइट कंटेनर में संग्रहीत किया जाना चाहिए, जो प्रकाश से सुरक्षित है; CoCl2 समाधान की वैधता अवधि 7 दिन है। - ट्राइस-एचसीएल बफर्ड नमक समाधान (टीबीएसटी) तैयार करें।
- सटीक रूप से 8 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 0.2 ग्राम पोटेशियम क्लोराइड और 3 ग्राम ट्रिस-बेस का वजन करें। उन्हें 1 एल बीकर में जोड़ें, और फिर मिश्रण को भंग करने के लिए 1,000 एमएल आरओ पानी जोड़ें।
- पीएच को 7.4 में समायोजित करें, ट्वीन 20 का 1 एमएल जोड़ें, और टीबीएसटी समाधान प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं।
नोट: ट्वीन 20 एंटीजन के लिए एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए एक सर्फेक्टेंट के रूप में कार्य करता है और 0.1% एकाग्रता पर सबसे अच्छा काम करता है।
- 5 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए 20 एमएल पीबीएस समाधान में 0.1 ग्राम एमटीटी पाउडर का वजन करके एमटीटी (3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल -2)-2,5-डिफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड नमक) समाधान तैयार करें। घोल को 0.22 μm बैक्टीरियल फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें, इसे सील करें, और इसे स्टैंडबाय पर रखे गए प्रकाश से 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: एमटीटी पाउडर अस्थिर है और आसानी से नमी को अवशोषित करता है, इसलिए इसे प्रकाश से दूर एक बंद और सूखी जगह में संग्रहीत किया जाना चाहिए। एमटीटी समाधान 7 दिनों के बाद समाप्त हो जाता है। एमटीटी का कार्सिनोजेनिक प्रभाव होता है, इसलिए त्वचा के साथ सीधे संपर्क से बचें। - कैप्सूल शेल को हटाकर एरी कैप्सूल समाधान तैयार करें और 100 μM स्टॉक समाधान (स्कुटेलरिन की एकाग्रता के आधार पर) तैयार करने के लिए डीएमईएम चीनी मुक्त माध्यम के 10 एमएल में 0.18 ग्राम सामग्री का सटीक वजन करें। समाधान को 0.2 μm बैक्टीरियल फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें, इसे सील करें, और इसे 4 °C पर एक एयरटाइट कंटेनर में स्टोर करें।
नोट: एरिजेरोन ब्रेविसकैपस में स्कुटेलरिन मुख्य सक्रिय घटक है। कैप्सूल में स्कुटेलरिन की एकाग्रता एचपीएलसी-यूवी द्वारा 2.56 मिलीग्राम / जी, यानी, 5.54 μmol / g8 निर्धारित की गई है। तैयारी की एकाग्रता की गणना स्कुटेलरिन एकाग्रता के आधार पर की जाती है। यह तैयारी और घटक की औषधीय गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए सुविधाजनक है। - 60 μM स्टॉक समाधान (एस्ट्रागलोसाइड ए की एकाग्रता के आधार पर) तैयार करने के लिए 15 एमएल बाँझ सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5 एमएल इंजेक्शन और 5 एमएल चीनी मुक्त डीएमईएम मीडिया जोड़कर एस्ट इंजेक्शन का समाधान तैयार करें। 0.2 μm बैक्टीरियल फ़िल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर एक एयरटाइट कंटेनर में स्टोर करें।
नोट: इंजेक्शन की मात्रा 10 एमएल है, और इंजेक्शन में एस्ट्रागैलोसाइड ए की एकाग्रता एचपीएलसी-ईएलएसडी द्वारा 0.094 मिलीग्राम / एमएल (यानी, 120 μM) 9 निर्धारित की गई है। तैयारी एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में की जानी चाहिए और पूरे समय हल्के-प्रूफ तरीके से संचालित की जानी चाहिए। इंजेक्शन समाधान और चीनी मुक्त माध्यम की मात्रा को सटीक रूप से मापा जाना चाहिए और अच्छी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए। - 7.85 मिलीग्राम एस्ट्रागैलोसाइड ए मानक का सटीक वजन करके और 5,000 μM स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए इसे 2 एमएल डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) में पूरी तरह से घोलकर एस्ट्रागैलोसाइड ए समाधान तैयार करें। इसे 0.22 μm बैक्टीरियल फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें और इसे 4 °C पर एयरटाइट स्टोर करें।
नोट: एस्ट्रागैलोसाइड ए पाउडर चीनी मुक्त माध्यम में अघुलनशील है। समाधान तैयार करते समय, डीएमएसओ की अंतिम प्रयोगात्मक एकाग्रता को 0.1% से नीचे रखने के लिए इसे डीएमएसओ की उचित मात्रा के साथ भंग करें ताकि कोई साइटोटॉक्सिसिटी सुनिश्चित न हो सके। - 5,000 μM स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए 11.56 मिलीग्राम स्कुटेलरिन मानक को सटीक रूप से और पूरी तरह से 5 एमएल चीनी मुक्त डीएमईएम माध्यम के साथ घोलकर स्कुटेलरिन समाधान तैयार करें। इसे 0.22 μm बैक्टीरियल फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें और इसे 4 °C पर एयरटाइट स्टोर करें।
- क्लोरोजेनिक एसिड मानक के 8.86 मिलीग्राम का वजन करके क्लोरोजेनिक एसिड समाधान तैयार करें और 5,000 μM स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए इसे 5 एमएल चीनी मुक्त DMEM माध्यम के साथ पूरी तरह से भंग करें। इसे 0.22 μm बैक्टीरियल फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें और इसे 4 °C पर एयरटाइट स्टोर करें।
नोट: क्लोरोजेनिक एसिड पाउडर अस्थिर है और आसानी से पानी को अवशोषित करता है। इसे सील किया जाना चाहिए और प्रकाश से 4 डिग्री सेल्सियस दूर संग्रहीत किया जाना चाहिए; वजन के दौरान एक्सपोजर समय को कम से कम किया जाना चाहिए।
2. सेल व्यवहार्यता परख
- पीसी 12 कोशिकाओं को प्राप्त करें और उन्हें डीएमईएम में 10% एफबीएस, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक करें।
नोट: इस अध्ययन में, कोशिकाओं को चीनी विज्ञान अकादमी से प्राप्त किया जाता है। पीसी 12 कोशिकाएं अनुयायी कोशिकाएं हैं जिनमें न्यूरोएंडोक्राइन कोशिकाओं की सामान्य विशेषताएं हैं और न्यूरोफिज़ियोलॉजी और न्यूरोफार्माकोलॉजी में व्यापक रूप से उपयोग की जाती हैं। - एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को 5% सीओ 2 के साथ पूरक करें और उन्हें हर2-3 दिनों में उप-संस्कृति करें। सभी प्रयोगों के लिए मार्ग 4-8 पर कोशिकाओं का उपयोग करें।
- सेल संस्कृति
- 1 एमएल ट्रिप्सिन (0.25%) के साथ लघुगणकीय विकास चरण (70% -80% सेल कंफ्लुएंसी) में पीसी 12 कोशिकाओं का इलाज करें और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। जब कोशिकाएं गोल हो जाती हैं, तो पूर्ण माध्यम के 3 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन पाचन को रोक दें।
- कोशिकाओं को बाँझ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 5 मिनट के लिए 840 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, पूर्ण माध्यम के साथ पुन: निलंबित करें, और सेल निलंबन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना करें।
- फ्लो साइटोमेट्री सॉफ्टवेयर शुरू करें, गिनती सेटिंग में सेल समाधान के संबंधित कमजोर पड़ने वाले गुणक का चयन करें, और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से सेल नमूना लोड करने के बाद घनत्व चार्ट पर क्लिक करें।
- सेल आबादी को एक्स-अक्ष और वाई-अक्ष से दूर सर्कल करें, आंकड़े के नीचे डेटा तालिका पर राइट-क्लिक करें, और एक्स, वाई, काउंट और एबीएस काउंट का चयन करें। डेटा तालिका में ABS Count के तहत डेटा सेल गिनती परिणाम देता है।
- सेल एकाग्रता को 1 x 105 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें, 96-वेल प्लेटों में 100 μL / अच्छी तरह से टीका लगाएं, और24 घंटे के लिए एक इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO 2 पर कल्चर करें।
- सामान्य पीसी 12 कोशिकाओं पर दो दवाओं की सुरक्षित सांद्रता की जांच
- चरण 2.1-2.2 में वर्णित कोशिकाओं को कल्चर करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और एस्ट इंजेक्शन (4, 8, 12, 16, 20, और 24 μM) और एरी कैप्सूल (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, और 20 μM) की विभिन्न अंतिम सांद्रता के साथ सामान्य कोशिकाओं का इलाज करें। 24 घंटे के लिए प्रत्येक समूह के छह प्रतिकृति कुओं का इलाज करें।
नोट: दवा की अंतिम एकाग्रता (चरण 2.4.1 में उल्लिखित) को प्राप्त करने के लिए दवाओं को मीडिया में जोड़ा जाता है, और फिर प्रत्येक कुएं में मीडिया की एक समान मात्रा जोड़ी जाती है। सतह पर तैरने वाले को सूंघते समय, पिपेट टिप को कुएं की दीवार के खिलाफ धीरे से रखा जाना चाहिए ताकि कुएं के तल पर कोशिकाओं से संपर्क न किया जा सके। विभिन्न समाधानों को जोड़ते समय, उन्हें कुओं के किनारों के साथ धीरे से और जल्दी से जोड़ें, और प्रयोगात्मक परिणामों को प्रभावित करने से बचने के लिए पिपेट गन हेड को बदलते समय ध्यान दें। - सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, प्रत्येक कुएं में 120 μL MTT घोल (1 mg/mL) जोड़ें, और कोशिकाओं को 37 °C पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- इनक्यूबेशन के बाद, सुपरनैटेंट को फिर से छोड़ दें और प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ का 150 μL जोड़ें। एक भंवर ऑसिलेटर का उपयोग करके 240 बार / मिनट (प्रति मिनट क्षैतिज कंपन की संख्या) की गति से 10 मिनट के लिए प्लेट को हिलाएं।
- माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 490 एनएम पर प्रत्येक नमूने के अवशोषण को मापें। सेल व्यवहार्यता (%) की गणना करें, जो उपचारित समूह का अवशोषण / सामान्य समूह (नियंत्रण) x 100 का अवशोषण है।
नोट: सुनिश्चित करें कि एमटीटी समाधान वैधता अवधि के भीतर है; यदि रंग बदल गया है (गहरे हरे रंग में), तो इसका उपयोग नहीं किया जा सकता है। कोशिकाओं के अवशोषण का परीक्षण करते समय, अन्य अभिकर्मकों के हस्तक्षेप को खत्म करने के लिए एक खाली कुआं (संस्कृति माध्यम और एमटीटी, कोशिकाओं या दवाओं के बिना) सेट किया जाना चाहिए। प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ की 150 μL की मात्रा जोड़ी जाती है और नीले-बैंगनी क्रिस्टल को बेहतर ढंग से भंग करने के लिए 10 मिनट तक हिलाया जाता है। परिणामों की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए अवशोषण का जल्द से जल्द पता लगाया जाना चाहिए।
- चरण 2.1-2.2 में वर्णित कोशिकाओं को कल्चर करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और एस्ट इंजेक्शन (4, 8, 12, 16, 20, और 24 μM) और एरी कैप्सूल (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, और 20 μM) की विभिन्न अंतिम सांद्रता के साथ सामान्य कोशिकाओं का इलाज करें। 24 घंटे के लिए प्रत्येक समूह के छह प्रतिकृति कुओं का इलाज करें।
- घायल पीसी 12 कोशिकाओं पर दो दवाओं की प्रभावी सांद्रता की जांच
- चरण 2.1-2.2 में उल्लिखित 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को कल्चर करें, सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और फिर कोशिकाओं को चीनी मुक्त माध्यम के साथ संयुक्त CoCl 2 (0.4 mM) के20 μL / वेल के साथ इलाज करें।
- इसके साथ ही कोशिकाओं को 100 μL/well Ast इंजेक्शन (अंतिम सांद्रता 2, 6, 8, 10, और 12 μM है) या 100 μL एरी कैप्सूल (अंतिम सांद्रता 1, 2, 3, 4, और 5 μM है) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर अगले 24 घंटे के लिए इलाज करें। नियंत्रण समूह में पूर्ण माध्यम का 120 μL/well जोड़ें.
नोट: CoCl2 कोशिकाओं में हाइपोक्सिक स्थितियों को प्रेरित करता है। - एमटीटी विधि द्वारा प्रत्येक नमूने के अवशोषण को मापें और चरण 2.4.2 और 2.4.3 में पहले वर्णित सेल व्यवहार्यता की गणना करें।
- सजातीय डिजाइन विधि के आधार पर दो दवाओं के इष्टतम संयोजन की स्क्रीनिंग
नोट: एस्ट्रागलस इंजेक्शन और ब्रेविसकैपस कैप्सूल की प्रभावी एकाग्रता सीमा प्राप्त करने के बाद, दो दवाओं के छह अलग-अलग संयोजनप्राप्त करने के लिए समान डिजाइन विधि यू 7 (74) तालिका का उपयोग किया गया था। एएसटी इंजेक्शन: एरी कैप्सूल: 1) 2: 2.6 μM, 2) 4: 5 μM, 3) 6: 1.8 μM, 4) 8: 4.2 μM, 5) 10: 1 μM, और 6)12:3.4 μM.- चरण 2.3.1 में ऊपर वर्णित कोशिकाओं को कल्चर करें, और घायल पीसी 12 कोशिकाओं को एस्ट इंजेक्शन के छह अनुपात सांद्रता के साथ इलाज करें: जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है।
- 24 घंटे के लिए कोशिकाओं का इलाज करें और चरण 2.4.2 और 2.4.3 में पहले वर्णित सेल व्यवहार्यता की गणना करें।
- घायल पीसी 12 कोशिकाओं पर दो इष्टतम संयोजनों के सुरक्षात्मक प्रभाव का मूल्यांकन
नोट: इष्टतम तैयारी संयोजन (एस्ट इंजेक्शन: 6: 1.8 μM का एरी कैप्सूल) और इष्टतम घटक संयोजन7 (10 μM एस्ट्रागैलोसाइड ए, 40 μM Scutellarin, और 75 μM क्लोरोजेनिक एसिड) प्राप्त करने के बाद, घायल PC12 कोशिकाओं पर उनके सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच करने के लिए आगे का मूल्यांकन किया जाता है।- चरण 2.3.1 में ऊपर वर्णित कोशिकाओं को कल्चर करें, और घायल पीसी 12 कोशिकाओं को दवाओं के दो प्रकार के संयोजनों के साथ इलाज करें जैसा कि ऊपर नोट में चर्चा की गई है।
- 24 घंटे के लिए कोशिकाओं का इलाज करें और चरण 2.4.2 और 2.4.3 में पहले वर्णित सेल व्यवहार्यता की गणना करें।
3. एपोप्टोसिस दर के लिए एनेक्सीन वी-एफआईटीसी/पीआई परख
- पीसी 12 कोशिकाओं को 1.3 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एकाग्रता पर 12-वेल प्लेट में बीज दें और उन्हें 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कल्चर करें।
- कोशिकाओं को समूहीकृत करें: नियंत्रण समूह, मॉडल समूह, और दवाओं के दो संयोजन। नियंत्रण समूह में पूर्ण माध्यम का 1.2 एमएल / वेल जोड़ें, मॉडल समूह में 0.4 एमएम सीओसीएल 2 युक्त मीडिया का1.2 एमएल / वेल जोड़ें, और 0.4 एमएम सीओसीएल 2 वाले दो संयोजनों में से प्रत्येक का1.2 एमएल / वेल जोड़ें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर अगले 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- दवा उपचार के बाद, कोशिकाओं को ट्रिप्सिन के 250 μL / वेल के साथ इलाज करें, कोशिकाओं को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 840 xg पर सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और बाइंडिंग बफर के 500 μL में गोली को फिर से निलंबित करें।
- आरटी में 15 मिनट के लिए एनेक्सीन वी-एफआईटीसी के 5 μL और प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) के 10 μL के साथ अंधेरे में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और फिर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एपोप्टोसिस की जांच करें। प्रत्येक समूह में तीन प्रतिकृति कुएं सेट करें।
नोट: इस परीक्षण में उपयोग किए जाने वाले ट्रिप्सिन में ईडीटीए नहीं हो सकता है क्योंकि ईडीटीए एक धातु आयन चेलटिंग एजेंट है जो कैल्शियम आयनों को बांधने के लिए एनेक्सीन वी के साथ प्रतिस्पर्धा करता है और पीआई के लिए एनेक्सीन के संबंध को प्रभावित करता है। जब एपोप्टोसिस होता है, तो फॉस्फोसेरिन, मूल रूप से कोशिका झिल्ली के आंतरिक पक्ष पर, कोशिका की सतह पर बाहर की ओर मुड़ जाता है, और एनेक्सिन वी-एफआईटीसी हरे रंग की प्रतिदीप्ति दिखाने के लिए झिल्ली के बाहर फॉस्फोसेरिन को चुनिंदा रूप से बांधता है। - प्रारंभ मेनू में स्वचालित मुआवजा क्लिक करें, चैनल का चयन करें में FITC, PE, PerCP और APC का चयन करें, और इस पर मुआवजा चुनें: ऊंचाई. सांख्यिकीय आइटम में ठीक क्लिक करें: Median. चरण 2.3.2 में उल्लिखित एक ही सेल गिनती विधि के साथ, सेल नमूने एकत्र करें, घनत्व मानचित्र पर क्लिक करें, और प्रभावी सेल आबादी को सर्कल करें।
- एक्स-अक्ष पैरामीटर के रूप में एफआईटीसी प्रतिदीप्ति के साथ, और वाई-अक्ष पैरामीटर के रूप में अन्य प्रतिदीप्ति पैरामीटर के साथ, घनत्व मानचित्र बनाएं। स्टार्ट मेनू में मुआवजा मैट्रिक्स और अतिप्रवाह मैट्रिक्स में गुणांक पर क्लिक करें। एपोप्टोसिस दर के विश्लेषण के लिए घनत्व मानचित्र जानकारी प्रदर्शित की जाती है।
- आरटी में 15 मिनट के लिए एनेक्सीन वी-एफआईटीसी के 5 μL और प्रोपिडियम आयोडाइड (PI) के 10 μL के साथ अंधेरे में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, और फिर फ्लो साइटोमेट्री द्वारा एपोप्टोसिस की जांच करें। प्रत्येक समूह में तीन प्रतिकृति कुएं सेट करें।
4. कैसपेज़ -3 पीढ़ी का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन
- पीसी 12 कोशिकाओं को 8 x 104 कोशिकाओं / कवरस्लिप के घनत्व पर कवरलिप्स पर बीज दें और उन्हें 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24-वेल प्लेटों में रखें। चरण 3.2 में ऊपर वर्णित कोशिकाओं को समूहीकृत करें; प्रत्येक समूह के लिए तीन प्रतिकृति कवरलिप सेट करें।
- दवा उपचार के बाद, कवरलिप्स को पीबीएस (37 डिग्री सेल्सियस) के साथ 5 मिनट के लिए दो बार धोएं, उन्हें 15 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ ठीक करें, और आरटी में 20 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के साथ परमेबिलाइज करें।
- कोशिकाओं को फिर से धोएं और आरटी पर 1 घंटे के लिए 10% बकरी सीरम के साथ उन्हें अवरुद्ध करें।
- प्रत्येक कवरस्लिप को प्राथमिक एंटीबॉडी कैसपेज़ -3 (एपोप्टोसिस का एक प्रमुख कार्यकारी प्रोटीन) के 200 μL के साथ इनक्यूबेट करें, जो रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x TBST में 1:250 की एकाग्रता पर पतला होता है। 1x TBST (प्रत्येक 3 मिनट के लिए तीन बार) के साथ धोएं, और अंधेरे में RT पर 1 घंटे के लिए 200 μL द्वितीयक एंटीबॉडी (1x TBST में 1:300 कमजोर पड़ने) के साथ इनक्यूबेट करें।
नोट: प्रतिदीप्ति आसानी से बुझा दी जाती है; इस प्रकार, द्वितीयक एंटीबॉडी के इनक्यूबेशन के बाद, स्लाइड्स को प्रकाश से दूर रखा जाना चाहिए। प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी को प्रकाश से 4 डिग्री सेल्सियस दूर संग्रहीत किया जाना चाहिए। - 10 मिनट के लिए कवरलिप्स (नाभिक का पता लगाने के लिए) में 300 μL DAPI (0.5 μg / mL) जोड़ें और कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 1x TBST के साथ तीन बार धोएं।
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कवरलिप्स का निरीक्षण करें और छवियों को कैप्चरकरें 10. इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रतिदीप्ति तीव्रता का सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
नोट: उपयोग की जाने वाली स्लाइड और कवरलिप साफ और बाँझ होना चाहिए। धुंधला होने पर, रंगाई समाधान के पीएच, एकाग्रता और तापमान पर ध्यान दें, और प्रतिदीप्ति शमन से बचें। फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप को पारा लैंप को पहले से गर्म करने के लिए कम से कम 15 मिनट पहले चालू किया जाना चाहिए और फिर से चालू होने से पहले 30 मिनट के लिए बंद कर दिया जाना चाहिए। छवियों को प्राप्त करते समय, प्रयोगों के एक ही बैच में एक ही डाई के एक्सपोजर पैरामीटर परिणामों की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए सुसंगत होना चाहिए।
5. आरओएस स्तर के इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख
- चरण 4.1 में चर्चा के अनुसार कोशिकाओं को संस्कृति और व्यवहार करें।
- दवा उपचार के बाद, प्रत्येक कवरस्लिप को 3 मिनट के लिए पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 400 μL DCFH-DA (10 μM) के साथ इनक्यूबेट करें।
नोट: डीसीएफएच-डीए ऑक्सीडेटिव तनाव का एक सार्वभौमिक संकेतक है। इसमें कोशिका झिल्ली पारगम्यता और कोई प्रतिदीप्ति नहीं है। एक बार जब यह कोशिका में प्रवेश करता है, तो इसे 2', 7'-डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन (डीसीएफएच) का उत्पादन करने के लिए एस्टरेज़ द्वारा हाइड्रोलाइज्ड किया जाता है और फिर एक मजबूत फ्लोरोसेंट उत्पाद का उत्पादन करने के लिए तेजी से ऑक्सीकरण किया जाता है। - कोशिकाओं को सीरम-मुक्त डीएमईएम (प्रत्येक 3 मिनट के लिए दो बार) के साथ फिर से धोएं और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदीप्ति शमन एजेंट जोड़ने के बाद तुरंत कवरस्लिप का निरीक्षण करें। इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना करें।
नोट: डीसीएफएच-डीए जांच लोड करने के बाद, अवशिष्ट जांच को साफ करना सुनिश्चित करें जो सेल में प्रवेश नहीं करता है, अन्यथा पृष्ठभूमि उच्च हो जाएगी।
6. एनआरएफ 2, पी-एकेटी, एकेटी, बीसीएल -2 और बैक्स11,12 की प्रोटीन अभिव्यक्ति का पश्चिमी धब्बा पता लगाना
- पीसी 12 कोशिकाओं को 6-वेल प्लेटों में 1 x 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से और 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कल्चर में टीका लगाएं। चरण 4.1 में उपर्युक्त के अनुसार कोशिकाओं को समूहीकृत और व्यवहार करें, और प्रत्येक समूह में तीन प्रतिकृति कुओं को सेट करें।
- 24 घंटे के लिए दवा उपचार के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं और तैयार लाइसिस बफर में 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। लाइसिस के बाद, कोशिकाओं को 16,000 x g और 4 °C पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनैटेंट एकत्र करें।
- प्रोटीन एकाग्रता का पता लगाएं और ब्रैडफोर्ड परख के माध्यम से निर्देशों के अनुसार समायोजित करें। नमूने को पतला करें और 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर डिनेचर करें।
नोट: लाइसिस बफर फॉस्फेट अवरोधक, प्रोटीज अवरोधक और आरआईपीए लाइसेट से बना है जो 1: 1: 50 के मात्रा अनुपात में है। नियंत्रण समूह में, लाइसिस बफर के 200 μL / वेल की आवश्यकता होती है, और अन्य समूहों में 100 μL / वेल लाइसिस बफर की आवश्यकता होती है। आम तौर पर, नियंत्रण, मॉडल और दो प्रकार के संयोजन समूहों की प्रोटीन सांद्रता क्रमशः 0.45 मिलीग्राम / एमएल, 0.25 मिलीग्राम / एमएल, और 0.32-0.39 मिलीग्राम / एमएल होती है; लोडिंग बफर के साथ कमजोर पड़ने के बाद उनकी प्रोटीन सांद्रता क्रमशः 0.36, 0.2, और 0.256-0.312 मिलीग्राम / एमएल है। - विभिन्न आणविक भार वाले प्रोटीन का पता लगाने के लिए, प्रत्येक लेन में 25 μg प्रोटीन लोड करें, 12% एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन चलाएं, और जेल को पीवीडीएफ झिल्ली में स्थानांतरित करें।
नोट: एसडीएस जेल की तैयारी के दौरान, इसे बुलबुले या अघुलनशील कणों के बिना पूरी तरह से मिश्रित किया जाना चाहिए; अन्यथा, असमान या अनियमित बैंड हो सकते हैं। झिल्ली को स्थानांतरित करते समय, सुनिश्चित करें कि पीवीडीएफ झिल्ली और जेल के बीच कोई बुलबुले नहीं हैं; अन्यथा, पट्टी में सफेद धब्बे दिखाई देंगे। इसके अलावा, इस चरण को कम तापमान पर किया जाना चाहिए, और बर्फ की थैली को हर 30 मिनट में बदला जाना चाहिए। - आरटी में 1.5 घंटे के लिए 5% नॉनफैट दूध के साथ झिल्ली को अवरुद्ध करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी (एनआरएफ 2 1: 1,000, एकेटी 1: 2,000, पी-एकेटी 1: 2,000, बीसीएल -2 1: 5,000, और बैक्स 1: 1,000) के 5 एमएल के साथ इनक्यूबेट करें। आंतरिक नियंत्रण के रूप में β-एक्टिन (1: 5,000) एंटीबॉडी का उपयोग करें।
- टीबीएसटी के साथ झिल्ली को धोएं (प्रत्येक 10 मिनट के लिए तीन बार), फिर 2 घंटे के लिए आरटी पर 5 एमएल द्वितीयक एचपीआर-संयुग्मित एंटीबॉडी (1: 5,000) के साथ इनक्यूबेट करें।
नोट: एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के अनुपात को मनमाने ढंग से नहीं बदला जाना चाहिए, और बैंड के पृष्ठभूमि रंग से बचने के लिए आवश्यकताओं के अनुसार झिल्ली को टीबीएसटी के साथ पर्याप्त रूप से धोया जाना चाहिए। - अंत में, झिल्ली को फिर से टीबीएसटी के साथ धोएं, और प्रोटीन बैंड का पता लगाने के लिए केमिलुमिनसेंट एचआरपी सब्सट्रेट (निर्माता के निर्देशों के अनुसार) के साथ इसका इलाज करें। केमिल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके छवियों को कैप्चर करें और तुलनात्मक आंतरिक नियंत्रण के रूप में β-एक्टिन के साथ इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोटीन के ग्रे मूल्यों को निर्धारित करें।
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Representative Results
एस्ट इंजेक्शन और एरी कैप्सूल के इष्टतम संयोजन की स्क्रीनिंग चित्रा 1 में दिखाया गया है। सामान्य पीसी 12 कोशिकाओं पर एएसटी इंजेक्शन और एरी कैप्सूल की सेल जीवित रहने की दर चित्रा 1 ए में दिखाई गई है। सेल व्यवहार्यता 12 μM (चित्रा 1A) से अधिक सांद्रता पर Ast इंजेक्शन के साथ 95% से कम थी और एरी कैप्सूल 5 μM (चित्रा 1A) से अधिक सांद्रता पर थी, यह दर्शाता है कि अधिकतम नॉनटॉक्सिक एकाग्रता क्रमशः 12 μM और 5 μM थी। उनकी साइटोटॉक्सिसिटी अकेले इस्तेमाल किए जाने वाले एस्ट्रागलोसाइड ए और स्कुटेलरिन की तुलना में अधिक थी। CoCl2 द्वारा प्रेरित घायल PC12 कोशिकाओं पर एएसटी इंजेक्शन और एरी कैप्सूल की व्यवहार्यता चित्र 1B, C में दिखाई गई है। मॉडल समूह की तुलना में, एस्ट इंजेक्शन 6-12 μM (p < 0.05 या p < 0.01) की एकाग्रता सीमा में घायल PC12 कोशिकाओं की जीवित रहने की दर में सुधार कर सकता है, और 2-5 μM की एकाग्रता पर एरी कैप्सूल जीवित रहने की दर में सुधार कर सकता है (p < 0.05 या p < 0.01)। 10: 1, 8: 4.2, और 6: 1.8 μM के अनुपात में एएसटी इंजेक्शन और एरी कैप्सूल चोट पीसी 12 कोशिकाओं (पी < 0.01) की व्यवहार्यता में काफी वृद्धि कर सकते हैं (चित्रा 1 डी)। 6: 1.8 μM के अनुपात ने उच्चतम सेल व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया, यह दर्शाता है कि यह सर्वोत्तम घटक संयोजन की तुलना में इष्टतम तैयारी संयोजन और औषधीय गतिविधि है।
घायल पीसी 12 कोशिकाओं पर दो प्रकार के संयोजन के सुरक्षात्मक प्रभावों का मूल्यांकन चित्रा 2 में दिखाया गया है। मॉडल समूह की तुलना में, दो संयोजनों की सेल व्यवहार्यता को काफी बढ़ावा दिया गया था (पी < 0.001), और घटक संयोजन तैयारी संयोजन (चित्रा 2 ए) से बेहतर था। इससे पता चलता है कि घटक संयोजन तैयारी संयोजन की तुलना में सेल अस्तित्व को बेहतर तरीके से बढ़ावा दे सकता है। एपोप्टोसिस दर का परीक्षण फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 2 बी, सी) द्वारा किया गया था। सामान्य समूह की तुलना में, मॉडल समूह में प्रारंभिक, देर से और कुल एपोप्टोटिक कोशिकाओं का प्रतिशत काफी अधिक था (पी < 0.01 या पी < 0.001)। मॉडल समूह की तुलना में, प्रत्येक चरण में एपोप्टोटिक कोशिकाओं का प्रतिशत उपचार समूहों में काफी कम था (पी < 0.05 या पी < 0.01, या पी < 0.001)। प्रत्येक समूह में कैसपेज़ -3 प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रतिदीप्ति तीव्रता चित्रा 2 डी, ई में दिखाई गई है। सामान्य समूह की तुलना में, मॉडल समूह में कैसपेज़ -3 की प्रतिदीप्ति तीव्रता काफी अधिक थी। मॉडल समूह की तुलना में, कैसपेज़ -3 की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रत्येक उपचार समूह (पी < 0.001 या पी < 0.01) में काफी कम थी और तैयारी संयोजन समूह की तुलना में घटक संयोजन समूह में अपेक्षाकृत कम थी। इन परिणामों से पता चलता है कि सेल मॉडल एपोप्टोसिस को प्रेरित कर सकता है, और घटक संयोजन का एंटी-एपोप्टोसिस प्रभाव तैयारी संयोजन की तुलना में बेहतर है।
वेस्टर्न ब्लॉट ने पी-एकेटी, एकेटी, बीसीएल -2 और बैक्स प्रोटीन अभिव्यक्ति (चित्रा 3) का पता लगाया। सामान्य समूह की तुलना में, मॉडल समूह (पी < 0.01 या पी < 0.001) में पी-एकेटी / एकेटी और बीसीएल -2 / बैक्स के अभिव्यक्ति स्तर काफी कम थे। मॉडल समूह की तुलना में, पी-एकेटी / एकेटी और बीसीएल -2 / बैक्स की अभिव्यक्ति दो संयोजनों (पी < 0.05 या पी < 0.01, या पी < 0.001) में काफी अधिक थी, विशेष रूप से घटक संयोजन में अधिक थी। परिणाम बताते हैं कि घटक संयोजन सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने में तैयारी संयोजन से बेहतर है, जो एकेटी / बीसीएल -2 / बैक्स सिग्नल मार्ग को विनियमित करके उत्पादित मजबूत एंटी-एपोप्टोसिस प्रभाव से संबंधित है।
कोशिकाओं में आरओएस के स्तर को निर्धारित करने के लिए डीसीएफएच की प्रतिदीप्ति को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा मापा जा सकता है (चित्रा 4 ए, बी)। जैसा कि चित्रा 4 ए में दिखाया गया है, प्रतिदीप्ति सामान्य कोशिकाओं में लगभग अदृश्य थी, और मॉडल समूह में प्रतिदीप्ति को काफी बढ़ाया गया था। मॉडल समूह की तुलना में दोनों संयोजनों में प्रतिदीप्ति काफी कम हो गई थी। जैसा कि चित्रा 4 बी में दिखाया गया है, मॉडल समूह (पी < 0.001) की तुलना में प्रत्येक उपचार समूह में सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता काफी कमजोर थी। प्रतिदीप्ति में तैयारी संयोजन समूह की तुलना में घटक संयोजन समूह में कमी की प्रवृत्ति थी, यह दर्शाता है कि सेल मॉडल ऑक्सीडेटिव क्षति को प्रेरित कर सकता है। घटक संयोजन का एंटी-ऑक्सीडेटिव क्षति प्रभाव तैयारी संयोजन की तुलना में बेहतर है।
वेस्टर्न ब्लॉट ने एनआरएफ 2 प्रोटीन (चित्रा 4 सी) की अभिव्यक्ति का पता लगाया। सामान्य समूह की तुलना में, मॉडल समूह (पी < 0.05) में एनआरएफ 2 की अभिव्यक्ति काफी कम हो गई थी। मॉडल समूह की तुलना में, उपचार समूहों (पी < 0.01 या पी < 0.05) में एनआरएफ 2 प्रोटीन की अभिव्यक्ति काफी अधिक थी, विशेष रूप से घटक संयोजन समूह (चित्रा 4 डी) में अधिक थी। इससे पता चलता है कि घटक संयोजन सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने में तैयारी संयोजन से बेहतर है, जो एनआरएफ 2 सिग्नल मार्ग को विनियमित करके उत्पादित मजबूत एंटी-ऑक्सीडेटिव क्षति से संबंधित है।
अंत में, घटक संयोजन (10 μM एस्ट्रागलोसाइड A, 40 μM scutellarin, और 75 μM क्लोरोजेनिक एसिड) एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव क्षति से संबंधित सिग्नल मार्गों के मजबूत विनियमन के माध्यम से तैयारी संयोजन (6 μM Ast Injection और 1.8 μM Eri Capsule) की तुलना में घायल कोशिकाओं के अस्तित्व को बेहतर तरीके से बढ़ावा दे सकता है।
एसपीएसएस सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर 26.0 का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए किया गया था, और सभी डेटा को मानक विचलन (एसडी) ± साधन के रूप में व्यक्त किया जाता है। समूहों के बीच तुलना के लिए, डेटा का मूल्यांकन एक-तरफ़ा एनोवा द्वारा किया गया था, जिसके बाद टुकी का परीक्षण किया गया था। पी < 0.05 को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर को इंगित करने के लिए माना जाता था।
चित्र 1: सामान्य और घायल पीसी 12 कोशिकाओं की व्यवहार्यता पर दवाओं का प्रभाव। (ए) सामान्य पीसी 12 कोशिकाओं पर एएसटी इंजेक्शन की विभिन्न सांद्रता और एरी कैप्सूल की विभिन्न सांद्रता का प्रभाव। (बी) घायल पीसी 12 कोशिकाओं पर एएसटी इंजेक्शन की प्रभावी एकाग्रता की जांच। (सी) घायल पीसी 12 कोशिकाओं पर एरी कैप्सूल की प्रभावी एकाग्रता की जांच। (डी) घायल पीसी 12 कोशिकाओं की जीवित रहने की दर पर अलग-अलग अनुपात में दो दवाओं के संयोजन का प्रभाव। सांख्यिकीय मूल्यों को छह स्वतंत्र प्रयोगों से एसडी ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। नियंत्रण समूह की तुलना में &&p < 0.01 है। * पी < 0.05 और ** पी मॉडल समूह की तुलना में 0.01 <। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: घायल पीसी 12 कोशिकाओं के अस्तित्व और एपोप्टोसिस पर दो संयोजनों का प्रभाव। (ए) घटक संयोजन का प्रभाव और घायल पीसी 12 कोशिकाओं की जीवित रहने की दर पर तैयारी संयोजन। (बी) एनेक्सिन वी-पीआई द्वारा पता लगाए गए एपोप्टोसिस दर का ग्राफ। (सी) एपोप्टोसिस दर का सांख्यिकीय हिस्टोग्राम। (डी) कैसपेज़ -3 प्रोटीन अभिव्यक्ति (400x) की सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता। स्केल बार: 20 μm. (E) कैसपेज़ -3 प्रोटीन अभिव्यक्ति की प्रतिदीप्ति तीव्रता का सांख्यिकीय हिस्टोग्राम। सांख्यिकीय मूल्यों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसडी ± औसत के रूप में व्यक्त किया जाता है, छह स्वतंत्र प्रयोगों के लिए सेल व्यवहार्यता को छोड़कर। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, और *** पी मॉडल समूह की तुलना में 0.001 <। # # पी < तैयारी संयोजन समूह की तुलना में 0.01 है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: पी-एकेटी, एकेटी, बीसीएल -2, और बैक्स के अभिव्यक्ति स्तरों पर दो संयोजनों का प्रभाव (ए) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा निर्धारित पी-एकेटी और एकेटी की प्रोटीन अभिव्यक्ति। (बी) प्रत्येक समूह में पी-एकेटी/एकेटी अनुपात आंकड़ों का सांख्यिकीय हिस्टोग्राम। (सी) बीसीएल -2 और बैक्स की प्रोटीन अभिव्यक्ति पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा निर्धारित की जाती है। (घ) प्रत्येक समूह में बीसीएल-2/बक्स अनुपात का सांख्यिकीय हिस्टोग्राम। सांख्यिकीय मूल्यों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसडी ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, और *** पी मॉडल समूह की तुलना में 0.001 <। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: एनआरएफ 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति और आरओएस स्तरों पर दो संयोजनों का प्रभाव। (ए) आरओएस के स्तर फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (400x) द्वारा पता लगाया गया था। स्केल बार: 20 μm. (B) प्रत्येक समूह में ROS प्रतिदीप्ति तीव्रता का सांख्यिकीय हिस्टोग्राम। (सी) एनआरएफ 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा निर्धारित की जाती है। (डी) एनआरएफ 2 प्रोटीन अभिव्यक्ति का सांख्यिकीय हिस्टोग्राम। सांख्यिकीय मूल्यों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों से एसडी ± माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, और *** पी मॉडल समूह की तुलना में 0.001 <। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
आधुनिक नैदानिक अभ्यास 2 में सेरेब्रल इस्किमिया के उपचार के लिए अभी भी आदर्श दवाओं की कमीहै। क्यूई को पूरक करने और रक्त परिसंचरण विधि को सक्रिय करने के मार्गदर्शन में, टीसीएम के नैदानिक अभ्यास में संयोजन में एएसटी, एरी और अन्य तैयारियों का उपयोग किया गया है और अच्छे व्यापक लाभ13,14,15 हासिल किए हैं। बड़ी संख्या में अध्ययनों से पता चला है कि एएसटी रक्त-मस्तिष्क बाधा की पारगम्यता में सुधार कर सकता है, मस्तिष्क रक्त प्रवाह को बढ़ा सकता है, हाइपोक्सिया को सहन करने और ऑक्सीजन मुक्त कण क्षति का विरोध करने के लिए तंत्रिका कोशिकाओं की क्षमता में सुधार कर सकता है, और न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन16,17 में काफी सुधार कर सकता है। यह विशेष रूप से सेनिल इस्केमिक सेरेब्रोवास्कुलर रोग16,17 के लिए उपयुक्त है। एरी रक्त वाहिकाओं को पतला कर सकता है, मस्तिष्क में रक्त की आपूर्ति बढ़ा सकता है, आरओएस को हटा सकता है, और लिपिड पेरोक्सीडेशन18,19 को कम कर सकता है। हालांकि, सहक्रियात्मक प्रभाव, फार्माकोडायनामिक घटक, और दो दवाओं के संयोजन का तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है, जो टीसीएम के नैदानिक अनुप्रयोग को प्रतिबंधित करने वाली एक आम समस्या है।
क्रोनिक सेरेब्रल इस्किमिया का इस्केमिक और हाइपोक्सिक वातावरण ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति को प्रेरित करता है और साथ ही, न्यूरोनल एपोप्टोसिस20,21 को बढ़ावा देने के लिए मस्तिष्क सेल एपोप्टोसिस सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करता है। एकेटी मार्ग एक क्लासिक एंटी-एपोप्टोटिक और प्रो-सर्वाइवल सिग्नल ट्रांसडक्शन मार्ग22,23 है, जिसमें से बीसीएल -2 परिवार प्रोटीन और कैसपेस परिवार इस सिग्नल मार्ग के डाउनस्ट्रीम कार्यकारी प्रोटीन हैं। फॉस्फोराइलेटेड एकेटी प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से बीसीएल -2 परिवार को विनियमित कर सकता है और डाउनस्ट्रीम मार्ग कैस्पेस -3 के सक्रियण को रोक सकता है, जिससे एंटी-एपोप्टोटिक प्रभाव11 को लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, हाइपोक्सिया द्वारा उत्पन्न अतिरिक्त आरओएस ऑक्सीडेटिव तनाव की चोट को प्रेरित कर सकता है, जबकि फॉस्फोराइलेटेड एकेटी ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति 12,24 से निपटने के लिए अतिरिक्त आरओएस को खत्म करने के लिए एनआरएफ2 को सक्रिय कर सकता है। इसलिए, पीआई 3 के / एकेटी / एनआरएफ 2 मार्ग की सक्रियता प्रभावी ढंग से ऑक्सीडेटिव तनाव और एपोप्टोसिस को रोक और नियंत्रित कर सकती है, जिससे हाइपोक्सिक-इस्केमिक मस्तिष्क की चोट25,26 कम हो जाती है।
अध्ययन में, तैयारी संयोजन को घायल पीसी 12 सेल मॉडल का उपयोग करके जांचा गया था, और इस मॉडल में प्रभाव और तंत्र की तुलना पहले7 स्क्रीन किए गए घटक संयोजन के साथ की गई थी। इसके अलावा, एस्ट इंजेक्शन और एरी कैप्सूल की अधिकतम नॉनटॉक्सिक एकाग्रता क्रमशः 12 μM (एस्ट्रागेलोसाइड ए द्वारा गणना) और 5 μM (स्कुटेलरिन द्वारा गणना) है, जबकि एस्ट्रागलोसाइड ए और स्क्यूटेलेरिन की अधिकतम नॉनटॉक्सिक एकाग्रताक्रमशः 20 μM और 50 μM है। यह दर्शाता है कि घटक संयोजन तैयारी संयोजन की तुलना में अधिक सुरक्षित है, जिसमें अधिक नियंत्रणीय गुणवत्ता और उच्च दक्षता और कम विषाक्तता के व्यापक फायदे हैं।
वर्तमान सेल मॉडल जिनका उपयोग सेरेब्रल इस्किमिया को अनुकरण करने के लिए किया जा सकता है, उनमें मुख्य रूप से शारीरिक हाइपोक्सिया (ओजीडी द्वारा प्रेरित) और रासायनिक हाइपोक्सिया (एनए2एस2ओ4 या सीओसीएल2) 27 शामिल हैं। उनमें से, ओजीडी और एनए2एस2ओ4 चोटों दोनों में कम हाइपोक्सिया समय होता है और क्रोनिक इस्किमिया27 का अनुकरण करने के लिए उपयुक्त नहीं होता है। CoCl2-प्रेरित हाइपोक्सिया ओजीडी की तुलना में सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले हाइपोक्सिया मिमिक में से एक है और अन्य हाइपोक्सिया मिमिक्स का उपयोग करता है। यह आरओएस द्वारा लगातार और स्थिर ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बन सकता है और विभिन्न सेललाइनों 27 में विशिष्ट एपोप्टोटिक परिवर्तन पैदा कर सकता है। इसलिए, इस अध्ययन में, न्यूरोनल हाइपोक्सिया 28,29 का अनुकरण करने के लिए24 घंटे के लिए सीओसीएल 2 का उपयोग किया गया था। इसकी मॉडलिंग एकाग्रता (0.1, 0.2, 0.4, और 0.8 एमएम) और वैधता अवधि (1 और 7 दिन) की जांच की गई। इसके अलावा, सेरेब्रल इस्किमिया के बाद ग्लूकोज और ऑक्सीजन की अपरिहार्य कमी को देखते हुए, ग्लूकोज मुक्त और हाइपोक्सिक वातावरण सेरेब्रल इस्केमिक चोट का बेहतर अनुकरण कर सकता है। इस अध्ययन से पता चला है कि24 घंटे के लिए ग्लूकोज मुक्त माध्यम के साथ संयुक्त 0.4 एमएम सीओसीएल 2 एक स्थिर और नियंत्रणीय क्रोनिक हाइपोक्सिक सेल मॉडल स्थापित कर सकता है। अनुवर्ती अध्ययन में, क्रोनिक सेरेब्रल इस्किमिया के पशु मॉडल का उपयोग विवो में घटक संयोजन के चिकित्सीय लाभों को और मान्य करने के लिए किया जाएगा।
यह सेल मॉडल एपोप्टोसिस दर, कैसपेज़ -3 फ्लोरेसेंस तीव्रता और इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर (चित्रा 2 और चित्रा 4) को बढ़ा सकता है, जो क्रोनिक सेरेब्रल इस्किमिया के पैथोलॉजिकल परिवर्तनों को बेहतर ढंग से अनुकरण कर सकता है, जैसे एपोप्टोसिस, ऑक्सीडेटिव तनाव, आदि। इस मॉडल के आधार पर, यह पाया गया कि दो प्रकार के संयोजन एपोप्टोसिस और ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति को रोक सकते हैं। सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने पर घटक संयोजन का प्रभाव तैयारी संयोजन (चित्रा 1) की तुलना में काफी बेहतर था; दोनों संयोजन अलग-अलग डिग्री (चित्रा 3 और चित्रा 4) में पी-एकेटी / एकेटी, बीसीएल -2 / बैक्स और एनआरएफ 2 के अभिव्यक्ति स्तरों को बढ़ा सकते हैं। विशेष रूप से, घटक संयोजन का एकेटी / बीसीएल -2 / बैक्स और एनआरएफ 2 सिग्नलिंग मार्ग के अप-विनियमन पर एक मजबूत प्रभाव पड़ा। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि घटक संयोजन तैयारी संयोजन की तुलना में सेल क्षति का बेहतर विरोध कर सकता है, जो मजबूत एंटी-एपोप्टोसिस और एंटी-ऑक्सीडेटिव तनाव से संबंधित है।
अंत में, ये परिणाम घायल पीसी 12 कोशिकाओं के इलाज के लिए दो जड़ी बूटियों की एक संयोजन रणनीति प्रदान करते हैं और दो जड़ी बूटियों के संयुक्त अनुप्रयोग मोड का मूल्यांकन और अनुकूलन करने के लिए एक नया विचार प्रदान करते हैं। कुल मिलाकर, यह अध्ययन टीसीएम के सक्रिय घटक संयोजन का चयन करने के लिए एक संदर्भ प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस शोध को सिचुआन प्रांतीय विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (2020वाईएफएस0325) की प्रमुख आर एंड डी परियोजनाओं द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300 series class II biosafety cabinet | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, Inc | - | |
| Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | |
| Analytical flow cytometry | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Annexin V-FITC apoptosis detection kit | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Astragalus injection | Heilongjiang Zhenbao Island Pharmaceutical Company | A03190612144 | Ast injection |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| BCA protein quantification kit | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Carbon dioxide incubators | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Chlorogenic acid | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cobalt chloride hexahydrate | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM high sugar medium | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM sugar free medium | Beijing Solarbio life sciences Company | 2029548 | |
| ECL luminous fluid | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Electronic balance | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, China | FA1204 | |
| Electrophoresis instrument | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsule | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Z53021671 | Eri capsule |
| Fetal bovine serum | Four Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | FBS |
| Fluorescent microscope | Olympms Corporation | IX71-F32PH | |
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Goat anti-mouse secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Goat anti-rabbit secondary antibody | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics version 26.0 | International Business Machines Corporation, USA | - | |
| ImageJ 1.8.0 | National Institutes of Health, USA | - | imaging software |
| Immunol fluorescence staining kit | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Microplate reader | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | HH35L2018296 | |
| Motic Inverted microscope | Nanda Scientific Instruments Co. | AE2000LED | |
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| Nonfat milk | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cells | Chinese Academy of Sciences | CBP60430 | |
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo scientific Hyclone | SV30010 | |
| Phosphatase protease inhibitor mixture | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Reactive oxygen species assay kit | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| RI-PA lysis solution | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| SDS-PAGE sample loading buffer, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Sterile filter tips (0.22 µm) | Merck Biotechnology, Inc. | SLGP033RB | |
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | TBS |
| Trypsin | Thermo scientific Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| Vortex oscillator | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, China | VXMNAL | |
| β-actin | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-Ig |
References
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